CN102766663B - 桑黄活性多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桑黄活性多糖的制备方法，对培养基进行优化，在培养基中添加了抗氧化剂、天门冬氨酸、维生素等化学因子对桑黄菌丝体的生长有显著的影响并优化了配方和工艺条件，大大提高了桑黄活性多糖的产率和多糖活性，另外，在培养基中添加了抗氧化剂，克服或缓解了非自然条件下真菌细胞生长和合成活性多糖的胁迫条件，本发明方法简单，副产物少，适用于工业化应用，为后续相关产品的开发奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种定向发酵获得桑黄活性多糖的方法，特别是一种通过培养基成分优化配置，利用桑黄菌丝体定向合成水溶性桑黄活性多糖的方法。
背景技术
桑黄，属担子菌亚门(Basidiomycota)、多孔菌科、木层孔菌属，是火木层孔菌(P.igniarius)，鲍氏针层孔菌，裂蹄针层孔菌(P.linteus)的俗称，又称桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇。桑黄主要活性成分为桑黄多糖，桑黄活性多糖干粉逐渐或已经走向国内外市场。在桑黄的药用价值被广泛揭示以及市场前景看好的同时，桑黄的产量已经成为抑制桑黄应用的主要限制因素。由于其菌物特征的特殊性和复杂性以及受生存条件的制约，在自然界中其很难形成子实体，往往需要多年才能形成可用子实体。而且室内培养条件苛刻，人工栽培及其困难，且生长周期长达3-4年。而且，由于桑黄价格昂贵及供不应求，必然导致人们对桑黄菌的无序采集，目前存在的问题是：天然桑黄资源匮乏，面临枯竭，不仅难以满足市场需要，而且有些地方的某些种质资源几近灭绝。所以利用生物工程进行液体发酵生产菌丝体和人工栽培的研究非常重要。因此，深层液体培养技术规模化生产桑黄菌丝体以及其活性多糖物质是满足国内外市场对桑黄相关产品需求的有效途径之一。目前，国内外有关桑黄的研究多集中于深层液体发酵条件优化、多糖分离纯化技术、多糖分子结构解析、抗癌、免疫活性机理等方面。
敖宗华等人公开了大规模化液体深层发酵生产桑黄水提物及多糖(专利号为：200410013869.6)，其以大规模液体发酵制取桑黄多糖，此外，邹祥等人公开了一种用于桑黄菌液体培养的合成培养基及发酵生产桑黄多糖的方法（专利号为：200810070224）以及《中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法》（专利号为：200710018319），这些对促进桑黄多糖产品的开发有重要的意义。
但是，调研文献发现，目前几乎所有技术文献，只关注桑黄培养的目的是获得高的多糖含量以及菌丝体，但在生产阶段，其多糖活性几乎无从考虑，这就严重影响着此类产品的质量和使用效果。由于复合碳氮源或这些复杂培养基的成分复杂，批次之间存在成分上的差异，往往造成桑黄菌液体培养生产菌丝体产量和多糖分子量不稳定，同时也给桑黄多糖的下游提取分离带来困难。目前，从现有文献分析，就菌种制备而言，为了保证桑黄菌株的旺盛生长，许多技术提到要加入桑树枝或树叶，或者丰富的维生素或氨基酸。这些措施虽然可以满足菌株的活化和生长，但是，从工业生产的角度而言，如果以此方法制备菌种，由于桑树枝等农副产品质量不稳定，而且其所含营养成分受自然条件影响大，必然对建立规模化的稳定工艺不利。现有技术中也有这样的文献记载，其培养方法是采用PDA培养基来进行种子液甚至生产发酵液培养，而这种及其复杂的培养基配方是不利于产品的分离纯化，也不能满足现代医药产品生产要求的需要。目前，国内外还没有有关针对桑黄水溶性胞外活性多糖和高活性菌丝体培养的工艺和技术的文献和专利报道，虽然有很多文献报道了其所具有的活性的实验结果。
现有生产或发酵合成桑黄菌丝体或多糖的方法中，多以获得高含量的菌丝体和多糖为主要目的。虽然，这些技术体系所获得的菌丝体和多糖也证明有一定的抗氧化、抗肿瘤细胞生长、提高免疫力等功能，但是这些功能试验多是以体内动物或体外培养细胞试验而证明多糖功能的，而且对多糖的功能验证是滞后于生产过程的。而且，从多糖含量分析测定而言，多使用苯酚硫酸法进行检测，而此种检测体系无法排除培养基中诸如葡萄糖、蔗糖等还原性多糖成分或含有相应和硫酸-苯酚试剂发生反应的基团物质的影响，因此对生产过程所获得的多糖的准确定量难以完成，常常导致虽含有高浓度多糖，但却无相应功能的假象，严重影响了桑黄菌丝体以及多糖产品的使用效果和市场推广。如果忽视或有意忽略液体发酵过程中获得多糖和菌丝体活性的检测，是难以保证规模化生产此类产品的质量的。而且，还应注意到，多糖属于一类次级代谢物，而此类物质的合成在自然界中自有其特定的规律和条件。最近研究已经证明，真菌合成三大类次级代谢物的基因簇在实验室标准培养条件下，往往处于沉默状态。如果仅仅是满足获得高含量菌丝体或多糖，不考虑其所含活性物质的多少或具体活性的高低，必然难以保证此类物质生产的有效性和实际使用过程中的效果。研究还证实：在stress response条件下，液体培养桑黄或其他真菌获得具有活性的多糖和菌丝体是和自然条件下的培养条件具有很大差异的，参与这些物质和菌丝体形成基因的表达和翻译的条件是有很大不同的。具体针对合成活性多糖而言，自然界中，真菌活性多糖的合成是在相对温和、并且相对平衡的状态下合成的，一般要获得相应产物和菌丝的时间很长，过程复杂，受自然条件影响大，获得相应产品是要经过大自然多种条件的洗礼才能完成；在深层液体培养条件下，菌丝细胞在氧气充足、营养相对丰富等体外条件下，细胞合成活性多糖的基因表达和翻译的条件和桑黄菌在自然条件下相比有很大改变。在这些变化的基因中，针对于合成活性多糖，变化很明显的就是好氧环境的改变，而此改变使得细胞在此条件下会产生大量的自由基；而细胞要在体外这种特殊条件下，能够正常生长并合成功能性多糖，据推测可能就要首先清除体内的这些自由基，典型的清除自由基的体内酶包括SOD（超氧化物歧化酶）要参与这一过程。而此类酶系要参与这些过程，需要一些特殊的条件，如这类酶需要Fe、Cu等离子和酶分子的活性中心相结合，从而激活这些酶的活性，或者其他的特殊的活性维护条件，以保证菌丝细胞的存活和进一步的合成活性产物。
而且研究还表明，从自然界分离得到的真菌，如果在标准实验室培养条件下，细胞是处于一种Stress response状态下，因此，细胞要发挥其正常的生理功能，就需要克服细胞处于不利环境下的各种障碍，以完成菌丝生长和合成多糖的生理活动。但是，由于一般人工条件下很难满足细胞的相应生理活动的需要，导致细胞生长速度减慢、合成功能化合物能力下降或消失。定向发酵是基于菌株代谢自然规律，为了生产合成目的产物而采取一定措施如添加特殊抑制剂、弱化或强化相关基因的表达，而完成在特定条件下合成特定目的产物的生理活动。基于真菌细胞在非自然或人工培养条件下面临着诸多因素的胁迫，而目前最受关注的就是氧化胁迫，这种外在的和自然界真菌所处环境不一样的条件导致真菌细胞不能发挥相应的功能。
目前的技术体系，多采用天然或半合成培养基成分，但由于忽略或没有注意到真菌细胞在非自然条件下的“氧化胁迫”状态对其生长和合成多糖的影响。经调研，目前所报道或申请专利的技术体系，在利用桑黄菌株获得菌丝体产品或多糖产品时，大多只以获得高比例的菌丝体或高浓度的多糖为主要或唯一目的，而没有注意到真菌在非自然条件下所受环境的巨大差异对其合成活性多糖的影响。
总结而言，现有的这些制备方法主要存在有以下几个问题：
1、现有的桑黄液体培养方法中采用的发酵培养基多采用天然农副产品如土豆汁、糖蜜、黄豆饼粉、玉米浆、或者复杂的氨基酸组合、植物提取物等为碳氮源，由于复合碳氮源或这些复杂培养基的成分复杂，批次之间存在成分上的差异，往往造成桑黄菌液体培养桑黄多糖分子量不稳定，给桑黄多糖的下游提取分离带来困难，而且该种方法对桑黄多糖的制取产率仍然偏低，不能满足现有市场对桑黄的需求。
2、目前大多数的技术文献，关注桑黄培养的目的是获得较高的桑黄多糖含量，对多糖活性几乎无从考虑，严重影响到此类产品的质量和使用效果。
3、为了保证桑黄菌株的旺盛生长，许多技术提到要加入桑树枝或树叶，或者丰富的维生素或氨基酸，这些措施虽然可以满足菌株的活化和生长，但是，从工业生产的角度而言，如果以此方法制备菌种，由于桑树枝等农副产品质量不稳定，而且其所含营养成分受自然条件影响大，必然对建立规模化的稳定工艺不利，不适于工业化生产。
4、现有技术中在利用桑黄菌株获得菌丝体产品或多糖产品时，大多只以获得高浓度的多糖为主要目的，而没有注意到真菌在非自然条件下所受环境的巨大差异对其合成活性多糖的影响。
发明内容
本发明的目的是解决目前桑黄活性多糖合成技术中所存在的问题，提供了一种桑黄多糖产率高、适于工业化生产、产品质量稳定的桑黄活性多糖的制备方法。
解决上述技术问题采用的技术方案是：
本发明的桑黄活性多糖的制备方法包含有以下的步骤：
1）菌种活化
在改良PDA培养基中接种桑黄菌丝体，25～30℃，有氧避光培养至桑黄菌丝体长满斜面；
上述的1L改良PDA培养基中：马铃薯180～200g、葡萄糖10～20g、琼脂20g、抗氧化剂0.5～6g，余量为水，改良PDA培养基的pH为6.5；
2)一级种子液培养
按照每50ml的种子液培养基中接入3块1cm2的斜面菌种的量，将活化后的斜面菌种接入装有种子液培养基的三角瓶中，25～30℃，摇床培养120～240小时，摇床转速150～180r/min；
上述的1L种子液培养基中：马铃薯200～260g、葡萄糖5～30g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、抗氧化剂1～6g、CaCl2 0.1～2g、FeSO4 0.05～0.35g，余量为水，种子液培养基的pH为6.5；
3）二级种子液培养
将步骤2）所得的菌种按照菌种与种子液培养基的体积比为1：10～15的量接入装有种子液培养基的三角瓶中，25～30℃摇床培养120小时，摇床转速180r/min，得扩大培养的菌种；
4）定向发酵
将步骤3）扩大培养的菌种转接入装有定向发酵培养基的发酵罐中，菌种与定向发酵培养基的体积比为1：10～15，保持罐温28～29℃，罐压0.5～0.7kPa，搅拌速率300～400rpm，通气量为1：0.5～0.7v/v.m，发酵180～220小时，得到发酵液；
上述的1L定向发酵培养基中：麦芽粉5～20g、葡萄糖15～100g、FeSO40.1～0.6g、抗氧化剂1～6g、天门冬氨酸0.5～8g、MgSO4 1g、KH2PO4 1～2g、复合维生素0.001～0.05g、吐温80 1～10g，余量为水，定向发酵培养基的pH为6.5；
5）提取桑黄活性多糖
将步骤4）得到的发酵液打到减压浓缩器中，浓缩至浓缩液的体积为原发酵液体积的0.1～0.25倍，转移到贮罐中，经板框压滤，压滤清液浓缩，加入乙醇至乙醇在浓缩清液中的体积浓度达到60%～80％，低温醇析10～20小时，取沉淀物用去离子水溶解，喷雾干燥，得到桑黄活性多糖。
上述步骤4）的定向发酵培养基中：麦芽粉8～15g、葡萄糖20～100g、FeSO40.2～0.5g、抗氧化剂1～6g、天门冬氨酸0.5～8g、MgSO4 1g、KH2PO4 1g、复合维生素0.001～0.05g、吐温80 1～10g，余量为水，定向发酵培养基的pH为6.5。
上述步骤1）的改良PDA培养基中：马铃薯185～195g、葡萄糖13～18g、琼脂20g、抗氧化剂1～2g，余量为水。
上述步骤2）中的种子液培养基中：马铃薯220～240g、葡萄糖10～20g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、抗氧化剂2～5g、CaCl2 0.1～1g、FeSO4 0.1～0.25g，余量为水，种子液的PH为6.5。
上述抗氧化剂是维生素C或维生素P或芦丁。
上述步骤1）所述桑黄菌丝体的名称为桑黄P0988（Phellinus sp.P0988），保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012080，保藏日期是2012年3月14日。
本发明主要在桑黄活性多糖的制备方法中对培养基进行优化，在培养基中添加了抗氧化剂、天门冬氨酸、维生素等化学因子对桑黄菌丝体的生长有显著的影响并优化了配方和工艺条件，大大提高了桑黄活性多糖的产率和多糖活性，另外，在培养基中添加了抗氧化剂，克服或缓解了非自然条件下真菌细胞生长和合成活性多糖的胁迫条件，本发明方法简单，副产物少，适用于工业化应用，为后续相关产品的开发奠定了基础。
附图说明
图1为本发明的影响多糖含量因素的标准化效应pareto图。
图2为本发明的影响总抗氧化活性因素的标准化效应pareto图。
具体实施方式
现结合附图和试验对本发明的桑黄活性多糖的制备方法进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的桑黄活性多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤1：菌种活化
取出1块1cm2的桑黄菌丝体接入配制好的20ml的改良PDA培养基中，28℃，有氧避光培养240小时至桑黄菌丝体长满斜面后取出，4℃冰箱中保存；
上述的改良PDA培养基的组成为：马铃薯190g，葡萄糖15g，琼脂20g，维生素P 1.5g，水添加至1L，培养基的pH值为6.5。
步骤2：一级种子液培养
取3块步骤1中1cm2大小的斜面菌种转接入装有50ml种子液培养基的250ml容量的三角瓶中，28℃，转速为150～180r/min，144小时，进行扩大培养，以此作为一级种子液培养。
种子液培养基的组成为：马铃薯230g，葡萄糖15g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素P 3g、CaCl2 0.5g、FeSO4 0.25g，加水至1L，种子液培养基的pH值为6.5，颜色为墨黑色。
步骤3：二级种子液培养
取步骤2所培养的菌种8.3ml接入装有100ml种子液培养基的容量为300ml的三角瓶中进行二次扩大培养，菌种与种子液培养基中的体积比为1：12，28℃培养，转速150～180r/min，培养120小时后接入三角瓶中进行扩大培养，直至直径为0.5-2mm的菌丝球长满三角瓶，即培养液中长满大小、分布比较均匀的菌丝球。
步骤4：定向发酵
将0.58L步骤3中扩大培养的菌种转接入装有7L定向发酵培养基的容积为10L的发酵罐中，菌种与定向发酵培养基的体积比为1：12，保持罐温28℃，罐压0.5-0.7kPa，搅拌速率350rpm，通气量1：0.5-0.7v/v.m，发酵198小时。
上述的定向发酵培养基的组成为：麦芽粉11g、葡萄糖60g、FeSO4 0.25g、维生素P 2.5g、天门冬氨酸3.3g、MgSO4 1g、KH2PO4 1g、复合维生素0.025g、吐温80 4g，加水定容至1L，该培养基的pH为6.5。
依照GB/T 15672-2009，对本步骤发酵后的发酵液中桑黄活性多糖的含量进行检测，检测结果中桑黄活性多糖的含量为7.998g/L，桑黄活性多糖的总抗氧化活性为：2.960mmol/g
步骤5：桑黄活性多糖提取
对步骤4）所得到的发酵液打到减压浓缩器中，浓缩至浓缩液的体积为原发酵液的0.14倍，转移到贮罐中，经板框压滤，得清液，清液浓缩，加入适量乙醇，使乙醇在浓缩清液中的体积浓度达到70％，低温醇析15小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥即得到桑黄活性多糖。
取上述制取的粗桑黄活性多糖用总抗氧化活性试剂盒（ABTS法）测定其活性，检测粗桑黄活性多糖的产率为54%，其总抗氧化活性为2.532mmol/g。
上述的桑黄菌丝体名称为桑黄P0988（Phellinus sp.P0988），保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2012080，其是作为获得桑黄高活性多糖的生产菌株，保藏日期：2012年3月14日。该桑黄菌丝体是在野外采集桑黄子实体，利用孢子弹射法培养获得。
上述的孢子弹射法具体是由以下步骤实现：
A、选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的桑黄子实体，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。
B、在接种箱或无菌室内，把桑黄子实体的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住，培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内，形成一层粉末状孢子印，用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种，待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养，试管培养温度为28℃，静置避光培养。
实施例2
在上述实施例1的步骤1中，改良PDA培养基的组成为：马铃薯185g、葡萄糖13g、琼脂20g、维生素P 1g，加水定容为1L。本步骤中其他的步骤与实施例1相同。
其他的步骤与实施例1相同。
实施例3
在上述实施例1的步骤1中，改良PDA培养基的组成为：马铃薯195g、葡萄糖18g、琼脂20g、维生素P 2g，加水定容为1L。本步骤中其他的步骤与实施例1相同。
其他的步骤与实施例1相同。
实施例4
在上述实施例1的步骤1中，改良PDA培养基的组成为：马铃薯180g、葡萄糖10g、琼脂20g、维生素P 0.5g，加水定容为1L。本步骤中其他的步骤与实施例1相同。
其他的步骤与实施例1相同。
实施例5
在上述实施例1～3的步骤1中，改良PDA培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、维生素P 6g，加水定容为1L。本步骤中其他的步骤与相应的实施例相同。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例6
在上述实施例1～5的步骤2中，所涉及的种子液培养基的组成为：马铃薯220g、葡萄糖10g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素P 2g、CaCl2 0.1g、FeSO40.1g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例7
在上述实施例1～5的步骤2中，所涉及的种子液培养基的组成为：马铃薯240g、葡萄糖20g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素P 5g、CaCl2 1g、FeSO40.25g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例8
在上述实施例1～5的步骤2中，所涉及的种子液培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素P 1g、CaCl2 0.1g、FeSO4 0.05g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例9
在上述实施例1～5的步骤2中，所涉及的种子液培养基的组成为：马铃薯260g、葡萄糖30g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、维生素P 6g、CaCl2 2g、FeSO4 0.35g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例10
在上述的实施例1～9的步骤4中，所涉及的定向发酵培养基的组成为：麦芽粉8g、葡萄糖20g、FeSO4 0.2g、维生素P 1g、天门冬氨酸0.5g、MgSO4 1g、KH2PO4 1g、复合维生素0.001g、吐温80 1g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例11
在上述的实施例1～9的步骤4中，所涉及的定向发酵培养基的组成为：麦芽粉15g、葡萄糖100g、FeSO4 0.5g、维生素P6g、天门冬氨酸8g、MgSO4 1g、KH2PO4 1g、复合维生素0.05g、吐80 10g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例12
在上述的实施例1～9的步骤4中，所涉及的定向发酵培养基的组成为：麦芽粉5g、葡萄糖15g、FeSO4 0.1g、维生素P 1g、天门冬氨酸0.5g、MgSO41g、KH2PO4 1g、复合维生素0.001g、吐温80 1g，加水定容至1L。
其他的步骤与相应的实施例相同。
实施例13
在上述的实施例1～9的步骤4中，所涉及的定向发酵培养基的组成为：麦芽粉20g、葡萄糖100g、FeSO4 0.6g、维生素P 6g、天门冬氨酸8g、MgSO4 1g、KH2PO4 2g、复合维生素0.05g、吐温80 10g，加水定容至1L。
实施例14
在上述的实施例1～13中，培养基中所用的维生素P用等质量的维生素C或芦丁替换，其它的步骤与相应的实施例相同。
实施例15
上述实施例1～14中的桑黄活性多糖的制备方法包括以下步骤：
在步骤1中，桑黄菌丝体接入改良PDA培养基中，在25℃有氧避光培养；本步骤中的其他步骤与对应实施例相同。
在步骤2中，取3块步骤1中1cm2大小的斜面菌种转接入装有50ml种子液培养基的250ml容量的三角瓶中，25℃，转速150～180r/min，摇床培养180小时，进行扩大培养，本步骤中其他的步骤与对应实施例相同。
在步骤3中，将10ml步骤2所培养的菌种接入装有100ml种子液培养基的容量为500ml的三角瓶中进行二次扩大培养，菌种与种子液培养基中的体积比为1：10，25℃摇床培养，本步骤中其他的步骤与对应实施例相同。
在步骤4中将0.7L步骤3中扩大培养的菌种转接入装有7L定向发酵培养基的容积为10L的发酵罐中，菌种与定向发酵培养基的体积比为1：10，保持罐温28℃，罐压0.5～0.7kPa，搅拌速率300～400rpm，通气量1：0.5～0.7v/v.m，发酵220小时，本步骤中其他的步骤与对应实施例相同。
其他的步骤与对应实施例相同，制得桑黄活性多糖，产率为54%。
实施例16
在上述实施例1～14中的桑黄活性多糖的制备方法包括以下步骤：
在步骤1中，桑黄菌丝体接入改良PDA培养基中，在30℃有氧避光培养；本步骤中的其他操作与实施例1相同。
在步骤2中，取3块步骤1中1cm2大小的斜面菌种转接入装有50ml种子液培养基的250ml容量的三角瓶中，30℃，转速150～180r/min，120小时，进行扩大培养，本步骤中其他的步骤与实施例1相同。
在步骤3中，将6.7ml步骤2所培养的菌种接入装有100ml种子液培养基的容量为500ml的三角瓶中进行二次扩大培养，菌种与种子液培养基中的体积比为1：15，30℃培养，本步骤中其他的步骤与实施例1相同。
在步骤4中将0.47L步骤3中扩大培养的菌种转接入装有7L定向发酵培养基的容积为10L的发酵罐中，菌种与定向发酵培养基的体积比为1：15，保持罐温29℃，罐压0.5～0.7kPa，搅拌速率300～400rpm，通气量1：0.5～0.7v/v.m，发酵180小时，本步骤中其他的步骤与实施例相同。
其他的步骤与实施例1相同。
为了确定本发明中定向发酵培养基的最优工艺条件以及最佳配比，还进行了以下试验，具体如下：
1、因子筛选实验
根据桑黄子实体的生长条件，确定出对桑黄生长及活性多糖产生可能有影响的因子，PB实验对其主要因子进行筛选，筛选结果如下：
表1 全面因子筛选结果
参见表1和附图1和2，可以得出对多糖总抗氧化活性影响最为明显的因子有：维生素P、天门冬氨酸和硫酸亚铁；影响多糖含量的因子是麦芽粉。
综合上面结果可以看出影响桑黄多糖含量和多糖总抗氧化活性的因子是：麦芽粉、维生素P、硫酸亚铁、天门冬氨酸。
2、最陡爬坡实验
目的是为了确定下一步响应面设计中的中心点，结果如下表2：
表2 响应面设计和实验结果
由上表可以看出：第五组实验有利于胞外多糖的产生，第四组实验有利于多糖总抗氧化活性的提高。所以，分别把第五组和第四组数据作为后面多糖含量和多糖总抗氧化活性响应面设计的中心点，通过前面PB实验可以知道：麦芽粉对多糖含量的影响非常显著，维生素P、硫酸亚铁和天门冬氨酸对多糖的总抗氧化活性有显著影响作用。因此，麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸的中心点分别定为：12g/L、0.25g/L、2.5g/L、2.5g/L。
三、响应面设计
通过中心组合实验进行响应面分析，实验组如下：
表3 为响应面设计及实验结果
| A | B | C | D | EPS(g/L) | EPS TEAC(mmol/g) | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 3.593 | 0.9751 |
| 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 5.791 | 1.396 |
| 3 | 1 | -1 | 1 | 1 | 6.302 | 0.8063 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.115 | 0.9962 |
| 5 | -2 | 0 | 0 | 0 | 1.019 | 3.121 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.993 | 1.006 |
| 7 | 1 | -1 | -1 | -1 | 6.954 | 0.5181 |
| 8 | 0 | 0 | -2 | 0 | 6.382 | 0.7178 |
| 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.843 | 1.164 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.879 | 1.125 |
| 11 | -1 | 1 | -1 | 1 | 4.611 | 1.406 |
| 12 | 0 | -2 | 0 | 0 | 4.892 | 0.8077 |
| 13 | -1 | -1 | 1 | 1 | 4.122 | 1.436 |
| 14 | 1 | -1 | 1 | -1 | 6.115 | 0.935 |
| 15 | -1 | -1 | 1 | -1 | 3.804 | 1.548 |
| 16 | 1 | -1 | -1 | 1 | 6.506 | 0.7383 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | -2 | 4.982 | 0.9473 |
| 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.811 | 1.043 |
| 19 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5.746 | 0.6786 |
| 20 | 0 | 0 | 0 | 2 | 6.271 | 1.053 |
| 21 | 1 | 1 | -1 | 1 | 7.287 | 0.5753 |
| 22 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5.939 | 1.138 |
| 23 | -1 | 1 | 1 | 1 | 4.444 | 1.455 |
| 24 | 0 | 0 | 2 | 0 | 4.892 | 1.083 |
| 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.031 | 1.135 |
| 26 | 1 | 1 | -1 | -1 | 6.429 | 0.3182 |
| 27 | -1 | 1 | 1 | -1 | 2.384 | 1.662 |
| 28 | -1 | 1 | -1 | -1 | 4.205 | 1.236 |
| 29 | -1 | -1 | -1 | 1 | 2.729 | 1.923 |
| 30 | -1 | -1 | -1 | -1 | 3.330 | 1.590 |
| 31 | 0 | 2 | 0 | 0 | 5.256 | 0.6348 |
上表3中，Ａ、B、C、D分别代表的是麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸。
上述的麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸的水平分别如下表4：
表4 麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸的水平分析结果
| -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | |
| 麦芽粉(g/L) | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 |
| 硫酸亚铁(g/L) | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.35 |
| 维生素P(g/L) | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 |
| 天门冬氨酸(g/L) | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 |
拟合多糖含量方程为：
Y＝5.94450+2.40387X1-0.03614X2-0.71009X3+0.62602X4-2.55661X1 2-0.88747X2 2-0.32459X3 2-0.33512X4 2-1.12068X1X2-1.32436X1X3+0.14190X1X4-1.79725X2X3+1.50541X2X4+1.12587X3X4
通过对回归方程的计算可得：麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸的实际最佳含量分别为：14gL、0.35g/L、1.5g/L、3.5g/L
计算出来的Y值为：8.613g/L，然后经过五组验证试验得到平均多糖产量为8.213g/L，与预计值比较接近。
基础培养基产生的多糖是：1.315g/L。
拟合多糖总抗氧化活性方程为：
Y=1.08674-0.84675X1-0.12784X2+0.16018X3+0.03724X4+1.10020X1 2-0.43722X2 2-0.25798X3 2-0.15837X4 2+0.07175X1X2+0.32483X1X3-0.03304X1X4+0.31972X2X3-0.09706X2X4-0.43079X3X4
通过对回归方程的计算可得：麦芽粉、硫酸亚铁、维生素P、天门冬氨酸的实际最佳含量分别为：8gL、0.2g/L、2g/L、2.3g/L
计算出来的Y值为：3.002mmol/g，然后经过五组验证试验得到平均多糖总抗氧化活性为2.997mmol/g，与预计值比较接近。
基础培养基多糖的总抗氧化活性为：0.3220mmol/g。
以郭霞2010年在西南大学博士学位论文库中公开的分类号为S567.39，名称为《桑黄发酵过程优化及其多糖代谢调控研究》的论文中公开的产生桑黄多糖的培养基作为对比，用与本发明中完全相同的检测方法测定其发酵液中的多糖含量和多糖总抗氧化活性，并且与本发明实施例1发酵液中桑黄活性多糖进行对比，检测结果如下：
表5 实施例1与对比例的产率与抗氧化活性检测结果对比
| 项目 | 实施例1 | 对比例 |
| 产率（%） | 54 | 49.7 |
| 总抗氧化活性（mmol/g） | 2.960 | 0.59875 |
由此可以得知，本发明制备方法所制备的桑黄活性多糖较现有技术，其产率大大提高，而且，本发明考虑了桑黄多糖的活性因子，制备的桑黄多糖总抗氧化活性高。
本发明的获得桑黄活性多糖的方法的建立和实施，在生物工程上有非常重要的优点和意义。一、由于本技术发明的实施可以获得高活性的菌丝体和多糖，为后续相关产品的开发奠定了基础；二、由于定向发酵的技术源于化学营养因素的最优组合，对最终产品的高产率获得有重要意义；三、目前，规模化生产菌丝体和多糖的技术体系已经有过探索，但还需对其生产过程是否获得高活性产品而进一步研究，因此可以依据本技术方面进一步改造现有生产技术体系以生产市场上急需的菌丝体产品和多糖；四、有利于进步开发菌丝体和多糖的相关产品。
Claims (1)
1.一种桑黄活性多糖的制备方法，其特征在于：所述方法包含有以下的步骤：
1)菌种活化
在改良PDA培养基中接种桑黄菌丝体，25～30℃，有氧避光培养至桑黄菌丝体长满斜面；
上述的改良PDA培养基中，以1L计算：马铃薯190g、葡萄糖15g、琼脂20g、抗氧化剂1.5g，余量为水，改良PDA培养基的pH为6.5；
上述桑黄菌丝体的名称为Phellinus sp.P0988，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012080，保藏日期是2012年3月14日；
2)一级种子液培养
按照每50ml的种子液培养基中接入3块1cm2的斜面菌种的量，将活化后的斜面菌种接入装有种子液培养基的三角瓶中，25～30℃，摇床培养120～240小时，摇床转速150～180r/min；
上述的种子液培养基中，以1L计算：马铃薯230g、葡萄糖15g、KH2PO41g、MgSO40.5g、抗氧化剂3g、CaCl20.5g、FeSO40.25g，余量为水，种子液培养基的pH为6.5；
3)二级种子液培养
将步骤2)所得的菌种按照菌种与种子液培养基的体积比为1：10～15的量接入装有种子液培养基的三角瓶中，25～30℃摇床培养120小时，摇床转速180r/min，得到扩大培养的菌种；
4)定向发酵
将步骤3)扩大培养的菌种转接入装有定向发酵培养基的发酵罐中，菌种与定向发酵培养基的体积比为1：12，保持罐温28℃，罐压0.5-0.7kPa，搅拌速率350rpm，通气量为1：0.5～0.7v/v·m，发酵198小时，得到发酵液；
上述的定向发酵培养基中，以1L计算：麦芽粉11g、葡萄糖60g、FeSO40.25g、抗氧化剂2.5g、天门冬氨酸3.3g、MgSO41g、KH2PO41g、复合维生素0.025g、吐温80 4g，余量为水，定向发酵培养基的pH为6.5；
5)提取桑黄活性多糖
将步骤4)得到的发酵液打到减压浓缩器中，浓缩至浓缩液的体积为原发酵液体积的 0.1～0.25倍，转移到贮罐中，经板框压滤，压滤清液浓缩，加入乙醇至乙醇在浓缩清液中的体积浓度达到60％～80％，低温醇析10～20小时，取沉淀物用去离子水溶解，喷雾干燥，得到桑黄活性多糖；
所述的抗氧化剂是维生素C或维生素P。
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