CN101235394A - 一种分离提取富马酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开一种利用米根霉发酵制备富马酸的过程中原位分离提取富马酸的方法。本发明针对富马酸独特的理化性质，在利用米根霉游离细胞发酵的同时，采用中空纤维超滤膜、纳滤浓缩和离子交换吸附耦合技术分离提取富马酸。该方法操作条件温和，分离选择性强，菌体细胞的活性损失性小，有效提高米根霉的发酵效率，减少生物法合成富马酸的工艺流程；同时，在反应分离的过程中，利用纳滤装置进行发酵液的浓缩，大大提高了离子交换树脂对富马酸的吸附能力，物耗和能耗相对较低，产生的废弃物和二次污染物较少。该方法反应分离过程快速、完全、操作稳定性佳，是一种高效、新型的传质分离耦合强化技术，具有较广的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种发酵工业中有机酸分离提取方法。
背景技术
富马酸(fumaric acid)，是一种重要的大宗化学品，可广泛应用于食品、化工、医药、涂料、树脂等领域，同时富马酸也是一种重要的四碳平台化合物，可以通过催化转化、脂化、加氢等工艺生产天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1，4-丁二醇等其它四碳化合物。
富马酸的生产方法有化学合成法和生物发酵法，当前富马酸生产的主要技术是化学合成法，但是早在20世纪初期，人们就已经开始了生物发酵法生产富马酸的研究，只是由于当时科技水平和人们认识的局限性，生物法合成富马酸一直处于较低的水平，基本上都是处于实验室研究阶段。近年来随着石油价格的不断上涨，生物发酵法制备富马酸再次成为人们研究的热点。
生物发酵法制备富马酸多采用米根霉或少根根霉等菌种，以葡萄糖为底物进行发酵生产，国内外学者在富马酸生产菌种选育方面做了大量的研究，本研究小组诱变筛选获得一株富马酸高产菌株并申请专利(公开号：CN101100645)。然而在富马酸发酵过程中，需要添加适量中和剂来中和生成的富马酸，Ying Zhou等在2002年的Bioprocess Biosyst Eng上发表文章探讨了不同中和剂对富马酸发酵的影响，发现以CaCO3作为中和剂时富马酸产量最高。同样，1988年美国杜邦公司发表专利(专利号：4877731)在对富马酸发酵过程中的溶氧调控进行了保护，该专利中所采用发酵工艺依然是采用钙盐作为中和剂。可见，钙盐法作为有机酸传统的分离方法，在富马酸的分离中同样具有重要作用。然而，采用钙盐法制备有机酸会导致产物分离过程中产生大量的钙盐积累从而导致环境污染，随着2007年9月1日我国“节能减排全民行动”的正式启动，钙盐法分离提取有机酸必然会被淘汰。
近年来，人们还对从发酵液中提取有机酸的其它如：溶液萃取法、吸附法、离子交换法和电渗析法等进行了研究。研究发现：液液萃取技术具有选择性强和适用范围广的特点，但反萃问题尚未得到很好的解决，产物浓度很低；电渗析法技术原理简单，但操作过程中产生的热量易导致菌体失活，同时较强的反向对流使该过程不能达到高收率。使得以上方法均有一定的局限性。同时，有机酸的发酵过程也是一个产物抑制的过程，如何实现发酵液中有机酸的及时移出，提高产率和产量，是传统单一分离技术所无能为力的。
同时，有机酸的发酵过程也是一个产物抑制的过程，如何实现发酵液中有机酸的及时移出，提高产率和产量，是传统单一分离技术所无能为力。1993年A.Freeman等人在nature biotechnology发表文章总结了原位产物分离技术在生物过程中的应用，该技术在有机酸生产的应用越来越广泛。虽然早在1996年，George T.Tsao等人在Applied and Environmental Microbiology发表文章，利用R.oryzae具有自我固定的特性，设计了一种旋转生物膜接触器耦联吸附柱的装置用于米根霉的发酵和富马酸的吸附收集，富马酸产量为85g/L。但在该工艺发酵条件下，发酵液中富马酸浓度较低，树脂的吸附能力未能得到有效利用，从而使得发酵过程中树脂使用量相对增加，能耗和物耗增大，难以实现产业化应用。
本发明采用游离细胞发酵制备富马酸，利用中空纤维膜截留菌体，纳滤装置浓缩发酵液提高富马酸浓度，并采用离子交换树脂对发酵液中的富马酸进行实时吸附分离，提高了树脂的吸附能力，极大的降低了树脂在反应分离过程的使用量。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用米根霉发酵制备富马酸的过程中原位分离提取富马酸的方法，其特征在于利用游离化的米根霉菌菌体进行发酵的同时，采用中空纤维膜过滤、纳滤浓缩和离子交换吸附耦合技术分离提取富马酸。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种利用米根霉发酵制备富马酸的过程中原位分离提取富马酸的方法，其特征是由以下步骤组成：
(1)发酵培养：米根霉在反应器中经发酵培养得到发酵培养液；
(2)中空纤维膜过滤：米根霉在反应器中发酵培养时，反应器中发酵培养液pH值＜6.0时，发酵培养液进入中空纤维膜过滤，截留液返回反应器中，滤过液进入浓缩池；
(3)纳滤浓缩：浓缩池内pH值＞3.0时，浓缩池内的滤过液进入纳滤装置，相对分子质量＜100的物质透过纳滤膜返回反应器，其余物质被截留返回浓缩池形成浓缩液；
(4)离子交换吸附：当浓缩池内pH值为3.0以内时，浓缩液进入离子交换层析柱进行离子交换，富马酸根离子被交换吸附在离子交换树脂上，交换液返回反应器。
上述中空纤维膜孔径为0.2μm，操作温度30～40℃，操作压力0.02～0.1MPa。
上述纳滤浓缩操作温度30～40℃，操作压力0.5～0.8MPa，纳滤浓缩所用纳滤膜截留相对分子质量为100以上的物质。
上述离子交换树脂为大孔弱碱性阴离子交换树脂AIW-Fa。
上述米根霉原料可以是购自菌种保藏中心，也可以是按常规方法从森林树下土壤中筛选出来。
按常规方法对米根霉进行种子培养及发酵培养。
具体培养方法可以按以下步骤进行：
种子培养：将根霉菌孢子悬浮液按照种子培养基1％～5％(v/v)的接种量接入装有种子培养基的反应器中，置于温度为30～40℃、通气量0.5～1.5vvm，转速为300～500rpm，培养24～48小时后，排掉种子培养液，菌球用于发酵培养；
发酵培养：将灭菌后的发酵培养基倒入反应器中，置于温度为30～40℃、通气量0.5-1.5vvm，转速为300～500rpm，发酵培养得到发酵培养液；
上述种子培养基为pH2.0～3.0米根霉种子培养基；所述的发酵培养基为pH5.0-6.0米根霉发酵培养基；其中，所述的种子培养基和发酵培养基为能提供碳源、氮源及无机盐的常用液体培养基。
上述种子培养基具体为米根霉种子培养基：葡萄糖30～50g/L，尿素2～4g/L，KH2PO4 0.3～0.6g/L，MgSO4 0.3～0.6g/L，FeSO4 0.0004～0.0008g/L，ZnSO4 0.01～0.03g/L，pH 2.0-3.0；
上述发酵培养基具体为米根霉发酵培养基：葡萄糖99～150g/L，KH2PO40.3～0.6g/L，MgSO4 0.3～0.6，FeSO4 0.001～0.002g/L，ZnSO4 0.01～0.03g/L，pH 5.0～6.0。
上述根霉菌孢子悬浮液为将米根霉接种于固体培养基，30～40℃培养4～6天，待孢子成熟后，用无菌水、生理盐水、吐温溶液或磷酸盐缓冲溶液洗脱孢子，接于盛有玻璃珠的三角瓶中，30～40℃及100～150rpm下充分振荡20～60min，过滤，即制得根霉菌孢子悬浮液，孢子浓度控制在105～108个/ml备用。
上述固体培养基为能提供碳源、氮源及无机盐的常用固体培养基。
上述固体培养基具体为：酵母浸出汁1.0～5.0g/L，麦芽浸出汁1.0～5.0g/L，蛋白胨1.0～5.0g/L，甘油10～30g/L，琼脂20g/L。
1.米根霉发酵过程中pH值的优化：
(1)发酵培养液pH值的优化：发酵过程中，不同的pH值对富马酸发酵有重要影响，因此，在发酵过程中，使得发酵培养液的pH值分别控制在3.5～4.5，5.0～6.0，6.5～7.5三个范围，进行发酵培养，来优化发酵过程中培养液的pH值；
(2)中空纤维膜过滤：在对(1)中考察的每一个pH范围，通过pH值监测器控制，当发酵培养液中pH值低于该设定pH值范围时，发酵液进入中空纤维膜过滤，孔径为0.2μm，操作温度30～40℃，压力差0.02MPa，菌球被截留返回反应器中，滤过液进入浓缩池；
(3)纳滤浓缩：pH监测器控制浓缩池中的pH值，当浓缩池中pH值＞3.0时，(2)步骤得到滤过液进入纳滤装置，操作温度30～40℃，压力0.5MPa。水分子及相对分子质量＜100的物质返回反应器，富马酸等相对分子质量100以上的化合物被截留返回浓缩池，当浓缩池pH值低于3.0时，将浓缩液泵入离子交换层析柱；
(4)离子交换吸附：浓缩液泵入26mm×300mm，填充大孔弱碱性阴离子交换树脂AIW-Fa的离子交换层析柱内进行离子交换，上柱流速：1～5ml/min，富马酸根离子被吸附在离子交换树脂上，采用0.5～2mol/l NaOH洗脱至采用紫外检测器检测洗脱液无富马酸为止，洗脱流速1～5ml/min，交换液返回反应器。
优化结果分析：当发酵pH值控制在5.0～6.0时，发酵结束后，富马酸产量是pH为3.5～4.5，6.5～7.5的2～4倍，因此，pH值在5.0～6.0之间发酵时，有利于富马酸的生成。
2.在确定米根霉发酵过程中最佳发酵pH值范围的基础上，对浓缩池中的pH进行优化：
(1)浓缩池pH值的优化：不同的pH值对离子交换树脂的吸附具有影响，在浓缩过程中，选择不同的pH值2.0、3.0、4.0做为考察点，进行浓缩控制；
(2)纳滤浓缩：当浓缩池的pH值高于(1)中各考察点时，浓缩液进入纳滤装置，纳滤装置截留相对分子质量为100以上，操作温度30～40℃，压力0.5MPa。水分子及相对分子质量＜100内的物质返回反应器，富马酸等相对分子质量100以上的化合物被截留返回浓缩池，当浓缩池pH值低于该考察点时，将浓缩液泵入离子交换层析柱；
(3)离子交换吸附：浓缩液泵入26mm×300mm，填充大孔弱碱性阴离子交换树脂AIW-Fa的离子交换层析柱内进行离子交换，上柱流速：1～5ml/min，富马酸根离子被吸附在离子交换树脂上，采用0.5～2mol/l NaOH洗脱至采用紫外检测器检测洗脱液无富马酸为止，洗脱流速1～5ml/min，交换液返回反应器。
优化结果分析：浓缩池中的pH值控制在3∶0时，最有利于树脂的吸附，树脂吸附量是其它两个pH值的2～3倍；浓缩池中的pH值控制在2.0时，富马酸易于结晶，并不利于树脂的吸附，同时对纳滤造成损伤；pH值控制在4.0时，树脂吸附性能较差，吸附量较小。
3.在确定米根霉发酵过程中最佳发酵pH值，浓缩池的最佳pH值范围的基础上，对浓缩装置的压力进行优化：
(1)纳滤压力的筛选：纳滤装置截留相对分子质量为100以上，操作温度30～40℃，选取不同的压力条件(0.2～0.5MPa，0.5～0.8MPa，0.8～1MPa)进行纳滤浓缩；
(2)离子交换吸附：浓缩液泵入26mm×300mm，填充离子交换树脂AIW-Fa的离子交换层析柱进行离子交换，上柱流速：1～5ml/min，富马酸根离子被吸附在离子交换树脂上，采用0.5～2mol/l NaOH洗脱至采用紫外检测器检测洗脱液无富马酸为止，洗脱流速1～5ml/min，，交换液返回反应器。
优化结果分析：纳滤压力控制在0.5～0.8MPa，最有利于发酵培养液的浓缩；当压力控制在0.8～1MPa时，浓缩体积较大，富马酸易于形成结晶，对纳滤膜损伤较大；当压力控制在0.2～0.5MPa时，浓缩效果较差。
4.在确定米根霉发酵过程中最佳发酵pH值范围和纳滤最优条件后，对树脂条件进行优化：浓缩液泵入填充离子交换树脂AIW-Fa的离子交换层析柱(26mm×300mm)内进行离子交换，考察不同的上柱流速：0.5～1ml/min，1～5ml/min，5～10ml/min，富马酸根离子被交换吸附在离子交换树脂上，采用0.5～2mol/l NaOH洗脱至采用紫外检测器检测洗脱液无富马酸为止，洗脱流速1～5ml/min，交换液返回反应器。
优化结果分析：上柱流速控制在1～5ml/min时，最有利于树脂的吸附；流速过慢，增加耦合反应的时间；流速过快，树脂未能及时吸附，富马酸吸收不够彻底。
本发明的有益效果：
离子交换树脂对富马酸的吸附能力是随着富马酸浓度的增加而增加，在发酵过程中，如果仅仅只是使用离子交换树脂与生物反应器耦联进行富马酸的原位反应分离，树脂的使用效率明显下降，因此，目前研究中应用于富马酸反应分离耦合的装置还不能很好的应用于富马酸的生产过程中。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出效果：本发明操作条件温和，分离选择性强，菌体细胞的活性损失性小，有效提高米根霉的发酵效率，进一步提高糖转化率和富马酸的产率，减少生物法合成富马酸的工艺流程；同时，在反应分离的过程中，利用纳滤装置进行发酵液的浓缩，大大提高了离子交换树脂对富马酸的吸附能力，物耗和能耗相对较低，产生的废弃物和二次污染物较少。该方法反应分离过程快速、完全、操作稳定性佳，是一种高效、新型的传质分离耦合强化技术，具有较广的工业化生产前景。
附图说明
图1为发酵制备富马酸的过程中原位分离提取富马酸的装置结构示意图。
图1中：1-1蠕动泵1，1-2蠕动泵2，1-3蠕动泵3，1-4蠕动泵4，1-5蠕动泵5，2补料瓶，3-1空气过滤器1，3-2空气过滤器2，4反应器，5 pH监测器1，6 pH监测器2，7中空纤维膜，8纳滤装置，9浓缩池，10离子交换层析柱。
具体实施方式
实施例1：
结合图1所示，采用根霉菌种米根霉(Rhizopus Oryzae)ME-F11(中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 207066)原位分离提取富马酸的步骤具体如下：
(1)制备孢子悬浮液：将米根霉(Rhizopus Oryzae)ME-F11接种于固体培养基(酵母浸出汁5.0g/L，麦芽浸出汁5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，甘油20g/L，琼脂20g/L)35℃培养6天，待孢子成熟后，用无菌水洗脱孢子，接于已经灭菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35℃及120rpm下充分振荡50min，使孢子均匀分散，用灭过菌的脱脂棉过滤，即制得孢子悬浮液，孢子浓度控制在106个/ml备用；
(2)种子培养：种子培养液(葡萄糖40g/L，尿素3g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.0006g/L，ZnSO4 0.02g/L，pH 2.0)用摇瓶分装在121℃下灭菌15min，冷却后倒入3L反应器4(实际装液量2L)中，并按照3％的接种量接入孢子悬浮液，置于温度为35℃、通气量1vvm，转速为500rpm，培养24小时后，获得光滑、规整的直径在600um的根霉菌球，排掉培养液，菌球用于发酵培养；
(3)发酵培养：发酵用培养液(葡萄糖99.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO4 0.001g/L，ZnSO4 0.02g/L，pH 6.0)用摇瓶分装，在121℃的高温下灭菌30min，摇瓶冷却后倒入3L反应器4中(实际装液量2L)，置于温度为35℃、通气量1vvm，转速为500rpm，发酵培养得发酵培养液，反应器通过pH监测器1与蠕动泵1相连；
(4)中空纤维膜超滤：在富马酸发酵过程中，富马酸的生成会降低溶液中的pH值，当反应器中发酵培养液pH值低于6.0时，pH监测器1启动蠕动泵1，把发酵培养液泵入中空纤维膜7，膜径为0.2μm，操作温度35℃，操作压力0.02MPa，菌球被截留返回反应器4中，滤过液进入浓缩池9，pH值高于6.0时，蠕动泵1停止工作；
(5)纳滤浓缩：浓缩池9中的pH通过pH检测器2监测，当pH值高于3.0时，蠕动泵2开始工作，浓缩池9中液体进入纳滤装置8，操作温度35℃，操作压力0.5～0.8MPa，滤过液返回反应器4，相对分子质量为100以上的截留液返回浓缩池9，当浓缩池9的pH值低于3.0时，蠕动泵2停止工作，蠕动泵3开始工作，将浓缩液泵入离子交换层析柱10；
(6)离子交换吸附：浓缩液泵入填充离子交换树脂AIW-Fa的离子交换层析柱10(26mm×300mm)内进行离子交换，，上柱流速为3ml/min，富马酸根离子被吸附在大孔弱碱性离子交换树脂AIW-Fa上，采用1mol/l NaOH洗脱至采用紫外检测器检测洗脱液无富马酸为止，洗脱流速3ml/min，吸附后的交换液返回反应器4中，继续参与反应。
实验采用离子交换树脂AIW-Fa购自南京麦科菲高效分离载体有限公司；模组件购自天津膜天膜工程有限公司。
采用此方法发酵产富马酸，发酵结束后，富马酸产量达到了80g/L，富马酸产量占总酸产量的90％以上，同时发酵生产富马酸的过程中，极大的减少了离子交换树脂的使用量，使得树脂的使用量降低到无钠滤装置耦合体系的55％，可以看到，应用本发明可以有效地实现米根霉原位反应分离耦合制备富马酸，并且产酸速度快、操作稳定。
Claims (5)
1、一种分离提取富马酸的方法，其特征是由以下步骤组成：
(1)发酵培养：米根霉在反应器中经发酵培养得到发酵培养液；
(2)中空纤维膜过滤：米根霉在反应器中发酵培养时，反应器中发酵培养液pH值＜6.0时，发酵培养液进入中空纤维膜过滤，截留液返回反应器中，滤过液进入浓缩池；
(3)纳滤浓缩：浓缩池内pH值＞3.0时，浓缩池内的滤过液进入纳滤装置，相对相对分子质量＜100的物质透过纳滤膜返回反应器，其余物质被截留返回浓缩池形成浓缩液；
(4)离子交换吸附：当浓缩池内pH值为3.0以内时，浓缩液进入离子交换层析柱进行离子交换，富马酸根离子被交换吸附在离子交换树脂上，交换液返回反应器。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中空纤维膜孔径为0.2μm，操作温度30～40℃，操作压力0.02～0.1MPa。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纳滤浓缩的操作温度30～40℃，操作压力0.5～0.8MPa，纳滤浓缩所用纳滤膜截留相对分子质量为100以上的物质。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的离子交换树脂为大孔弱碱性阴离子交换树脂。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的大孔弱碱性离子交换树脂为大孔弱碱性阴离子交换树脂AIW-Fa。
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