CN107365713A - 一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法 - Google Patents

一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：(1)制备米曲霉孢子悬浮液；(2)物理化学诱变，得到突变株；(3)酶解制备原生质体；(4)原生质体的纯化；(5)原生质体的再生。本发明制备的原生质体数量较多，获得的原生质体的活力较高，再生率可达到31.2％。原生质体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续融合子的制备，对于米曲霉调控乳糖酶的代谢调控理论研究及提高乳糖酶活力都具有重要意义；同时也为乳糖酶生产的菌种选育提供了新的途径。

Description

一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法
技术领域
本发明涉及真菌的生物学领域，具体涉及一种高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法。
背景技术
乳糖酶，***名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，或简称β-半乳糖苷酶。乳糖酶在食品工业、医药工业、环境保护、分析等方面具有广泛的应用价值。利用乳糖酶水解乳糖的能力，生产低乳糖制品(如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等)，可以有效解决“乳糖不耐症”问题，这是目前乳糖酶在食品工业的最大用途之一。
我国乳制品消费量与国外相比差距很大，导致这一现象的原因除了经济发展水平之外，还有就是中国人群中有很大一部分患有“乳糖不耐症”。据报道，亚洲人口中约有70％的人患有不同程度的“乳糖不耐症”，我国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86.7％，乳糖不耐受指数为0.9，主要表现为消化不良、腹胀、肠鸣、呕吐、急性腹痛或腹泻等。乳糖不耐症的长期危害在儿童易表现为钙吸收不良、腹泻、软骨病、体重低及生长发育迟缓，在老年人尤其是老年妇女易表现为骨质疏松症状。由于“乳糖不耐症”的普遍存在，使相当一部分人无法像正常人一样接受牛奶这一天然、具有良好营养平衡性的食品，这成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一。一般水解70％～80％乳糖即可解决“乳糖不耐症”的问题，而水解乳糖的最好方法就是酶解法，用乳糖酶水解牛奶或乳制品中的乳糖，生产低乳糖制品可以有效地消除人体对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业，提高人们的健康水平具有十分重要的意义，这也是目前乳糖酶在食品工业的最大用途之一。
国内外对乳糖酶的研究起步较晚，于20世纪80年代以后才开始对乳糖酶进行研究。到目前为止，已经报道了一些乳糖酶产生菌株，并对酶的分离纯化及酶学性质、诱变育种及产酶优化、酶的固定化及工业化应用等方面进行了一定的研究。由于乳糖酶主要用于人体、健康有关的食品和医药工业等方面，所以生产上使用的菌株必须是无毒的安全菌株，即必须具有GRAS资格，因此黑曲霉、米曲霉、乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母普遍作为工业化生产的酶源。米曲霉乳糖酶蛋白分子量大多在100kD～130kD之间，且都是胞外酶，不需酵母乳糖酶的破壁工艺，纯化工艺简单，最适作用pH为4.5～5.0，且具有较高的热稳定性，常被用于加工处理牛奶、乳清及生产低聚半乳糖。尽管米曲霉乳糖酶在处理乳制品中的作用十分显著，但目前该酶并未在市场上大规模使用，主要的原因是乳糖酶的单位产量较低。
针对以上问题，为了提高乳糖酶的酶活，国内外研究者从多方面进行了大量的探索：(1)从工业发酵方面，主要是培养基优化，诱导因子的添加以及发酵条件和提取工艺的优化；(2)通过诱变育种筛选高产菌株；(3)固定化乳糖酶，使其连续使用；(4)通过基因工程技术并利用酿酒酵母和丝状真菌表达***来表达曲霉和酵母来源的乳糖酶基因。虽然取得了一定的进展，但表达量依然有限。基因组改组技术为这一问题的解决提供了新的思路。
基因组改组的基本原理是在实验室条件下模拟自然界进化的机制，通过对具有一定多样性的基因库在体外进行重组来获得不同的嵌合基因，并从中定向筛选出具有预期性状的突变体。这种方法易被广泛应用于酶的改性、蛋白的改良、疫苗的优化等方面。基因组改组的方法是首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变侯选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株。这种技术在蛋白质、酶和单克隆抗体等的定向进化方面得到了广泛的应用，并极大地促进了生物催化工程的发展。由于酶在生物反应途径中的特殊重要性，因此通过定向进化方法改进酶的特性、甚至创造出新酶成为对代谢途径进行改造的一种非常有用的策略。
与传统的诱变法相比，利用基因组改组技术还可以较快较高效的获得性状优良的重组体，同时剔除负突变，这在很大程度上弥补了传统诱变法的不足。通过基因组改组可以提高微生物代谢产量或改善质量，进行高产菌株的选育。基因组改组技术包括原生质体诱变、制备、再生、融合、转化等内容，在进行原生质体融合之前，可以利用诱变得到原始出发菌株的诱变体，将带有正性突变的菌株作为第一轮融合的出发菌株，然后在经过多轮的递推式融合，从而使具有不同正向突变的不同基因重组体到同一个细胞中。而原生质体的制备和再生是进行融合的前提条件和关键技术，因此米曲霉原生质体的制备与再生技术具有重要的理论与实用价值。专利CN 103756917 B提供了一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，为后续菌体改造、提高其抗癌活力并研究其抗癌机制提供了依据。专利CN 102061266B发明了一种用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法，制备数高，再生率较高，而且制备的原生质体完全满足原生质体融合的要求，为进一步的采用原生质体融合技术提高米根霉发酵生产L-乳酸的发酵强度提供了基础。因此，为了进一步提高米曲霉产乳糖酶的能力，也为下一步探讨米曲霉合成乳糖酶的调控机理提供基础，本发明从基因组改组出发构建高产乳糖酶的米曲霉的原生质体。
发明内容
为了使用基因组改组技术选育高产乳糖酶的米曲霉菌株，本发明的目的是提供一种高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的一种高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化培养：
将冻干保存的米曲霉菌株(BNCC338380)用无菌生理盐水充分溶解成菌悬液，将此菌悬液接种于察氏琼脂培养基斜面进行活化，28℃培养5～6天，待长满黄绿色孢子后再连续扩培一次。
所述扩培时所用的培养基为察氏培养基。
(2)制备单孢子悬浮液
将察氏培养基上长满的黄绿色孢子用无菌生理盐水洗脱孢子后，倒入装有玻璃珠的250mL无菌锥形瓶中，充分摇动锥形瓶，在玻璃珠的作用下，将瓶内的孢子打散，用无菌脱脂棉过滤孢子悬浮液，得到除去菌丝的孢子悬液，用无菌水将其稀释成106个/ml。
(3)紫外及氯化锂复合诱变得到突变菌株
取5mL步骤(2)所得的菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入2mL 1.5～5％LiCl溶液混匀后开盖进行紫外灯照射，30cm、30W紫外灯照射8～16min，黑暗处理后适当稀释凃板，在30℃恒温培养箱中黑暗培养4～6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。
(4)突变株的初筛
将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3d～6d。向初筛小管中喷洒浓度为10％Na2CO3溶液，等待片刻，从中找出颜色较黄小管的菌株，按照次序转接到斜面培养基上，在温度为30℃的培养箱中培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
所述的初筛培养基为：乳糖1g，(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 1.5g，琼脂2g，称取2g麸皮，加入100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1％的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用。
(5)突变株的复筛
将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液200r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min的高速冷冻离心机中离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株。
所述的固态发酵培养基为：乳糖10g，(NH4)2SO4 10g，KH2PO4 15g，蒸馏水1000mL配置成溶液，调整pH4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌20min。
(6)突变株菌丝体的培养与预处理
将米曲霉突变株的成熟孢子用无菌生理盐水从斜面上洗脱下来，转接入PDA液体培养基中，于28℃温箱中静置培养10～36h，然后4000r/min离心10min收集菌丝体，并用0.6mol/L的氯化钠渗透压稳定剂洗涤。
所述的米曲霉突变株的成熟孢子是将通过初筛、复筛得到的米曲霉突变菌株挑取菌丝一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面，在温度28℃恒温培养6d所得。
(7)原生质体的制备
取0.3mg菌丝体，加入1mL浓度为1％的混合酶液，在温度20～40℃下轻微振荡酶解1.5～6h；加入0.6～0.8mol/L氯化钠渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解液，观察原生质体制备情况，用血细胞计数板计算原生质体数，计算制备率。
所述的复合酶解液为1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶。
(8)原生质体的纯化
酶解完毕后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，滤液3000r/min低温离心10min，除去上清液，用0.6mol/L氯化钠渗透压稳定剂洗涤后悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体悬浮液。
(9)原生质体的再生
使用渗透压稳定剂将原生质体的浓度稀释到105个/mL,然后吸取0.2mL原生质体涂布于再生固体培养基上，28℃恒温培养2～3d，即可见再生菌落。
所述的再生固体培养基为以0.6mol/L氯化钠配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。
本发明所述高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备方法所得的原生质体制备数高，再生率高，是米曲霉原生质体制备与再生的可靠方法，并为高产乳糖酶的米曲霉原生质体制备与再生提供技术参考。利用本发明制备的原生质体完全满足原生质体融合的条件，为进一步利用基因组改组技术提高米曲霉发酵生产乳糖酶的表达量提供了基础，也为进一步研究米曲霉生产乳糖酶的调控机制提供了前期基础。
具体实施方式
以下通过具体实施对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化培养：
将冻干保存的米曲霉菌株(BNCC338380)用无菌生理盐水充分溶解成菌悬液，将此菌悬液接种于察氏琼脂培养基斜面进行活化，28℃培养6天，待长满黄绿色孢子后备用，连续扩培一次。
所述扩培时所用的培养基为察氏培养基。
(2)制备单孢子悬浮液
将察氏培养基上长满的黄绿色孢子用无菌生理盐水洗脱孢子后，倒入装有玻璃珠的250ml无菌锥形瓶中，充分摇动锥形瓶，在玻璃珠的作用下，将瓶内的孢子打散，用无菌脱脂棉过滤孢子悬浮液，得到除去菌丝的孢子悬液，用无菌水将其进行稀释成3.5×106个/ml。
(3)紫外及氯化锂复合诱变得到突变菌株
取5mL步骤(2)所得的菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入2mL 1.5％LiCl溶液混匀后开盖进行紫外灯照射，30cm、30W紫外灯照射10min，黑暗处理后适当稀释凃板，在30℃恒温培养箱中黑暗培养4～6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。
(4)突变株的初筛
将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3～6d。向初筛小管中喷洒浓度为10％Na2CO3溶液，等待片刻，从中找出颜色较黄小管的菌株，按照次序转接到斜面培养基上，在温度为30℃的培养箱中培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
所述的初筛培养基为：乳糖1g，(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 1.5g，琼脂2g，称取2g麸皮，加入100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1％的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用。
(5)突变株的复筛
将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液200r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min的高速冷冻离心机中离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株。
所述的固态发酵培养基为：乳糖10g，(NH4)2SO4 10g，KH2PO4 15g，蒸馏水1000mL配置成溶液，调整pH4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌20min。
(6)突变株菌丝体的培养与预处理
将米曲霉突变株的成熟孢子用无菌生理盐水从斜面上洗脱下来，转接入PDA液体培养基中，于28℃温箱中静置培养10h，然后4000r/min离心10min收集菌丝体，并用0.6mol/L的氯化钠渗透压稳定剂洗涤。
所述的米曲霉突变株的成熟孢子是将通过初筛、复筛得到的米曲霉突变菌株挑取菌丝一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面，在温度28℃恒温培养6d所得。
(7)原生质体的制备
取0.3mg菌丝体，加入1mL浓度为1％的混合酶液，在温度30℃下轻微振荡酶解2.5h；加入0.6mol/L氯化钠渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解液，观察原生质体制备情况，用血细胞计数板计算原生质体数，计算制备率。
所述的复合酶解液为1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶。
(8)原生质体的纯化
酶解完毕后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，滤液3000r/min低温离心10min，除去上清液，用0.6moL/L氯化钠渗透压稳定剂洗涤后悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体悬浮液。
(9)原生质体的再生
使用渗透压稳定剂将原生质体的浓度稀释到1.5×105个/mL,然后吸取0.2mL原生质体涂布于再生固体培养基上，28℃恒温培养2d，即可见再生菌落。
所述的再生固体培养基为以0.6moL/L氯化钠配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。
实施例2：一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化培养：
将冻干保存的米曲霉菌株(BNCC338380)用无菌生理盐水充分溶解成菌悬液，将此菌悬液接种于察氏琼脂培养基斜面进行活化，28℃培养5天，待长满黄绿色孢子后备用，连续扩培一次。
所述扩培时所用的培养基为察氏培养基。
(2)制备单孢子悬浮液
将察氏培养基上长满的黄绿色孢子用无菌生理盐水洗脱孢子后，倒入装有玻璃珠的250ml无菌锥形瓶中，充分摇动锥形瓶，在玻璃珠的作用下，将瓶内的孢子打散，用无菌脱脂棉过滤孢子悬浮液，得到除去菌丝的孢子悬液，用无菌水将其进行稀释成2.3×106个/ml。
(3)紫外及氯化锂复合诱变得到突变菌株
取5mL步骤(2)所得的菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入2mL 2％LiCl溶液混匀后开盖进行紫外灯照射，30cm、30W紫外灯照射12min，黑暗处理后适当稀释凃板，在30℃恒温培养箱中黑暗培养4-6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。
(4)突变株的初筛
将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3～6d。向初筛小管中喷洒浓度为10％Na2CO3溶液，等待片刻，从中找出颜色较黄小管的菌株，按照次序转接到斜面培养基上，在温度为30℃的培养箱中培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
所述的初筛培养基为：乳糖1g，(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 1.5g，琼脂2g，称取2g麸皮，加入100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1％的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用。
(5)突变株的复筛
将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液200r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min的高速冷冻离心机中离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株。
所述的固态发酵培养基为：乳糖10g，(NH4)2SO4 10g，KH2PO4 15g，蒸馏水1000mL配置成溶液，调整pH4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌20min。
(6)突变株菌丝体的培养与预处理
将米曲霉突变株的成熟孢子用无菌生理盐水从斜面上洗脱下来，转接入PDA液体培养基中，于28℃温箱中静置培养12h，然后4000r/min离心10min收集菌丝体，并用0.6moL/L的氯化钠渗透压稳定剂洗涤。
所述的米曲霉突变株的成熟孢子是将通过初筛、复筛得到的米曲霉突变菌株挑取菌丝一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面，在温度28℃恒温培养6d所得。
(7)原生质体的制备
取0.3mg菌丝体，加入1mL浓度为1％的混合酶液，在温度35℃下轻微振荡酶解2h；加入0.7moL/L氯化钠渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解液，观察原生质体制备情况，用血细胞计数板计算原生质体数，计算制备率。
所述的复合酶解液为1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶。
(8)原生质体的纯化
酶解完毕后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，滤液3000r/min低温离心10min，除去上清液，用0.6moL/L氯化钠渗透压稳定剂洗涤后悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体悬浮液。
(9)原生质体的再生
使用渗透压稳定剂将原生质体的浓度稀释到2.5×105个/mL,然后吸取0.2mL原生质体涂布于再生固体培养基上，28℃恒温培养3d，即可见再生菌落。
所述的再生固体培养基为以0.6moL/L氯化钠配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。
实施例3：一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化培养：
将冻干保存的米曲霉菌株(BNCC338380)用无菌生理盐水充分溶解成菌悬液，将此菌悬液接种于察氏琼脂培养基斜面进行活化，28℃培养5天，待长满黄绿色孢子后备用，连续扩培一次。
所述扩培时所用的培养基为察氏培养基。
(2)制备单孢子悬浮液
将察氏培养基上长满的黄绿色孢子用无菌生理盐水洗脱孢子后，倒入装有玻璃珠的250ml无菌锥形瓶中，充分摇动锥形瓶，在玻璃珠的作用下，将瓶内的孢子打散，用无菌脱脂棉过滤孢子悬浮液，得到除去菌丝的孢子悬液，用无菌水将其进行稀释成2.3×106个/ml。
(3)紫外及氯化锂复合诱变得到突变菌株
取5mL步骤(2)所得的菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入2mL 2.5％LiCl溶液混匀后开盖进行紫外灯照射，30cm、30W紫外灯照射14min，黑暗处理后适当稀释凃板，在30℃恒温培养箱中黑暗培养4～6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。
(4)突变株的初筛
将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3～6d。向初筛小管中喷洒浓度为10％Na2CO3溶液，等待片刻，从中找出颜色较黄小管的菌株，按照次序转接到斜面培养基上，在温度为30℃的培养箱中培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
所述的初筛培养基为：乳糖1g，(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 1.5g，琼脂2g，称取2g麸皮，加入100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1％的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用。
(5)突变株的复筛
将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液200r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min的高速冷冻离心机中离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株。
所述的固态发酵培养基为：乳糖10g，(NH4)2SO4 10g，KH2PO4 15g，蒸馏水1000mL配置成溶液，调整pH4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌20min。
(6)突变株菌丝体的培养与预处理
将米曲霉突变株的成熟孢子用无菌生理盐水从斜面上洗脱下来，转接入PDA液体培养基中，于28℃温箱中静置培养14h，然后4000r/min离心10min收集菌丝体，并用0.6moL/L的氯化钠渗透压稳定剂洗涤。
所述的米曲霉突变株的成熟孢子是将通过初筛、复筛得到的米曲霉突变菌株挑取菌丝一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面，在温度28℃恒温培养6d所得。
(7)原生质体的制备
取0.3mg菌丝体，加入1mL浓度为1％的混合酶液，在温度25℃下轻微振荡酶解2.5h；加入0.8mol/L氯化钠渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解液，观察原生质体制备情况，用血细胞计数板计算原生质体数，计算制备率。
所述的复合酶解液为1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶。
(8)原生质体的纯化
酶解完毕后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，滤液3000r/min低温离心10min，除去上清液，用0.6moL/L氯化钠渗透压稳定剂洗涤后悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体悬浮液。
(9)原生质体的再生
使用渗透压稳定剂将原生质体的浓度稀释到2.5×105个/mL,然后吸取0.2mL原生质体涂布于再生固体培养基上，28℃恒温培养3d，即可见再生菌落。
所述的再生固体培养基为以0.6moL/L氯化钠配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。

Claims (7)

1.一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
(1)菌种的活化培养：
将冻干保存的米曲霉菌株(BNCC338380)用无菌生理盐水充分溶解成菌悬液，将此菌悬液接种于察氏琼脂培养基斜面进行活化，28℃培养5～6天，待长满黄绿色孢子后再连续扩培一次。
(2)制备单孢子悬浮液
将察氏培养基上长满的黄绿色孢子用无菌生理盐水洗脱孢子后，倒入装有玻璃珠的250mL无菌锥形瓶中，充分摇动锥形瓶，在玻璃珠的作用下，将瓶内的孢子打散，用无菌脱脂棉过滤孢子悬浮液，得到除去菌丝的孢子悬液，用无菌水将其稀释成106个/mL。
(3)紫外及氯化锂复合诱变得到突变菌株
取5mL步骤(2)所得的菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入2mL 1.5～5％LiCl溶液混匀后开盖进行紫外灯照射，30cm、30W紫外灯照射8～16min，黑暗处理后适当稀释凃板，在30℃恒温培养箱中黑暗培养4～6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。
(4)突变株的初筛
将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3～6d。向初筛小管中喷洒浓度为10％Na2CO3溶液，等待片刻，从中找出颜色较黄小管的菌株，按照次序转接到斜面培养基上，在温度为30℃的培养箱中培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
(5)突变株的复筛
将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液200r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min的高速冷冻离心机中离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株。
(6)突变株菌丝体的培养与预处理
将米曲霉突变株的成熟孢子用无菌生理盐水从斜面上洗脱下来，转接入PDA液体培养基中，于28℃温箱中静置培养10～36h，然后4000r/min离心10min收集菌丝体，并用0.6moL/L的氯化钠渗透压稳定剂洗涤。
(7)原生质体的制备
取0.3mg菌丝体，加入1mL浓度为1％的混合酶液，在温度20～40℃下轻微振荡酶解1.5～6h；加入0.6～0.8moL/L氯化钠渗透压稳定剂终止酶解反应，得酶解液，观察原生质体制备情况，用血细胞计数板计算原生质体数，计算制备率。
(8)原生质体的纯化
酶解完毕后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，滤液3000r/min低温离心10min，除去上清液，用0.6moL/L氯化钠渗透压稳定剂洗涤后悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体悬浮液。
(9)原生质体的再生
使用渗透压稳定剂将原生质体的浓度稀释到105个/mL,然后吸取0.2mL原生质体涂布于再生固体培养基上，28℃恒温培养2～3d，即可见再生菌落。
2.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(1)所述的扩培时所用的培养基为察氏培养基。
3.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(4)所述的初筛培养基为：乳糖1g，(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 1.5g，琼脂2g，称取2g麸皮，加入100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1％的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用。
4.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(5)所述的固态发酵培养基为：乳糖10g，(NH4)2SO4 10g，KH2PO4 15g，蒸馏水1000mL配置成溶液，调整pH4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(6)所述的米曲霉突变株的成熟孢子是通过将初筛、复筛得到的米曲霉突变菌株挑取菌丝一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成的固体斜面，在温度28℃恒温培养6d所得。
6.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(7)所述的复合酶解液为1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶。
7.根据权利要求1所述的一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法，其特征在于，步骤(9)所述的再生固体培养基为以0.6mol/L氯化钠配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯化钠35.1g/L。
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