CN105087390A - 一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株 - Google Patents

一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株 Download PDF

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杨静
蒋剑春
卫民
张宁
赵剑
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Abstract

本发明公开了一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株。包括菌株的原生质体诱变；选择性平板初筛；基于深孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察。本发明对传统的筛选方法进行了改进，有效地降低了工作强度，提高菌株筛选效率。

Description

一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株
技术领域
本发明涉及微生物菌种筛选技术领域，尤其是一种基于原生质体诱变、深孔细胞培养板的高通量筛选衣康酸高产菌株的方法。
背景技术
衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是世界上第五大有机酸。由于分子内存在一个不饱合双键和两个活泼的羧基,使得衣康酸能够进行加成、聚合反应,形成聚合高分子,其中尤其重要的是衣康酸的酯化反应。标准的酯化反应能够产生衣康酸二酯,且产率很高。衣康酸酯类是合成树脂、塑料、增塑剂的重要原料；另外,衣康酸与胺类反应生成的N-烃基吡咯烷酮是一类重要的化合物。衣康酸及其酯类是生产腈纶等化纤、合成树脂、塑料、橡胶、药物、表面活性剂、无毒食品包装材料、除草剂、除垢剂、粘着剂等工业原料,广泛用于化工行业。
衣康酸的生产方法有化学合成法、柠檬酸分解法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于原料来源广泛、成本低、生产条件温和，是目前国内外生产衣康酸的主要方法。在衣康酸的生产过程中，如何快速高效地获得高产菌株至关重要。目前，衣康酸生产菌种主要有属于土曲霉群的土曲霉(Asp.terreus)和属于灰绿曲霉群的衣康酸曲霉(Asp.itaconicus)。实际生产中应用最多的是土曲霉，但是Asp.terreus野生菌株一般产量都很低，因此运用诱变育种的方法来获得高产菌株的研究日益增加。而诱变后菌种筛选工作量巨大而效率非常低，是目前制约工业微生物生产发酵的重要因素。高通量筛选技术，由于具备微量、高效、灵敏、准确、可重复等特点，成为微生物筛选的主要技术手段。目前还未见适合筛选衣康酸高产突变株的高通量筛选方法的相关报道。
本研究旨在建立一种高效快速筛选衣康酸高产菌株的高通量筛选方法。通过诱变育种，结合高通量方法筛选衣康酸高产菌株，既可以提高工作效率，降低成本，又能大幅度提高筛选速率。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株。
本发明的技术方案为：一种衣康酸高产菌株，为土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11039，保藏日期为2015年7月2日。
一种权利要求1所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，包括菌株的原生质体诱变；选择性平板初筛；基于深孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察，具体步骤为：第一步，菌株的原生质诱变：菌株培养后过滤渗透压稳定剂冲洗得到的菌丝体，收集菌丝体移入无菌三角瓶内加入酶液酶解，过滤去除菌丝片段，离心收集原生质体，渗透压稳定剂清洗后重悬于渗透压稳定剂中；然后对得到的原生质体进行诱变得到原生质体液；所述的原生质体诱变采用方法为紫外线诱变、DES诱变或者超声波诱变中的任一种；
第二步，选择性平板初筛：利用渗透压稳定剂配制再生培养基，上层平板液事先放入40～45℃水浴中保温，将原生质体液加入上层平板液混匀，快速倾倒在已凝固的下层再生平板上，倒置，培养箱温度35～37℃，培养3～5d；平板的筛选因素为：溴甲酚绿、高糖、代谢产物衣康酸或代谢前体琥珀酸中任意一种；
第三步，基于深孔细胞培养板的高通量筛选：挑取再生平板单菌落挑至装有1.2～2.0mL发酵培养基的深孔板中，在150～250r/min下，振荡培养2～4d，离心，取上清液测衣康酸含量，同时一一对应地接至装有固体斜面培养基的深孔板中，于25～28℃恒温培养3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根据测定结果挑选菌株进行摇瓶复筛；
第四步，摇瓶复筛及遗传稳定性考察：将挑选出要进行摇瓶复筛的菌株从斜面培养基中对应的菌落接种至含种子培养基的摇瓶中，摇床培养得到种液，进行摇瓶复筛；摇瓶复筛的条件为：接种量5％～10％，35～37℃，150～250r/min摇床培养3～5d；连续传代培养5代，考察遗传稳定性，筛选得到最稳定的菌株。
第一步中所述的酶液为：纤维素酶4～8mg/ml，蜗牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。
所述的渗透压稳定剂为0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。
第三步所述的发酵培养基配方为：葡萄糖60～100g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，调节pH3.0-3.5；固体斜面培养基配方为PDA培养基。
所述的紫外线诱变法为：吸取单孢子悬浮液5～8mL，加入到放于磁力搅拌器上的直径9cm的培养皿中，在15～20cm的距离下用15～20W的紫外灯照射50～200s。边搅拌边照射，使孢子均匀的吸收紫外线光波。
所述的DES诱变法为：用0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值5～8，分别配置体积分数为0.5～2.5％的DES溶液，各取以上DES溶液和菌悬液等量加入到无菌试管内混匀，室温振荡处理5～10min，诱变处理结束后加入0.5～1mL、1～2％wt的NaS2O3终止反应。
所述的超声波诱变法为：用移液枪移取2～4mL菌悬液，置于灭好菌的无菌离心管中，运用超声波细胞粉粹机,采用150～200W的功率，分别作用5～60min。
第二步中平板筛选因素中，所述的高糖再生培养基配方为：葡萄糖160～250g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L；溴甲酚绿再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，0.2％的溴甲酚绿溶液30-50ml/L；代谢产物衣康酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，衣康酸10～50g/L；代谢前体琥珀酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，琥珀酸10～50g/L。
第三步中所选深孔板为24孔或48孔深孔板；发酵培养基装液量为1.3～4mL，固体斜面培养基装液量为1.8～4.5mL。
有益效果：
本发明根据衣康酸产生菌的自身代谢特性，设计筛选平板，利用深孔板初筛，摇瓶复筛的模式，大大提高了筛选工作效率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中，衣康酸的含量均采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1100高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-RadAminexHPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6mL/min；柱温：55℃；检验器：示差折光检验器；进样量：10μL。外标法测定。
本发明衣康酸高产菌株的高通量筛选方法，具体步骤是：
原生质体制备
将培养8-12h(35-37℃，150-250r/min)的土曲霉种液，用四层无菌擦镜纸过滤菌丝体，用渗透压稳定剂冲洗几遍，吸水纸吸干水分，收集菌丝体移入无菌三角瓶中。按8-10mL/g湿菌丝体加入酶液(纤维素酶0.4～0.8％，蜗牛酶0.2～0.4％，溶菌酶0.05～0.15z％(w/v)的混合酶)，缓慢震摇以分散菌丝体球，在33-35℃酶解2-4h。经4～6层无菌显微镜擦镜纸过滤，去除菌丝片断，300～700g离心8～10min，收集原生质体，用渗透压稳定剂洗2～3次，重悬于渗透压稳定剂中。
原生质体诱变
原生质体诱变所用方法为紫外线诱变、DES诱变或者超声波诱变，诱变后采用双层平板法进行原生质体再生。
如紫外线诱变方法为：吸取单孢子悬浮液5～8mL，加入到放于磁力搅拌器上的直径9cm的培养皿中，在15～20cm的距离下用15～20W的紫外灯照射50～200s。边搅拌边照射，使孢子均匀的吸收紫外线光波。
如DES诱变方法为：用0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH值5～8)分别配置体积分数为0.5～2.5％的DES溶液。各取以上DES溶液和菌悬液等量加入到无菌试管内混匀，室温振荡处理5～10min，诱变处理结束后加入0.5～1mL、1～2％的NaS2O3终止反应。
如超声波诱变为：用移液枪移取2～4mL菌悬液，置于灭好菌的无菌离心管中，运用超声波细胞粉粹机,采用150～200W的功率，分别作用5～60min。
原生质体选择性平板初筛
利用0.4～0.65mol/LNaCl作为渗透压稳定剂配制再生培养基，上层平板液事先放入40～45℃水浴中保温，将原生质体液加入上层平板液混匀，快速倾倒在已凝固的下层再生平板上。平板的筛选因素为：溴甲酚绿，或高糖，或代谢产物衣康酸，或代谢前体琥珀酸。
如高糖再生培养基配方为：葡萄糖160～250g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L。
如溴甲酚绿再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，0.2％的溴甲酚绿溶液30-50ml/L。
如代谢产物衣康酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，衣康酸10～50g/L。
如代谢前体琥珀酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，琥珀酸10～50g/L。
挑取再生平板单菌落挑至装有1.2～2.0mL发酵培养基的深孔板中，在150～250r/min下，振荡培养2～4d，离心，取上清液测衣康酸含量。同时一一对应地接至装有固体斜面培养基的深孔板中，于25～28℃恒温培养3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存。
发酵培养基的配方为：葡萄糖60～100g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，调节pH值至3.0～3.5。斜面培养基配方为PDA培养基。
摇瓶复筛
根据测定结果将48孔斜面培养基中的对应菌株，制备种液，进行摇瓶复筛。条件为：接种量5％～10％，35～37℃，150～250r/min摇床培养3～5d。连续传代培养5代，考察遗传稳定性，筛选得到最稳定的菌株。
实施例1原生质体制备
将菌株土曲霉菌(编号2433，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC))培养12h(37℃，200r/min)，用四层无菌擦镜纸过滤菌丝体，用渗透压稳定剂冲洗几遍，吸水纸吸干水分，收集菌丝体移入无菌三角瓶中。按10mL/g湿菌丝体加入酶液(纤维素酶0.6％，蜗牛酶0.3％，溶菌酶0.1％(w/v)的混合酶)，缓慢震摇以分散菌丝体球，在35℃酶解3.5h。经6层无菌显微镜擦镜纸过滤,去除菌丝片断，500g离心10min，收集原生质体，用渗透压稳定剂洗2～3次，重悬于渗透压稳定剂中。
原生质体诱变
吸取单孢子悬浮液5mL，加入到放于磁力搅拌器上的直径9cm的培养皿中，在15cm的距离下用18W的紫外灯照射150s。边搅拌边照射，使孢子均匀的吸收紫外线光波。
筛选平板再生及初筛
将孢子悬液适当稀释后涂溴甲酚绿再生平板。选取透明圈大的菌落挑至含有1.4mL发酵培养基的48孔深孔板中，在200r/min下，振荡培养3d，离心，取上清液测衣康酸含量。同时一一对应地接至装有1.8mL斜面培养基的深孔板中，于28℃恒温培养3d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存。
溴甲酚绿再生培养基配方为：葡萄糖45g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4.7H2O1g/L，KH2PO41g/L，FeSO4·7H2O0.04g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，玉米浆1g/L，0.2％的溴甲酚绿溶液40ml/L。
发酵培养基配方为：葡萄糖80g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4.7H2O1g/L，KH2PO41g/L，FeSO4·7H2O0.04g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，玉米浆3g/L，调节pH至3.5。
经过深孔板初筛，得到20株衣康酸产量较对照菌株(18.07g/L)提高40％以上的菌株。结果见表1。其中有5株的提高量在130％(AtYSZ-03、AtYSZ-21、AtYSZ-33、AtYSZ-38、AtYSZ-73)以上，对其进行摇瓶复筛，考察遗传稳定性。
摇瓶复筛及遗传稳定性
挑取斜面培养基中对应的菌落，接种至含30mL种子培养基的100mL摇瓶中，37℃,200r/min的摇床培养12h，随后5％的接种量接种至含有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，37℃,200r/min的摇床培养5d，连续传代培养5代，考察遗传稳定性。其中AtYSZ-38和AtYSZ-73基本保持了高产水平，具有良好的遗传稳定性，连续传代5代后，衣康酸发酵能力分别提高了154.5％和132.7％。最终综合筛选得到性能最好的为AtYSZ-38号菌种进行保藏，保藏号为CGMCC：11039。
菌株的形态学观察：
菌落质地毡状；表面紧密，有放射状沟纹；边缘锯齿状；菌落鲑鱼肉色；反面有黄色色素。分生孢子梗多数着生基质；分生孢子放射状，束状；顶囊近球形，表面1/2可育；产孢结构双层；分生孢子近球形，壁光滑。

Claims (10)

1.一种衣康酸高产菌株，其特征在于，为土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11039，保藏日期为2015年7月2日。
2.一种权利要求1所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于：包括菌株的原生质体诱变；选择性平板初筛；基于深孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察，具体步骤为：第一步，菌株的原生质诱变：菌株培养后过滤渗透压稳定剂冲洗得到的菌丝体，收集菌丝体移入无菌三角瓶内加入酶液酶解，过滤去除菌丝片段，离心收集原生质体，渗透压稳定剂清洗后重悬于渗透压稳定剂中；然后对得到的原生质体进行诱变得到原生质体液；所述的原生质体诱变采用方法为紫外线诱变、DES诱变或者超声波诱变中的任一种；
第二步，选择性平板初筛：利用渗透压稳定剂配制再生培养基，上层平板液事先放入40～45℃水浴中保温，将原生质体液加入上层平板液混匀，快速倾倒在已凝固的下层再生平板上，倒置，培养箱温度35～37℃，培养3～5d；平板的筛选因素为：溴甲酚绿、高糖、代谢产物衣康酸或代谢前体琥珀酸中任意一种；
第三步，基于深孔细胞培养板的高通量筛选：挑取再生平板单菌落挑至装有1.2～2.0mL发酵培养基的深孔板中，在150～250r/min下，振荡培养2～4d，离心，取上清液测衣康酸含量，同时一一对应地接至装有固体斜面培养基的深孔板中，于25～28℃恒温培养3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根据测定结果挑选菌株进行摇瓶复筛；
第四步，摇瓶复筛及遗传稳定性考察：将挑选出要进行摇瓶复筛的菌株从斜面培养基中对应的菌落接种至含种子培养基的摇瓶中，摇床培养得到种液，进行摇瓶复筛；摇瓶复筛的条件为：接种量5％～10％，35～37℃，150～250r/min摇床培养3～5d；连续传代培养5代，考察遗传稳定性，筛选得到最稳定的菌株。
3.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第一步中所述的酶液为：纤维素酶4～8mg/ml，蜗牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。
4.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的渗透压稳定剂为0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。
5.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第三步所述的发酵培养基配方为：葡萄糖60～100g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，调节pH3.0-3.5；固体斜面培养基配方为PDA培养基。
6.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的紫外线诱变法为：吸取单孢子悬浮液5～8mL，加入到放于磁力搅拌器上的直径9cm的培养皿中，在15～20cm的距离下用15～20W的紫外灯照射50～200s。边搅拌边照射，使孢子均匀的吸收紫外线光波。
7.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的DES诱变法为：用0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值5～8，分别配置体积分数为0.5～2.5％的DES溶液，各取以上DES溶液和菌悬液等量加入到无菌试管内混匀，室温振荡处理5～10min，诱变处理结束后加入0.5～1mL、1～2％wt的NaS2O3终止反应。
8.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的超声波诱变法为：用移液枪移取2～4mL菌悬液，置于灭好菌的无菌离心管中，运用超声波细胞粉粹机,采用150～200W的功率，分别作用5～60min。
9.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第二步中平板筛选因素中，所述的高糖再生培养基配方为：葡萄糖160～250g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L；溴甲酚绿再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，0.2％的溴甲酚绿溶液30-50ml/L；代谢产物衣康酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，衣康酸10～50g/L；代谢前体琥珀酸再生培养基配方为：葡萄糖40～60g/L，(NH4)2SO41～5g/L，MgSO4.7H2O1～3g/L，KH2PO41～3g/L，FeSO4·7H2O0.02～0.05g/L，ZnSO4·7H2O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，琥珀酸10～50g/L。
10.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第三步中所选深孔板为24孔或48孔深孔板；发酵培养基装液量为1.3～4mL，固体斜面培养基装液量为1.8～4.5mL。
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