CN105602995B - 一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法。该方法步骤主要包括菌种活化、种子液的培养、液体深层快速发酵和浒苔生物肥的制备四部分。在发酵制备方面运用液体深层发酵技术结合生物反应器等专业发酵设备，实现了发酵过程的实时监控，在有效调控菌体代谢过程的同时提高了目的产物的产量。本发明的发酵制备方法可直接将固体浒苔粉作为主要原料进行发酵，在显著缩短发酵周期的同时，降低了生产成本，符合产业化生产的需求。

Description

一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及浒苔生物肥的微生物发酵生产方法，尤其涉及液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法。
背景技术
液体深层发酵通常是指利用发酵罐等生物反应器对液体培养基及物料进行连续发酵、分批发酵或补料分批发酵等操作，在实时监测发酵过程中生物代谢变化的同时及时调整和把控产物合成，从而有效提高底物利用率及产物转化率。相比于传统的摇瓶发酵，液体深层发酵技术具有生产周期短，产率高，生产过程容易控制，产品质量稳定等特点。因此在微生物发酵规模化制备目的产物方面具有良好的应用前景。
随着海洋资源的开发，海藻加工及其高值化利用逐渐体现出重大的商业价值。海藻生物肥是以海藻提取物或海藻发酵物为核心物质的新型海洋生物制剂。其中含有大量的有机物，维生素，矿物质元素以及海藻自身所特有的海藻多糖、海藻寡糖、海藻酸和多种天然植物生长调节剂，能够对作物生长以及土壤品质的改善起到有益功效。随着不同海藻生物肥产品的相继出现，其快速规模化生产制备方式逐渐成为研究热点。
李国庭等以天然海藻为主要原料，配以少量的氢氧化钾在高压条件下进行碱解以破坏海藻中的植物纤维，从而释放出海藻素、赤霉素等天然植物生长调节物质，通过复配制备海藻生物肥料。虽然操作简单，但该机械法能耗较高且产物转化率较低，不适宜实现产物的规模化制备；王明鹏等在海藻生物肥的研究中提到采用酸、碱及有机溶剂等化学方法处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶可有效提取海藻组织内的活性成分，以用于海藻生物有机肥的制备。但是此类化学方法试剂残留严重，生物安全性差，对环境存在巨大的潜在危害；相比之下，微生物发酵法因其生物安全性良好、产物活性成分含量高以及快速高效专一的特点逐渐成为生产海藻有机肥的主流方式。
浒苔生物资源量巨大，传统的摇瓶发酵工艺繁琐，产率较低，且规模已远远不能满足于实际生产的需要。本发明将液体深层发酵技术运用于浒苔生物肥的制备，并创新性的将固体浒苔粉作为发酵培养基的主要成分，不仅极大的简化了发酵培养基的配置，而且有助于浒苔生物肥的规模化生产，为其后期工业化生产做了良好的技术铺垫。
目前没有关于与本申请相关的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的报道与专利。
发明内容
本发明旨在提供一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，本发明所述发酵方法首先将菌株进行活化，并通过生物反应器实时调控发酵条件，以固体浒苔粉为原料，经液体发酵、固液分离及复配工艺实现浒苔生物肥的规模化制备。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，所述方法包括以下具体步骤：
（1）菌种活化：将菌株接种于活化培养基中进行活化培养，初始pH6.8-7.2，培养温度30-32℃，摇床转速160-200rpm，培养时间36-48h；
（2）种子液的制备：将步骤（1）中菌种活化后的培养基以5-8%接种量接种于种子培养基中进行培养获得种子液，初始pH6.5-7.2，培养温度为28-30℃，摇床转速160-200rpm，培养时间30-36h；
（3）液体深层快速发酵：将步骤（2）中所述种子液以8-10%接种量接种于生物反应器的发酵培养基中进行浒苔生物肥的发酵制备得到发酵液，装液量为生物反应器体积的50-70%，pH6.8-7.5，培养温度24-28℃，搅拌桨转速200-600rpm，通气量0.5-2.5vvm，溶解氧30-70%，培养时间18-24h；
（4）浒苔生物肥的制备：将步骤（3）中的发酵液进行固液分离，将液体部分收集并通过大量元素、微量元素及营养物质的复配制得所述浒苔生物肥。
对上述技术方案的进一步改进：所述菌株为保藏编号为CCTCC NO ：M2012132的交替单胞菌A321。
对上述技术方案的进一步改进：所述活化培养基组成为：以质量百分比计，浒苔多糖0.5-2.0%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，余量为水。
对上述技术方案的进一步改进：所述种子培养基组成为：以质量百分比计，浒苔多糖0.5-2.0%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，余量为水。
对上述技术方案的进一步改进：所述发酵培养基组成为：以质量百分比计，粒径为40-200目的固体浒苔粉1.0-8.0%，有机氮源0.01-0.05%，磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，余量为水。
对上述技术方案的进一步改进：所述浒苔多糖通过热水法浸提或高压灭菌法浸提获得。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中活化培养基的装液量为25mL/100mL。
对上述技术方案的进一步改进所述有机氮源为牛肉膏、酵母膏和蛋白胨中的一种或多种。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中发酵液中的可溶性多糖含量为0.2-1.2%，还原糖含量为0.02-0.3%，蛋白含量为0.1-0.6%，有机质含量为0.5-3.0%，固形物含量为1.0-5.0%，以质量百分比计。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（4）中发酵液通过板框过滤结合低速离心的方法实现固液分离。
本发明提供的方法具有以下特点：
（1）以大型绿潮藻浒苔固体为主要原料，来源广泛，生物资源量巨大；（2）通过液体深层快速发酵技术结合生物反应器，极大的提高了底物利用率及产物转化率；（3）发酵液中含有众多活性多糖、寡糖以及有机质等植物促生长因子，结合配伍工艺制备的浒苔生物肥具有良好的环境友好性及生物安全性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
本发明中所用菌株是在青岛海域的海水中分离的交替单胞菌A321（Alteromonas colwelliana A321)，该交替单胞菌A321于2012年4月23日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO ：M2012132。
所述交替单胞菌A321的形态特征与生理生化特征参见公开号为CN 103451119 A的发明专利申请。
1.菌种活化：将所述交替单胞菌A321菌株接种于活化培养基中进行活化培养，培养基装液量25mL/100mL，初始pH6.8，培养温度30℃，摇床转速180rpm，培养时间48h；
所述活化培养基组成为：浒苔多糖0.5-2.0%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，其余成分为水。本发明所述浒苔多糖通过热水法浸提（沸水提取1-4小时）或高压灭菌法浸提（115℃提取30min）获得。
2.种子液的制备：将步骤1中菌种活化后的培养基以6%接种量接种于种子培养基中进行培养获得种子液，初始pH7.0，培养温度为28℃，摇床转速180rpm，培养时间36h；
所述种子培养基组成为：浒苔多糖0.5-2.0%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，其余成分为水。
种子培养基根据发酵规模的大小具体可分为一级种子培养基和二级种子培养基。
3.液体深层快速发酵：将步骤2中所述种子液以8%接种量接种于生物反应器的发酵培养基中进行浒苔生物肥的发酵制备，装液量为生物反应器体积的50%，pH6.8，培养温度26℃，搅拌桨转速200rpm，通气量1.5vvm，溶解氧60%，培养时间24h；
所述发酵培养基组成为：粒径为40-200目的固体浒苔粉1.0-8.0%，有机氮源0.01-0.05%，磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，其余成分为水。
本发明中液体深层快速发酵为分批发酵，补料分批发酵以及连续发酵方法中的一种或多种。生物反应器为中试、工业化规模发酵罐及其相关微生物发酵工程设备。
4.浒苔生物肥的制备：将步骤3中的发酵液通过板框过滤结合低速离心的方法实现固液分离，将液体部分收集并通过大量元素、微量元素及相关营养物质的复配制备浒苔生物肥。
实施例2
1.菌种活化：将所述交替单胞菌A321菌株接种于活化培养基（配方同实施例1）中进行活化培养，培养基装液量25mL/100mL，初始pH7.0，培养温度32℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；
2.种子液的制备：将步骤1中菌种活化后的培养基以8%接种量接种于种子培养基（配方同实施例1）中进行培养，初始pH6.8，培养温度为28℃，摇床转速160rpm，培养时间36h；
3.液体深层快速发酵：将步骤2中种子液以10%接种量接种于生物反应器的发酵培养基（配方同实施例1）中进行浒苔生物肥的发酵制备，装液量为生物反应器体积的60%，pH7.2，培养温度24℃，搅拌桨转速200rpm，通气量1.0vvm，溶解氧50%，培养时间20h；
4.浒苔生物肥的制备：将步骤3中的发酵液通过板框过滤结合低速离心的方法实现固液分离，将液体部分收集并通过大量元素、微量元素及相关营养物质的复配制备浒苔生物肥。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于所述方法包括以下具体步骤：
（1）菌种活化：将菌株接种于活化培养基中进行活化培养，初始pH6.8-7.2，培养温度30-32℃，摇床转速160-200rpm，培养时间36-48h；所述菌株为保藏编号为CCTCC NO ：M2012132的交替单胞菌A321；
（2）种子液的制备：将步骤（1）中菌种活化后以5-8%接种量接种于种子培养基中进行培养获得种子液，初始pH6.5-7.2，培养温度为28-30℃，摇床转速160-200rpm，培养时间30-36h；
（3）液体深层快速发酵：将步骤（2）中所述种子液以8-10%接种量接种于生物反应器的发酵培养基中进行浒苔生物肥的发酵制备得到发酵液，装液量为生物反应器体积的50-70%，pH6.8-7.5，培养温度24-28℃，搅拌桨转速200-600rpm，通气量0.5-2.5vvm，溶解氧30-70%，培养时间18-24h；
（4）浒苔生物肥的制备：将步骤（3）中的发酵液进行固液分离，将液体部分收集并通过大量元素、微量元素及营养物质的复配制得所述浒苔生物肥。
2.根据权利要求1所述的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计，粒径为40-200目的固体浒苔粉1.0-8.0%，有机氮源0.01-0.05%，磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸钾0.2-2.0%、硝酸钾0.05-0.6%、硫酸镁0.02-0.1%，余量为水。
3.根据权利要求1所述的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于：所述步骤（1）中活化培养基的装液量为25mL/100mL。
4.根据权利要求2所述的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于：所述有机氮源为牛肉膏、酵母膏和蛋白胨中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵液中的可溶性多糖含量为0.2-1.2%，还原糖含量为0.02-0.3%，蛋白含量为0.1-0.6%，有机质含量为0.5-3.0%，固形物含量为1.0-5.0%，以质量百分比计。
6.根据权利要求1所述的液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法，其特征在于：所述步骤（4）中发酵液通过板框过滤结合低速离心的方法实现固液分离。
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