CN102061266B

CN102061266B - 用于高产l-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法

Info

Publication number: CN102061266B
Application number: CN201010553718A
Authority: CN
Inventors: 姜绍通; 罗水忠; 潘丽军; 邱静; 郑志; 吴学凤
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CN102061266A

Abstract

本发明涉及用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法。该方法包括以下操作步骤：A、制备米根霉孢子悬液，B、制备种子培养液，C、制备菌丝悬液，D、酶解细胞壁，E、原生质体分离，F、原生质体再生。本发明所制备的米根霉原生质体形态近似圆形，活力较高，米根霉原生质体制备数最高能达到2.74×10⁶个/mL，再生率最高为6.8%。本发明方法易于操作，设备要求低，为霉菌原生质体制备及再生提供技术参考。本发明所述方法原生质体制备速度较快，原生质体再生周期短，再生速度快，可以有效提高原生质体制备效率。利用本发明制备的原生质体完全满足原生质体融合的要求，为原生质体的制备与再生提供了一种具有实际意义操作方法。

Description

用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法

技术领域

本发明属于细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及米根霉原生质体制备与再生技术。

背景技术

乳酸是一种重要的多用途有机酸，为三大有机酸之一，尤其是L-乳酸，以其独特的构型优势，展示了广泛的应用前景。L-乳酸广泛存在于植物与生物体内，在食品、医药、饲料、化工等领域有重要的应用。近年来，随着聚乳酸的发展和应用，L-乳酸的需求量越来越大。米根霉菌发酵营养要求低，可直接利用淀粉无须糖化处理；耐低pH值，产物为高光学纯度的L-乳酸，菌体大，容易分离，利于制得高品质产品且节省发酵成本。但是，目前米根霉产L-乳酸方法仍然存在发酵强度不高的缺点。主要原因是：在利用米根霉发酵生产L-乳酸的过程中，目标产物L-乳酸积累的抑制作用限制其生产强度和浓度进一步提高。通过微生物育种选育高产L-乳酸的米根霉菌株是进一步的研究方向。传统的菌株改良技术是采用物理、化学或生物学诱变方法处理出发菌株，以随机方式选育得到性能优异的变异菌株，其缺点是诱变剂所诱发的遗传性状的改变是随机的，筛选正向突变的工作量较大。原生质体技术，特别是原生质体融合，不仅可以在亲缘关系较远的双亲间进行遗传物质的重组，还可以在种内进行基因的重组，并且种内基因的重组更容易进行。将米根霉通过不同方法诱变得到的耐酸突变株进行原生质体融合杂交，得到可以缓解产物抑制的L-乳酸高产耐酸融合菌株。原生质体制备和再生是进行融合的前提条件和关键技术。因此，米根霉原生质体的制备与再生技术具有重要的理论与实用价值。

发明内容

为了进行高产L-乳酸菌米根霉原生质体的制备及再生，本发明提供一种操作简便、成本低的用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法。

本发明的具体操作步骤如下：

用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法包括下列操作步骤：

A、制备米根霉孢子悬液：

挑取米根霉AS3.819（Rhizopus oryzae AS3.819）菌丝一环，接种在由50mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基制成的固体斜面上，在温度32^oC、培养72 h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝，加入30 mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到成熟米根霉孢子浓度在1×10⁶个/mL的米根霉孢子悬液；

B、制备种子培养液：

将2 mL米根霉孢子悬液接种至20 mL种子培养基中，控制摇床转速200 r/min，温度32^oC培养18 h，得到种子培养液；

所述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖 100 g/L，硫酸铵 4 g/L，磷酸二氢钾 0.2 g/L，硫酸镁 0.25 g/L，硫酸锌 0.44 g/L，硫酸亚铁 0.01 g/L；

C、制备菌丝悬液：

取5 mL种子培养液，温度25℃、转速4000 r/min、离心分离10 min，将菌丝与培养基分离；弃上清液，用4 mL浓度0.6 mol/L的氯化钠溶液洗涤菌丝2次；弃上清液，用1 mL浓度6 mol/L的氯化钠缓冲液重悬，得到菌丝悬液；

D、酶解细胞壁：

取1mL菌丝悬液，加入1mL浓度1.5%的混合酶液，温度35℃轻微振荡酶解2 h；加入1mL渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解溶液；

所述浓度1.5%混合酶液由下列重量配比的物质组成：纤维素酶 15g/L、蜗牛酶 15 g/L、溶壁酶 15 g/L、溶剂为0.6 mol / L的氯化钠缓冲溶液，配置好后于4000 r/min，离心15 min，收集上清液，用直径为0.45 μm的超微微孔滤膜过滤除菌；

所述渗透压稳定剂为浓度0.6 mol/L的氯化钠缓冲液；

E、原生质体分离：

过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速500r/min、离心分离15min；弃上清液，用1～2mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤1次，收集原生质体重悬于1mL浓度0.6 mol/L的氯化钠溶液中保存，得到原生质体悬液；

F、原生质体再生：

将原生质体悬液用浓度0.6 mol/L的氯化钠溶液梯度稀释100倍，取稀释液0.1 mL分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板；温度32℃、保持相对湿度大于60%、光照培养12 h，直至长出直径0.5～1mm白色再生菌落；

上述高渗马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L，氯化钠35.1 g/L。

本发明所述方法制备的米根霉原生质体大小均一，形态近似圆形，原生质体制备数较高。微生物生理状态是原生质体化的重要影响因素之一。丝状真菌由于其结构的特点，原生质体的分离有其独特之处，早期形成的原生质体来自菌丝尖端，这些原生质体往往缺少细胞核，再生较困难；后期形成的原生质体来自远区细胞，形成的原生质体不均一。因此本发明采用孢子接种，在孢子生长为菌丝（即种子培养）的对数生长期（18 h）选择年轻菌丝和顶端菌丝制备原生质体，为较高的原生质体化提供保证。

本发明所述方法菌丝细胞的原生质体化较高，获得的原生质体活力较高。水解酶的选择对菌丝细胞壁的酶解效果影响很大，从而影响后期原生质体的制备质量。同时原生质体因为酶解脱去了细胞壁，对外界环境特别是对渗透压会变得非常敏感。因此渗透压稳定剂的种类及其浓度的选择对菌丝体原生质体的形成，尤其是对再生率的提高非常重要。必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁，才能形成和保持稳定的原生质体，从而获得高制备数，并提高后期的再生率。本发明选用0.6mol/L的氯化钠作为渗透压稳定剂，水解酶由蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶按一定比例混合而成。有力的保障了较多原生质体制备数及较高的再生率。本发明所述方法采用高渗马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基作为再生平板，提高了原生质体的再生率。本发明所述方法制备的米根霉原生质体制备数最高能达到2.74×10⁶个/mL，再生率最高为6.8%。

与超声波法原生质体制备方法相比较，本发明所述方法易于操作，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，有效提高了原生质体制备及再生的效率。

本发明所述米根霉原生质体制备及再生方法原生质体制备数高，再生率较高，是米根霉原生质体制备及再生的可靠方法，并为霉菌原生质体制备及再生提供技术参考。本发明为原生质体的制备与再生提供了一种具有实际意义操作方法。利用本发明制备的原生质体完全满足原生质体融合的要求，为进一步的采用原生质体融合技术提高米根霉发酵生产L-乳酸的发酵强度提供了基础。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例：

用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法的操作步骤如下：

A、制备米根霉孢子悬液：

用接种环挑取保藏的米根霉AS3.819（Rhizopus oryzae AS3.819）菌丝一环，接种至装在100 mL三角瓶里由50mL PDA培养基制成的固体斜面上，在32^oC恒温培养箱中培养72 h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝一瓶，加入30 mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，将该孢子液倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡打碎孢子团块，用4层无菌高级擦镜纸过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，使孢子终浓度为1×10⁶个孢子/mL，得到成熟米根霉孢子浓度在1×10⁶个/mL的孢子悬液；

上述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20 g/L；

B、制备种子培养液：

将A中得到的米根霉孢子悬液2 mL接种至装有20 mL种子培养基的100 mL三角瓶中，控制摇床转速200r/min，温度32^oC培养18h，得到种子培养液；

上述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸亚铁0.01g/L；

C、制备菌丝悬液：

取B中制得的种子培养液5mL于10 mL离心管中，然后25℃，4000 r/min，离心10 min，将菌丝与培养基分离；弃上清液，用4mL的0.6 mol/L的氯化钠溶液洗涤2次；弃上清液，用1mL的0.6 mol/L的氯化钠缓冲液重悬，得到菌丝悬液；

D、酶解细胞壁：

取C中制得的菌丝悬液1mL，加入1.5%混合酶液（纤维素酶+蜗牛酶+溶壁酶）1mL，35℃轻微振荡酶解2h。酶解结束后，加入1mL的渗透压稳定剂终止酶解反应。得酶解溶液；

上述混合酶液由下列重量配比的物质组成：纤维素酶 15g/L、蜗牛酶 15g/L、溶壁酶 15g/L、溶剂为0.6mol/L的氯化钠缓冲溶液，配置后于转速4000r/min、离心分离15 min，收集上清液，用直径为0.45 μm的超微微孔滤膜过滤除菌；

上述渗透压稳定剂为0.6 mol/L的氯化钠缓冲液；

E、原生质体分离：

用4层无菌高级擦镜纸过滤D中得到的酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速500r/min、离心分离15min；弃上清液，用1～2mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤1次，收集原生质体重悬于1 mL浓度0.6 mol/L的氯化钠溶液中保存，得到原生质体悬液；

F、原生质体再生：

将E中得到的原生质体悬液，用浓度0.6 mol/L的氯化钠溶液梯度稀释100倍，显微镜下计数，并取该稀释液0.1 mL分别涂布于PDA平板和高渗PDA平板。温度32℃、保持相对湿度大于60%、光照培养12 h，直至长出直径0.5～1 mm白色再生菌落，计算再生率；

上述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L；

上述高渗PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、氯化钠35.1 g/L。

上述计算再生率的公式为：再生率(％)=(高渗PDA上的菌落数-PDA上的菌落数)/显微镜计数原生质体数×100％。

Claims

1.用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于包括下列操作步骤：A、制备米根霉孢子悬液：

挑取米根霉Rhizopus oryzae AS3.819菌丝一环，接种在由50mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度32°C、培养72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到成熟米根霉孢子浓度在1×10⁶个/mL的米根霉孢子悬液；

B、制备种子培养液：

将2mL米根霉孢子悬液接种至20mL种子培养基中，控制摇床转速200r/min，温度32°C培养18h，得到种子培养液；

所述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸亚铁0.01g/L；

C、制备菌丝悬液：

取5mL种子培养液，温度25℃、转速4000r/min、离心分离10min，将菌丝与培养基分离；弃上清液，用4mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤菌丝2次；弃上清液，用1mL浓度6mol/L的氯化钠缓冲液重悬，得到菌丝悬液；

D、酶解细胞壁：

取1mL菌丝悬液，加入1mL浓度1.5%的混合酶液，温度35℃轻微振荡酶解2h；加入1mL渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解溶液；

所述浓度1.5%混合酶液由下列重量配比的物质组成：纤维素酶15g/L、蜗牛酶15g/L、溶壁酶15g/L、溶剂为0.6mol/L的氯化钠缓冲溶液，配置好后于4000r/min，离心15min，收集上清液，用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌；

所述渗透压稳定剂为浓度0.6mol/L的氯化钠缓冲液；

E、原生质体分离：

过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速500r/min、离心分离15min；弃上清液，用1～2mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤1次，收集原生质体重悬于1mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液中保存，得到原生质体悬液；

F、原生质体再生：

将原生质体悬液用浓度0.6mol/L的氯化钠溶液梯度稀释100倍，取稀释液0.1mL分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度32℃、保持相对湿度大于60%、光照培养12h，直至长出直径0.5～1mm白色再生菌落；

上述高渗马铃薯葡萄糖琼脂培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。