CN104130946B - 一种李氏木霉菌株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及通过原生质体融合技术构建高产纤维素酶的菌株，以及李氏木霉原生质体制备、分离、融合、再生及其筛选方法。本发明以三种李氏木霉为出发菌株，经PDA培养基活化、培养后，利用蜗牛酶、溶壁酶等水解细胞壁，在恒温下振荡，制备原生质体，经原生质体融合后，利用含纤维素的平板进行筛选，最后，得到一株纤维素酶高产菌株(Trichoderma reesei JL16)，该菌产纤维素酶的能力比出发菌株提高了25％。本发明李氏木霉菌株JL16可以用于工业生产；针对李氏木霉提出的原生质体制备、分离、融合、再生及其筛选方法具有很强的应用前景。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及通过原生质体融合技术构建的高产纤维素酶的李氏木霉菌株，以及李氏木霉的制备方法。
技术背景
用于生产的纤维素酶一般来自于霉菌，比较典型的是木霉属。而李氏木霉则是木霉属中最为重要的一种，并在纤维素降解领域得到广泛应用。从分离得到第一株李氏木霉到现在，李氏木霉经历了多轮诱变、筛选，得到了包括MCG-77，QM9414，RUTC-30等众多高产菌株。
工业生产上，一般使用真菌等生产纤维素酶，其中最著名的是李氏木霉，李氏木霉具有纤维素酶酶谱全、活力高的特点。自20世纪60年代以来，人们以野生菌株T.reeseiQM6a为出发菌株，进行了大量的诱变育种工作，其中QM9414、RutC30和MCG77等能够大量表达内切和外切葡聚糖酶，是国内外纤维素酶生产的主要菌种。
通过使用原生质体融合的方法能够得到高产纤维素酶的李氏木霉菌株。原生质体融合指通过人为的方法，把常规诱变所获得的优良性状菌株，通过原生质体融合集中到一个菌株中。目前，通过原生质体融合技术获得优良菌株的主要专利包括CN201210301323.5、CN201010210226.6、CN201010174196.8、CN200880132218.5等，这些原生质体融合主要采用“双亲灭活法”，操作方法仍需进一步简化，诱变率还需进一步提高。本发明选择三株纤维素酶高产菌株进行融合，从而提高纤维素酶系的整体活力。
发明内容
本发明目的之一是通过多株李氏木霉的原生质体融合，得到一株纤维素酶高产菌株。
本发明目的之二是建立李氏木霉诱变及筛选方法。
原生质体融合在本质上是基因组水平的随机重组，它的一般步骤是，通过经典的诱变育种方法得到多个正突变菌株，也就是多样性的的基因组库，然后，将这些突变菌株制备成原生质体，通过原生质体融合，进行全基因组水平的随机重组，筛选得到高产菌株。
本发明对QM9414、RutC30和MCG77进行原生质体融合，通过筛选，得到纤维素酶高产菌株。同时，建立了李氏木霉原生质体制备、分离、融合、再生和高产菌株的筛选方法。本发明构建的高产纤维素酶(李氏木霉JL16)，于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8807，分类命名为李氏木霉(Trichoderma reesei)。该菌株纤维素酶产率高，遗传稳定性好。
本发明请求保护的一种李氏木霉菌株，是于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8807的菌株，菌株的名称为李氏木霉JL16。
所述的李氏木霉JL16，是采用三株纤维素酶高产菌株通过原生质体制备、原生质体分离、原生质体融合、原生质体再生和筛选的制备步骤构建；所述的三株纤维素酶高产菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。
本发明的李氏木霉JL16的制备方法的技术方案如下所述。
一种李氏木霉菌株的制备方法，有原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体的再生和筛选的过程；
所述的原生质体的制备，是将李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌丝；将三株李氏木霉孢子悬液接种至种子培养基中，得到含有抱团菌丝体的李氏木霉；将菌丝体用pH6.5的柠檬酸缓冲液定容，离心，弃上清后重新补加柠檬酸缓冲液并混匀；再分别加入到去壁混合酶液中酶解细胞壁，得到含原生质体的溶液；最后经分离得到白色沉淀的李氏木霉原生质体；
所述的原生质体的融合，用融合剂将三种白色沉淀原生质体一起吹溶，室温静置10～60min；所述的融合剂，由按下列重量配比的物质组成：20％～80％聚乙二醇(PEG4000)、0.01～0.05M CaCl2和0.2～1.0M山梨醇；
所述的原生质体的再生，是将融合完的原生质体悬液用NaCl溶液梯度稀释，取稀释液涂在原生质体再生培养基上，28℃见光培养96h，保持相对湿度大于60％，直到长出透明圈；所述的再生培养基，由下列重量配比的物质组成：KH2PO43～5g/L、NaNO3 2.6～3.0g/L、尿素0.5～1.0g/L、FeSO4·7H2O 7.5～10mg/L、MnSO4·H2O 2.5～3.0mg/L、ZnSO4·7H2O3.6～5.0mg/L、CoCl2·6H2O 3.7～5.0mg/L、MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L、CaCl20.5～1.0g/L、脱氧胆酸钠2～5g/L、蛋白胨10～15g/L、NaCl 35～50g/L、琼脂16～20g/L、球磨纤维素20g/L；
所述的筛选，是挑取透明圈直径/菌落直径大的菌株一环至甘油中，得到李氏木霉JL16于-80℃下保存。
在原生质体的制备中，柠檬酸缓冲液由下列重量配比的物质组成：每升中含有0.1M柠檬酸溶液70ml、0.1M柠檬酸钠溶液930ml、NaCl 0.6mol。
在原生质体的制备中，去壁混合酶液由溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶，加入pH6.5柠檬酸缓冲液构成，各成分含量为溶壁酶2～8mg/ml、蜗牛酶2～8mg/ml、纤维素酶2～8mg/ml。
在原生质体的制备中，分离所使用的分离装置是由一支5～50ml的离心管，在距底部1～10cm处塞满脱脂棉，厚度约为1～5cm，底部***枪头，用柠檬酸缓冲液浸湿脱脂棉，在分离装置顶部加入酶解后的菌液，1000～3000rpm离心8～10min，底部液体即为含有原生质体的稳渗液，取出分离装置中的脱脂棉，将分离装置底部液体分装至1～10ml离心管中，3000～8000rpm离心12～15min，去掉上清后底部残留的白色沉淀即为原生质体。
在原生质体的再生中所述的球磨纤维素，是经直径2～4mm的玻璃珠在200rpm下振荡处理48小时得到的纤维素。
本发明提供的李氏木霉原生质体制备、分离及融合的方法，更具体的操作步骤叙述如下：
1.制备三亲本的李氏木霉孢子悬液
分别挑取甘油冻存管中的三株李氏木霉菌株QM9414、MCG77、RutC-30一环，接种在含有50ml马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基制成的固体斜面上，在温度28℃、培养72h，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌丝，加入2ml无菌蒸馏水，用vortex振荡2min，得到含有孢子的孢子液，将该孢子液进行倍比稀释，并在显微镜下计数，使得成熟的李氏木霉孢子浓度在1×106/ml的李氏木霉孢子悬液。
所述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：土豆：200g/L(煮沸30min并过滤)；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L。
2.制备三亲本的菌丝悬液
分别将三株1ml的李氏木霉孢子悬液接种至20ml种子培养基中，控制摇床转速为200rpm，温度28℃，培养72h，用8层纱布过滤掉培养基，得到含有抱团菌丝体的李氏木霉。
将菌丝体导入50ml的离心管中，用pH6.5的柠檬酸缓冲液定容至15ml，5000转4℃离心10min，弃掉上清后重新补加柠檬酸缓冲液至15ml，重复3次，最后，将菌丝体在缓冲液中混匀。
所述pH6.5的柠檬酸缓冲液由下列重量配比的物质组成：每升中含有：0.1M柠檬酸溶液70ml、0.1M柠檬酸钠溶液930ml、NaCl 0.6mol。
3.去壁酶的制作
取三支5ml的EP管，分别加入的溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶，并分别加入pH6.5柠檬酸缓冲液，充分溶解。
用孔径为0.2μm的滤膜分别过滤三种酶液并混合到一起，最终得到的混合酶液，含量为溶壁酶2～8mg/ml、蜗牛酶2～8mg/ml、纤维素酶2～8mg/ml。
4.酶解细胞壁
三株菌各取3ml的菌丝悬液，并分别加入1ml的混合酶液，温度35℃轻微振荡酶解3个小时，每半个小时一镜检观察。
5.三亲本的原生质体的分离及融合
酶解去壁后，取一支5～50ml的离心管，在距底部1～10cm处塞满脱脂棉，厚度约为1～5cm，底部***枪头，构成自制的原生质体分离装置(如图1)。用pH6.5的柠檬酸缓冲液浸湿分离装置中的脱脂棉，在分离装置顶部分别加入酶解去壁后的三种菌液，1000～3000rpm离心8～10min，离心后，用镊子取出脱脂棉，将分离装置底部含有原生质体的柠檬酸缓冲液分装至1～10ml离心管中，3000～8000rpm离心12～15min，去掉上清后底部残留的白色沉淀即为原生质体，立刻加入400μl融合剂将3种菌株的白色沉淀一起吹溶，最终室温静置10～60min，并镜检观察。
所述的融合剂由下列重量配比的物质组成：20％～80％聚乙二醇(PEG4000)；0.01～0.05M CaCl2；0.2～1.0M山梨醇。
本发明又提供了纤维素酶高产菌株的再生、筛选方法，具体操作步骤如下：
1.原生质体的再生
将融合完的原生质体悬液用浓度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀释100倍，取0.1ml稀释液涂在原生质体再生培养基上，28℃见光培养96h，保持相对湿度大于60％，直到长出透明圈为止。
所述的再生培养基由下列重量配比的物质组成：KH2PO4：3～5g/L；NaNO3：2.6～3.0g/L；尿素：0.5～1.0g/L；FeSO4·7H2O：7.5～10mg/L；MnSO4·H2O：2.5～3.0mg/L；ZnSO4·7H2O：3.6～5.0mg/L；CoCl2·6H2O：3.7～5.0mg/L；MgSO4·7H2O：0.5～1.0g/L；CaCl2：0.5～1.0g/L；脱氧胆酸钠：2～5g/L；蛋白胨：10～15g/L；NaCl：35～50g/L；琼脂：16～20g/L；球磨纤维素20g/L(球磨纤维素事先用100g直径3mm左右的玻璃珠200rpm振荡处理48h)。
2.高产纤维素酶的李氏木霉菌株的筛选和检测方法：
挑取透明圈直径/菌落直径大的6株菌落一环至1ml去离子水中，在显微镜下计数，适量稀释至菌浓度为1×106/ml，取1ml加入发酵液中，200rpm 28～32℃培养96～144h,后取1ml的发酵液，8000rpm离心8～10min取上清，测定酶活，发现JL16号菌株的酶活明显高于三株原始菌株高，即JL16号菌株为突变株。
每一个250ml的锥形瓶中含有100ml的发酵液，所述的发酵液由下列重量配比的物质组成：蛋白胨3～5g/L、酵母提取物0.5～1.0g/L、KH2PO43～5g/L、(NH4)2SO42～5g/L、尿素0.3～0.5g/L、MgSO40.3～0.5g/L、CaCO35～10g/L、气爆秸秆30～40g/L，调节pH至5.5。
酶活的测定方法：将1*6cm滤纸条对折卷起放入试管底部，加入1ml柠檬酸缓冲液，注：缓冲液要将滤纸完全浸透，水浴50℃保温，加入适当稀释的酶液，50℃60min反应。加3mlDNS，充分混匀后放入沸水浴中5min，如作标准曲线，则同时加3mlDNS。空白：1.5ml柠檬酸缓冲液，酶空：1.0ml柠檬酸缓冲液+0.5ml酶液，滤纸空白：1.5ml柠檬酸缓冲液+滤纸，绘制葡萄糖标准曲线，计算样品的葡萄糖含量，在样品葡萄糖含量为2mg/ml处找出对应的酶浓度，用0.37/酶浓度即为此纤维素酶的活力。
本发明选择三株纤维素酶高产菌株进行融合，得到纤维素酶高产菌株李氏木霉JL16(Trichoderma reesei JL16)，从而提高纤维素酶系的整体活力，产纤维素酶的能力比出发菌株提高了25％，可以用于工业生产。另外，本发明针对李氏木霉提出的原生质体制备、分离、融合、再生及其筛选方法具有很强的应用前景。
附图说明
图1为原生质体分离装置。提供的原生质体分离装置附图，帮助相关人员实施本发明。
具体实施方式
实施例1：优选条件下的李氏木霉的原生质体制备和融合
1.制备三亲本的李氏木霉孢子悬液
李氏木霉菌QM9414和李氏木霉菌MCG77购买于ATCC(American Type CultureCollection)，李氏木霉菌RutC-30购买于CGMCC(China General MicrobiologicalCulture Collection Center)。分别挑取甘油冻存管中的三株李氏木霉菌株QM9414、MCG77、RutC-30一环，接种在含有50ml马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基制成的固体斜面上，在温度28℃、培养72h，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌丝，加入2ml无菌蒸馏水，用vortex振荡2min，得到含有孢子的孢子液，将该孢子液进行梯度稀释，并在显微镜下计数，使得成熟的李氏木霉孢子浓度在1×106/ml的李氏木霉孢子悬液；
所述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：土豆：200g/L(煮沸30min并过滤)；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L。
2.制备三亲本的菌丝悬液
分别将三株1ml的李氏木霉孢子悬液接种至20ml种子培养基中，控制摇床转速为200rpm，温度28℃培养72h，用8层纱布过滤掉培养基，得到含有抱团菌丝体的李氏木霉。
将菌丝体导入50ml的离心管中，用pH6.5的柠檬酸缓冲液定容至15ml，5000转4℃离心10min，弃掉上清后重新补加柠檬酸缓冲液至15ml，重复3次，最后，后将菌丝体在缓冲液中混匀。
3.去壁酶的制作
取三支5ml的EP管，分别加入144mg的溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶，并分别加入3ml的pH6.5柠檬酸缓冲液，充分溶解。
用孔径为0.2μm的滤膜分别过滤三种酶液，得到约1.5ml左右的三种酶液，各取1ml混合到一起，最终得到3ml的混合酶液，含量为溶壁酶4mg/ml、蜗牛酶4mg/ml、纤维素酶4mg/ml。
4.酶解细胞壁
三株菌各取3ml的菌丝悬液，并分别加入1ml的混合酶液，温度35℃轻微振荡酶解3个小时，每半个小时一镜检观察，最终液体的酶液浓度为溶壁酶4mg/ml、蜗牛酶4mg/ml、纤维素酶4mg/ml。
5.原生质体的分离及融合
酶解去壁后，取三支15ml的离心管，在距底部4cm处塞满脱脂棉，厚度约为1cm，底部***1ml枪头，构成原生质体分离装置。用pH6.5的柠檬酸缓冲液浸湿分离装置中的脱脂棉，在分离装置顶部分别加入酶解后的三种菌液，1000rpm离心10min，离心后，用镊子取出脱脂棉，将分离装置底部液体分装至1ml离心管中，4000rpm离心15min，去掉上清后底部残留的白色沉淀即为原生质体，立刻加入400μl融合剂将3种菌株的白色沉淀一起吹溶，最终室温静置30min，并镜检观察。
所述的融合剂由下列重量配比的物质组成：50％PEG4000；0.01M CaCl2；0.6M山梨醇。
实施例2：优选条件下的纤维素酶高产菌株的筛选方法
1.原生质体的再生
将融合完的原生质体悬液用浓度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀释100倍，取0.1ml稀释液涂在原生质体再生培养基上，28℃见光培养96h,保持相对湿度大于60％，直到长出透明圈为止。
所述的再生培养基由下列重量配比的物质组成：:KH2PO4:3g/L；NaNO3:2.6g/L；尿素:0.5g/L；FeSO4·7H2O:7.5mg/L；MnSO4·H2O:2.5mg/L；ZnSO4·7H2O:3.6mg/L；CoCl2·6H2O:3.7mg/L；MgSO4·7H2O:0.5g/L；CaCl2:0.5g/L；脱氧胆酸钠:2g/L；蛋白胨:10g/L；NaCl:35g/L；琼脂:16g/L；球磨纤维素20g/L(球磨纤维素事先用100g直径3mm左右的玻璃珠200rpm振荡处理48h)。
2.高产纤维素酶李氏木霉菌株的筛选方法
挑取透明圈直径/菌落直径大的6株菌落一环至1ml去离子水中，在显微镜下计数，适量稀释至菌浓度为1×106/ml，取1ml加入发酵液中，200rpm转28℃培养144h,后取1ml的发酵液，8000rpm离心10min取上清，测定酶活，发现JL16号菌株的酶活明显高于三株原始菌株高，纤维素酶酶活提高25％，即JL16号菌株为突变株。
每一个250ml的锥形瓶中含有100ml的发酵液，所述的发酵液由下列重量配比的物质组成：蛋白胨:3g/L；酵母提取物：0.5g/L；KH2PO4:3g/L；(NH4)2SO4:2g/L；尿素:0.3g/L；MgSO4:0.3g/L；CaCO3:5g/L；气爆秸秆：30g/L；调节pH至5.5。
实施例3：李氏木霉的原生质体制备和融合、纤维素酶高产菌株的筛选方法
在优选条件的基础上，在发明内容公开的制备条件范围内，均可以实施本发明，得到李氏木霉JL16的菌株。
实施例4：由实施例1、2制得的李氏木霉JL16菌株与三株原始菌株的β-葡萄糖苷酶酶活及蛋白产量比较
1.发酵液样品的提取
分别挑取斜面生长的高产菌株JL16和三株原始菌株一环至1ml去离子水中，在显微镜下计数，适量稀释至菌浓度为1×106/ml，取1ml加入发酵液中，200rpm转28℃培养144h,后取适量的发酵液，8000rpm离心10min取上清，上清于-20℃冰箱内保存。
每一个250ml的锥形瓶中含有100ml的发酵液，所述的发酵液由下列重量配比的物质组成：蛋白胨:3g/L；酵母提取物:0.5g/L；KH2PO4:3g/L；(NH4)2SO4:2g/L；尿素:0.3g/L；MgSO4:0.3g/L；CaCO3:5g/L；气爆秸秆：30g/L；调节pH至5.5.
2.β-葡萄糖苷酶及蛋白的测定方法
①.β-葡萄糖苷酶酶活的测定：用50mM柠檬酸缓冲液pH4.8适当稀释酶液，取1ml酶液+1ml 15mmol/L纤维二糖，50℃反应30min，再沸水浴5min，迅速冷却，用葡萄糖试剂盒测其葡萄糖含量。通过测定，JL16菌株的β-葡萄糖苷酶酶活提高15％。
②.蛋白含量的测定：配制考马斯亮蓝G-250试剂及1mg/ml的BSA溶液，并配制BSA浓度为0～1mg/ml的BSA标准溶液若干，分别取BSA标准溶液和适当稀释的酶液0.1ml于15ml试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂充分混匀，5分钟后测OD595。通过测定，JL16菌株的蛋白产量提高12％。
Claims (1)
1.一种李氏木霉菌株，其特征在于，是于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8807的菌株，菌株的名称为李氏木霉JL16；所述的李氏木霉菌株JL6，采用三株纤维素酶高产菌株通过原生质体制备、原生质体分离、原生质体融合、原生质体再生和筛选的制备步骤构建；所述的三株纤维素酶高产菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。
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| 通过红曲霉-土曲霉属间原生质体融合提高Monacolin K产量;陈芝 等;《自然科学进展》;20070430;第17卷(第4期);第537页左栏第3-6段 * |
| 里氏木霉40539原生质体制备条件研究;张晓烜 等;《东北农业大学学报》;20110831;第42卷(第8期);第109页左栏第2-7段 * |
| 黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株;王春丽 等;《生物工程学报》;20091225;第25卷(第12期);第1922页-第1923页 * |
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| CN104130946A (zh) | 2014-11-05 |
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