CN105969653A - 一种蛹虫草静置发酵的生物反应器及其发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草静置发酵的生物反应器它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器，广口玻璃容器底部设有倒置的不锈钢筛网，广口玻璃容器底部、不锈钢筛网内部设有磁力搅拌子，不锈钢筛网上设置一层无菌琼脂凝胶层，广口玻璃容器顶部包裹纱布。本发明还公开了利用上述生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法。本方法克服了现有蛹虫草静置发酵对培养基高度的限制，增大了实际发酵体积，使工业化大规模蛹虫草静置发酵生产虫草素得以实现，大大提高了虫草素的产能。因此，本发明方法具有很高的实际应用价值。

Description

一种蛹虫草静置发酵的生物反应器及其发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种蛹虫草静置发酵的生物反应器及其发酵方法。
背景技术
虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。
现有的文献报道重复间歇表面液体发酵蛹虫草制备虫草素能达到15-17g/L，是发酵法制备虫草素的最优方法。但是该静置发酵方法由于传质速率较慢而培养基高度较小，大大限制了实际培养体积和发酵规模。但是目前还没有增强静置发酵传质速率的生物反应器和相应发酵方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种蛹虫草静置发酵的新型生物反应器。
本发明还要解决的技术问题是提供利用上述蛹虫草静置发酵的新型生物反应器进行发酵生产虫草素的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种蛹虫草静置发酵的生物反应器，它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器，广口玻璃容器底部设有倒置的不锈钢筛网，广口玻璃容器底部、不锈钢筛网内部设有磁力搅拌子，不锈钢筛网上设置一层无菌琼脂凝胶层，广口玻璃容器顶部包裹纱布。
其中，倒置的不锈钢筛网的顶部平面具有网孔；所述的琼脂凝胶层要完全覆盖住倒置的不锈钢筛网的顶部平面。
其中，所述的纱布为6层。
其中，所述的广口玻璃容器为100-1000mL玻璃烧杯，优选500mL玻璃烧杯。
磁力搅拌子的长度由广口玻璃容器的大小决定。当所述的广口玻璃容器为100mL时，配套使用Φ8mm×30mm聚四氟磁力搅拌子；当所述的广口玻璃容器为500mL时，配套使用Φ8mm×50mm聚四氟磁力搅拌子；当所述的广口玻璃容器为1000mL时，配套使用Φ9mm×70mm聚四氟磁力搅拌子。
不锈钢筛网的直径和高度由广口玻璃容器的大小决定。当所述的广口玻璃容器为100mL时，配套使用直径5cm、高度3cm、网孔10目的不锈钢筛网；当所述的广口玻璃容器为500mL时，配套使用直径8cm、高度4cm、网孔10目的不锈钢筛网；当所述的广口玻璃容器为1000mL时，配套使用倒置2层的直径12cm、高度5cm、网孔10目的不锈钢筛网。
其中，所述的无菌琼脂凝胶层由含有2-20g/L的腺嘌呤的15-40g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入Φ6-12cm无菌培养皿中冷却制得；优选由含有10g/L的腺嘌呤的20g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入Φ9cm无菌培养皿中冷却制得。
利用上述生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法，它包括如下步骤：
1)广口玻璃容器中，加入磁力搅拌子，并倒置不锈钢筛网，将发酵培养基倒入广口玻璃容器中使得液面高出不锈钢筛网1-3cm(优选2cm)，体系灭菌；
2)将蛹虫草从保藏斜面上刮入发酵培养基中22-30℃ 180-300转/分震荡培养3-5d得到种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以5-20％v/v(优选10％v/v)的接种量接入步骤1)所述的发酵培养基中，覆上无菌琼脂凝胶层，以完全盖住不锈钢筛网的顶部平面，广口玻璃容器顶部用无菌纱布封口；
4)将步骤3)的广口玻璃容器置于磁力搅拌恒温水浴锅中搅拌培养，搅拌转速60-120转/分，温度设置为25-27℃，培养21-34d。
步骤2)中，所述的蛹虫草为Cordyceps militaris CICC 14014。
步骤2)中，优选将蛹虫草从保藏斜面上刮入发酵培养基中27℃ 250转/分震荡培养4d。
步骤1)或2)中，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖30-50g/L，酵母膏6-12g/L，蛋白胨10-30g/L，磷酸二氢钾0.3-1.0g/L，磷酸氢二钾0.3-1.0g/L，硫酸镁0.3-2.0g/L，溶剂为水，用盐酸调pH值至5.0-7.0。优选的发酵培养基配方为：葡萄糖42g/L，酵母膏9g/L，蛋白胨17g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，用盐酸调pH值至5.8。
步骤4)中，优选的培养条件是，搅拌转速100转/分，温度设置为27℃，培养21d。
有益效果：本发明相对于现有技术具有如下优势：
1)重复间歇液体表面发酵是一种静置发酵，也是蛹虫草发酵生产虫草素的最佳方法，产物浓度高。但是随着大规模虫草素生产的需要，静置发酵中传质速率慢成为了该方法工业化生产的最大的瓶颈；而且因为菌体在液体培养基表面生长的原因，发酵液体培养基高仅为1-2cm。当发酵液体培养基高度大于2cm以上时，产物浓度急剧下降。而本技术可以很好地解决这个问题，用搅拌子在底部搅拌时，发酵培养基流动起来，加速了琼脂凝胶上下的传质，另外又不会影响菌体在液体表面的生长。因此，使用本发明所述方法能够大大增加蛹虫草的发酵体积，增大发酵规模同时获得与重复间歇液体表面发酵相同的产物浓度。
2)采用腺嘌呤固定化技术将腺嘌呤包埋在琼脂凝胶中，防止腺嘌呤与虫草素固体混合。当虫草素大量合成时，虫草素浓度超过15g/L即析出形成沉淀，这样会与未反应的腺嘌呤一同以固体形式存在于发酵液中，影响后续分离。当腺嘌呤被固定化在琼脂凝胶中时，腺嘌呤固体不会存在于发酵液中，降低了后续虫草素纯化的难度。
附图说明
图1是实施例1中蛹虫草静置发酵的生物反应器的结构示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。
实施例1：一种蛹虫草静置发酵的新型生物反应器。
如图1所示，一种蛹虫草静置发酵的生物反应器，它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器1，广口玻璃容器1底部设有倒置的不锈钢筛网2，倒置的不锈钢筛网2的顶部平面具有网孔6，广口玻璃容器1底部、不锈钢筛网2内部设有磁力搅拌子3，不锈钢筛网2上设置一层无菌琼脂凝胶层4，所述的琼脂凝胶层4要完全覆盖住倒置的不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部包裹6层纱布5。
其中，所述的广口玻璃容器1为500mL玻璃烧杯，配套使用Φ8mm×50mm聚四氟磁力搅拌子和直径8cm、高度4cm、网孔10目的不锈钢筛网。
其中，所述的琼脂凝胶层由含有10g/L的腺嘌呤的20g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入Φ9cm无菌培养皿中冷却制得。
实施例2：一种蛹虫草静置发酵的新型生物反应器。
如图1所示，一种蛹虫草静置发酵的生物反应器，它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器1，广口玻璃容器1底部设有倒置的不锈钢筛网2，倒置的不锈钢筛网2的顶部平面具有网孔6，广口玻璃容器1底部、不锈钢筛网2内部设有磁力搅拌子3，不锈钢筛网2上设置一层无菌琼脂凝胶层4，所述的琼脂凝胶层4要完全覆盖住倒置的不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部包裹6层纱布5。
其中，所述的广口玻璃容器1为100mL玻璃烧杯，配套使用Φ8mm×30mm聚四氟磁力搅拌子和直径5cm、高度3cm、网孔10目的不锈钢筛网。
其中，所述的琼脂凝胶层由含有2g/L的腺嘌呤的15g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入Φ6cm无菌培养皿中冷却制得。
实施例3：一种蛹虫草静置发酵的新型生物反应器。
如图1所示，一种蛹虫草静置发酵的生物反应器，它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器1，广口玻璃容器1底部设有倒置的不锈钢筛网2，倒置的不锈钢筛网2的顶部平面具有网孔6，广口玻璃容器1底部、不锈钢筛网2内部设有磁力搅拌子3，不锈钢筛网2上设置一层无菌琼脂凝胶层4，所述的琼脂凝胶层4要完全覆盖住 倒置的不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部包裹6层纱布5。
其中，所述的广口玻璃容器1为1000mL玻璃烧杯，配套使用Φ9mm×70mm聚四氟磁力搅拌子和倒置2层的直径12cm、高度5cm、网孔10目的不锈钢筛网。
其中，所述的琼脂凝胶层由含有20g/L的腺嘌呤的40g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入Φ12cm无菌培养皿中冷却制得。
实施例4：
利用实施例1的生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法，它包括如下步骤：
1)广口玻璃容器1中，加入磁力搅拌子3，并倒置不锈钢筛网2，将发酵培养基倒入广口玻璃容器1中使得液面7高出不锈钢筛网22cm，体系灭菌；
2)将蛹虫草Cordyceps militaris CICC 14014从保藏斜面上刮入发酵培养基中27℃250转/分震荡培养4d得到种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以10％v/v的接种量接入步骤1)所述的发酵培养基中，覆上无菌琼脂凝胶层4，以完全盖住不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部用无菌纱布封口；
4)将步骤3)的广口玻璃容器1置于磁力搅拌恒温水浴锅中搅拌培养，搅拌转速100转/分，温度设置为27℃，培养21d。将发酵液收集，过滤，用量筒测定发酵液体积，用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素的含量，结果见表1。
步骤1)或2)中，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖42g/L，酵母膏9g/L，蛋白胨17g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，用盐酸调pH值至5.8。
实施例5：
利用实施例2的生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法，它包括如下步骤：
1)广口玻璃容器1中，加入磁力搅拌子3，并倒置不锈钢筛网2，将发酵培养基倒入广口玻璃容器1中使得液面7高出不锈钢筛网21cm，体系灭菌；
2)将蛹虫草Cordyceps militaris CICC 14014从保藏斜面上刮入发酵培养基中22℃300转/分震荡培养5d得到种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以5％v/v的接种量接入步骤1)所述的发酵培养基中， 覆上无菌琼脂凝胶层4，以完全盖住不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部用无菌纱布封口；
4)将步骤3)的广口玻璃容器1置于磁力搅拌恒温水浴锅中搅拌培养，搅拌转速60转/分，温度设置为25℃，培养34d。将发酵液收集，过滤，用量筒测定发酵液体积，用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素的含量，结果见表1。
步骤1)或2)中，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，溶剂为水，用盐酸调pH至5.0。
实施例6：
利用实施例3的生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法，它包括如下步骤：
1)广口玻璃容器1中，加入磁力搅拌子3，并倒置不锈钢筛网2，将发酵培养基倒入广口玻璃容器1中使得液面7高出不锈钢筛网23cm，体系灭菌；
2)将蛹虫草Cordyceps militaris CICC 14014从保藏斜面上刮入发酵培养基中30℃180转/分震荡培养3d得到种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以20％v/v的接种量接入步骤1)所述的发酵培养基中，覆上无菌琼脂凝胶层4，以完全盖住不锈钢筛网2的顶部平面，广口玻璃容器1顶部用无菌纱布封口；
4)将步骤3)的广口玻璃容器1置于磁力搅拌恒温水浴锅中搅拌培养，搅拌转速120转/分，温度设置为27℃，培养21d。将发酵液收集，过滤，用量筒测定发酵液体积，用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素的含量，结果见表1。
步骤1)或2)中，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖50g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁2.0g/L，溶剂为水，用盐酸调pH至7.0。
表1发酵液体积及发酵液中的虫草素浓度：
发酵液体积(mL) 发酵液中虫草素浓度(g/L)
实施例4 350 21.7
实施例5 70 18.1
实施例6 900 19.2

Claims (10)

1.一种蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，它包括设置于磁力搅拌恒温水浴锅内的广口玻璃容器(1)，广口玻璃容器(1)底部设有倒置的不锈钢筛网(2)，广口玻璃容器(1)底部、不锈钢筛网(2)内部设有磁力搅拌子(3)，不锈钢筛网(2)上设置一层无菌琼脂凝胶层(4)，广口玻璃容器(1)顶部包裹纱布(5)。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，倒置的不锈钢筛网(2)的顶部平面具有网孔(6)；所述的琼脂凝胶层(4)要完全覆盖住倒置的不锈钢筛网(2)的顶部平面。
3.根据权利要求1所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，所述的纱布(5)为6层。
4.根据权利要求1所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，所述的广口玻璃容器(1)为100-1000mL玻璃烧杯。
5.根据权利要求4所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，当所述的广口玻璃容器(1)为100mL时，配套使用Φ8mm×30mm聚四氟磁力搅拌子；当所述的广口玻璃容器(1)为500mL时，配套使用Φ8mm×50mm聚四氟磁力搅拌子；当所述的广口玻璃容器(1)为1000mL时，配套使用Φ9mm×70mm聚四氟磁力搅拌子。
6.根据权利要求4所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，当所述的广口玻璃容器(1)为100mL时，配套使用直径5cm、高度3cm、网孔10目的不锈钢筛网；当所述的广口玻璃容器(1)为500mL时，配套使用直径8cm、高度4cm、网孔10目的不锈钢筛网；当所述的广口玻璃容器(1)为1000mL时，配套使用倒置2层的直径12cm、高度5cm、网孔10目的不锈钢筛网。
7.根据权利要求1所述的蛹虫草静置发酵的生物反应器，其特征在于，所述的无菌琼脂凝胶层由含有2-20g/L的腺嘌呤的15-40g/L琼脂粉水溶液经高温蒸汽灭菌后，倒入6-12cm无菌培养皿中冷却制得。
8.利用权利要求1所述的生物反应器进行蛹虫草静置发酵的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)广口玻璃容器(1)中，加入磁力搅拌子(3)，并倒置不锈钢筛网(2)，将发酵培养基倒入广口玻璃容器(1)中使得液面(7)高出不锈钢筛网(2)1-3cm，体系灭菌；
2)将蛹虫草从保藏斜面上刮入发酵培养基中22-30℃180-300转/分震荡培养3-5d得到种子液；
3)将步骤2)制得的种子液以5-20％v/v的接种量接入步骤1)所述的发酵培养基中，覆上无菌琼脂凝胶层(4)，以完全盖住不锈钢筛网(2)的顶部平面，广口玻璃容器(1)顶部用无菌纱布封口；
4)将步骤3)的广口玻璃容器(1)置于磁力搅拌恒温水浴锅中搅拌培养，搅拌转速60-120转/分，温度设置为25-27℃，培养21-34d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的蛹虫草为Cordycepsmilitaris CICC 14014。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)或2)中，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖30-50g/L，酵母膏6-12g/L，蛋白胨10-30g/L，磷酸二氢钾0.3-1.0g/L，磷酸氢二钾0.3-1.0g/L，硫酸镁0.3-2.0g/L，溶剂为水，用盐酸调pH值至5.0-7.0。
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