CN101674853B - 氨基酸脂质及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于药物递送、治疗、和诊断和治疗疾病和病症的一系列的氨基酸脂质化合物和组合物。该氨基酸脂质化合物和组合物可用于递送各种试剂如核酸治疗剂至细胞、组织、器官、和患者。

Description

氨基酸脂质及其用途
技术领域
本发明涉及新型药物递送增强剂，包括可用于将各种分子递送至细胞的脂质。本发明提供了一系列的化合物、组合物、制剂、方法、这些增强剂的用途，最终意在药物的递送、疗法以及疾病和病症的诊断和治疗，包括对受试者基因表达或活性调控产生响应的那些疾病和病症的诊断和治疗。更具体地说，本发明涉及化合物、脂质体、层状囊泡(lamellar vesicles)、乳剂(emulsions)、胶束(micelles)、悬浮剂(suspensions)、颗粒、溶液和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及这些递送物质的治疗方法和用途。
背景技术
治疗性化合物向患者的递送会因为受限于化合物到达靶细胞或组织的能力或受限于细胞内化合物的进入或通行而受到阻碍。治疗性物质的递送通常受限于细胞膜。针对递送的这些屏障和限制导致需要使用比实现预期结果更高的化合物浓度，这样就带来了毒性作用和副作用的风险。
一种递送策略是利用脂质或聚合物载体分子来改善化合物向细胞内的运输。这些物质可以充分利用为选择性进入细胞而显现的机制，但不包括外源分子，如核酸和蛋白。例如，阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并与细胞膜接触。还可以将脂质分子并入作为药物试剂载体的脂质体或颗粒。脂质体药物载体可以保护药物分子免受降解，同时改善细胞对其的吸收。而且，脂质体药物载体通过静电和其它相互作用可以包裹或结合某些化合物，且可以与带负电荷的细胞膜相互作用以开始跨膜运输。
其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi)、RNAi治疗、RNA药物、反义治疗和基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有效手段的需要。通常，核酸仅在有限的时间内在细胞或血浆内保持稳定。但是，基于核酸的试剂能够在组合物和制剂中保持稳定，其随后可以被分散以用于细胞递送。
本发明提供了用于改善药物和生物活性分子全身和局部递送的化合物、组合物、方法和用途。其中，本发明提供了新型的化合物和组合物，其用于制备和利用能够增强生物活性分子递送效率的递送结构和载体。
发明内容
本发明提供了用于细胞内和体内递送最终作为治疗剂的药物的新型化合物、组合物和制剂。本发明的化合物和组合物可用于递送药物至选定的细胞、组织、器官或隔室以改变疾病状态或表型。
在一些方面中，本发明提供了递送RNA结构至细胞的化合物、组合物和方法以便产生RNA干扰应答、反义效应或调节基因组表达。
本发明提供了一系列的氨基酸脂质，其是用于药剂的递送和给药并用于药物递送***中的亲脂性化合物。本发明的氨基酸脂质是包含氨基酸残基和一个或多个亲脂性尾的分子。
在一些方面中，本发明提供了如式I所示一系列的氨基酸脂质化合物及其盐：
R3-(C＝O)-Xaa-Z-R4                            式I
其中
Xaa是具有式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸残基，或具有式-{NRN-CR1R2-(C＝O)}n-的n＝2-20个氨基酸残基的肽，其中
R1各自独立地是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链；
R2各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团、或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基、或羟基；
RN各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团，或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基、或羟基；
R3独立地是衍生自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾，其中所述尾可以包含类固醇；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4独立地是衍生自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾，其中所述尾可以包含类固醇；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
其中R3和R4中任一是如上定义的亲脂性尾，而另一个是氨基酸末端基团、或R3和R4都是亲脂性尾；所述氨基酸末端基团是氢、羟基、氨基、或有机保护基团；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些方面，本发明提供了其如式I所示的一系列氨基酸脂质化合物及其盐：
R3-(C＝O)-Xaa-Z-R4                                式I
其中，
Xaa是具有式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的D-或L-氨基酸残基，其中
R1是取代或未取代的氨基酸碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；
R4独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；
Z是NH、O、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，所述氨基酸脂质化合物可以含有选自下述的Xaa：精氨酸、高精氨酸、正精氨酸(norarginine)、正-正精氨酸(nor-norarginine)、鸟氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶丙氨酸、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺、4-氨基苯丙氨酸、其N-甲基化变体、和其侧链修饰性衍生物。在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以包括选自半胱氨酸和丝氨酸的Xaa。
在一些实施方式中，R3和R4可以是C(6-22)烷基，且可以相同或不同。在一些实施方式中，R3和R4可以是C(6-22)烯基，且可以相同或不同。
在一些实施方式中，Xaa可以是2-20个氨基酸残基的肽。
在一些实施方式中，Xaa可以具有含pKa为5-7.5的官能团的侧链。
在一些方面中，氨基酸脂质化合物可以是交联的两种或多种氨基酸脂质化合物的多聚体。
在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以是具有与氨基酸残基侧链缀合的肽的缀合物。
在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以与寡聚或聚合骨架结合。
在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以与药物化合物结合。
在一些方面中，本发明提供了如式I所示的一系列氨基酸脂质化合物及其盐；
R3-(C＝O)-Xaa-Z-R4                            式I
其中
Xaa是具有式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的D-或L-氨基酸残基，其中
R1是取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；
R4是氢；
Z是NH、O、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种治疗性核酸的组合物。治疗性核酸可以是基因沉默剂、RNAi诱导剂、双链RNA或mdRNA，或可以包含修饰的核苷。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种其它非氨基酸脂质或聚合脂质的组合物。在一些实施方式中，组合物可以包括胆固醇琥珀酸单酯。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种能与氨基酸脂质形成复合物的核酸的组合物。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物，其形成脂质体。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物，其形成乳剂。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物，其形成胶束分散体。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种药剂或生物活性试剂的组合物。
在一些方面中，本发明涵盖通过制备包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和用所述组合物处理细胞来将治疗性核酸递送至细胞的方法。
在一些实施方式中，本发明涵盖通过制备含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和用该组合物处理细胞来抑制基因在细胞中表达的方法。
在一些方面中，本发明涵盖抑制基因在哺乳动物中表达的方法，该方法包括制备含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和给哺乳动物施用该组合物。
在一些实施方式中，本发明涵盖治疗人类疾病的方法，所述疾病选自风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症，该方法包括制备包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和给人类施用该组合物。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物在制备治疗包括风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症的疾病的药物的用途。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物在治疗选自风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症的疾病中的用途。
本发明概述和本发明详述以及附图、实施例和权利要求书整体上都作为本发明的公开内容。
附图说明
图1：图示本发明的脂质体实施方式，其中氨基酸脂质与其它脂质一起形成双分子层状囊泡10。在该实施方式中，脂质体外层用与一个脂质头基结合的聚乙二醇链20进行保护。脂质体外层还有用于特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，脂质体囊泡包括活性干扰性RNA组分的负载，其包括浓缩的RNA纳米颗粒40、双链RNA双螺旋肽缀合物50、三链mdRNA60、dicer底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA、和具有平末端90的siRNA，其合并入本实施方式中。
图2：在JEOL 1230 TEM上获得的本发明的脂质体实施方式的透射电子显微照片，显示用氨基酸脂质C12-正Arg-C12形成的球型脂质双分子层囊泡颗粒。显微照片的长度标记是0.5微米，样品用3％乙酸铀酰染色。脂质体制剂的脂质部分是[C12-正Arg(NH3 +Cl-)-C12/DSPC/胆固醇/DSPE-PEG-2000]，以总脂质的摩尔百分数表示的量分别为[30％/20％/49％/1％]。脂质体包括抗流感-活性的dicer底物dsRNA DX3030。
图3：图3显示了从A549细胞体外试验获得的PPIB基因敲除活性的实施例。将对干扰性-RNA的两种氨基酸脂质制剂在25、10、1和0.1nM RNA下的浓度应答的标准化PPIB mRNA表达值与RNAIMAX的标准化PPIBmRNA表达值进行比较。制剂1是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]和制剂2是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE(50/32/18)]。通过在本发明的氨基酸脂质组合物中的干扰性-RNA获得的PPIB基因敲除可以超过用RNAIMAX。
图4：图4显示了9L/LacZ细胞体外试验获得的LacZ基因敲除活性的实施例。将对干扰性-RNA的两种氨基酸脂质制剂在25、10、1和0.1nM RNA下的浓度应答的标准化β-半乳糖苷酶表达值与RNAIMAX的标准化β-半乳糖苷酶表达值进行比较。制剂1是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]和制剂2是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE(50/32/18)]。通过在本发明的氨基酸脂质组合物中的干扰-RNA获得的LacZ基因敲除可以超过用RNAIMAX。
图5：图5显示了HepG2细胞体外试验获得的ApoB基因敲除活性的实施例。显示了对干扰性-RNA的三种氨基酸脂质制剂在25、2.5和0.25nM RNA下的浓度应答的标准化ApoB mRNA表达值。制剂1是[非氨基酸阳离子脂质/DSPC/chol./DMPE-PEG2k(40/10/48/2)]。制剂2和3都是[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]。
发明详述
本发明一般地涉及用于递送药物试剂的新型化合物、组合物和其用途。本发明的化合物和组合物可用于将治疗剂递送至所选的细胞、组织、器官或患者。
本发明一般地涉及脂质的化学和脂质样结构和物质的有效药物递送的用途。
本发明的化合物和组合物可用于递送治疗剂、预防剂和诊断剂，如核酸、多核苷酸、肽、蛋白、和小分子化合物和药物。
本发明的化合物和组合物可以下述形式用于递送治疗剂，如脂质体、层状囊泡、乳剂、胶束、悬浮剂、颗粒和溶液。这些形式可以包括各种直径的纳米颗粒。
在一些方面中，本发明的化合物和组合物可用于递送脂质体中的治疗剂。在这些实施方式中，治疗剂可以称作负载。例如，图1显示了本发明的脂质体实施方式，其中氨基酸脂质与其它脂质一起形成双分子层囊泡10。在该实施方式中，脂质体外层通过使一个脂质头基结合聚乙二醇链20而得到保护。脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，脂质体囊泡包括负载分子活性干扰性RNA组分，其包括浓缩的RNA纳米颗粒40、双链RNA双螺旋肽缀合物50、三链mdRNA 60、dicer底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，其合并入本实施方式中。其它形式的治疗剂负载可以包括微小RNA或发夹RNA形式。
在一些方面中，本发明的化合物和组合物可以以可释放形式或组合物递送治疗剂。可释放形式和组合物包括结合并释放活性试剂的分子、结合活性试剂并能将帮助释放该试剂的部分放出的分子、结合活性试剂并随后在生物隔室内调节从而帮助该试剂释放的分子，和含有与释放中间介质化合物混合的活性试剂结合的分子。
氨基酸脂质
本发明提供了一系列的氨基酸脂质，其是用于药物试剂递送和给药以及用于药物递送***的亲脂性化合物。本发明的氨基酸脂质是含有氨基酸残基和一种或多种亲脂性尾的分子。
在一些实施方式中，氨基酸脂质是具有亲水性部分和亲脂性部分的分子。该亲水性部分可以由氨基酸残基来提供。亲脂性部分可以包含一种或多种亲脂性尾。
在一些实施方式中，氨基酸脂质是含有疏水性氨基酸残基和一种或多种亲脂性尾的亲脂性分子。
在一些实施方式中，氨基酸脂质提供了相对低的细胞毒性，和相应地相对某些其它脂质而言的细胞保护效应。在一些实施方式中，氨基酸脂质是药学上可接受的、生物可降解的或生物相容的脂质。
氨基酸脂质可以通过在氨基酸的N-端或C-端或两端取代递送增强或脂质样尾来形成。在一些实施方式中，氨基酸核心可以包括一种或多种氨基酸，或可以是2-20个氨基酸残基的肽。
氨基酸脂质可以是阳离子或非阳离子，其中非阳离子包括中性和阴离子。在本文中，物质的物理状态或离子性是针对pH约为7的环境，除非另有说明。
本发明的氨基酸脂质可以显现低细胞毒性。在一些实施方式中，本发明的氨基酸脂质相对其它结构的脂质可以提供细胞保护效应。
在一些方面中，本发明的氨基酸脂质可以可释放形式提供治疗剂的递送。设计的可释放形式和组合物能够提供细胞对试剂的充分摄取，从而提供治疗效力。
可释放形式包括结合和释放活性试剂的氨基酸脂质。在一些实施方式中，活性试剂的释放可以由酸不稳定性接头来提供。
酸不稳定性接头的实例包括含原酸酯基团、腙、顺式-乙酰甲基、缩醛、缩酮、甲硅烷基醚、硅氮烷、亚胺、柠檬酸酐、马来酸酐、冠醚、氮冠醚、硫代冠醚，二硫苯甲基、顺式-乌头酸、顺式-羧酸三烯烃、甲基丙烯酸、和其混合物的接头。
酸不稳定性基团和接头的实例在美国专利号7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931中给出。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括这样的分子，其结合活性试剂且能将帮助该试剂释放的部分放出。在一些实施方式中，氨基酸脂质可以包括释放小分子(如帮助递送试剂至细胞的乙醇)的基团。氨基酸脂质可以结合活性试剂，且随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输，在酸性环境中水解以释放帮助递送试剂的乙醇。在一些实施方式中，小分子如帮助递送试剂的乙醇可以结合到脂质组分。
在一些实施方式中，氨基酸脂质可以与释放小分子如帮助递送试剂至细胞的乙醇的化合物混合。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括氨基酸脂质，其可以结合活性试剂，随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输，在酸性环境中调节成阳离子形式从而帮助释放试剂。
在一些实施方式中，氨基酸脂质可以结合活性试剂，且可以与在酸性环境中可被调节成阳离子形式从而帮助释放活性试剂的分子混合。
可水解和可调节的基团实例在美国专利号6,849,272；6,200,599；以及Z.H.Huang和F.C.Szoka，“Bioresponsive liposomes and their use formacromolecular delivery，”in：G.Gregoriadis(ed.)，Liposome Technology，3rd ed.(CRC Press 2006)中给出。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合活性试剂的氨基酸脂质，且可以与在酸性环境中能调节为中性形式从而帮助释放活性试剂的脂质或化合物混合。可以随后进入酸性环境以与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输。
可从阴离子调节至中性形式的脂质的实例包括胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)，如美国专利号6,897,196、6,426,086和7,108,863中所述。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合活性试剂的氨基酸脂质，其可与pH-敏感性聚合材料混合。
pH-敏感性聚合材料的实例在美国专利号6,835,393中给出。
在一些实施方式中，活性试剂的释放可以通过酶可裂解肽来提供。
在一些方面中，本发明提供了如式I所示的一系列的氨基酸脂质及其盐：
R3-(C＝O)-Xaa-Z-R4                            式I
其中
Xaa是具有式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸残基，或具有式-{NRN-CR1R2-(C＝O)}n-的n＝2-20个氨基酸残基的肽，其中
R1各自独立地是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链；
R2各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团、或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基、或羟基；
RN各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团、或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基、或羟基；
R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾、或下文描述的任一的其它递送脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾、或下文描述的任一的其它递送脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，R3独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；R4独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基。
残基Xaa可以是D-或L-立构中心。
在一些实施方式中，氨基酸核心可以是在肽的N-末端和C-末端具有亲脂性尾的2-20个氨基酸残基的肽。
在一些实施方式中，R1是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链，其中侧链取代基是由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机基团。
在一些实施方式中，Z是烷基或有机接头合成聚合物，如聚乙二醇链(PEG)，或PEG共聚物，如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。参见如J.MiltonHarris，Poly(ethylene glycol)chemistry：biotechnical and biomedical applications(1992)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一的额外递送脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一的额外递送脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意的D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是NH。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意的D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是O。
可以制备阳离子氨基酸脂质，其中例如Xaa具有碱性侧链。具有碱性侧链的氨基酸实例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(侧链-(CH2)4NH(C＝NH)NH2)、正精氨酸(正Arg)(侧链-(CH2)2NH(C＝NH)NH2)、正-正精氨酸(正正Arg)(侧链-(CH2)NH(C＝NH)NH2)、鸟氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸、和其侧链修饰性衍生物。
在本文中，术语“高”，当指氨基酸时，是指额外的碳添加到侧链，而术语“正”，当指氨基酸时，是指碳从侧链减去。因此，高赖氨酸是指侧链-(CH2)5NH2。
可以制备阴离子氨基酸脂质，其中例如Xaa是谷氨酸或天冬氨酸。
还可以制备阳离子和阴离子氨基酸脂质，其中氨基酸侧链含有电离基团或取代基。
可以制备非-阳离子氨基酸脂质，其中例如Xaa是亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-甲基精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二甲基精氨酸、NG-甲基-高精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二甲基-高精氨酸、NG-甲基-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二甲基-正精氨酸、或NG-甲基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二甲基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-乙基精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二乙基精氨酸、NG-乙基-高精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二乙基-高精氨酸、NG-乙基-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二乙基-正精氨酸、或NG-乙基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二乙基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-烷基精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二烷基精氨酸、NG-烷基-高精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二烷基-高精氨酸、NG-烷基-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二烷基-正精氨酸、或NG-烷基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二烷基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是含胍-或含脒-侧链的氨基酸。例如，Xaa残基的侧链可以包括如胍基、脒基、二氢咪唑、4-胍基-苯基、4-脒基-苯基、N-脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4，5-二氢咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷基、或4-[(2-氨基嘧啶基)]乙基的基团。
Xaa侧链的实例包括以下结构，及其盐的形式：
Figure G2008800147206D00141
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括pKa为约5至约7.5，或约6至约7的释放官能团。通常，弱碱的释放官能团在局部pH高于pKa时可以表现出显著的中性形式，且在局部pH低于pKa时可以表现出显著的离子形式。弱酸的释放官能团在局部pH高于pKa时可以表现出显著的离子形式，且在局部pH低于pKa时可以表现出显著的中性形式。参见，如P.Heinrich Stahl，Handbook of Pharmaceutical Salts，(2002)。
在一些实施方式中，Xaa可以具有含pKa为5至7.5的官能团的侧链。
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括1-甲基组氨酸。
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括3，5-二碘酪氨酸。
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括以下结构：
Figure G2008800147206D00151
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物1
Figure G2008800147206D00152
化合物2
Figure G2008800147206D00153
适合可释放形式的氨基酸脂质的氨基酸侧链上的取代基实例包括衍生自下述的释放官能团：3，5-二碘-酪氨酸、1-甲基组氨酸、2-甲基丁酸、2-邻-茴香基丙酸、内消旋-酒石酸、4，6-二甲基嘧啶胺、对苯二甲酸、肌酸酐、丁酸、N，N-二甲基-1-萘胺、戊酸、4-甲基戊酸、N-甲基苯胺、1，10-邻二氮杂菲、3-吡啶羧酸、己酸、丙酸、4-氨基苯甲酸、2-甲基丙酸、庚酸、辛酸、环己烷羧酸、喹啉、3-氨基喹啉、2-氨基苯甲酸、4-吡啶羧酸、壬酸、三聚氰胺、8-羟基喹啉、三甲基乙酸、6-甲氧基喹啉、4-(甲基氨基)苯甲酸、对甲基苯胺、3-(甲基氨基)苯甲酸、苹果酸、N-乙基苯胺、2-苯甲基吡啶、3，6-二硝基苯酚、N，N-二甲基苯胺、2，5-二甲基哌嗪、对氨基苯***、5-甲基喹啉、2-苯基苯并咪唑、吡啶、吡啶甲酸、3，5-二碘酪氨酸，对茴香胺、2-(甲基氨基)苯甲酸、2-氨基噻唑、戊二酸、己二酸、异喹啉、衣康酸、邻苯二甲酸、苯并咪唑、哌嗪、庚二酸、吖啶、菲啶、琥珀酸、甲基丁二酸、4-甲基喹啉、3-甲基吡啶、7-羟基异喹啉、丙二酸、甲基丙二酸、2-甲基喹啉、2-乙基吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、组胺、组氨酸、马来酸、顺式-1，2-环己烷二胺、3，5-二甲基吡啶、2-乙基苯并咪唑、2-甲基苯并咪唑、卡可基酸、伯啶、柠檬酸、异柠檬酸、2，5-二甲基吡啶、罂粟碱、6-羟基-4-甲基蝶啶、L-甲状腺素、3，4-二甲基吡啶、甲氧基吡啶、反式-1，2-环己烷二胺、2，5-吡啶二胺、l-1-甲基组氨酸、l-3-甲基组氨酸、2，3-二甲基吡啶、黄蝶呤、1，2-丙烷二胺、N，N-二乙基苯胺、阿脲酸、2，6-二甲基吡啶、L-肌肽、2-氨基吡啶、N-b-丙氨酰组氨酸、毛果芸香碱、1-甲基咪唑、1H-咪唑、2，4-二甲基吡啶、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、酪氨酰胺、5-羟基喹唑啉、1，1-环丙烷二羧酸、2，4，6-三甲基吡啶、佛罗那、2，3-二氯苯酚、1，2-乙二胺、1-氨基异喹啉、和其组合物。
在一些实施方式中，对应式I的一系列氨基酸脂质的结构如下：
Figure G2008800147206D00161
结构1A
和
Figure G2008800147206D00171
结构1B
其中R1、R2、RN、R3、和R4如上定义。
在一些实施方式中，R3和R4独立地选自脂质样尾，其赋予充分的亲脂特性或亲脂性，如被水/辛醇分隔开，从而递送通过膜或被细胞吸收。当用于氨基酸脂质结构中时，这些尾提供两性分子。脂质样尾可以衍生自磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂等，且可以包括类固醇。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是具有甘油骨架的脂质样尾。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基、或C22烷基。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地为具有下述一种结构的亲脂性尾：
Figure G2008800147206D00172
在上述结构中，X代表直接结合到氨基酸残基端的尾原子，且记作以数字指示的其一原子，例如“18:3”。在一些实施方式中，X可以是碳、氮或氧原子。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是具有下述一种结构的亲脂性尾：
Figure G2008800147206D00181
其中X如上定义。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地选自脂质样尾，其可以包括胆固醇、固醇、或类固醇，如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、gorgostanes、羊毛甾烷、环波罗烷、以及前述的任何固醇或动物甾醇衍生物、和其生物中间体和前体，其可以包括如胆固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇、和其混合物和衍生物。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地选自衍生自脂肪酸样尾，如衍生自肉豆蔻酸(C14:0)烯基、棕榈酸(C16:0)烯基、硬脂酸(C18:0)烯基、油酸(C18:1，碳双键在碳9)烯基、亚油酸(C18:2，碳双键在碳9或12)烯基、亚麻酸(C18:3，碳双键在碳9、12或15)烯基、花生四烯酸(C20:4，碳双键在碳5、8、11或14)烯基、和二十碳五烯酸(C20:5，碳双键在碳5、8、11、14或17)烯基的尾。其它的脂肪酸样尾的实例参见Donald Voet和Judith Voet，Biochemistry，3rd Edition(2005)，p.383。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地衍生自类异戊二烯。
在本文中，术语“氨基酸”包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。因此本发明的氨基酸脂质可以由遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的氨基酸或合成氨基酸制的。
氨基酸的实例包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
氨基酸的实例包括吖丁啶、2-氨基十八烷酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、2，3-二氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2，3-二氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、2-氨基异丁酸、4-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，2′-二氨基庚二酸、6-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、锁链素、鸟氨酸、瓜氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-乙基甘氨酸、环己基甘氨酸、4-氧代-环己基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、环己基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-氯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-卤代苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、2-噻吩基丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、正精氨酸、正-正精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、4-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、正缬氨酸、O-烯丙基-丝氨酸、O-烯丙基-苏氨酸、α-氨基己酸、α-氨基戊酸、焦谷氨酸、和其衍生物。
在本文中，术语“氨基酸”包括α-和β-氨基酸。
氨基酸残基的实例可参见Fasman，CRC Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.(1989)。
通常，化合物可以包括一种或多种手性中心。含一种或多种手性中心的化合物可以包括被称为“异构体”、“立体异构体”、“非对映异构体”、“对映异构体”、“光学异构体”、或“外消旋混合物”的那些。立体化学命名公约，例如Cahn，Ingold和Prelog的立体异构体命名法，以及确定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域已知的。参见，例如Michael B.Smith和JerryMarch，Marchs’Advanced Organic Chemistry，5th edition，2001。本发明的化合物和结构意欲包括所有可能的异构体、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、和/或光学异构体，其应理解为以指定化合物或结构，包括其任何混合物、消旋或其它形式存在。
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-Arg-NH-R4，其中Arg是D-或L-精氨酸，且R3和R4独立地是烷基或烯基。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
Figure G2008800147206D00201
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
Figure G2008800147206D00202
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物7
Figure G2008800147206D00211
化合物8
Figure G2008800147206D00212
化合物9
Figure G2008800147206D00213
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-正Arg-NH-R4，其中正Arg是D-或L-正精氨酸，且R3和R4独立地是烷基或烯基。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物10
化合物11
Figure G2008800147206D00221
化合物12
Figure G2008800147206D00222
化合物13
Figure G2008800147206D00223
化合物14
Figure G2008800147206D00224
化合物15
Figure G2008800147206D00225
化合物16
Figure G2008800147206D00231
化合物17
Figure G2008800147206D00232
化合物18
Figure G2008800147206D00233
化合物19
Figure G2008800147206D00234
化合物20
Figure G2008800147206D00235
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-正正Arg-NH-R4，其中正正Arg是D-或L-正-正精氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物21
Figure G2008800147206D00241
化合物22
Figure G2008800147206D00242
化合物23
Figure G2008800147206D00243
化合物24
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-高Arg-NH-R4，其中高Arg是D-或L-高精氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-4-啶基丙氨酸-NH-R4，其中吡啶基丙氨酸是D-或L-吡啶基丙氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。R3-(C＝O)-吡啶基丙氨酸-NH-R4氨基酸脂质的实例包括药学上可接受的吡啶盐，如4-[N-甲基吡啶基]丙氨酸氯化物。吡啶基丙氨酸氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物25
Figure G2008800147206D00251
化合物26
Figure G2008800147206D00252
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-Lys-NH-R4，其中R3和R4独立地是烷基或烯基。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物27
Figure G2008800147206D00253
化合物28
Figure G2008800147206D00254
化合物29
Figure G2008800147206D00261
化合物30
Figure G2008800147206D00262
化合物31
Figure G2008800147206D00263
化合物32
Figure G2008800147206D00264
化合物33
Figure G2008800147206D00265
化合物34
Figure G2008800147206D00271
化合物35
化合物36
Figure G2008800147206D00273
化合物37
化合物38
Figure G2008800147206D00275
化合物39
Figure G2008800147206D00281
化合物40
Figure G2008800147206D00282
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-His-NH-R4，其中R3和R4独立地是烷基或烯基。His氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物41
化合物42
化合物43
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-Xaa-O-R4，其中R3是烷基且R4是鞘氨基醇。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物44
化合物45
Figure G2008800147206D00293
化合物46
Figure G2008800147206D00301
氨基酸脂质的实例包括R3-(C＝O)-Xaa-NH-R4，其中R3和R4是烷基或烯基。氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物47
Figure G2008800147206D00302
氨基酸脂质的实例包括(C10酰基)-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-高Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-高Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-高Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-4-Pal-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C16烷基)、和(C18酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C18烷基)。
通常，名称“C14-正Arg-C14”例如是指(C13烷基)-(C＝O)-正Arg-NH-(C14烷基)，其等同于(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(C10酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C10烷基)、(C 12酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C18烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)。
可以将氨基酸脂质制备成聚合体或多聚体，如二聚体、三聚体或四聚体。聚合体或多聚体可以制备自一种或多于一种的氨基酸脂质。在一些实施方式中，聚合体或多聚体氨基酸脂类可以通过在氨基酸侧链上提供巯基或其它可交联基团，或提供连接的或锁链的(tethered)氨基酸结构如锁链素或瓜氨酸来制备。在其它的实施方式中，聚合体或多聚体氨基酸脂类可以用生物缀合接头化学方法来制备。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
化合物48        化合物49
Figure G2008800147206D00331
氨基酸脂质可以制备成具有共价结合到氨基酸侧链的肽或聚合物链的缀合物。肽或聚合物链可以利用氨基酸侧链反应基团来结合，例如分别利用半胱氨酸或蛋氨酸的硫醇或甲基硫醇基团，或丝氨酸的醇基，或赖氨酸的氨基。肽或聚合物链可以利用取代或修饰的氨基酸侧链的任何反应基团来结合。各种接头基团，如NHS、马来酰亚胺基、和生物缀合技术和接头都可以使用。
氨基酸脂质可以制备成结合寡聚或聚合框架的结构物。例如，氨基酸脂质可以与聚乙二醇、聚丙二醇、寡核苷酸网状物或网格、聚(氨基酸)、碳水化合物、葡聚糖、水凝胶或淀粉结合。
氨基酸脂质可以制备成结合药物化合物或组合物，或生物活性试剂的结构物。例如，氨基酸脂质可以与核酸药物如调节性或干扰性RNA缀合。
氨基酸脂质的实例包括以下结构：
其中R是任意的氨基酸侧链。
本发明的化合物和组合物可以引入包括聚合体结构的增溶或功能化基团或结构。参见，如.R.L.Dunn和R.M.Ottenbrite，Polymeric Drugs and DrugDelivery Systems，ACS Symp.Ser.469(1991)。可以对氨基酸脂质进行衍生化以便提高溶解性例如以结合二醇，制备季铵或带电基团，结合羟基或胺基团如醇、多元醇或聚醚，或结合聚乙烯亚胺、聚乙二醇或聚丙二醇。结合的聚合体组分如聚乙二醇的分子量可以是任何值，例如200、300、400、500、600、750、1000、1250、1500、2000、3000、4000、5000、7500、10,000、15,000、20,000、25,000或30,000Da或更大。例如，聚乙二醇链可以通过氨基酸侧链的氨基或其它反应基团来结合。
通常，在本文中，除非另外说明，常规的化学术语是指指定类型的所有基团，包括具有任何数量和类型的原子的基团。例如“烯基”广义上是指具有如下文定义的2-22个碳原子的烷基，其中(C18:1)烯基是指具有18个碳原子和一个双键的烯基。
在本文中，术语“烷基”是指饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的含有1-22个碳原子的脂肪族基团。这些定义可以应用于其它基团的烷基部分，例如烷氧基、烷酰基、芳烷基和下文定义的其它基团。在本文中，术语“环烷基”是指饱和的，取代或未取代的含3-12个碳原子的环烷基环。在本文中，术语“C(1-5)烷基”包括C(1)烷基、C(2)烷基、C(3)烷基、C(4)烷基、和C(5)烷基。另外，术语“C(3-22)烷基”包括C(1)烷基、C(2)烷基、C(3)烷基、C(4)烷基、C(5)烷基、C(6)烷基、C(7)烷基、C(8)烷基、C(9)烷基、C(10)烷基、C(11)烷基、C(12)烷基、C(13)烷基、C(14)烷基、C(15)烷基、C(16)烷基、C(17)烷基、C(18)烷基、C(19)烷基、C(20)烷基、C(21)烷基、和C(22)烷基。
在本文中，术语“烯基”是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2-22个碳原子和至少一个碳碳双键的烷基或环烷基。在本文中，术语“炔基”是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2-22个碳原子和至少一个碳碳三键的烷基或环烷基。
在本文中，术语“烷氧基”是指共价结合氧原子的烷基、环烷基、烯基或炔基。在本文中，术语“烷酰基”是指-C(＝O)-烷基，其还可称作“酰基”。在本文中，术语“烷酰氧基”是指-O-C(＝O)-烷基。在本文中，术语“烷基氨基”是指基团-NRR’，其中R和R’是氢或烷基，且至少R和R’之一是烷基。烷基氨基包括如哌啶基的基团，其中R和R’形成环。术语“烷基氨基烷基”是指-烷基-NRR’。
在本文中，术语“芳基”是指各环中有4-12个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环***，其中至少一个环是芳香族化合物。芳基的一些实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯。其中芳基取代基是双环，且一个环是非芳香族化合物，应该理解结合的是芳环。芳基可以是取代或未取代的。
在本文中，术语“杂芳基”是指任何稳定的各环有4-12个原子的单环的、双环的或多环的碳环***，其中至少一个环是芳香族化合物，且含有1-4个选自氧、氮和硫的杂原子。杂芳基的一些实例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并***基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基和四氢喹啉基。杂芳基包括含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
在本文中，术语“杂环”或“杂环基”是指5-22个原子的芳香或非芳香环***，其中1-4个环原子是选自氧、氮和硫的杂原子。因此，杂环可以是杂芳基或其二氢或四氢变体。
在本文中，术语“芳酰基”是指衍生自芳香羧酸的芳基基团，如取代的苯甲酸。术语“芳烷基”在本文中是指结合烷基的芳基，例如苯基。
在本文中，术语“羧基”表示式-C(＝O)OH或-C(＝O)O-的基团。术语“羰基”和“酰基”在本文中是指氧原子与碳原子以双键结合的基团＞C＝O。在本文中，术语“羟基”是指-OH或-O-。在本文中，术语“腈”或“氰基”是指-CN。术语“卤素”或“卤代”是指氟代(-F)、氯代(-Cl)、溴代(-Br)和碘代(-I)。
在本文中，术语“取代的”是指原子具有一种或多种取代或取代基，其可以相同或不同，且可以包括氢取代基。因此，术语烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基和芳烷基在本文中是指包括取代变体的基团。取代的变体包括线性的、分支的和环状变体，和具有代替一个或多个结合到该基团上任意碳原子的氢的取代基的基团。可结合到基团上碳原子的取代基包括烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基、芳烷基、酰基、羟基、氰基、卤代、卤代烷基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳氧基，芳氧基烷基、巯基、硝基、氨基甲酰、氨基甲酰和杂环。例如，术语乙基包括但不限于：-CH2CH3、-CHFCH3、-CF2CH3、-CHFCH2F、-CHFCHF2、-CHFCF3、-CF2CH2F、-CF2CHF2、-CF2CF3、和如上所述的其它变体。通常，取代基可以进一步被任何原子或原子基团取代。
本发明的氨基酸脂质或其变体可以通过本领域已知的方法来合成。
制备各种有机基团和保护基团的方法是本领域已知的，且通常其应用和修饰也在本领域技术人员的能力范围内。参见如Stanley R.Sandler和WolfKaro，Organic Functional Group Preparations(1989)；Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(1996)；Leroy G.Wade，Compendium Of OrganicSynthetic Methods(1980)；examples of protective groups are found in T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups In Organic Synthesis(3rd ed.1991)。
具有足够碱性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是与例如无机或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氯璜酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、醋酸、丙酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸或酒石酸，和烷烃-或芳烃磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氯苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸和樟脑磺酸的酸加成盐。
具有足够酸性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是碱金属盐例如钠或钾盐，或碱土金属盐例如钙或镁盐，或锌或锰盐，或铵盐，或可提供生理学上可接受阳离子的有机碱的盐，例如甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺的盐，且包括氨基酸如精氨酸的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐。参见如Berge等，J.Pharm.Sci.66：1-19，1977。
包含干扰性RNA制剂和脂质、肽或蛋白的本发明组合物的盐或药学上可接受的盐还可以包含干扰性RNA试剂和脂质、肽或蛋白的盐复合物。干扰性RNA试剂和脂质、肽或蛋白的盐复合物可以形成自干扰性RNA试剂的药学上可接受的盐，或形成自脂质、肽或蛋白的药学上可接受的盐。
本发明的某些化合物可以同时包括碱性和酸性官能团，这样就能将化合物制成碱或酸加成盐。
本发明的一些化合物、肽和/或蛋白组合物可以具有一个或多个手性中心和/或几何异构中心(E-和Z-异构体)，且应该理解本发明涵盖全部此类光学异构体、非对映异构体、几何异构体和其混合物。
本发明涵盖本文公开的任何和全部互变异构体、溶剂化物或非溶剂化物、水合或非水合形式、以及化合物的任何原子同位素形式、肽和/或蛋白组合物。
其它的递送脂质
在本发明的一些方面中，氨基酸脂质和其它的非氨基酸脂质可以用于递送和施用调节性RNA组分、RNA拮抗剂、干扰性RNA或核酸。更优选地，本发明的组合物可以包括一种或多种氨基酸脂质以及非氨基酸阳离子脂质和非氨基酸非阳离子脂质。
非氨基酸阳离子脂质可以是单阳离子或聚阳离子。一些非氨基酸阳离子脂质包括中性脂质和在特定pH下大致具有零静电荷的脂质，例如，两性脂质。非氨基酸非阳离子脂质也包括阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分与氨基酸脂质和非氨基酸阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物可以是一种或多种调节性或干扰性RNA试剂与一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸阳离子脂质的混合物或复合物。
本发明的化合物和组合物可以与各种用于递送活性试剂至有机体细胞、组织、器官或区域的靶标配体或试剂混合或结合。靶向试剂的实例包括抗体、受体配体、肽、蛋白、外源凝集素、(聚)糖类、半乳糖、甘露糖、环糊精、核酸、DNA、RNA、核酸适配子和聚氨基酸。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1，2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、1，2-双(二肉豆蔻氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷(DMTAP)；1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)；二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB)；3-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰)胆固醇(DC-Chol)；3β-[N′，N′-二胍基乙基-氨基乙烷]氨基甲酰胆固醇(BGTC)；2-(2-(3-(双(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N，N-二十四烷基乙酰胺(RPR209120)；其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1，2-二烯酰基-sn-丙三基-3-乙基胆碱磷酸(EPCs)，如1，2-二油酰-sn-丙三基-3-乙基胆碱磷酸、1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-乙基胆碱磷酸、1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-乙基胆碱磷酸、其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1，2-二硬脂酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1，2-二油酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。
非氨基酸聚阳离子脂质的实例包括四甲基四棕榈酰精胺(TMTPS)、四甲基四油烯基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油烯基精胺(TMDOS)、其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸聚阳离子脂质的实例包括2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二-十八烷基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八碳-9-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS-9-en)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DLinGS)；3-β-(N4-(N1，N8-二羰苯酰氧基亚精胺)氨基甲酰)胆固醇(GL-67)、(9Z，9’Z)-2-(2，5-双(3-氨基丙基氨基)戊氨基)丙烷-1，3-二基-二-十八碳-9-烯酸酯(DOSPER)；2，3-二油烯氧基-N-[2(精胺羰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)；其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括DS404-28 BGTC(CAS 182056-06-0)、DOSPER(CAS 178532-92-8)、GL-67(179075-30-0)、RPR209120(CAS433292-13-8)、DOGS(12050-77-7)、DOGS(9-en，C18:1)、DLinGS(C18:2)、和DOTMA(104162-48-3)。
非氨基酸阳离子脂质的实例描述于美国专利号4,897,355；5,279,833；6,733,777；6,376,248；5,736,392；5,334,761；5,459,127；2005/0064595；5,208,036；5,264,618；5,279,833；5,283,185；5,753,613；和5,785,992中。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分和氨基酸脂质和非氨基酸非-阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物是一种或多种RNA组分和一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸非阳离子脂质的混合物或复合物。
非氨基酸非阳离子脂质包括中性、两性和阴离子脂质。因此，非-阳离子两性脂质可以包括阳离子头基。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括1，2-二月桂酰-sn-甘油(DLG)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(DMG)；1，2-二棕榈酰-sn-甘油(DPG)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油(DSG)；1，2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DPPA)；1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA)；1，2-二arachidoyl-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DAPC)；1，2-二月桂酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DLPC)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DMPC)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-0-乙基-3-胆碱磷酸(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DPPC)；1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DSPC)；1，2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1，2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；DMPG)；1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸-sn-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG)；1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸丙三基(钠盐；DSPG)；1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸-sn-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(PLinoPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(POPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG)；1-棕榈酰-2-4o-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(P-lyso-PC)；1-硬脂酰-2-lyso-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(S-lyso-PC)；和其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合化合物和聚合物脂质缀合物或聚合脂质，如含有分子量为300、500、1000、1500、2000、3500或5000的PEG范围的聚乙二醇化的脂质，包括聚乙二醇、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇750)-1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-750)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-5000)；胆固醇硫酸酯钠盐(SCS)；其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DOPE-PEG、DLPE-PEG、DDPE-PEG DLinPE-PEG、和二酰基甘油-PEG-2000或-5000。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如多支聚乙二醇化化合物，例如DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DSPE-PG8G甘油聚合物脂质。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二植烷酰磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、1，2-二油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DOPC)、和1，2-二植烷酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DPhPC)。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆固醇、固醇、和类固醇，如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、gorgostanes、羊毛甾烷、环波罗烷、以及前述的任何固醇或动物甾醇衍生物、和其生物中间体和前体，其包括例如胆固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚乙烯二醇化的胆固醇和胆甾烷3-氧代(C1-22酰基)衍生物，如胆固醇乙酸酯、胆固醇花生四烯酸酯、胆固醇丁酸酯、胆固醇己酸酯、胆固醇辛酸酯、胆固醇正癸酸酯、胆固醇十二烷酸酯、胆固醇肉豆蔻酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇山嵛酸酯、胆固醇硬脂酸酯、胆固醇二十四酸酯、胆固醇壬酸酯、胆固醇正戊酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇反油酸脂、胆固醇芥酸酯、胆固醇庚酸酯、胆固醇反亚油酸酯、胆固醇亚油酸脂、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自植物固醇的化合物，包括植物甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麦甾醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆汁酸、胆酸、鹅胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甲基石胆酸、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括糖皮质激素、皮质醇、氢化可的松、皮质脂酮、Δ5-孕烯醇酮、孕酮、去氧皮质酮、17-OH-孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-去氧皮质醇、脱氢表雄甾酮、硫酸脱氢表雄甾酮、雄烯二酮、醛甾酮、18-羟基皮质甾酮、四氢化可的松、四氢化可的松、可的松、强的松、6α-甲基强的松、9α-氟-16α-羟基波尼松龙、9α-氟-16α-甲强龙、9α-氟皮质醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括雄激素、***、二氢睾酮、雄(甾)烯二醇、雄(甾)烯二酮、雄(甾)烯二酮、3α，5α-雄(甾)烷二醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括***、雌三醇、雌素酮、***、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自光甾醇和维生素D化合物的化合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括范围从C10:0至C22:6的具有尾的脂质，例如DDPE(C10:0)(CAS 253685-27-7)、DLPE(C12:0)(CAS 59752-57-7)、DSPE(C18:0)(CAS 1069-79-0)、DOPE(C18:1)(CAS 4004-05-1)、DLinPE(C18:2)(CAS 20707-71-5)、DLenPE(C18:3)(CAS 34813-40-6)、DARAPE(C20:4)(CAS 5634-86-6)、DDHAPE(C22:6)(CAS 123284-81-1)、DPhPE(16:0[(CH3)4])(CAS 201036-16-0)。
非氨基酸阴离子脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇(pi(4)p、pi(4，5)p2)、心磷脂(钠盐)、溶血磷脂、氢化磷脂、鞘脂、神经节苷脂、植物鞘氨醇、鞘氨醇、其药学上可接受的盐和其混合物。
调节性RNA和RNA干扰的应用
在一些方面中，本发明一般地涉及调节性RNA和RNA干扰、反义治疗剂和RNA治疗剂的递送领域。更具体地说，本发明涉及核糖核酸的组合物和制剂，和其用作药剂和用于递送治疗剂的用途。本发明一般地涉及在RNA干扰中使用核糖核酸在细胞或在哺乳动物中进行基因表达的基因特异性抑制，从而改变疾病状态或表型的方法。
RNA干扰是指通过称作短干扰性RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)来进行调节的序列特异性转录后基因沉默的方法。参见Fire等，Nature391：806，1998，和Hamilton等，Science 286：950-951，1999。RNAi为不同菌群和门为共有，而且确信是抵抗外来基因表达的进化保守性细胞防御机制。参见Fire等，Trends Genet.15：358，1999。
因此RNAi是普遍存在的内源机制，其利用小型的非编码RNAs来沉默基因表达。参见Dykxhoorn，D.M.和J.Lieberman，Annu.Rev.Biomed.Eng.8：377-402，2006。RNAi可以调节参与细胞死亡、分化和发育的重要基因。RNAi还可以防止基因组免受由转座子和病毒编码的遗传元件侵袭。当将siRNA导入细胞中时，它可以结合内源RNAi组织机构，从而破坏含具高度特异性的互补序列的mRNA的表达。任何致病基因和任何细胞类型或组织都可以潜在地被标靶。该技术已经快速用于基因功能分析和药物靶的发现和确认。控制性RNAi也具有很大的治疗前途，虽然将siRNAs导入体内细胞还存在着许多障碍。
虽然RNAi的机制尚未完全表征，但认为是通过切割靶mRNA。RNAi应答涉及称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物，其调节互补于siRNA双螺旋反义链的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在siRNA双螺旋反义链的互补中间区域中(Elbashir等，Genes Dev.15：188，2001)。
完成RNAi的一个方法是将siRNA引入细胞或在细胞中表达siRNA。另外一个方法是利用称作dicer的内源核糖核酸酶III酶。dicer的一个活性是将长dsRNA加工成siRNAs。参见Hamilton等，Science 286：950-951，1999；Berstein等，Nature 409：363，2001。衍生自dicer的siRNA通常是全长约21-23个核苷酸，并有约19个碱基对双螺旋化。参见Hamilton等，见上；Elbashir等，Genes Dev.15：188，2001。实质上，可以将长dsRNA作为siRNA的前体导入细胞。
本发明提供了一系列的组合物、制剂和方法，其包括调节性RNA、干扰性核酸或其前体与各种组分包括脂质、氨基酸脂质和天然或合成的聚合物的组合。
在本文中，术语“dsRNA”是指任何核酸分子，其含有至少一个核糖核苷酸分子且能抑制或下调基因表达，例如以序列特异性方式通过促进RNA干扰(“RNAi”)或基因沉默。本发明的dsRNAs可以是适合Dicer的底物，或是适合与RISC结合以通过RNAi来调节基因沉默的底物。dsRNA的一条或两条链可以进一步包括末端磷酸基团，如5’-磷酸或5’，3’-二磷酸。在本文中，dsRNA分子，除了至少一个核糖核苷酸之外，可以进一步包括取代、化学修饰的核苷酸、和非核苷酸。在一些实施方式中，dsRNA分子包括高至约100％的核苷酸位置的核糖核苷酸。
dsRNA分子的实例可参见例如美国专利申请号11/681,725、美国专利号7,022,828和7,034,009、和PCT国际申请公开号WO/2003/070897。
修饰性核苷酸的实例参见美国专利号6,403,566、6,509,320、6,479,463、6,191,266、6,083,482、5,712,378、和5,681,940。修饰性核苷酸可以具有以下结构：
Figure G2008800147206D00441
其中，X是O或CH2，Y是O，且Z是CH2；R1选自基团：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和杂环，其中杂环是选自基团：取代的1，3-二嗪、未取代的1，3-二嗪和未取代的7H咪唑并[4，5]1，3-二嗪；且R2、R3独立地选自基团H、OH、DMTO、TBDMSO、BnO、THPO、AcO、BzO、OP(NiPr2)O(CH2)2CN、OPO3H、二磷酸盐和三磷酸盐，其中R2和R3同时可以是PhCHO2、TIPDSO2或DTBSO2。在本文中，缩写“Ac”是指乙酰基；缩写“Bn”是指苯甲基；缩写“Bz”是指苯甲酰基；缩写“DMT”是指二甲氧基三苯甲基；缩写“THP”是指四氢吡喃基；缩写“TBDMS”是指叔丁基二甲基甲硅烷基；缩写“TIPDS”是指四异丙基二甲硅烷基；和缩写“DTBS”是指二(叔丁基)甲硅烷基。
另外，在本文中，术语“dsRNA”、“RNAi诱导剂”和“RNAi制剂”与用于描述能调节序列特异性RNAi的核酸分子，包括内消旋双螺旋RNA(mdRNA)、带切口的dsRNA(ndsRNA)、缺口的dsRNA(gdsRNA)、短干扰性核酸(siRNA)、siRNA、微小RNA(miRNA)、单链RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰性寡核苷酸、短干扰性取代的寡核苷酸、短干扰性修饰的寡核苷酸、化学修饰的dsRNA、和转录后基因沉默型RNA(ptgsRNA)、以及上述任一的前体是同义的。
术语“大双链(ds)RNA”是指大于约40个碱基对(bp)至约100bp或更大，尤其是高至约300bp至约500bp的任意双链RNA。大dsRNA序列可以代表mRNA片段或完整的mRNA。双链结构可以通过自身互补的核酸分子形成或通过两种或多种明显的互补核酸分子链退火形成。
在一些方面中，dsRNA包括包含第一链(反义)和第二链(正义)的两个分离的寡核苷酸，其中所述反义链和所述正义链是自身互补的(即各链含有与另一个链核苷酸序列互补的核苷酸序列，且两个分离的链形成双螺旋或双链结构，例如，其中双链区是约15至约24个碱基对，或约26至约40个碱基对)；反义链包括互补于靶核酸分子(如人mRNA)中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分；且正义链包括对应于(即同源于)靶核酸序列(如对应于靶核酸约15至约25个核苷酸或约26至约40个核苷酸的正义链或其部分)中的核苷酸序列或其部分。
在一些实施方式中，dsRNA可以组装自单一寡核苷酸，其中dsRNA的自身互补的正义和反义链一起通过核酸基接头或非核酸基接头相连接。在一些实施方式中，dsRNA分子的第一(反义)链和第二(正义)链通过如本文描述的和本领域所已知的核苷酸或非核苷酸接头共价连接。在一些实施方式中，第一dsRNA分子通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头与至少一个第二dsRNA分子共价连接，其中第一dsRNA分子可以与多个其它dsRNA分子(相同或不同)或其组合物连接。在一些实施方式中，连接的dsRNA可以包括与连接的dsRNA形成内消旋双螺旋的第三链。
在一些方面，本文所述的dsRNA分子形成内消旋双螺旋RNA(mdRNA)，其具有三个或更多的链，例如′A′(第一或反义)链、′S1′(第二)链和′S2′(第三)链，其中′S1′和′S2′链互补并形成具有′A′链的非重叠区的碱基对(bp)(如mdRNA可以具有A:S1S2形式)。S1、S2或更多的链共同本质上含有′A′链的正义链。通过′S1′和′A′链退火形成的双链区与通过′S2′和′A′链退火形成的双链区不相同且非重叠。mdRNA分子是“缺口”分子，意思是范围为0个核苷酸到高至约10个核苷酸的“缺口”。在一些实施方式中，A:S1双螺旋与A:S2双螺旋被从′A′链的至少一个非配对核苷酸(高至约10个非配对核苷酸)获得的缺口分开，所述缺口位于A:S1双螺旋和A:S2双螺旋之间，而且不同于一种或多种′A′、′S1′或′S2′链的3’-端的任何一个或多个非配对核苷酸。在一些实施方式中，A:S1双螺旋与A:B2双螺旋被在A:S1双螺旋和A:S2双螺旋间的零核苷酸缺口分开(即其中仅两个核苷酸间的磷酸二酯键是不完整的或缺失多核苷酸分子的缺口)，其也称作带切口的dsRNA(ndsRNA)。例如，A:S1S2可以由具有结合总共约14个碱基对至约40个碱基对的至少两个双链区的dsRNA组成，且双链区被约0至约10个核苷酸的缺口分开，任选地具有平末端，或A:S1S2可以由被高至10个核苷酸的缺口分开的具有至少两个双链区的dsRNA组成，其中至少一个双链区含有约5个碱基对至13个碱基对。
如本文所述，含有三条或更多条链的dsRNA可以被称作“内消旋双螺旋”RNA(mdRNA)。mdRNA分子的实例可以参见美国临时专利申请60/934,930和60/973,398。
dsRNA或大dsRNA可以包括取代或修饰，其中所述取代或修饰可以在磷酸骨架键、糖、碱基或核苷中。所述核苷取代可以包括天然的非标准核苷(如5-甲基尿苷或5-甲基胞苷或2-硫代胸腺嘧啶核糖核苷)，且所述骨架、糖或核苷修饰可以包括烷基或杂原子取代或添加，如甲基、烷氧基烷基、卤素、氮或硫、或本领域已知的其它修饰。
另外，在本文中，术语“RNAi”的意思等同于用于描述序列特异性RNA干扰如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学的其它术语。例如，本发明的dsRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平或其组合上通过表观遗传学沉默基因。
在一些方面中，本发明提供了包括靶向一种或多种基因或靶转录物的一种或多种RNAi诱导剂，以及一种或多种递送组分的组合物。递送组分的实例包括脂质、肽、聚合物、聚合脂质和其缀合物。
本发明的组合物和制剂可以用于将RNAi诱导实体递送如dsRNA、siRNA、mdRNA、miRNA、shRNA或RNAi诱导载体递送至包括人在内的完整的哺乳动物患者的细胞内，而且可以用于将这些制剂递送至培养中的细胞内。
本发明还提供了将一种或多种RNAi诱导剂或实体递送至哺乳动物体内的细胞、器官和组织的方法。在一些方面，可以通过不同的途径引入包含RNAi诱导实体以使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞吸收，在此可以调控靶转录物的表达。
通常，本发明包括RNAi诱导剂，其是预防和治疗以各种异常途径为特征的疾病或病症的有用治疗剂。例如，侵染哺乳动物的病毒可以通过控制宿主细胞的细胞机制来进行复制。参见如Fields Virology(2001)。因此，dsRNAs可用于破坏控制病毒产生或复制的病毒路径。
本发明包括通过利用具有广谱抵抗靶病毒株效力的一种或多种治疗性RNAi诱导剂来治疗或预防患者病毒侵染的方法。本发明的RNAi诱导剂可以靶向已知的病毒变体株或病毒变体中的病毒基因序列，并且在这些变体内表现出靶病毒基因的序列特异性基因沉默。例如，RNAi诱导剂可以靶向和表现出抵抗流感病毒季节菌株以及流感变体菌株的效力。
本发明的组合物和制剂可以用于递送药物制剂或生物活性试剂至各种体外细胞。体外递送的细胞实例包括表皮细胞如A549、永久细胞系如HeLa、肝细胞瘤细胞如HepG2、犬胶质肉瘤细胞如9L/LacZ、人单核细胞如THP-1、Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)、各种纤维原细胞系、和在存在和缺失各种血清的培养基中的原代细胞等。
本发明的组合物和制剂可用于递送药物试剂或生物活性试剂至各种体内细胞，组织或器官。体内递送试剂的方法包括局部、肠内和肠胃外途径。体内递送试剂的方法实例包括颗粒或液滴吸入、鼻或鼻咽滴剂、颗粒、或悬浮液递送、透皮和经黏膜途径、以及通过肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、脑脊髓膜内、骨内、腹膜内和硬膜外的注射或灌输途径。
在一些实施方式中，试剂可以通过直接接触来源于哺乳动物患者的细胞，组织或器官离体给药。
利用本发明的组合物或制剂来递送的药物试剂或生物活性试剂可以是任何形式，包括例如纯净形式、结晶形式、固体形式、纳米颗粒、浓缩形式、复合物形式、或缀合物形式。
本发明还提供了递送一种或多种RNAi诱导实体至哺乳动物体内的器官和组织的方法。在一些实施方式中，可以通过不同的途径引入包含RNAi诱导实体、一种或多种氨基酸脂质、和一种或多种其它的脂质组分的组合物以使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞吸收，在此可以调控靶转录物的表达。
本发明提供了含有递送核酸和基因沉默RNA治疗剂的各种脂质的药学上可接受的核酸组合物。具体地说，本发明提供了用于体外和体内递送dsRNAs以降低、下调或沉默靶核酸序列翻译或基因表达的组合物和方法。这些组合物和方法可用于预防和/或治疗哺乳动物中的疾病。在本发明的示例性的方法中，将核糖核酸分子如siRNA或shRNA与氨基酸脂质接触以配制成能施用于细胞或患者如哺乳动物的组合物。在一些实施方式中，本发明提供了通过使含核酸的组合物与细胞接触来在细胞内递送siRNA或shRNA的方法。
在示例性的实施方式中，本发明包括包含核酸分子如双链RNA(dsRNA)、短干扰性RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)的组合物，所述核酸分子与氨基酸脂质和聚合脂质混合或复合以形成提高核酸分子细胞内递送的组合物。在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括dsRNA和可以是阳离子或非阳离子的一种、两种或多种氨基酸脂质。在某些变例中，递送组合物可以包含dsRNA、氨基酸脂质、和一种或多种聚合脂质。在一些实施方式中，递送组合物可以包括dsRNA、氨基酸脂质、一种或多种其它脂质、和一种或多种聚合脂质。本发明的组合物可以形成稳定颗粒，其能引入作为干扰性RNA制剂的dsRNA。本发明的组合物和制剂可以包括进一步的递送增强组分或赋形剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括直径约5nm至约400nm的稳定的RNA脂质颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50nm至约150nm的均匀直径。
在本发明的示例性的组合物中，双链RNA可以与氨基酸脂质混合或复合，以形成相比于使靶细胞与裸dsRNA接触能提高dsRNA细胞内递送的组合物。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约0.5％至约70％(摩尔％)的一种或多种氨基酸脂质，并包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约10％至约55％的一种或多种氨基酸脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约15％至约35％的一种或多种氨基酸脂质。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约2％至约95％(摩尔％)的一种或多种非氨基酸非阳离子脂质，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。递送在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含约20％至约75％、或约45％至约75％、或约45％至约55％的一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含约10％至约50％的一种或多种非阳离子脂质。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约0.2％至约20％(摩尔％)的一种或多种聚合脂质，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。递送在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约0.5％至约10％的一种或多种聚合脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占组合物约1％至约5％的一种或多种聚合脂质。
核酸治疗剂组合物和应用
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物患者疾病或病症的方法。可以递送向患有与能被该组合物降低、减少、下调或沉默的基因表达或过表达相关疾病或病症的患者施用包含干扰性RNA、氨基酸脂质、非氨基酸非阳离子脂质、聚合脂质、和一种或多种递送增强组分或赋形剂的治疗有效量的本发明组合物。
本发明包括通过向患者施用治疗有效量的组合物来治疗肺部疾病，如呼吸困难、哮喘、囊肿性纤维化、肺纤维化、慢性障碍性肺病、支气管炎或气肿的方法。
本发明包括治疗风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、病毒性疾病(包括肝炎和流感)、或癌症的方法。
制备脂质体的方法参见例如G.Gregoriadis，Liposome Technology(CRCPress 1984)，M.J.Ostro，Liposomes(Marcel Dekker 1987)；Subhash C.Basu和Manju Basu，Liposome Methods and Protocols(2002)。
可以首先在适合的培养基如细胞培养基中将核酸组分、氨基酸脂质和任何其它组分混合在一起，然后添加一种或多种其它脂质或化合物至该混合物。可选地，可以首先在适合的培养基如细胞培养基中混合氨基酸脂质，然后添加核酸组分。
在本发明的一些实施方式中，将dsRNA与一种或多种氨基酸脂质、或一种或多种氨基酸脂质和非氨基酸非阳离子脂质的组合物混合。
在一些实施方式中，氨基酸脂质转染/递送制剂可以通过干燥制剂的再水合来制备。脂质可以溶解在CHCl3中，氮气中干燥，并在如pH 7.4下在10mMHEPES、5％葡萄糖中再水合，且经声波处理形成脂质体。脂质体可以在HEPES葡萄糖中稀释。dsRNA可以在10mM HEPES、5％葡萄糖(pH 7.4)中以0.0008μmol/mL稀释。1体积的脂质体可以加入到1体积dsRNA中并涡旋(自组装)，以提供终dsRNA浓度为100nM至6.25nM dsRNA。该混合物可以在存在细胞培养基时稀释1-4份。
干扰性RNA试剂可以与氨基酸脂质或聚合脂质复合或缀合，并与一种或多种非氨基酸非阳离子脂质，或一种或多种非氨基酸非-阳离子和非氨基酸阳离子脂质的组合物混合。
干扰性RNA试剂和氨基酸脂质可以首先混合在一起，然后加入一种或多种非氨基酸非阳离子脂质，或加入到适合培养基如细胞培养基中的非氨基酸非阳离子和非氨基酸阳离子脂质组合。可选地，可以首先混合氨基酸脂质和非氨基酸脂质组分，然后加入适合培养基中的RNA试剂。
在一些实施方式中，本发明包括胶束分散组合物，其含有与氨基酸脂质和分散剂混合和复合的药物或活性试剂，从而形成能提供细胞内递送药物或活性试剂组合物。
在一些实施方式中，本发明的分散组合物可以包括一种或多种药物或活性试剂、一种或多种氨基酸脂质、和一种或多种分散剂。在某些变化中，递送组合物可以包括药物或活性试剂、分散剂、氨基酸脂质、和任选的聚合脂质。本发明的分散组合物可以形成能引入药物或活性试剂的稳定颗粒。
在一些方面中，本发明的分散组合物可以包含直径约5nm至约400nm的稳定的核酸分散颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50nm至约150nm的均匀直径。
胶束分散体可以用于配制和改进包括RNAi治疗剂的药物或活性试剂的生物利用率。而常规的脂质-药物复合物可以包括保持亲水性或水性核心的脂质双分子层或脂质体结构，胶束分散体可以提供具有疏水性油样核心的分散液滴或纳米颗粒。分散纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。分散结构利用脂质体结构来递送活性试剂可以避免固有的某些弱势，而且因为亲脂性核心而可以提供递送优势。
本发明提供了一系列的胶束分散组合物，其包含用于药物或药剂且用于递送和施用RNA制剂的脂质和分散剂。
分散剂的实例包括合成化合物，包括聚氧甘油酯，如聚乙二醇化的癸酰基甘油酯、乙氧基二甘醇、聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯、二甘醇单***和其混合物。分散剂的实例包括LABRAFIL、LABRASOL、ARLATONE、TRANSCUTOL和其混合物。分散剂的实例包括合成的化合物，如烷基磷酸-N-甲基乙醇胺和烷氧基肌氨酸(alkoyl creatine)。分散剂的实例包括FOS-MEA和CRODASINIC。
在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括药物或活性试剂、一种或多种油、一种或多种氨基酸脂质、和乳化剂和稳定剂脂质。在某些变化中，递送组合物可以包括药物或活性试剂、油、脂质乳化剂、氨基酸脂质、非阳离子脂质、和聚合脂质。
本发明的组合物可以形成可以引入药物或活性试剂的稳定颗粒。在一些方面中，本发明的组合物包括直径为约5nm至约400nm的稳定的药物或活性试剂乳剂颗粒。在一些实施方式中，颗粒具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒具有约50nm至约150nm的均匀直径。
在本发明的示例性的组合物中，药物或活性试剂可以与油、乳化剂、氨基酸脂质、和聚合体稳定化的脂质混合或复合，以形成能提高细胞内递送药物或活性试剂的组合物。
水包油乳剂可以用于配制和提高包括RNAi治疗剂的药物或活性试剂的生物利用率。
而常规的脂质-药物复合物可以包含保持亲水性或水性核心的脂质双分子层或脂质体结构，水包油乳剂可以提供具有围绕疏水性油核心的脂质层的乳剂液滴或纳米颗粒。乳剂液滴或纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。利用脂质体结构来递送活性试剂，乳剂结构可以避免固有的某些弱势，并且因为亲脂性核心而能提供递送优势。
本发明提供了一系列的新型乳剂组合物，包括新型组成和干扰性RNA试剂与油、乳化剂和脂质组分的使用。
油的实例包括合成的油、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇醚、甘油油、胆固醇油、植物油、花生油、精油、矿物油、脂质可溶性化合物如生育酚和维生素E、和其混合物。油的实例包括合成油，如CAPRYOL 90(丙二醇单酯)、CAPRYOL PGMC(丙二醇单酯)、LABRAFAC PC(丙二醇单酯)、LABRAFACPG(丙二醇二酯)、LAUROGLYCOL 90(丙二醇单酯)、LAUROGLYCOL FCC(丙二醇单酯)、PLUROL OLEIQUE CC 497(丙二醇单酯)、LABRAFACLIPOPHILE WL 1349(甘油三酯)、PECEOL(甘油单酯)、MAISINE 35-1(甘油单酯)、和其混合物。
RNA治疗剂组合物和方法
本发明提供了利用调节RNA如通过RNA干扰来调节基因表达的组合物和方法。本发明的组合物可以递送核糖核酸试剂至能产生RNAi应答的细胞。适合本发明的核酸试剂的实例包括双链核酸、修饰的或降解抗性的核酸、RNA、siRNA、siRNA、shRNA、miRNA、piRNA、RNA拮抗剂、单链核酸、DNA-RNA嵌合体、反义核酸和核酶。在本文中，术语siRNA、siRNA和shRNA分别包括siRNA、siRNA和shRNA的前体。例如，术语siRNA包括适合作为dicer酶底物的RNA或双链RNA。
可用于本发明的核糖核酸试剂可以靶向各种基因。适合作为靶标的人基因的实例包括TNF、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、BCR-ABL、和MAPK家族等。适合作为靶标的人基因的实例和其核酸序列包括描述于PCT/US08/55333、PCT/US08/55339、PCT/US08/55340、PCT/US08/55341、PCT/US08/55350、PCT/US08/55353、PCT/US08/55356、PCT/US08/55357、PCT/US08/55360、PCT/US08/55362、PCT/US08/55365、PCT/US08/55366、PCT/US08/55369、PCT/US08/55370、PCT/US08/55371、PCT/US08/55372、PCT/US08/55373、PCT/US08/55374、PCT/US08/55375、PCT/US08/55376、PCT/US08/55377、PCT/US08/55378、PCT/US08/55380、PCT/US08/55381、PCT/US08/55382、PCT/US08/55383、PCT/US08/55385、PCT/US08/55386、PCT/US08/55505、PCT/US08/55511、PCT/US08/55515、PCT/US08/55516、PCT/US08/55519、PCT/US08/55524、PCT/US08/55526、PCT/US08/55527、PCT/US08/55532、PCT/US08/55533、PCT/US08/55542、PCT/US08/55548、PCT/US08/55550、PCT/US08/55551、PCT/US08/55554、PCT/US08/55556、PCT/US08/55560、PCT/US08/55563、PCT/US08/55597、PCT/US08/55599、PCT/US08/55601、PCT/US08/55603、PCT/US08/55604、PCT/US08/55606、PCT/US08/55608、PCT/US08/55611、PCT/US08/55612、PCT/US08/55615、PCT/US08/55618、PCT/US08/55622、PCT/US08/55625、PCT/US08/55627、PCT/US08/55631、PCT/US08/55635、PCT/US08/55644、PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、PCT/US08/55662、PCT/US08/55672、PCT/US08/55676、PCT/US08/55678、PCT/US08/55695、PCT/US08/55697、PCT/US08/55698、PCT/US08/55701、PCT/US08/55704、PCT/US08/55708、PCT/US08/55709和PCT/US08/55711中的那些。
本发明要递送的RNA可以具有互补于病毒基因区域的序列。例如，本发明的某些组合物和方法可以用于调节感冒病毒的病毒基因组的表达。在一些实施方式中，本发明提供了通过RNA干扰来调节流感的表达和传染活性的组合物和方法。流感的表达和/或活性可以通过递送例如具有互补于流感的RNA聚合酶亚单位区域的序列的短干扰性RNA分子至细胞来进行调节。靶向流感病毒的RNA实例参见美国专利申请号20070213293 A1。
在一些实施方式中，本发明提供了通过给患者施用含有效量的RNAi诱导化合物，如短干扰性寡核苷酸分子或其前体，来抑制患者内靶转录物表达的组合物和方法。RNAi利用小干扰性RNAs(siRNAs)来靶向信使RNA(mRNA)和削弱翻译。本发明使用的siRNA可以是dicer加工的前体，例如加工成siRNA的长dsRNA。本发明提供了治疗或预防与靶转录物或由靶转录物编码的肽或蛋白活性表达相关的疾病或病症的方法。
基于RNAi的治疗策略可以通过切断病毒或微生物的生长或功能，以及通过切断内源基因产物在疾病通道中的功能来治疗多种疾病。
在一些实施方式中，本发明提供了递送RNAi诱导实体如短干扰性寡核苷酸分子和其前体的新型组合物和方法。具体地，本发明提供了包含靶向患者细胞、组织和/或器官的一种或多种转录物的RNAi诱导实体的组合物。
siRNA可以是具有约19个核苷酸长度的互补性区域的两条RNA链。siRNA任选包括一个或两个单链突出端或环。
shRNA可以是具有自身互补区域的单一RNA链。单一RNA链可以形成具有茎和环和任选地在RNA的5′和/或3′部分的一种或多种非配对部分的发夹结构。
活性治疗剂可以是具有体内核酸酶降解改良抗性和/或改善的细胞吸收的化学修饰的RNA，其保留RNAi活性。
本发明的siRNA试剂可以是具有互补于靶基因区域的序列。本发明的siRNA可以具有29-50个碱基对，例如具有互补于靶基因区序列的dsRNA。另外，双链核酸可以是dsDNA。
在一些实施方式中，活性试剂可以是能够调控基因产物表达的短干扰性核酸(siRNA)、短干扰性RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA或短发夹RNA(shRNA)。
提供了对比方法和组合物，其靶向与患者特定疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达，包括已知由于与所选疾病状况相关的因果或起作用的因素使其表达异常增加的多种基因中的任意一个。
本发明的RNAi诱导化合物可以与其它已知疗法联合来治疗疾病。
在一些实施方式中，本发明涉及包含与递送增强化合物混合或复合或缀合的小核酸分子，如短干扰性核酸、短干扰性RNA、双链RNA、微RNA或短发夹RNA的组合物。
在本文中，术语“调节RNA”、“短干扰性核酸”、“siRNA”、“短干扰性RNA”、“短干扰性寡核苷酸分子”和“化学修饰的短干扰性核酸分子”是指通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来调节、抑制或下调基因表达或如病毒复制的任何核酸分子。调节性RNA包括单链RNA拮抗剂。
在一些实施方式中，siRNA是含有自身互补的正义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中反义区含有互补于用于下调表达的靶核糖核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义区包含对应于(即其在序列上实质一致)靶核糖核酸序列的核苷酸序列或其部分。
在本文中，“siRNA”是指小干扰性核糖核苷酸，即相对短长度的双链核酸或任选地其较长前体。在一些实施方式中，本发明中可用siRNA的长度优选为约20至50bp的长度。但是，在此对可用siRNA长度，包括siRNA没有特殊限制。例如，siRNA可以最初以前体形式存在于细胞中，所述前体形式与递送时或递送至靶细胞后表现和发挥基因沉默活性的siRNA的最终或加工形式实质上不同。例如，siRNA的前体形式可以包括前体序列元件，所述元件在递送时或递送后就会被加工、降解、改变或切割，以产生在细胞内有介导基因沉默活性的siRNA。在一些实施方式中，使用的siRNA具有的前体长度为例如约100-200个碱基对、或50-100个碱基对、或少于约50个碱基对，其在靶细胞内会产生有活性的，加工过的siRNA。在其它实施方式中，可用的siRNA或siRNA前体长度约为10至49bp、或15至35bp、或约21至30bp。
在本发明的一些实施方式中，增强递送多核苷酸的多肽可以用于促进递送核酸分子包括siRNA的大核酸前体的递送。例如，本文的方法和组合物可用于提高递送代表期望siRNA的“前体”的较大核酸的递送，其中前体氨基酸可以在递送至靶细胞之前、期间或之后被切割或被加工，从而形成用于在靶细胞内调节基因表达的活性siRNA。
例如，选择的dsRNA前体多核苷酸可以是环状的单链多核苷酸，其具有两种或多种环结构和含有自身互补的正义和反义区的茎，其中所述反义区含有互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区具有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分，且其中所述环状多核苷酸可以被在体内或体外加工，以产生能诱导RNAi的活性dsRNA分子。
本发明的siRNA分子，特别是非前体形式，可以是少于30个碱基对、或约17-19bp、或19-21bp、或21-23bp。
siRNA可以在哺乳动物***内调节选择性基因沉默。具有短环和茎内19-27个碱基对的发夹RNA也选择性地沉默与双链茎内序列同源的基因的表达。哺乳动物细胞可以将短发夹RNA转变为siRNA以调节选择性基因沉默。
RISC调节具有互补于siRNA双螺旋反义链的序列的单链RNA切割。靶RNA的切割发生在互补于siRNA双螺旋反义链的区域内。21个核苷酸的siRNA双螺旋通常在包含两个核苷酸3′-突出端时活性最高。
用脱氧核糖核苷酸代替具有2-核苷酸3′突出端的21-mer siRNA双螺旋的3′-突出端片段可能对RNAi活性无副作用。将siRNA各末端的高至4个核苷酸用脱氧核糖核苷酸代替是可以接受的。
可选地，siRNA可以作为单个或多个转录产物来递送，所述转录产物由编码单个或多个siRNA且指向其在靶细胞内表达的多核苷酸载体所表达。在这些实施方式中，欲在靶细胞内表达的siRNA终转录产物的双链部分可以是如15-49bp、15-35bp、或约21-30bp长。
在本发明的一些实施方式中，两条链是配对的siRNAs的双链区可以包括凸起或错配的部分，或凸起和错配的部分。两条链是配对的siRNA的双链部分不限于完全配对的核苷酸片段，且可以包含由于如错配(相应的核苷酸不互补)、凸起(在一条链上缺失对应的互补核苷酸)或突出端引起的非配对部分。在不干扰siRNA形成的情况下可以包含非配对部分。在一些实施方式中，“凸起”可以包含1至2个非配对的核苷酸，且其中两条链配对的siRNA的双链区可以包括约1-7、或约1-5个凸起。另外，包括在siRNA双链区内的“错配”部分可以存在的数量是约1-7或约1-5个。错配情况中最常见的是，一个核苷酸是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。所述错配可以归因于如在编码正义RNA的对应DNA中C突变成T、G突变成A、或其混合，但其它原因也是可以预料的。
本发明的siRNA的末端结构可以是平末端或粘性(突出)末端，只要siRNA保持其沉默靶基因表达的活性。粘性(突出端)末端结构并不限于3′突出端，且包括5′突出结构，只要其保持诱导基因沉默的活性。另外，突出核苷酸的数量并不限于2个或3个核苷酸，而可以是任意数量的核苷酸，只要其保持诱导基因沉默的活性。例如，突出端可以包含1至约8个核苷酸或2至4个核苷酸。
具有突出端结构的siRNA的长度可以表述为配对的双螺旋部分和各末端的任意突出部分。例如，具有2-bp 3’反义突出端的25/27-mer siRNA双螺旋具有25-mer正义链和27-mer反义链，其中配对部分长度为25bp。
任意突出端序列都可以具有对靶基因的低特异性，而且可以与靶基因序列不互补(反义)或相同(正义)。只要siRNA保持基因沉默活性，其就可以在突出端部分包括低分子量结构，例如天然RNA分子如tRNA、rRNA、病毒RNA，或人工RNA分子。
siRNAs的末端结构可以具有茎-环结构，其中双链核酸的一侧末端通过接头核酸例如接头RNA连接。双链区(茎部分)的长度可以是如15至49bp、或15至35bp、或约21至30bp。可选地，作为靶细胞中表达的siRNA的最终转录产物的双链区长度可以是如约15至49bp、或15至35bp、或约21至30bp。
siRNA可以包含具有互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列的单链多核苷酸或其部分，其中单链多核苷酸可以包含末端磷酸基团如5′-磷酸(参见如Martinez等，Cell.110：563-574，2002，和Schwarz等，Molecular Cell10：537-568，2002)，或5′，3′-二磷酸。
在本文中，术语siRNA不限于仅含天然存在的RNA或DNA的分子，但也包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方式中，本发明的短干扰性核酸分子缺少含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在一些实施方式中，短干扰性核酸不需要存在用于调节RNAi等的具有2′-羟基的核苷酸，本发明的短干扰性核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(如具有2′-OH基团的核苷酸)。然而，不需要在siRNA分子中存在核糖核苷酸来维持RNAi的siRNA分子可以具有结合的接头或其它的结合的或连接的基团、实体、或包含具有2′-OH基团的一种或多种核苷酸的链。siRNA分子可以在至少约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。
在本文中，术语siRNA包括能调节序列特异性RNAi的核酸分子，例如，短干扰性RNA(siRNA)分子、双链RNA(dsRNA)分子、微RNA分子、短发夹RNA(shRNA)分子、短干扰性寡核苷酸分子、短干扰性核酸分子、短干扰性修饰的寡核苷酸分子、化学修饰的siRNA分子、和转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)分子等。
在一些实施方式中，siRNA分子包括分离的正义和反义序列或区域，其中正义和反义区通过核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、和/或堆集相互作用非共价连接。
“反义RNA”是具有互补于靶基因mRNA的序列的RNA链，其能通过结合靶基因mRNA来诱导RNAi。
“正义RNA”是具有互补于反义RNA的序列的RNA链，且与其互补的反义RNA退火而形成siRNA。
在本文中，术语“RNAi结构”或“RNAi前体”是指RNAi诱导化合物，如小干扰性RNA(siRNA)、发夹RNA、和其它RNA种类，其能在体内被切割而形成siRNA。本文的RNAi前体还包括表达载体(也称作RNAi表达载体)，其能产生在细胞内形成dsRNA或发夹RNA的转录物，和/或产生能在体内制备siRNA的转录物。
siHybrid分子是具有与siRNA相似功能的双链核酸。除了是双链RNA分子之外，siHybrid由RNA链和DNA链组成。优选地，该RNA链是结合靶mRNA的反义链。通过将DNA和RNA链杂交而制成的siHybrid具有杂交互补部分，且优选具有至少一个3’突出端。
本发明所用的siRNA可以组装自两个分离的寡核苷酸，其中一条链是正义链且另一条是反义链，其中反义和正义链是自身互补的(即各链含有互补于另一条链中的核苷酸序列的核苷酸序列；如其中反义链和正义链形成双螺旋或双链结构，例如，其中双链区是约19个碱基对)。反义链可以包括互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义链可以包含对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。可选地，siRNA可以组装自单个寡核苷酸，其中siRNA的自身互补的正义和反义区是通过基于核酸的或基于非核酸的接头而连接。
在一些实施方式中，用于细胞内递送的siRNA可以是具有双螺旋、不对称双螺旋、发夹或不对称的发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的正义和反义区，其中所述反义区含有互补于分离的靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区含有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。
可在siRNA中制造的化学修饰的实例包括硫代磷酸核苷酸间连键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和末端甘油基和/或反向脱氧无碱基残基。
siRNA分子的反义区可以在所述反义区的3’-端上包括硫代磷酸核苷酸间连键。反义区可以在所述反义区的5’-端上包含约1至约5个硫代磷酸核苷酸间连键。siRNA分子的3′-端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、碱基或骨架上可进行化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可以包括一种或多种通用碱基核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可以包括一种或多种无环核苷酸。
例如，化学修饰的siRNA可以在一个链内具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸核苷酸间连键，或可以在各链内具有1至8个或更多个硫代磷酸核苷酸间连键。硫代磷酸核苷酸间连键可以存在于siRNA双螺旋的一个或两个寡核苷酸链上，例如在正义链、反义链、或两条链上。
siRNA分子可以包括在正义链、反义链、或两条链上的3’-端、5’-端、或3′-和5’-端的一个或多个硫代磷酸核苷酸间连键。例如，示例性的siRNA分子可以包括在正义链、反义链、或两条链上的5′-端的1、2、3、4、5或更多个连续的硫代磷酸核苷酸间连键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链、或两条链上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个嘧啶硫代磷酸核苷酸间连键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链、或两条链上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个嘌呤硫代磷酸核苷酸间连键。
siRNA分子可以包括环状核酸分子，其中siRNA在长度上是约38至约70个核苷酸，例如约38、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸，具有约18至约23个碱基对，例如约18、19、20、21、22或23个碱基对，其中环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃型结构。
环状siRNA分子可以包括2个环基序，其中siRNA分子的一个或两个环部分是生物可降解的。例如，环状siRNA分子的环部分可以在体内转化以生成具有3′-端突出端的双链siRNA分子，如包含约2个核苷酸的3′-端核苷酸突出端。
siRNA分子中的修饰性核苷酸可以在反义链、正义链或两者上。例如，修饰性核苷酸可以具有Northern构型(如Northern假回转环；参见如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)。具有Northern构型的核苷酸实例包括锁定核酸(LNA)核苷酸(如2′-O，4′-C-亚甲基-(D-核糖呋喃糖基)核苷酸)、2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫代-乙基，2′-脱氧-2′-氟代核苷酸、2′-脱氧-2′-氯代核苷酸、2′-叠氮核苷酸和2′-O-甲基核苷酸。
化学修饰性核苷酸可以对核酸酶降解具有抗性，且同时保持调节RNAi的能力。
双链iRNA分子的正义链可以在正义链的3’-端、5’-端、或3′和5’-端上具有端帽实体，如反向的脱氧无碱基实体。
缀合物的实例包括描述于2003年4月30日提交的Vargeese等人的美国申请序列号10/427,160中的缀合物和配体，其包括附图整体引入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，缀合物可以通过生物可降解的接头共价结合化学修饰性siRNA分子。例如，缀合分子可以与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链、或两条链的3’-端结合。
在一些实施方式中，缀合分子与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链、或两条链的5’-端结合。在一些实施方式中，缀合分子与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链、或两条链的3’-端和5’-端、或其任意组合结合。
在一些实施方式中，缀合分子包括能递送促进化学修饰的siRNA分子递送至生物***如细胞内的分子。
在一些实施方式中，结合化学修饰的siRNA分子的缀合分子是聚乙二醇、人血清白蛋白、或调节细胞吸收的细胞受体的配体。本发明期望的能结合化学修饰的siRNA分子的特异性缀合分子的实例描述于Vargeese等，美国专利公开号20030130186和20040110296中。
siRNA可以包含将siRNA的正义区和siRNA的反义区相连接的核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一些实施方式中，核苷酸接头可以是3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。在一些实施方式中，核苷酸接头可以是核酸适配子。在本文中，术语“适配子”或“核酸适配子”包括特异性结合靶分子的核酸分子，其中核酸分子包含在其自然状态下被靶分子识别的序列。另外，适配子可以是结合非自然结合核酸的靶分子的核酸分子。
例如，适配子可以用于结合蛋白的配体结合域，从而可以防止天然存在的配体与蛋白发生相互作用。参见例如Gold等，Annu.Rev.Biochem.64：763，1995；Brody和Gold，J.Biotechnol.74：5，2000；Sun，Curr.Opin.Mol.Ther.2：100，2000；Kusser，J.Biotechnol.74：27，2000；Hermann和Patel，Science 287：820，2000；和Jayasena，Clinical Chemistry 45：1628，1999。
非核苷酸接头可以是无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如，如那些具有2至100个乙二醇单元的聚乙二醇)。具体的实例包括下述中描述的那些：Seela和Kaiser，Nucleic Acids Res.18：6353，1990和Nucleic Acids Res.15：3113，1987；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：6324，1991；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：5109，1991；Ma等，Nucleic Acids Res.21：2585，1993和Biochemistry 32：1751，1993；Durand等，Nucleic Acids Res.18：6353，1990；McCurdy等，Nucleosides & Nucleotides 10：287，1991；Jaschke等，TetrahedronLett.34：301-304，1993；Ono等，Biochemistry 30：9914，1991；Arnold等，国际公开号WO89/02439；Usman等，国际公开号WO95/06731；Dudycz等，国际公开号WO95/11910；和Ferentz和Verdine，J.Am.Chem.Soc.113：4000，1991。
“非核苷酸接头”是指能引入核酸链内代替一个或多个核苷酸单元的基团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，且使保留的碱基表现其酶活性。基团或化合物可以是无碱基的，因为其在如糖的C1位置上不含有常规公认的核苷酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，修饰的siRNA分子可以具有磷酸骨架修饰，包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛(formacetal)、硫代缩甲醛(thioformacetal)、和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修饰的实例在Hunziker和Leumann，Nucleic AcidAnalogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，pp.331-417，1995和Mesmaeker等，Novel Backbone Replacements forOligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，pp.24-39，1994中给出。
可以化学修饰的siRNA分子可以通过下述方法合成：(a)合成siRNA分子的两条互补链；和(b)在适合获得双链siRNA分子的条件下将两条互补链一起退火。在一些实施方式中，siRNA分子互补部分的合成是通过固相寡核苷酸合成，或通过固相串联寡核苷酸合成来实现的。
寡核苷酸(如某些修饰的寡核苷酸或缺失核糖核苷酸的寡核苷酸部分)是利用本领域熟知的方法来合成，例如，Caruthers等，Methods in Enzymology211：3-19，1992；Thompson等，国际PCT公开号WO99/54459；Wincott等，Nucleic Acids Res.23：2677-2684，1995；Wincott等，Methods Mol.Bio.74：59，1997；Brennan等，Biotechnol Bioeng.61：33-45，1998；和Brennan，美国专利号6,001,311中所描述的。RNA的合成，包括本发明的某些siRNA分子，根据如下所述的方法进行，例如Usman等，J.Am.Chem.Soc.109：7845，1987；Scaringe等，Nucleic Acids Res.18：5433，1990；和Wincott等，Nucleic Acids Res.23：2677-2684，1995；Wincott等，Methods Mol.Bio.74：59，1997。
在本文中，“不对称发夹”是线性siRNA分子，其含有反义区、可包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和在正义区具有足够可与反义区碱基对互补的核苷酸且形成具有环的双螺旋的前提下，包含少于反义区的核苷酸的正义区。
在本文中，“不对称的双螺旋”是具有两条分离的链的siRNA分子，其含有正义区和反义区，其中在正义区具有足够可与反义区碱基对互补的核苷酸且形成具有环的双螺旋的前提下，正义区包含少于反义区的核苷酸。
在本文中，“调控基因表达”是指上调或下调靶基因的表达，其可以包括上调或下调细胞中存在的mRNA水平、或mRNA翻译、或由靶基因编码的蛋白或蛋白亚基的合成。
术语“抑制”、“下调”或“减少表达”在本文中是指基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚单位的RNA分子或相当的RNA分子的表达的水平，或由靶基因编码的一种或多种蛋白或蛋白亚单位的水平或活性，降低到低于在缺失本发明的核酸分子(如siRNA)时观察到的水平。
在本文中，“基因沉默”是指在细胞中部分的或完全的抑制基因表达，而且可以称作“基因敲除”。基因沉默的程度可以通过本领域已知的方法来确定，其中的一些总结在国际公开号WO99/32619。
本文中，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。核糖核苷酸是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本纯净的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、以及通过添加、删除、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的和改变的RNA。RNA的改变可以包括例如向如siRNA的末端或如在RNA的一个或多个核苷酸内部添加非核苷酸材料。
RNA分子中的核苷酸包括非标准的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物。
“高度保守序列区域”是指靶基因中一个或多个区域的核苷酸序列在从一代到另一代或从一个生物体系到另一个生物体系时没有显著变化。
“正义区”是指具有互补于siRNA分子的反义区的siRNA分子的核苷酸序列。另外，siRNA分子的正义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
“反义区”是指具有互补于靶核酸序列的siRNA分子的核苷酸序列。另外，siRNA分子的反义区可以包括具有互补于siRNA分子的正义区的核酸序列。
“靶核酸”是指表达或活性被调节的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA或RNA。
“互补”是指核酸通过常规Watson-Crick或通过其它的非常规结合模式可以与另一个核酸序列形成氢键。
在本文中，术语“生物可降解接头”是指设计成作为生物可降解接头以将一个分子与另一个分子连接(例如，生物活性分子与siRNA分子或siRNA分子的正义和反义链连接)的核酸或非核酸接头分子。如此设计生物可降解接头，使得其稳定性可以为特定目的如递送至特定组织或细胞类型而发生调节。基于核酸的生物可降解接头分子的稳定性可以以不同的方式调节，例如，通过核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、和化学修饰的核苷酸，如2′-O-甲基、2′-氟代、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基和其它的2′-修饰性或碱基修饰性核苷酸的组合。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或较长的核酸分子，例如长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包括具有磷基键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包括核酸骨架、核酸糖、或核酸碱基修饰。
对于如本文所述的2′-修饰的核苷酸，“氨基”是指2′-NH2或2′-O-NH2，其可以是修饰的或未修饰的。所述修饰的基团描述于例如，Eckstein等，美国专利号5,672,695和Matulic-Adamic等，美国专利号6,248,878中。
本发明使用的递送核酸分子的辅助或补充方法描述于，例如，Akhtar等，Trends Cell Bio.2：139，1992；″Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics，″ed.Akhtar，1995，Maurer等，Mol.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland and Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165 192，1999；和Lee等，ACSSymp.Ser.752：184-192，2000。Sullivan等，国际PCT公开号WO94/02595中进一步描述了递送酶的核酸分子的常规方法。
核酸分子可以在制剂中施用，所述制剂包括一种或多种其它组分，如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、助剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
在本文中，术语“载体”是指药学上可接受的固体或液体稀释剂、溶剂、填充剂或包封材料。载体的实例包括盐水、生物学上和药学上的缓冲***、和生物学上可接受的媒介剂。含水的液体载体可以包括药学上可接受的添加剂，如酸化剂、碱化剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、溶解剂、湿润剂、溶剂、悬浮剂和/或粘度增强剂、张力剂、润湿剂或其他生物相容性材料。上述范畴的组分实例可参见U.S.Pharmacopeia NationalFormulary，1990，pp.1857-1859，以及Raymond C.Rowe等，Handbook ofPharmaceutical Excipients，5th ed.，2006，和″Remington：The Science andPractice of Pharmacy，″21st ed.，2006，editor David B.Troy。
防腐剂的实例包括苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、间甲酚、硫柳汞、苯扎氯铵和其混合物。
表面活性剂的实例包括油酸、失水山梨醇油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱、各种长链甘油二酯和磷脂、和其混合物。
磷脂的实例包括磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、和磷脂酰乙醇胺、和其混合物。
分散剂的实例包括乙二胺四乙酸。
气体的实例包括氮气、氦气、氯氟烃(CFC)、氢氟烃(HFC)、二氧化碳、空气和其混合物。
在一些实施方式中，siRNA和/或多肽可以包封入脂质体、或存留在脂质体内部或外部、或存在于脂质体层内、或通过离子电渗疗法施用、或加入到其他载体，如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊、生物粘性微球、或蛋白质的载体。参见，例如O′Hare和Normand，PCT国际公开号WO00/53722。可选地，核酸组合物可以通过直接注射或通过利用输注泵来局部递送。本发明核酸分子的直接注射，无论经皮下、经肌肉内、或经皮内，都可以利用标准的针和注射器操作法，或采用无针技术，如Conry等，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999，和Barry等，国际PCT公开号WO99/31262中所描述。
本发明的组合物可以有效地用作药物制剂。药物制剂预防，调节患者中疾病状态或其它不良状况的发生或严重程度，或治疗(减轻一种或多种症状至可检测或可测量的程度)患者中疾病状态或其它不良状况的发生或严重程度。
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物和方法，特征是存在或施用一种或多种多核酸，所述多核酸通常是与脂质结合、复合或缀合的一种或多种siRNA，其可以进一步与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂或缓冲剂配伍。
通常地，siRNA会靶向以高水平表达的基因，该基因作为与患者疾病或不良状况相关的因果或起作用的因素。在这种情况下，siRNA会有效地下调该基因的表达水平，从而预防、减轻或降低一种或多种相关疾病症状的严重性或复发。可选地，对于各种不同的疾病模型来说，靶基因的表达不一定会随着疾病或其他不良症状的结果或结局而提高，通过降低基因表达(即降低选定的mRNA的水平和/或靶基因的蛋白产物的水平)，下调靶基因将仍然会获得治疗结果。可选地，本发明的siRNA可以靶向较低表达的一个基因，这可以导致上调“下游”基因，该“下游”基因的表达被该靶基因的产物或活性负性调节。
本发明的siRNA可以以任何形式给药，例如经透皮或通过局部注射(如在银屑病斑块位点上局部注射以治疗牛皮癣，或局部注射入患银屑病或RA患者关节内)。在更具体的实施方式中，本发明提供了制剂和施用治疗有效量的直接抵抗TNF-α的mRNA的siRNA的方法，该siRNA有效下调TNF-αRNA，并因此降低或预防一种或多种TNT-α相关炎症。提供了对比方法和组合物，其针对与动物患者中所选疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达，包括已知其表达随着与所选疾病状况相关的因果或起作用的因素会异常增加的大量基因中的任何一个。
本发明的组合物还可以配制，并用作口服给药的片剂、胶囊或酏剂，直肠给药的栓剂，无菌溶液，注射给药的悬浮液，以及本领域已知的其他形式。
药理学组合物或制剂是指适合给药的形式的组合物或制剂，例如全身给药至细胞或患者，包括如人类。适合的形式部分依赖于用途或进入途径，例如经口服、经透皮、经上皮、或通过注射。所述形式并不妨碍组合物或制剂到达靶细胞(即带负电的核酸希望递送到的细胞)。例如，注入到血液中的药理学组合物应该是可溶的。其它因素是本领域已知，且包括如毒性的考虑。
“全身给药”是指体内全身吸收或血液中药物的累积，随后分布到全身。会导致全身吸收的给药途径包括但不限于：经静脉、经皮下、经腹腔、吸入、口服、经肺内和经肌肉内。
适合与本发明的核酸分子配制的试剂的实例包括：P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)，其能提高药物进入CNS(Jolliet-Riant和Tillement，Fundam.Clin.Pharmacol.13：16-26，1999)；生物可降解的聚合物，如在脑内植入后用于缓释递送的聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)微球(Emerich，D.F等，Cell Transplant8：47-58，1999，Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)；和载药纳米颗粒，如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些，其能递送药物穿过血脑屏障并能改变神经摄取机制(Prog.Neuropsychopharmacol Biol.Psychiatry 23：941-949，1999)。用于本发明核酸分子递送方法的其它实例包括描述于Boado等，J.Pharm.Sci.87：1308-1315，1998；Tyler等，FEBS Lett.421：280-284，1999；Pardridge等，PNAS USA.92：5592-5596，1995；Boado，Adv.Drug Delivery Rev.15：73-107，1995；Aldrian-Herrada等，Nucleic Acid Res.26：4910-4916，1998；和Tyler等，PNAS USA.96：7053-7058，1999中的材料。
本发明还包括制备用于储存或给药的组合物，其包括在药学可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的期望化合物。治疗使用的可接受的载体或稀释剂是药物领域所熟知的，且描述于，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro ed.1985)中。例如，可以使用防腐剂、稳定剂、染料和增味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外，抗氧化剂和悬浮剂也可以使用。
药学有效剂量是预防，抑制疾病状态的发生，治疗或改善疾病状态的症状到一定程度所需的剂量。活性核酸的给药量应该是每日每千克体重0.01mg至50mg。
水悬浮液可以包括与适合制备水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。所述赋形剂是悬浮剂，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和***树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷基亚乙氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯。水悬浮液还可以包括一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种增味剂、和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性悬浮剂可以通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或在矿物油如液体石蜡中悬浮活性成分来配制。油性悬浮剂可以包括增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可添加甜味剂和增味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来进行保存。
适合通过加水制备水性悬浮剂的可分散粉剂和颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。也可以存在其它赋形剂，例如甜味剂、增味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以是水包油乳剂型。油相可以是植物油或矿物油或两者的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的橡胶，例如***树胶或黄芪树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。乳剂还可以包括增甜剂和增味剂。
药物组合物可以是无菌注射的水性或含油的悬浮剂形式。该悬浮剂可以按照本领域已知的方法，利用上文所述的适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的双亲可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。其中可以使用的可接受的载体和溶剂是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常，无菌的不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮媒介物。为此，任何温和的不挥发性油都可以使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，发现脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
siRNA可以以栓剂形式给药，例如用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过将药物与适合的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体，因此其能在直肠中溶解而将药物释放。所述材料包括可可油和聚乙二醇。
siRNA可以通过核酸酶抗性基团如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟代、2′-O-甲基、2′-H的修饰来进行广泛地修饰，以提高稳定性。综述参见Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman等，Nucleic Acid Symp.Ser.31：163，1994。siRNA结构可以利用常规方法通过凝胶电泳来纯化，或通过高压液相层析和在水中重悬浮来纯化。
包含修饰(碱基、糖和/或磷酸)的化学合成的核酸分子可以防止其被血清核糖核酸酶降解，这可以增加其效力。参见，例如Eckstein等，国际公开号WO92/07065；Perrault等，Nature 344：565，1990；Pieken等，Science 253，314，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334，1992；Usman等，国际公开号WO93/15187；和Rossi等，国际公开号WO91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；和Gold等，美国专利号6,300,074。全部上述参考文献都描述了能对本文描述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖实体进行的各种化学修饰。
在现有技术中有许多实例描述了能够引入核酸分子的糖、碱基和磷酸修饰，并且会显著提高其核酸酶稳定性和功效。例如，寡核苷酸通过用核酸酶抗性基团，例如，2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟代、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H修饰，以提高稳定性和/或提高生物活性。综述参见Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman等，Nucleic Acid Symp.Ser.31：163，1994；Burgin等，Biochemistry 35：14090，1996。核酸分子的糖修饰已经被现有技术所广泛描述。参见Eckstein等，国际公开PCT号WO92/07065；Perrault等，Nature344：565-568，1990；Pieken等，Science 253：314-317，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334-339，1992；Usman等，国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，J.Biol.Chem.270：25702，1995；Beigelman等，国际PCT公开号WO97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824；Usman等，美国专利号5,627,053；Woolf等，国际PCT公开号WO98/13526；Thompson等，Karpeisky等，Tetrahedron Lett.39：1131，1998；Earnshaw和Gait，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48：39-55，1998；Verma and Eckstein，Annu.Rev.Biochem.67：99-134，1998；和Burlina等，Bioorg.Med.Chem.5：1999-2010，1997。这些出版物描述了确定将糖、碱基和/或磷酸修饰等引入核酸分子而不调节催化性的位点的常规方法和策略。在这些指导下，如本文所述，类似的修饰可用于修饰本发明的siRNA核酸分子，只要siRNA在细胞内促进RNAi的能力不被显著抑制。
虽然包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯键的寡核苷酸核苷酸间连键的化学修饰会提高稳定性，但是过度的修饰会导致某些毒性或降低活性。因此，当设计核酸分子时，应该最小化这些间连键的量。这些键的浓度降低就会降低毒性，而使这些分子获得增加的效力和较高的特异性。
在一些实施方式中，本发明涉及具有磷酸骨架修饰的修饰性siRNA分子，所述磷酸骨架修饰包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸酯、缩甲醛(formacetal)、硫代缩甲醛(thioformacetal)、和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修饰的综述参见Hunziker和Leumann，Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties，inModern Synthetic Methods，VCH，1995，pp.331-417，和Mesmaeker等，″NovelBackbone Replacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications inAntisense Research，″ACS，1994，pp.24-39。
递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，Trends Cell Bio.2：139，1992；″Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，″ed.Akhtar，1995；Maurer等，Mol.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165-192，1999；和Lee等，ACS Symp.Ser.752：184-192，2000。Beigelman等，美国专利号6,395,713和Sullivan等，PCT WO94/02595进一步描述了递送核酸分子的常规方法。这些指导方案可以用于递送几乎任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的各种方法来施用给细胞，包括但不限于通过脂质体内部或外部包封、通过离子电渗疗法、或通过引至其它载体，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见如Gonzalez等，Bioconjugate Chem.10：1068-1074，1999；Wang等，国际PCT公开号WO03/47518和WO03/46185)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见如美国专利号6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430)、生物可降解纳米胶囊、和生物粘性微球，或通过蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际PCT公开号WO00/53722)。可选地，核酸/载体组合物可以通过直接注射或采用输注泵来局部递送。直接注射本发明核酸分子，无论经皮下、经肌肉内或经皮内，都可以利用常规针和注射器操作法，或采用无针技术，如Conry等，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999和Barry等，国际PCT公开号WO99/31262中所描述的进行。本发明的分子可以用作药物制剂。药物制剂预防，调节患者疾病状态的发生，或治疗患者疾病状态(减轻症状至某种程度，优选全部症状)。
“RNA”是指含有至少一个核糖核酸残基的分子。“核糖核苷酸”意思是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、删除、取代和/或改变一种或多种核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。所述改变可以包括例如在RNA的一个或多个核苷酸上添加非核苷酸物质如到siRNA末端或内部。在本发明的RNA分子中的核苷酸还包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作天然存在的RNA的类似物或相似物。
“帽结构”是指在寡核苷酸的任一末端所引入的化学修饰(参见，如Adamic等，美国专利号5,998,203，引入本文作为参考)。这些末端修饰保护核酸分子免受外源核酸酶降解，并且帮助在细胞内的递送和/或定位。该帽可以存在在5′-端(5′-帽)或3′-端(3′-帽)或可以存在着两端。在非限制性实例中，5′-帽包括但不限于甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸；碳环形核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰性碱核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏型-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸，3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向无碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向无碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；磷酸己酯；磷酸氨基己酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。
3′-帽的实例包括但不限于甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰性碱性核苷酸；二硫代磷酸酯；苏型-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连和/或非桥连5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥连甲基膦酸酯和5′-巯基部分(详细描述参见Beaucage和Lyer，Tetrahedron 49：1925，1993；其引入以供参考)。
术语“非核苷酸”是指能引至核酸链代替一种或多种核苷酸单元的任何基团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，且允许残留碱基表现其酶活性。基团或化合物是无碱基的，即不包括常规公认的核苷酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，因此在1′-位置缺失碱基。
在本文中，“核苷酸”如本领域所公认的，包括天然碱基(标准)和本领域熟知的修饰性碱基。所述碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸酯基团。核苷酸可以在糖、磷酸酯和/或碱基部分是未修饰的或修饰的，(还可互换地称为核苷酸类似物、修饰性核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见，如Usman和McSwiggen，见上；Eckstein等，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO93/15187；Uhlman & Peyman，见上，其全部引入以供参考)。本领域已知的修饰性核酸碱基的许多实例总结在Limbach等，Nucleic Acid Res.22：2183，1994。可引入核酸分子的碱基修饰的某些非限制性实例包括肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二羟尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如核糖胸腺嘧啶)、5-卤代尿苷(如5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等，Biochemistry 35：14090，1996；Uhlman & Peyman，见上)。“修饰性碱基”意思是在1′位置上除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或其类似物。
“靶位点”或“靶序列”或“靶定的序列”意思是靶核酸(如RNA)内部的序列，即通过siRNA构建体调节切割的“靶标”，所述siRNA结构含有互补于靶序列的反义区内的序列。
siRNA分子可以与阳离子脂质复合，封装在脂质体内，或以其它方式递送到靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以通过注射、输注泵或支架局部给药，将它们引至或不引至生物聚合物内。在另一个实施方式中，聚乙二醇(PEG)可以共价地结合本发明的siRNA化合物、或多肽、或两者。结合的PEG可以是任何分子量，优选约2,000至约50,000道尔顿(Da)。
正义区可以通过接头分子，如多核苷酸接头或非核苷酸接头，与反义区相连。
“反向重复”是指含有正义和反义元件的核酸序列，当该重复被转录时，其位置能够让它们可以形成双链的siRNA。反向重复可以任选地包括接头或异源序列，如在两个重复元件间的自切割核酶。反向重复元件具有足够的长度，以便形成双链RNA。通常，反向重复的各元件为约15至约100个核苷酸长，优选约20-30个碱基核苷酸，优选约20-25个核苷酸长，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其单链-或双链型聚合物。该术语包括含已知核苷酸类似物或修饰性骨架残基或键的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有与参照核酸相似的结合特性，且其以与参照核苷酸相似的方式发生代谢变化。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2′-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
“大双链RNA”是指具有大小大于约40bp的任何双链RNA，例如大于100bp或更优选大于300bp。大dsRNA的序列可以代表mRNA片段或完整mRNA。大dsRNA的最大大小不受本文的限制。双链RNA可以包括修饰性碱基，其中可以对磷酸糖骨架或核苷进行修饰。所述修饰可以包括氮或硫杂原子或本领域已知的任何其它修饰。
双链结构可以由自身互补的RNA链来形成，如出现发夹或微小RNA，或通过两条不同的互补RNA链。
“重叠”是指两个RNA片段在一条链上具有重叠的多个核苷酸序列，例如其中多个核苷酸(nt)数量少到2-5个核苷酸或5-10个核苷酸或更多。
“一种或多种dsRNA”是指在初级序列基础上相互不同的dsRNA。“靶基因或mRNA”是指任何感兴趣的基因或mRNA。靶基因或mRNA可以包括发育基因和调节基因，以及代谢或结构基因或编码酶的基因。靶基因可以是内源或外源的。靶基因可以以直接或间接影响表型特征的方式在表型已经被研究的那些细胞中或生物体中表达。所述细胞包括成熟或胚胎动物或植物体内的的任何细胞，包括配子或任何分离的细胞，如存在于永生细胞系或原代细胞培养基中。
抗败血症效应的用途
在一些方面中，本发明一般性地涉及败血症领域。更具体地说，本发明涉及氨基酸脂质组合物和制剂，和其用作药物和治疗剂的用途。本发明一般性地涉及利用氨基酸脂质来预防，治疗或改善败血症、败血性休克、炎性败血症、败血症、或全身炎性反应综合症的方法。
当免疫***损害或无法抵抗时，败血症可以由于感染导致，或由于某种化学疗法导致。例如，革兰氏阴性细菌内毒素可以诱导败血性休克。革兰氏阴性败血症中重症特别护理是最主要的死亡病因。单独的抗菌治疗并不能有效地防止败血症病例的死亡。败血症会伴有普遍的先天性免疫应答活性，从而导致不可控的产生各种炎性介质。不可控的全身性炎性应答会导致死亡。
本发明的氨基酸脂质可以降低对某些内毒素如脂多糖的免疫应答。本发明的阳离子两性氨基酸脂质可以结合和中和内毒素，从而降低免疫应答。因此，本发明打算使用氨基酸脂质药物和方法来预防，治疗或改善败血症、败血性休克、炎性败血症、败血症、或全身炎性反应综合症。
递送活性试剂的应用
本发明的化合物和组合物可以用于递送任何生理学上的活性试剂以及活性试剂的任何组合物，如上所述或如本领域所知。活性试剂可以在本发明的组合物和用途中以足以提供期望的生理学上的或改善的效应的量存在。
本发明的化合物和组合物能够定向地提高在哺乳动物患者内的一系列的药剂和生物学活性试剂的递送，包括小分子化合物和药物、肽、蛋白和疫苗试剂。
活性试剂的实例包括肽、蛋白、核酸、双链RNA、补血剂、抗感染药；抗痴呆药；抗病毒剂、抗肿瘤剂、、解热药、止痛剂、消炎药、抗溃疡剂、抗变应性剂、抗抑郁剂、精神药物、强心剂、抗心律失常剂，血管扩张剂、抗高血压药、降压利尿剂、抗糖尿药、抗凝剂、降胆固醇剂、骨质疏松症治疗剂，激素、抗生素、疫苗、细胞因子、激素、生长因子、心血管因子、细胞粘附因子、中枢或周围神经***因子、体液电解质因子，血液有机物质、骨生长因子、胃肠道因子、肾因子、***因子、感官因子、免疫***因子、呼吸***因子、生殖器官因子、雄激素、***，***素、生长激素、***、白介素、类固醇、细菌性类毒素、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、和免疫球蛋白。
活性试剂的实例包括***、粒细胞集落刺激因子、胰岛素、因子VIII、因子IX、干扰素、肝素、水蛭素原、水蛭联、和水蛭素。
活性试剂的实例包括***、氢***酮、氧***酮、羟甲左吗喃、烯丙左吗喃、可待因、纳美芬、纳洛芬、纳洛酮、纳屈酮、丁丙诺啡、布托啡诺、或纳布啡、可的松、氢化可的松、氟氢可的松、***、氢化***、甲泼尼龙、氟羟氢化***、***、倍他米松、帕拉米松、氟轻松、秋水仙素、醋胺酚、非甾体抗炎剂NSAID、阿昔洛韦、利巴韦林、三氟胸苷、阿糖呋喃糖腺嘌呤、酰基鸟苷、正脱氧鸟苷、叠氮胸腺嘧啶、二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、安体舒通、睾酮、***、***、***、***、孕酮、罂粟碱、硝基甘油、舒血管肠肽、降钙素基因相关肽、赛庚啶、多虑平、丙米嗪、甲腈咪胺、右美沙芬、氯氮平、超氧物歧化酶、神经脑啡肽酶、两性霉素B、灰黄霉素、咪康唑、酮康唑、噻康唑、伊曲康唑、氟康唑、头孢菌素、四环素、氨基葡糖苷、红霉素、庆大霉素、多粘菌素B、五氟脲嘧啶、博来霉素、氨甲喋呤、羟基脲、二脱氧肌苷、氟尿苷、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、I-去甲正定霉素、紫杉酚、紫杉醇、生育酚、奎尼丁、哌唑嗪、异搏定、硝苯吡啶、硫氮草酮、组织纤溶酶原激活物TPA、表皮生长因子EGF、酸性或碱性成纤维细胞生长因子FGF、血小板衍生生长因子PDGF、转化生长因子TGF-α或β、舒血管肠肽、肿瘤坏死因子TNF、下丘脑释放因子、促乳素、促甲状腺激素TSH、促肾上腺皮质激素ACTH、甲状旁腺素PTH、促卵泡激素FSF、***释放激素LHRH、内啡肽、胰高血糖素、降钙素、催产素、卡贝缩宫素、aldoetecone、脑啡肽、生长抑素、生长激素、生长调节素、α-黑色素细胞刺激素、利多卡因、舒芬太尼、特布他林、氟哌利多、东莨菪碱、性促放素、环匹罗司、丁螺环酮、色甘酸钠、咪达***、环孢菌素、白血霉素、卡托普利、地拉普利、雷尼替丁、法莫替丁、超氧化物歧化酶、天门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胰蛋白酶、化学胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、铃蟾肽、P物质、加压素、α-球蛋白、转铁蛋白、血纤蛋白原、β-脂蛋白、β-球蛋白、凝血素、血浆铜蓝蛋白、α2-糖蛋白α2-球蛋白、胎球蛋白、α1-脂蛋白、α1-球蛋白、白蛋白、和前白蛋白。
活性试剂的实例包括阿片样物质或阿片样物质拮抗剂、例如***、氢***酮、氧***酮、羟甲左吗喃、烯丙左吗喃、可待因、纳美芬、纳洛芬、纳洛酮、纳屈酮、丁丙诺啡、布托啡诺、和纳布啡；皮质酮、例如可的松、氢化可的松、氟氢可的松、***、氢化***、甲泼尼龙、氟羟氢化***、***、倍他米松、帕拉米松、氟轻松；其它消炎药、例如秋水仙碱、布洛芬、茚甲新、和吡罗昔康；抗病毒药物例如阿昔洛韦、利巴韦林、三氟胸苷、阿糖呋喃糖腺嘌呤、酰基鸟苷、去甲脱氧鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷；抗雄激素例如安体舒通；雄激素、例如睾酮；***、例如***；孕酮；肌肉松弛剂、例如罂粟碱；血管扩张剂、例如硝基甘油、舒血管肠肽和降钙素基因相关肽；抗组胺、例如赛庚啶；具有组胺受***阻断活性的试剂、例如多虑平、米帕明、和甲氰咪胍；止咳药、例如美沙芬；神经松弛剂例如氯氮平；抗心律失常药；镇痫剂；酶、例如超氧化物歧化酶和神经脑啡肽酶；抗真菌剂、例如两性霉素B、灰黄霉素、咪康唑、酮康唑、噻康唑、伊曲康唑、和氟康唑；抗细菌剂、例如青霉素、头孢菌素、四环素、氨基葡糖苷、红霉素、庆大霉素、多粘菌素B；抗癌症剂、例如五氟脲嘧啶、博来霉素、氨甲喋呤、和羟基脲、双脱氧肌苷、氟尿苷、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、I-去甲正定霉素、紫杉酚、和紫杉醇；抗氧化剂、例如维生素E、类维生素A、类葫萝卜素、泛醌、金属螯合剂、和植酸；抗心律失常剂、例如奎尼丁；抗高血压剂例如哌唑嗪、维拉帕米、硝苯吡啶、和地尔硫卓；镇痛药例如醋氨酚、和阿斯匹林；单克隆和多克隆抗体、包括人源化抗体、和抗体片段；反义寡核苷酸；和RNA、调节性RNA、干扰性RNA、DNA、和含有编码治疗肽和蛋白的基因的病毒载体。
用于给药的组合物和制剂
在本文中，术语“给药”包括直接和间接地递送化合物或组合物至作用位点的全部方法。本发明的化合物和组合物可以单独给药，或者与本文未公开的化合物、组合物、或治疗剂组合给药。
本发明的组合物和方法可以通过各种粘膜给药模式，包括经口、经直肠、经***、经鼻内、经肺内、或经透皮递送，或通过局部递送至眼、耳、皮肤或其它粘膜表面给药至患者。在本发明的一些方面，粘膜组织层包括上皮细胞层。上皮细胞可以是肺部的、气管的、支气管的、齿槽的、鼻的、口腔的、表皮的、或肠胃的。本发明的组合物可以使用常规推进器给药，如机械喷雾器，以及加压的、电动的、或其它类型的加载器。
本发明的组合物可以作为鼻或肺喷雾以水溶液给药，而且可以采用本领域技术人员熟知的各种方法以喷雾形式分散。本发明组合物的肺部递送可以通过将组合物以液滴、颗粒、或喷雾的形式给药来实现，其可以是，例如、烟雾化的、雾化的、或成雾状的。肺部递送可以以液滴、颗粒、或喷雾形式，通过鼻或支气管通道来进行组合物给药。组合物颗粒、喷雾、或气溶胶可以是液体或固体形式。适合以鼻部喷雾分散液体的优选***公开在美国专利号4,511,069中。所述制剂可以便利地通过将本发明的组合物溶解在水中以制备水溶液，并将所述溶液灭菌来制备。制剂可以存在于多剂容器中，例如美国专利号4,511,069公开的密封性悬浮***中。其它适合的鼻部喷雾递送***描述于Transdermal Systemic Medication，Y.W.Chien ed.，Elsevier Publishers，NewYork，1985中；和美国专利号4,778,810中。另外的气溶胶递送形式可以包括例如压缩空气-、喷射-、超声-、和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在药物溶剂例如水、乙醇或其混合物中的生物活性试剂。
本发明的鼻部和肺部喷施溶液通常包括药物或要递送的药物，任选地与表面活性试剂如非离子表面活性试剂(如聚山梨醇酯-80)和一种或多种缓冲液配制。在本发明的某些实施方式中，鼻部喷施溶液进一步包括推进剂。鼻部喷施溶液的pH可以是约pH 6.8至7.2。使用的药学溶剂还可以是pH 4-6的弱酸性水缓冲液。可以添加其它组分来增强或保持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性试剂、分散剂或气体。
在某些实施方式中，本发明是包括含有本发明组合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻内喷雾的推进剂或气溶胶的药品。
本发明组合物的剂型可以是液滴或乳剂形式，或是喷雾剂形式的液体。
本发明的组合物的剂型可以是固体，其可以在施用前在液体中重构。固体可以以粉末给药。固体可以是胶囊、片剂或凝胶形式。
在本发明中为了配制适合肺部递送的组合物，可以将生物活性试剂与任何药学上可接受的添加剂或递送增强组分，以及适合分散活性试剂的碱或载体组合。添加剂或递送增强组分的实例包括pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸和其混合物。其它添加剂或递送增强组分包括局部麻醉剂(如苄醇)、等渗剂(如氯化钠、甘露醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(如吐温80)、溶解性增强剂(如环式糊精和其衍生物)、稳定剂(如血清白蛋白)和还原剂(如谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液态时，制剂的张性，参考将0.9％(重量/体积)生理盐溶液作为一个单位所测定，通常被调节到在给药位点的粘膜内不会引起实质上不可逆的组织损害的值。通常，将溶液的张性调节到约1/3至3的值，更通常是1/2至2，最通常是3/4至1.7。
生物活性试剂可以分散在碱或媒介物内，其可以包含具有分散活性试剂和任何需要的添加剂能力的亲水性化合物。碱可以选自范围广泛的适合载体，包括但不限于聚羧酸或其盐、羧酸酐(如马来酸酐)与其它单体(如(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物，亲水性乙烯基聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物，如羟甲纤维素、羟丙纤维素等，和天然聚合物，如壳聚糖、胶原、海藻酸钠、明胶、透明质酸、和其无毒金属盐。生物可降解的聚合物可以选自碱或载体，例如聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-羟基乙酸)共聚物和其混合物。可选地或另外地，合成的脂肪酸酯，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸糖酯等可被用作载体。亲水性聚合物和其它载体可以单独使用或者组合使用，且可通过部分结晶化、离子键、交联等来赋予该载体提高的结构完整性。提供的载体可以是各种形式，包括用于直接施用至鼻粘膜的流体或粘性溶液、凝胶、贴剂、粉末、微球和膜剂。使用本发明所选的载体可以促进生物活性试剂的吸收。
生物活性试剂可以按照各种方法与碱或载体组合，活性试剂的释放可以通过扩散、载体分解、或相关的水通道制剂。在某些情况下，活性试剂分散在微胶囊(微球体)或纳米胶囊(纳米球体)内，其制备自适合的聚合物，如2-氰基丙烯酸异丁酯(参见，如Michael等，J.Pharmacy Pharmacol.43：1-5，1991)，和分散在施于鼻粘膜的生物相容性的分散介质内，其会在很长的时间内产生持续不断的递送和生物活性。
用于粘膜、鼻或肺部递送的制剂可以包括亲水性低分子量化合物作为碱或赋形剂。所述亲水性低分子量化合物提供通道介质，水溶性活性试剂如生理性活性肽或蛋白通过该通道介质可以通过该基础扩散至吸收活性试剂的身体表面。亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或给药环境吸收水分和溶解水溶性活性肽。亲水性低分子量化合物的分子量通常不大于10,000，且优选不大于3000。亲水性低分子量化合物的实例包括多元醇化合物，如寡糖、二糖和单糖，包括蔗糖、甘露醇、乳糖、L-***糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油、聚乙二醇、和其混合物。进一步的亲水性低分子量化合物的实例包括N-甲基吡咯烷酮，醇(如寡乙烯基醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)和其混合物。
本发明的组合物可选地包括与所需生理条件近似的药学上可接受的载体物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、和润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、和其混合物。对于固体组合物，可以使用常规的无毒药学上可接受的载体，其包括例如药物梯度的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
在本发明的某些实施方式中，生物活性试剂可以以时间控制制剂的形式给药，例如，以在包括缓慢释放聚合物的组合物中的形式。活性试剂可以采用保护对抗快速释放的载体来制备，例如控释载体，如聚合物、微胶囊化的递送***或生物粘性胶。在本发明的各种组合物中，活性试剂的延长递送可以大约通过包括在延迟吸收的组合物试剂中来获得，例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶。
在本发明的某些实施方式中，组合物可以包括一种或多种天然或合成表面活性试剂。某些天然的表面活性试剂可在人肺(肺表面活性试剂)中找到，而且是磷脂和蛋白的复合混合物，其在肺小泡的空气-液体表面形成单层，降低呼气时的表面张力接近于0，并防止肺小泡破裂。超过90％(重量)的肺表面活性试剂是由磷脂组成，其中大约40-80％是DPPC，且剩余的是不饱和的卵磷脂POPG、POPC和磷脂酰甘油。剩余的10％(重量)的表面活性试剂由血浆蛋白和脱辅基蛋白，如表面蛋白(SP)-A、SP-B、SP-C和SP-D组成。
可用于本发明的天然的表面活性试剂的实例包括SURVANTATM(贝拉康坦)、CUROSURFTM(poractantalfa)和INFASURFTM(calfactant)、和其混合物。
合成的表面活性试剂的实例包括西那普肽；二棕榈酰卵磷脂、棕榈酰油酰磷脂酰甘油和棕榈酸的组合物；SURFAXINTM(lucinactant)；和EXOSURFTM(colfosceril)；组分可以包括四丁酚醛、DPPC、和十六醇；和其混合物。
本发明的组合物可以采用本领域熟知的方法制备。制备脂质组合物的方法包括利用塞满规定孔大小的聚碳酸酯薄膜滤剂的Northern Lipids LipexExtruder***的乙醇注射法和挤压法。可以使用超声处理法，其利用探针针尖和浴超声波仪，来获得均匀大小的脂质颗粒。均质和单分散颗粒大小可以通过不添加核酸组分来获得。对于体外转染组合物来说，在转染剂制成并用其它的缓冲组分稳定后，可以添加核酸组分。对于体内递送组合物来说，核酸组分是制剂的一部分。
本发明的组合物和制剂可以通过各种途径来给药，例如以经由静脉、肠胃外或腹膜内途径实现全身递送。在某些实施方式中，可以细胞内递送制剂，例如在靶组织如肺或肝的细胞中，或在炎性组织中。本发明包括通过移走患者细胞，将试剂递送至已移出的细胞内，并将细胞再引至患者内，来递送制剂的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明提供了体内递送制剂的方法。可以将组合物经静脉、皮下或腹膜内给药至患者。在某些实施方式中，本发明提供了体内递送制剂至哺乳动物患者肺部的方法。
其它实施方式
本文所述的全部出版物、参考文献、专利、专利出版物和专利申请都明确地以其整体引入本文作为参考。
虽然本发明描述了一些实施方式，且许多详细内容是为了进行说明，本领域的技术人员应该理解，本发明包括附加实施方式，且本文描述的某些详细内容可以适当地不脱离本发明地改变。本发明包括所述的附加实施方式、改变和相等物。特别是，本发明包括各种说明性的组分和实施例的特征、术语或要素的任意组合。
本文使用的术语“一个”和本发明描述的和权利要求中的类似术语解释为包括单数和多数。
术语“含有”、“具有”、“包括”和“包含”解释为开放式术语，其意思是例如“包括但不限于”。因此，术语如“包括”、“具有”、“包括″和″含有″解释为包括性的，而不是排他性的。
本文一系列的数值叙述是指，单独的各值和如同其在本文单独叙述一样地落入该范围内的任何分散数值，而不论某些数值是否在确切表述的范围内。例如，范围“4至12“包括且并不限于数值5、5.1、5.35和大于或等于4且少于或等于12的任何其它整数、分数或有理数。应该理解，本文使用的特定值是示例性的，且并不限制本发明的范围。
本文一系列碳原子数量的叙述是指，单独的各值和如同其在本文单独叙述一样地落入该范围内的任何分散数值，而不论某些数值是否在确切表述的范围内。例如，术语“C1-22“包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、和C22。
本文提供的技术术语定义应该解释为包括没有说明的那些与本领域技术人员已知的术语相关的意思，且并不意欲限制本发明的范围。本文提供的技术术语定义应该解释为在本领域的可选定义中占支配地位，或通过参考某种程度上的可选定义而引入本文的定义，会跟本文提供的定义发生冲突。
本文所给的实施例，和本文所用的示例性语言仅仅是出于解释的目的，且并不意欲限制本发明的范围。
当给出了实施例表列时，如适合本发明的化合物或分子表列，对于本领域的技术人员来说，很显然所列的化合物或分子的混合物也是适合的。
实施例
实施例1
制备C10-Arg-C10
N-(5-胍基-1-氧代-1-(癸氨基)戊-2-基)癸酰胺
Fmoc-Arg(Pbf)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的含3g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入5.06g(11.7mmol，3eq)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Mw＝648.8，Novabiochem，04-12-1145)和2.23ml(12.87mmol，3.3eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Arg(Pbf)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3XDCM、2XDMF、3XDCM洗涤，且用30ml 20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C10-Arg(Pbf)-树脂。Fmoc脱保护后，用3XDCM、2XMeOH和3XDCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)癸酸(Sigma，Mw＝127.27)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3XDCM、2XMeOH和3XDCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C10-Arg(Pbf)-OH(Mw＝580.83)，并将溶剂蒸发。
C10-Arg(Pbf)-C10(Mw＝720.13)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C10-胺(Sigma，Mw＝157.3，d＝0.792)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，并在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C10-Arg-C10(Mw＝467.8)：向上述反应获得的油状残余物中添加100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。残余物溶解在AcCN/0.5M HCl(1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_Akta Explorer(PhenomenexRP，250X 21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用0-100％乙腈进行梯度洗脱；X＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。
实施例2
制备C10-D-Arg-C10
N-(5-胍基-1-氧代-1-(癸烷基氨基)戊-2-基)癸酰胺
Fmoc-D-Arg(Pmc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的含3g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入5.06g(11.7mmol，3eq)的Fmoc-D-Arg(Pmc)-OH(Mw＝662.8，Novabiochem，04-12-1145)和2.23ml(12.87mmol，3.3eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
D-Arg(Pmc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C10-D-Arg(Pmc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)的癸酸(Sigma，Mw＝127.27)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw 129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5×30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C10-D-Arg(Pmc)-OH(Mw＝591.84)，并将溶剂蒸发。
C10-D-Arg(Pmc)-C10(Mw＝732.14)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C10-胺(Sigma，Mw＝157.3，d＝0.792)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl，3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C10-D-Arg-C10(Mw＝467.8)：向上述反应获得的油状残余物中添加100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。残余物溶解在AcCN/0.5M HCl(1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_Akta Explorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用0-100％乙腈进行梯度洗脱；λ＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。
实施例3
制备C12-Arg-C12
N-(5-胍基-1-氧代-1-(十二烷基氨基)戊烷-2-基)十二酰胺
Fmoc-Arg(Pbf)-树脂。向用于固相合成的200ml反应器中的5g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM中，加入8.434g(13mmol，2eq)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Mw＝648.8，Novabiochem，04-12-1145)和2.26ml(13mmol，2eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Arg(Pbf)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护两次，每次15分钟。
C12-Arg(Pbf)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤，为了进行耦合反应，加入含1.95g(9.75mmol)的正十二烷酸(Sigma，Mw＝200.32)、4.033(9.75mmol)的HCTU(Mw＝417.7)和1.7ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C12-Arg(Pbf)-OH(Mw＝608.9)，并将溶剂蒸发。
C12-Arg(Pbf)-C12(Mw＝776.13)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含1.246g(6.5mmol)的EDC*HCl(Mw＝191.7)、1.06g(7.15mmol，1.1eq)的HOBt*H2O(Mw＝153)和5.65ml(31.5mmol，5eq)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DCM，从而预激活-COOH，随后在20分钟后加入1.32g(7.15mmol)的C12-胺(Sigma，Mw＝185.36)。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3XNaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。在TELEDYNE IscoCombiFlash Rf仪器上纯化产物，使用40g正相硅胶柱、5CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-5％MeOH，检测波长254nm，流速40ml/分钟。
C12-Arg-C12(Mw＝523.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入50ml的85％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。用0.5M HCl沉淀产物。
实施例4
制备C12-Arg-C14
N-(5-胍基-1-氧代-1-(十四烷基氨基)戊-2-基)十二酰胺
Fmoc-Arg(Pbf)-树脂。向用于固相合成的200ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM中，加入8.434g(13mmol，2eq)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Mw＝648.8，Novabiochem，04-12-1145)和2.26ml(13mmol，2eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Arg(Pbf)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C12-Arg(Pbf)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.95g(9.75mmol)的正十二烷酸(Sigma，Mw＝200.32)、4.033(9.75mmol)的HCTU(Mw＝417.7)和1.7ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C 12-Arg(Pbf)-OH(Mw＝608.9)，并将溶剂蒸发。
C12-Arg(Pbf)-C14(Mw＝804.13)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含1.246g(6.5mmol)的EDC*HCl(Mw＝191.7)、1.06g(7.15mmol，1.1eq)的HOBt*H2O(Mw＝153)和5.65ml(31.5mmol，5eq)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DCM，从而预激活-COOH，随后在20分钟后加入1.52g(7.15mmol)的C14-胺(Sigma，Mw＝213.41)。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。在TELEDYNE IscoCombiFlash Rf仪器上纯化产物，使用40g正相硅胶柱、5CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-5％MeOH，检测波长254nm，流速40ml/分钟。
C12-Arg-C14(Mw＝551.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入50ml的85％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。用0.5M HCl沉淀产物。
实施例5
以与实施例1-4相同的方式来制备C14-Arg-C14(产量：1.6g)、C16-Arg-C16和C18-Arg-C18。
实施例6
制备C18(油酰)-Arg-C16
N-(5-胍基-1-氧代-1-(十六烷基氨基)戊-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-Arg(Pbf)-树脂。向用于固相合成的60ml反应器中的5g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM中，加入8.4g(13mmol，2eq)的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Mw＝648.8，Novabiochem，04-12-1145)和2.26ml(13mmol，2eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Arg(Pbf)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤树脂，且用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C18油酰-Arg(Pbf)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.1ml(9.75mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47；d＝0.891)、4g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.7ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油酰-Arg(Pbf)-OH(Mw＝690.83)，并将溶剂蒸发。
C18油酰-Arg(Pbf)-C16(Mw＝850.13)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含1.437g(7.5mmol)的EDC*HCl(Mw＝191.7)、1.178g(7.7mmol)的HOBt*H2O(Mw＝153)和6.5ml(37.5mmol，5eq)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DCM，以预激活-COOH，随后在20分钟后加入1.86g(7.7mmol)的C16-胺(Sigma，Mw＝241.46)。反应过夜后，在分液漏斗中用3×0.5M HCl、3×10％NaCO3和3×NaCl洗涤有机层。DCM层用无水MgSO4干燥并蒸发。在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化产物，使用40g正相硅胶柱、5CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-5％MeOH，检测波长215nm，流速40ml/分钟。
C18油酰-Arg-C16(Mw＝661.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。用0.5M HCl沉淀产物并再纯化。产量：1.8g。
实施例7
制备C8-高Arg-C8
N-(6-胍基-1-氧代-1-(辛基氨基)己-2-基)辛酰胺
Fmoc-hArg(diBoc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的含3g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入3.57g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-hArg(diBoc)-OH(Mw＝610.69，Novabiochem，)和2.04ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
hArg(diBoc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C8-hArg(diBoc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.854ml(11.7mmol)的C8酸(Sigma，Mw＝144.22，d＝0.91)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C8-hArg(diBoc)-OH(Mw＝514.68)，并将溶剂蒸发。
C8-hArg(diBoc)-C8(Mw＝625.93)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含1.93ml(11.7mmol)的C8-胺(Sigma，Mw＝129.25，d＝0.782)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C8-hArg-C8(Mw＝426.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。残余物溶解在MeOH/AcCN/0.5M HCl(1∶1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_AktaExplorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内水作为流动相，用50-100％乙腈梯度洗脱；λ＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。
实施例8
制备C10-高Arg-C10
N-(6-胍基-1-氧代-1-(癸烷基氨基)己-2-基)癸酰胺
Fmoc-hArg(diBoc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的3g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入3.57g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-hArg(diBoc)-OH(Mw＝610.69，Novabiochem)和2.04ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
hArg(diBoc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C10-hArg(diBoc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)的癸酸(Sigma，Mw＝127.27)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C10-hArg(diBoc)-OH(Mw＝541.78)，并将溶剂蒸发。
C10-hArg(diBoc)-C10(Mw＝682.08)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C10-胺(Sigma，Mw＝157.3，d＝0.792)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C10-hArg-C10(Mw＝481.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。将残余物溶解在MeOH/0.5 M HCl(1∶1)中，并用H2O沉淀。
实施例9
制备C12-高Arg-C12
N-(6-胍基-1-氧代-1-(十二烷基氨基)己-2-基)十二酰胺
以与实施例8相同的方式制备C12-高Arg-C12(产量：1g)。
实施例10
制备C8-正-正Arg-C8
N-(3-胍基-1-氧代-1-(辛烷基氨基)丙-2-基)辛酰胺
Fmoc-Dap(Boc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的3g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入2.5g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-Dap(Boc)-OH(Mw＝426.5，(Fmoc-(N-β-Boc)-L-α，β-二氨基丙酸)、AnaSpec，22140)和2.03ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dap-(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C8-Dap(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.236ml(11.7mmol)的C8酸(Sigma，Mw＝144.22，d＝0.910)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C8-Dap(Boc)-OH(Mw＝330.49)，并将溶剂蒸发。
C8-Dap(Boc)-C8(Mw＝441.74)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C8-胺(Sigma，Mw＝129.25，d＝0.782)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C8-Dap-C8(Mw＝341.74)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C8-正-正Arg(diBoc)-C8(Mw 583.74)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.23g(5.85mM，1.5eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C8-正-正Arg-C8(Mw＝384.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。将残余物溶解在MeOH/AcCN/0.5M HCl(1∶1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_AktaExplorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用50-100％乙腈梯度洗脱；λ＝215nm下。将乙腈蒸发，并将产物冻干。
实施例11
制备C10-正-正Arg-C10
N-(3-胍基-1-氧代-1-(癸烷基氨基)丙-2-基)癸酰胺
Fmoc-Dap(Boc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的3.0g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入2.5g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-Dap(Boc)-OH(Mw＝426.5，(Fmoc-(N-β-Boc)-L-α，β-二氨基丙酸)，AnaSpec 22140)和2.03ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dap(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3xDCM、2xDMF、3xDCM洗涤，用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C10-Dap(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)的癸酸(Sigma，Mw＝172.27)、4.83g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM (以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C10-Dap(Boc)-OH(Mw＝357.54)，并将溶剂蒸发。
C10-Dap(Boc)-C10(Mw＝496.84)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C10-胺(Sigma，Mw＝157.3，d＝0.792)、4.83g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DCM。2小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C10-Dap-C10(Mw＝397.8)。向上述反应获得的油状残余物，加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C10-正-正Arg(diBoc)-C10(Mw＝640.8)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.23g(5.85mM，1.5eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C10-正-正Arg-C10(Mw＝439.8)：向上述反应获得的油状残余物中添加100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。将残余物溶解在AcCN/MeOH/0.5M HCl(1∶1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_AktaExplorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用50-100％乙腈梯度洗脱；λ＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。产量：1.6g。
实施例12
制备C12-正-正Arg-C12
N-(3-胍基-1-氧代-1-(十二烷基氨基)丙-2-基)十二酰胺
Fmoc-Dap(Boc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中含3.0g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入2.5g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-Dap(Boc)-OH(Mw＝426.5，(Fmoc-(N-β-Boc)-L-α，β-二氨基丙酸)，AnaSpec，22140)和2.03ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dap(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C12-Dap(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含2.34g(11.7mmol)的C12-酸(Sigma，Mw＝200.32)、4.48g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C12-Dap(Boc)-OH(Mw＝386.59)，并将溶剂蒸发。
C12-Dap(Boc)-C12(Mw＝553.95)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.168g(11.7mmol)的C12-胺(Sigma，Mw＝185.36)、4.48g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C12-Dap-C12(Mw＝453.9)。向上述反应获得的油状残余物，加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C12-正-正Arg(diBoc)-C12(Mw＝696.13)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.23g(5.85mM，1.5eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
实施例13
制备C8-正Arg-C8
N-(4-胍基-1-氧代-1-(辛基氨基)丁-2-基)辛酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的含3.0g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入2.577g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-Dab(diBoc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.23ml(12.87mmol，3.3eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Arg-Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C8-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)的C8酸(Sigma，Mw＝144.22，d＝0.910)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM (以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C8-Dab(Boc)-OH(Mw＝344.49)，并将溶剂蒸发。
C8-Dab(Boc)-C8(Mw＝455.74)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C8-胺(Sigma，Mw＝129325，d＝0.782)、4.84g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C8-Dab-C8(Mw＝355.74)。向上述反应获得的油状残余物，加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C8-正Arg(diBoc)-C8(Mw＝597.74)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.23g(5.85mM，1.5eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C8-正Arg-C8(Mw＝398.8)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。将残余物溶解在MeOH/AcCN/0.5M HCl(1∶1∶1)中，并用C18 Phenomenex柱上的RP_AktaExplorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用50-100％乙腈梯度洗脱；λ＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。产量：1.1g。
实施例14
以与实施例13相同的方式制备C10-正Arg-C10(产量：1.2g)、C12-正Arg-C12(产量：2.9g)、C14-正Arg-C14(产量：630mg)和C16-正Arg-C16(产量：1.0g)。
实施例15
制备C12-正Arg-C12
N-(4-胍基-1-氧代-1-(十二烷基氨基)丁-2-基)十二酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的500ml反应器中的含8g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的100ml干DCM，加入5g(11.35mmol，1.2eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和4ml(22.7mmol，2.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。在混合器上振荡2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C12-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM，2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含4.54g(22.7mmol)的C12-酸(Sigma，Mw＝200.32)、9.48g(22.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和4.52ml(26mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的100ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C12-Dab(Boc)-OH(Mw＝400.59)，并将溶剂蒸发。
C12-Dab(Boc)-C12(Mw＝567.95)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.168g(11.7mmol)的C12-胺(Sigma，Mw＝185.36)，4.48g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3×0.1M HCl、3×5％NaCO3和3×NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C12-Dab-C12(Mw＝467.9)。向上述反应获得的油状残余物中加入150ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C12-正Arg(diBoc)-C12(Mw＝710.13)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9-10。加入9g(23mM)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，3小时后将DCM蒸发。在TELEDYNE IscoCombiFlash Rf仪器上纯化产物，并使用120g正相硅胶柱、5.4CV(柱体积)的100％DCM和6.3CV的0-5％MeOH，检测波长215nm，流速70ml/分钟。
C12-正Arg-C12(Mw＝509.92)：向上述反应获得的油状残余物中加入150ml的70％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。用0.5M HCl沉淀残余物。
实施例16
制备C18-正Arg-C18
N-(4-胍基-1-氧代-1-(十八烷基氨基)丁-2-基)十八酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的3.0g含以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入2.577g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.03ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C18-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM，2×MeOH和3×DCM2洗涤树脂三次，为了进行耦合反应，加入含2.21g(7.8mmol)的C18酸(Sigma，Mw＝284.48)、3.32g(7.8mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和1.49ml(8.58mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18-Dab(Boc)-OH(Mw＝568.56)，并将溶剂蒸发。
C18-Dab(Boc)-C18(Mw＝735.95)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.1g(7.8mmol)的C18-胺(Sigma，Mw＝269.52)，3.32g(7.8mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和1.49ml(8.58mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C18-Dab-C18(Mw＝635.9)。向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，1小时后，将溶剂蒸发。
C18-正Arg(diBoc)-C18(Mw＝872.13)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.23g(5.85mM，1.5eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C18-正Arg-C18(Mw＝677.92)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。用AcCN/0.5M HCl(1∶1)混合物沉淀残余物。
实施例17
制备C18(油酰)-正Arg-C8
N-(4-胍基-1-氧代-1-(辛烷基氨基)丁-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的50ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入5.726g(13mmol，2eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.26ml(13mmol，2.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用40ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次30分钟。
C18油酰-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应2小时后，树脂用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油酰-Dab(Boc)-OH(Mw＝538.56)，并将溶剂蒸发。
C18油基-Dab(Boc)-C8(Mw＝594.01)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含1.227g(9.75mmol)的C8-胺(Sigma，Mw＝129.25)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C18油基-Dab-C8(Mw＝493.92)。向上述反应获得的油状残余物中加入70ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后减压除去溶剂。
C18油基-正Arg(diBoc)-C8(Mw＝735.95)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.543g(6.5mM，1eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C18油基-正Arg-C8(Mw＝535.89)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后将溶剂蒸发。将粗产物用在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化，利用40g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和7CV的0-15％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟，TLC：Rf＝0.2(CH2Cl2∶MeOH＝9∶1)。将DCM/MeOH蒸发和用0.1M HCl沉淀残余物。产量：0.7g。
实施例18
制备C18(油酰)-正Arg-C12
N-(4-胍基-1-氧代-1-(十二烷基氨基)丁-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的50ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入5.726g(13mmol，2eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.26ml(13mmol，2.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用40ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次30分钟。
C18油酰-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应2小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油基-Dab(Boc)-OH(Mw＝538.56)，并将溶剂蒸发。
C18油酰-Dab(Boc)-C12(Mw＝650.03)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物添加含1.76g(9.75mmol)的C12-胺(Sigma，Mw＝185.36)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C18油酰-Dab-C12(Mw＝549.91)。向上述反应获得的油状残余物中加入70ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后减压除去溶剂。
C18油酰-正Arg(diBoc)-C12(Mw＝792.5)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.543g(6.5mM，1eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C18油基-正Arg-C12(Mw＝591.55)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后将溶剂蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上化，利用40g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟。将TLC：Rf＝0.2(CH2Cl2∶MeOH＝9∶1)DCM/MeOH蒸发，用0.1M HCl沉淀残余物。
实施例19
制备C18(油酰)-正Arg-C16
N-(4-胍基-1-氧代-1-(十六烷基氨基)丁-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的50ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入5.726g(13mmol，2eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.26ml(13mmol，2.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用40ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次30分钟。
C18油酰-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，树脂用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应2小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油基-Dab(Boc)-OH(Mw＝538.56)，并将溶剂蒸发。
C18油酰-Dab(Boc)-C16(Mw＝705.95)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.354g(9.75mmol)的C16-胺(Sigma，Mw＝241.46)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C18油酰-Dab-C16(Mw＝605.9)。向上述反应获得的油状残余物，加入70ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后减压除去溶剂。
C18油酰-正Arg(diBoc)-C16(Mw＝842.13)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.543g(6.5mM，1eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C18油酰-正Arg-C16(Mw＝647.92)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后将溶剂蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化，利用48g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟。将DCM/MeOH蒸发，用0.1M HCl沉淀残余物。
实施例20
制备C18(油酰)-正Arg-C18
N-(4-胍基-1-氧代-1-(十八烷基氨基)丁-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-Dab(Boc)-树脂。向用于固相合成的60ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入5.726g(13mmol，2eq)的Fmoc-Dab(Boc)-OH(Mw＝440.5，(Fmoc-(N-γ-Boc)-L-α，γ-二氨基丁酸，AnaSpec，28246)和2.26ml(13mmol，2.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Dab(Boc)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基进行脱保护2次，每次15分钟。
C18:1-Dab(Boc)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18:1-Dab(Boc)-OH(Mw＝566.56)，并将溶剂蒸发。
C18:1-Dab(Boc)-C18:1(Mw＝734.95)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含3.725g(9.75mmol)的油基胺(Sigma，Mw＝267.49，70％)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。
C18:1-Dab-C18(Mw＝635.9)。向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的80％TFA/DCM 2.5％TIS，20分钟后将溶剂蒸发。
C18:1-正Arg(diBoc)-C18:1(Mw＝874.13)。将残余物溶解在50ml的DCM中，用TEA将pH调到9。加入2.348g(6mM，1eq)的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰)胍(Mw＝391.36，Aldrich 15033)，4小时后将DCM蒸发。
C18:1-正Arg-C18:1(Mw＝674.1)：向上述反应获得的油状残余物中加入100ml的95％TFA/DCM 2.5％TIS，3小时后，将溶剂蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化，利用48g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟。将DCM/MeOH蒸发，用0.1M HCl沉淀残余物。产量：3.2g。
实施例21
制备C10-[4-Pal(N-CH3)]-C10
4-(3-(癸烷基氨基)-3-氧代-2-癸酰胺丙基)-1-甲基吡啶氯化物
Fmoc-4-Pal-树脂。向用于固相合成的30ml反应器中的含3g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM，加入2.27g(5.85mmol，1.5eq)的Fmoc-4-Pal-OH(Fmoc-4-吡啶丙氨酸，Mw＝388.42，Advanced ChemTech，FX4140)和2.03ml(11.7mmol，3.0eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
4-Pal-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用30ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护30分钟。
C10-4-Pal-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.48g(11.7mmol)的癸酸(Sigma，Mw＝127.27)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的30ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C10-4-Pal-OH(Mw＝320.46)，并将溶剂蒸发。
C10-4-Pal-C10(Mw＝459.76)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.32ml(11.7mmol)的C10-胺(Sigma，Mw＝157.3，d＝0.792)、5.54g(11.7mmol)的HCTU(Mw＝473.7)和2.23ml(12.87mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。1小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3X 0.5M HCl、3X 10％NaCO3和3X NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。将残余物溶解在AcCN/0.5M HCl 1∶1中，用C18 Phenomenex柱上的RP_Akta Explorer(Phenomenex RP，250×21.2mm，序列号234236-1，柱体积83ml)纯化，以3CV内的水作为流动相，用350-100％乙腈梯度洗脱；λ＝215nm。将乙腈蒸发，并将产物冻干。
C10-4-Pal(Me)-C10(Mw＝474.76)。在溶液中进行甲基化。向溶解在20ml的THF中的0.4g(0.87mM)的C10-4-Pal-C10(Mw＝459.76)中加入83μl(0.87mmol)的二甲基硫酸盐(Sigma，Mw＝126.13，d＝1.325)。反应过夜后，加入等量的二甲基硫酸盐，1小时后，用0.5M HCl/AcCN混合物沉淀产物。
实施例22
制备C12-[4-Pal(N-CH3)]-C12
4-(3-(十二烷基氨基)-3-氧代-2-十二烷基氨基丙基)-1-甲基吡啶氯化物
Fmoc-4-Pal-树脂。向用于固相合成的200ml反应器中的含6.5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的70ml干DCM中，加入3.5g(9.01mmol，1.5eq)的Fmoc-4-Pal-OH(Fmoc-4-吡啶丙氨酸，Mw＝388.42，Advanced ChemTech，FX4140)和3.132ml(18mmol，2.2eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
4-Pal-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用70ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C12-4-Pal-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含2.549g(12.675mmol，1.5eq)的月桂酸(Sigma，Mw＝200.32)、5.3g(12.675mmol)的HCTU(Mw＝417.7)和2.2ml(12.675mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的70ml DMF。
反应1小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 30ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C12-4-Pal-OH(Mw＝346.7)，并将溶剂蒸发。
C12-4-Pal-C12(Mw＝515.7)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.3g(12mmol)的EDC*HCl(Mw＝191.7)、1.86g(12mmol的HOBt*H2O(Mw＝153.1)和10.44ml(60mmol，5eq)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的70ml DCM。预反应步骤进行20分钟，然后加入2.22g(12mmol)的C12-胺(Sigma，Mw＝185.36)。反应过夜后，在分液漏斗中用3×0.5M HCl、3×10％NaCO3和3×NaCl洗涤有机层。DCM用无水MgSO4干燥，并蒸发。在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化产物，并使用40g正相硅胶柱、5CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-5％MeOH，检测波长254nm，流速40ml/分钟。
C12-4-Pal(Me)-C12(Mw＝530.8)。甲基化在溶液中进行。向溶解在50ml的THF中的4g(7.75mM)的C12-4-Pal-C12(Mw＝415.7)中加入1.1ml(11.625mmol)的二甲基硫酸盐(Sigma，Mw＝126.13，d＝1.325)。反应过夜后，加入0.5ml的二甲基硫酸盐，1小时后，将溶剂蒸发，产物用0.5M HCl沉淀。
实施例23
制备C18油酰-[4-Pal]-C16
N-(1-氧代-3-(吡啶-4-基)-1-(十六烷基氨基)丙-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-4-Pal-树脂。向用于固相合成的50ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入3.787g(9.75mmol，1.5eq)的Fmoc-4-Pal-OH(Mw＝388.42，Advanced ChemTech)和1.7ml(9.75mmol，1.5eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
4-Pal-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用40ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C18油酰-4-Pal-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM，2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应2小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油基-4-Pal-OH(Mw＝430.62)，并将溶剂蒸发。
C18油酰-4-Pal-C16(Mw＝654.06)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.354g(9.75mmol)的C16-胺(Sigma，Mw＝241.46)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入AcOEt，在分液漏斗中用3×0.5M HCl、3×10％NaCO3和3×NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化，利用48g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟。将DCM/MeOH蒸发，用0.1M HCl沉淀残余物。产量：0.75g。
实施例24
制备(C18油酰)-(1-CH3-His)-NH-(C16烷基)
N-(3-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-1-氧代-1-(十六烷基氨基)丙-2-基)十八-9-烯酰胺
Fmoc-His(1-Me)-树脂。向用于固相合成的60ml反应器中的含1.7g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的30ml干DCM中，加入1g(2.5mmol，1.2eq)的Fmoc-His(1-Me)-OH(Mw＝391.43，ChemImpex)和0.435ml(2.5mmol，1.2eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
His(1-Me)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF、3×DCM洗涤，且用50ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次15分钟。
C18油酰-His(1-Me)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含1.247g(4.4mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47；d＝0.891)。1.82g(4.4mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和0.765ml(9.1mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应2小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验(无游离胺基存在)检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油基-His(1-Me)-OH，并将溶剂蒸发。
C18油酰-His(1-Me)-C16(Mw＝657.07)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含0.604g(2.5mmol)的C16胺(Sigma)、1.034g(2.5mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和0.435ml(2.5mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。反应过夜后，用乙酸醋酸酯稀释有机层，在分液漏斗中用3×0.5M HCl、3×10％NaCO3和3×NaCl洗涤。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlash Rf仪器上纯化，利用40g正相硅胶柱、5CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速40ml/分钟。用0.1M HCl沉淀纯化产物。产量：1g。
实施例25
制备(C18油酰)-(3’，5’-二碘-Tyr)-NH-(C16烷基)
(E)-N-(1-(十六烷基氨基)-3-(4-羟基-3，5-二碘苯基)-1-氧丙-2-基)十八-9-烯酰胺
建议的制备方法
Fmoc-Tyr(3’，5’-二碘)-树脂。向用于固相合成的50ml反应器中的含5g以1.3mmol/g取代(Novabiochem，01-64-0114)的2-氯化三苯甲基氯化物树脂的50ml干DCM，加入6.388g(9.75mmol，1.5eq)的Fmoc-Tyr(3’，5’-二I)-OH(Mw＝655.2，AnaSpec)和1.69ml(9.75mmol，1.5eq)的DIPEA(Aldrich，Mw＝129.2，d＝0.74)。
Tyr(3’，5’-二碘)-树脂。2小时后，用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)洗涤该树脂三次，用3×DCM、2×DMF，3×DCM洗涤，且用40ml的20％哌啶/DMF对Fmoc基团进行脱保护2次，每次30分钟。
C18油酰-Tyr(3’，5’-二碘)-树脂。Fmoc脱保护后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，为了进行耦合反应，加入含3.7g(13mmol)的油酸(Sigma，Mw＝282.47，d＝0.891)、5.37g(13mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和2.62ml(13mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。
反应3小时后，用3×DCM、2×MeOH和3×DCM洗涤树脂，反应进程通过阴性的Kaiser试验检测。
用1％TFA/DCM(以5X 50ml进行2分钟，用2ml 10％嘧啶/MeOH过滤至烧瓶中)从树脂上切下C18油基-Tyr(3’，5’-二碘)-OH(Mw＝697.43)，并将溶剂蒸发。
C18油酰-Tyr(3’，5’-二碘)-C16(Mw＝920.38)。在溶液中进行二次耦联。向上述反应获得的油状残余物中添加含2.354g(9.75mmol)的C16-胺(Sigma，Mw＝241.46)、4.033g(9.75mmol)的HCTU(Mw＝413.7)和1.69ml(9.75mmol)的DIPEA(Mw＝129.2，d＝0.74)的50ml DMF。4小时后，加入100ml的AcOEt，在分液漏斗中用3×0.5M HCl、3×10％NaCO3和3×NaCl洗涤有机层。AcOEt层用无水MgSO4干燥并蒸发。将粗产物在TELEDYNE Isco CombiFlashRf仪器上纯化，利用48g正相硅胶柱、3CV(柱体积)的100％DCM和10CV的0-20％MeOH，检测波长214nm，流速45ml/分钟。将DCM/MeOH蒸发，用AcCN/H2O混合物沉淀残余物。
实施例26
实施例 在9L细胞中的LacZ基因表达敲除体外试验
9L/LacZ是稳定表达编码细菌半乳糖苷酶的LacZ基因的大鼠胶质肉瘤细胞系。LacZ基因敲除测定可被用作干扰性RNA递送制剂的基于主要活性的体外试验。
为了进行LacZ基因敲除测定，用RNAi制剂转染9L/LacZ细胞，并在转染3日后采集的细胞上进行β-半乳糖苷酶试验。进行其它的试验来量化蛋白浓度。
以8000个细胞/孔(96-孔)平铺9L/LacZ细胞，并在培养基中孵育过夜。转染时的融合度为约15-20％。转染复合物的制备是通过将干扰性RNA加至OptiMEMTM培养基并搅拌，分别将递送制剂加至OptiMEMTM培养基并搅拌，最后将培养基中的干扰性RNA与培养基中的递送制剂混合，从而制成转染复合物。用新鲜的无血清培养基(无血清的OptiMEMTM)代替孵育细胞的培养基，并将转染复合物加至各孔中。细胞孵育5小时，然后加入100微升的完全培养基(DMEM加10％胎牛血清)后，于37℃和5％CO2孵育过夜。第二天，在转染24小时后，将培养基换成新鲜的完全培养基，将细胞于37℃和5％CO2再孵育48小时。
为了进行LacZ基因敲除，将采集的9L/LacZ细胞在PBS中洗涤，在M-PERTMReagent(Pierce)中裂解，并在室温下孵育15分钟。用Micro BCA试剂盒(Pierce，ThermoFisher Scientific)对采自各孔的裂解液进行蛋白分析，用All-in-OneTM β-半乳糖苷酶Assay Reagent(Pierce)进行β-gal分析。
实施例  在A549细胞中的PPIB基因表达敲除体外试验
亲环素B(PPIB)基因敲除测定可被用作干扰性RNA递送制剂的主要活性的体外试验。亲环素B(PPIB)基因表达敲除是在人泡状上皮基底细胞A549中测定的。为了进行PPIB基因敲除测定，用干扰性RNA制剂转染A549细胞，转染后24小时制备总RNA，并通过RT-PCR对PPIB mRNA进行分析。进行36B4(酸性核糖体磷蛋白PO)mRNA表达的QRT-PCR，从而进行标准化。
以7,500个细胞/孔(96-孔)接种A549细胞，在培养基中过夜培养。转染时的融合度为约50％。转染复合物的制备是通过将干扰性RNA加至培养基(OptiMEMTM)并搅拌，分别将递送制剂加至培养基(OptiMEMTM)并搅拌，最后将培养基中的干扰性RNA与培养基中的递送制剂混合，室温孵育20分钟，从而获得转染复合物。用新鲜的OptiMEMTM代替孵育细胞的培养基，将转染复合物加至各孔中。细胞37℃和5％CO2孵育5小时，然后添加完全培养基(至最终的胎牛血清浓度10％)，并孵育直至转染后24小时。
为了进行PPIB基因敲除，将细胞裂解，制备RNA(Invisorb RNA Cell HTS96-Kit/C，Invitek，Berlin，或RNeasy 96Kit，Qiagen)。在DNA Engine Opticon2热循环仪(BioRad)上，利用One-Step qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)进行定量RT-PCR。
PPIB所用的引物是：
(SEQ ID NO：1)
5’-GGCTCCCAGTTCTTCATCAC-3’(正向)和
(SEQ ID NO：2)
5’-CCTTCCGCACCACCTC-3’(反向)以及
(SEQ ID NO：3)
5’-FAM-CTAGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGG-TAMRA-3’作为探针。
36B4所用的引物是：
(SEQ ID NO：4)
5’-TCTATCATCAACGGGTACAAACGA-3’(正向)和
(SEQ ID NO：5)
5’-CTTTTCAGCAAGTGGGAAGGTG-3’(反向)以及
(SEQ ID NO：6)
5’-FAM-CCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTA-TAMRA-3’作为探针。
实施例  小鼠流感病毒滴度敲除的体内试验
小鼠体内流感病毒滴度敲除测试可被用作干扰性RNA氨基酸脂质递送制剂功效的体内测量标准。
在该试验中，通常将50uL的dsRNA氨基酸脂质制剂，或作为对照组的PBS，经鼻内施用给用克他命/甲苯噻嗪麻醉的7-9周龄的Balb/C小鼠。在第-2、-1和0天，每天给药，连续3天。在末次给药后的4小时诱导感染。
流感侵染是用流感A/Puerto Rico/8/34(PR8，H1N1亚型)诱导的。为了进行感染，将50μl在0.3％BSA/1XPBS/PS中稀释的20pfu PR8经鼻内施用给用克他命/甲苯噻嗪麻醉的小鼠。感染48小时后，采集肺部，并在600uL 0.3％BSA/1XPBS/PS中匀浆。将匀浆液冻融两次以释放病毒。进行TCID50试验(Tissue-Culture Infectious Dose 50)，以便滴定肺匀浆液中的病毒。在平底96-孔板中以2×104 MDCK细胞/孔接种细胞，并在24小时后除去含血清的培养基。将30uL的肺匀浆，未稀释或稀释10-至107-倍(以10倍系列稀释)，加入孔内，一式四份。孵育1小时后，将含4μg/ml胰蛋白酶的170μl的感染培养基(DMEM/0.3％BSA/10mM HEPES/PS)加至各孔内。在37℃孵育48小时后，通过鸡红血球的血凝集来确定培养上清液中是否存在病毒。利用Spearman和Karber公式评定病毒滴度。
实施例 siRNA浓度的SYBRTM Gold试验
制剂中的dsRNA浓度可用通过如下所述的SYBRTM Gold试验来确定：将10ul的dsRNA制剂加至100ul MeOH中，并于55℃孵育5分钟。加入50ul肝素(200mg/ml)，将溶液于55℃孵育5分钟。加入790ul PBS(磷酸盐缓冲液)，并将样品在微型离心机中离心旋转造粒。用10ul SYBRTM Gold试剂(Molecular Probes，Eugene，Oregon)孵育90ul的沉淀样品。用495nm的激发光读取Em 535nm的荧光。
实施例RNA分离和ApoB信使敲除的定量RT-PCR分析
在对于这种管家基因的方案中，第一天在8-10周龄的C57/B6或Balb/C雌鼠(5小鼠/每组)中分别通过鼻内或静脉内路径以50ul或200uL的dsRNA剂量进行肺部或全身给药。麻醉剂是克他命/甲苯噻嗪(IP-0.2ml剂量/小鼠)。第二天，从接受给药1天或连续给药3天后的肺模型小鼠分离全肺，或从全身模型小鼠分离肺、肝。肾、脾、心和/或全血。将组织置于含2ml RNALATERRNA稳定剂(Qiagen 76106)的24孔板内。平板置于干冰上立刻冷冻，并保存于-80℃直至制备匀浆液。
从尸检时保存在RNALATER溶液中的组织样品提取总RNA。总RNA的分离是根据制造商的关于分离哺乳动物组织的说明，利用InvitrogenPURELINK 96 RNA分离试剂盒完成的。然后，利用NanoDrop分光光度计对这些总RNA提取物进行定量，随后利用the Agilent Bioanalyzer 2100***，评定质量以确定RNA的完整性。在确定总RNA质量和数量后，将样品标准化为相等的浓度，根据制造商的用法说明，利用Applied Biosystems HighCapacity cDNA Archive试剂盒将50-100ng的总RNA合成为cDNA。然后，利用Nanodrop复核cDNA的浓度，接着以1∶10稀释，用于qRT-PCR分析。
使用cDNA样品和绿色SYBR技术，以及200nM的终引物浓度完成利用qRT-PCR的基因表达分析。利用Quanta PerfectCta SYBR Green FastMix，ROX以10μL的反应体积处理样品。利用384-孔型板在Applied Biosystems7900HT平台上以快速循环条件处理样品。然后，利用0.2的阈值将数据从SDS 2.3软件输出。利用用户输入到Excel的算法QBASE软件对其进行格式化而用于分析。内源对照所选的基因是基于geNorm分析，对于小鼠肝样品而言，GAPDH和PPIA和TBP已经显示出是用于基因表达分析的非常稳定的标准品。
血清胆固醇分析
本试验的目的是确定，用dsRNA给药48小时后，小鼠血液内的血清胆固醇水平。使用Invitrogen Amplex Red胆固醇分析试剂盒(cat# A12216)。采集小鼠全血，并置于血清分离管(SST-BD cat#365956)内，然后离心，从而将血清与其余的血液分离。血清在DI-H2O中以1∶40稀释，然后在来自Amplex分析试剂盒的1X反应缓冲液中以1∶5进一步稀释(总计1∶200)。标准物是试剂盒中附带的胆固醇参考标准物，浓度为20ug/ml、10ug/ml、8ug/ml、6ug/ml、4ug/ml、2ug/ml和1ug/ml。将样品，标准物和空白加至平底黑色96-孔板(CostarCatalogue#3916)内。制备Amplex分析混合物，并加至分析孔内。在37℃孵育至少30分钟后，用Molecular Devices SpectraMax M5对该板进行读数。选定“终点”方案，激发范围设定在530-560(优选544nM)，和发射检测在～590。一旦对该板进行读取，就将数据输出到excel，计算对照百分数，降低百分数和总血清胆固醇(ug/m)。
实施例27
本发明的某些双链RNAs(dsRNA)的结构示于表1中。
表1：双链RNAs
  RNA   序列
DX4227ApoB   (SEQ ID NO：7)正义5′-GGAAUCmUmUAmUAmUmUmUGAUCmCAsA-3′(SEQ ID NO：8)反义5′-mUmUGGAUmCAAAmUAmUAAGAmUUCmCsmCsU-3′
DX3030流感   (SEQ ID NO：9)正义5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3′(SEQ ID NO：10)反义5′-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCUU-3′
 RNA   序列
DX2816非-靶标Qneg   (SEQ ID NO：11)正义5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′(SEQ ID NO：12)反义5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′
DX2940LacZ   (SEQ ID NO：13)正义5′-CUACACAAAUCAGCGAUUUdTdT-3′(SEQ ID NO：14)反义5′-AAAUCGCUGAUUUGUGUAGdTdC-3′
DX2742PPIBMoCypB   (SEQ ID NO：15)正义5′-GGAAAGACUGUUCCAAAAAUU-3′(SEQ ID NO：16)反义5′-UUUUUGGAACAGUCUUUCCUU-3′
DX 2744G1498流感   (SEQ ID NO：17)正义5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT-3′(SEQ ID NO：18)反义5′-CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3′
经修饰的DX 2918Inm4TNFa   (SEQ ID NO：19)正义5′-CCGTCAGCCGATTTGCTATTT-3′(SEQ ID NO：20)反义5′-p-AUAGCAAATCGGCTGACGGTT-3′
表1中，“mU”代表2′-O-甲基尿苷，“mC”代表2′-O-甲基胞苷，和“s”代表硫代磷酸酯键。
实施例28
本发明的活性RNA制剂可以通过将干扰性RNA溶解在缓冲液或细胞培养基中并搅拌，分别将递送制剂与缓冲液或细胞培养基混合并搅拌，最后将和干扰性RNA混合物与递送制剂混合物掺合，而制成活性RNAi转染制剂。
为了制备递送制剂，可以将氨基酸脂质以及其它脂质和/或赋形剂溶解在CHCl3/MeOH中，N2下干燥，并在pH 7.4的含5％葡萄糖的10mM HEPES中水合。该混合物可以经超声处理，或挤出、透析和/或切向流过滤。
本领域已知的各种稀释方法都可以用于制备本发明的活性RNA制剂。
本发明的示例性干扰RNA制剂示于表2中。在该实例中，由名为C8-Arg-C8的氨基酸脂质提供用于向细胞内递送干扰性siRNA治疗剂的制剂。氨基酸脂质的量表示为递送组分的摩尔百分数，但不包括活性RNA试剂。名称“C16-Arg-C14”是指(C15烷基)-(C＝O)-Arg-NH-(C14烷基)，其等同于(C16酰基)-Arg-NH-(C14烷基)。
表2：dsRNA制剂
  组分 量
  dsRNA   50nM
  C16-Arg-C14氨基酸脂质   100mole％
本发明的示例性干扰RNA制剂示于表3中。在该实例中，由名为C14-正Arg-C14的氨基酸脂质提供用于向细胞内递送干扰siRNA治疗剂的制剂。氨基酸脂质的量表示为递送组分的摩尔百分数，不包括活性RNA试剂。名称“C14-正Arg-C14”是指(C13烷基)-(C＝O)-正Arg-NH-(C14烷基)，其等同于(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)。
表3：dsRNA制剂
  组分   量
  dsRNA   50nM
  C14-正Arg-C14氨基酸脂质   100mole％
本发明的示例性RNAi制剂示于表4中。在该实例中，将名为C10-正Arg-C10的氨基酸脂质与非-阳离子脂质在共递送制剂中组合。名称“C10-正Arg-C10”是指(C9烷基)-(C＝O)-正Arg-NH-(C10烷基)，其等同于(C10酰基)-正Arg-NH-(C12烷基)。
表4：dsRNA制剂
  组分 量
  dsRNA DX3030   50nM
  C10-正Arg-C10氨基酸脂质 50mole％
  DOPE   50mole％
本发明的示例性RNAi制剂示于表5中。在该实例中，将名为C12-高Arg-C12的氨基酸脂质与阳离子脂质、非-阳离子脂质和聚乙二醇化脂质在多组分递送制剂中组合。名称“C12-高Arg-C12”是指(C11烷基)-(C＝O)-高Arg-NH-(C12烷基)，其等同于(C12酰基)-高Arg-NH-(C12烷基)。
表5：dsRNA制剂
  组分 量
  dsRNA   25nM
  C12-正Arg-C12   30mole％
  DSPC   20mole％
  胆固醇   49mole％
  DSPE-PEG2000   1mole％
本发明的示例性干扰RNA乳剂组合物示于表6中。在该实例中，阳离子氨基酸脂质称作C14-正Arg-C14。
表6：dsRNA乳剂
Figure G2008800147206D01121
本发明的示例性干扰-RNA分散组合物示于表7中。在该实例中，阳离子氨基酸脂质称作C14-正Arg-C14。
表7：dsRNA分散组合物
  组分 量
  dsRNA   25nM，N/P4
  C14-正Arg-C14   12％(w/w of脂质/分散剂相)
  LABRASOL   88％(w/w of脂质/分散剂相)
  水   80％
实施例29
本发明的干扰性RNA组合物的示例性脂质体制剂示于表8。
表8：示例制剂
  组合物(mol％)
  C18-正Arg(NH3Cl)-C18/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C16-正Arg(NH3Cl)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C14-正Arg(NH3Cl)-C14/DMPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C12-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C10-Arg(NH3Cl)-C10/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C8-Arg(NH3Cl)-C8/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C10-D-Arg(NH3Cl)-C18/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C12-D-Arg(NH3Cl)-C16/DPPE-PEG5k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C14-D-Arg(NH3Cl)-C14/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C16-高Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C18-高Arg(NH3Cl)-C10/DMPE-PEG5k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C12-高Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C14-正正Arg(NH3Cl)-C14/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
  C16-正正Arg(NH3Cl)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30:1:20:49)
实施例30
RNA递送组合物的颗粒大小
脂质体氨基酸脂质干扰RNA制剂的实例示于表9中。表9中各制剂的N/P为1.8，且显示的粒径为106-139nm，分散值为约0.08-0.19。
表9：RNA递送组合物的粒径
组合物(mol％) N/P   粒径(nm) PDI
  C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30；1；20；49) 1.8 139 0.19
  C12-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30；1；20；49) 1.8 106 0.08
  C12-D-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30；1；20；49) 1.8 112 0.19
  C12-高Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30/1/20/49) 1.8 119 0.15
氨基酸脂质干扰RNA制剂的实例示于表10中。表10中制剂的N/P比为1.5-1.9，且显示的粒径为140-148nm，分散值为约0.18-0.30。
表10：RNA递送组合物的颗粒大小
组合物 N/P   粒径(nm) PDI
  C12-正-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30/1/20/49) 1.51 148.3 0.18
  C12-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30/1/20/49) 1.51 148.3 0.18
  C12-D-Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30/1/20/49) 1.51 148.3 0.18
  C12-高Arg(NH3Cl)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/CHOL(30/1/20/49) 1.89 140.3 0.30
本发明脂质体实施方案在JEOL 1230 TEM上的透射电子显微照片示于图2中。图2显示了用氨基酸脂质C12-正Arg-C12形成的球形脂质双分子层囊泡颗粒。显微照片的长度标尺是0.5微米，样品用3％乙酸双氧铀染色。脂质体制剂的脂质部分是[C12-正Arg(NH3 +Cl-)-C12/DSPC/胆固醇/DSPE-PEG-2000]，以总脂质的重量/重量百分比表示，其含量分别为[30％/20％/49％/1％]。脂质体包括抗流感活性dicer底物dsRNA DX3030。
实施例31
氨基酸脂质RNAi二元组合物的体外LacZ基因敲除活性
通过基于LacZ活性的体外试验，氨基酸脂质提供的有效干扰-RNA递送组合物如表11所示。表11的结果显示，采用在氨基酸脂质组合物中的干扰RNA的基因敲除结果由于了使用RNAIMAX(Invitrogen)的结果。
表11：氨基酸脂质干扰性RNA制剂的LacZ敲除
  组合物   ％敲除vs.Qneg
  C8-正Arg-C8:DOPE(1:1)   88
  C10-正Arg-C10:DOPE(1:1)   89
  C12-正Arg-C12:DOPE(1:1)   88
  C8-L-Arg-C8:DOPE(1:1)   16
  C10-L-Arg-C10:DOPE(1:1)   82
  C12-L-Arg-C12:DOPE(1:1)   100
  C8-D-Arg-C8:DOPE(1:1)   40
  C10-D-Arg-C10:DOPE(1:1)   82
  C12-D-Arg-C12:DOPE(1:1)   80
  C8-高Arg-C8:DOPE(1:1)   52
  C10-高Arg-C10:DOPE(1:1)   100
  C12-高Arg-C12:DOPE(1:1)   51
  C8-正正Arg-C8:DOPE(1:1)   78
  C10-正正Arg-C10:DOPE(1:1)   78
  C8-正Arg-C8:DPhPE(1:1)   43
  C10-正Arg-C10:DPhPE(1:1)   73
  RNAI-MAX   92
在表11中，dsRNA的终浓度是100nM，各组合物的N/P比是1.8。
实施例32
氨基酸脂质RNAi脂质体组合物的体外LacZ基因敲除
通过基于LacZ活性的体外试验，氨基酸脂质提供的有效干扰-RNA递送组合物如表12所示。
表12：氨基酸脂质RNAi组合物的标准化LacZ基因敲除
  组合物   ％敲除
  C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DPhPE/DSPE-PEG  (50/49/1)   60
  C12-Arg(NH3Cl)-C12/DPhPE/DSPE-PEG    (50/49/1)   94
  C12-D-Arg(NH3Cl)-C12/DPhPE/DSPE-PEG  (50/49/1)   86
  C12-高Arg(NH3Cl)-C12/DPhPE/DSPE-PEG  (50/49/1)   81
  RNAIMAX   82
表12的标准化LacZ敲除结果显示，所有氨基酸脂质组合物至少观察到60％敲除。表12的结果显示，采用氨基酸脂质组合物中的干扰-RNA的基因敲除结果超过了使用RNAIMAX的结果。
实施例33
氨基酸脂质RNAi组合物的体外基因敲除浓度应答
在体外测定了多个三元氨基酸脂质RNAi组合物的基因敲除活性。
如图3所示，根据在A549细胞中的基于PPIB敲除活性的体外试验，氨基酸脂质提供了有效的干扰-RNA递送组合物。根据图3的结果，如标准化PPIB值所表示，采用氨基酸脂质组合物中的干扰性-RNA的基因敲除超过了用RNAIMAX获得的结果。
在图3中显示了两种氨基酸脂质制剂的标准化PPIB值的浓度应答相比RNAIMAX的结果。图3中的制剂1是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]和制剂2是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE(50/32/18)]。
如图4所示，根据9L细胞中的基于LacZ敲除活性体外试验，氨基酸脂质提供了有效的干扰-RNA递送组合物。根据图4的结果，如标准化的β-半乳糖苷酶值所表示，采用氨基酸脂质组合物中的干扰性-RNA的基因敲除超过了用RNAIMAX获得的结果。
在图4中显示两种氨基酸脂质制剂的标准化β-半乳糖苷酶值的浓度应答相比RNAIMAX的结果。图4的制剂1是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]和制剂2是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE(50/32/18)]。
含三种脂质组分的多个氨基酸脂质制剂的体外基因敲除活性数据汇总于表13中。
表13：氨基酸脂质RNAi组合物的体外基因敲除
Figure G2008800147206D01171
如表13所示，以浓度10nM的dsRNA获得的结果显示，这些含C12-正Arg-C12的示例性氨基酸脂质制剂提供的体外基因敲除活性超过了使用获得RNAIMAX的结果。
在存在和不存在血清(胎牛血清)时获得的含三种脂质组分的某些氨基酸脂质制剂的体外基因敲除活性数据汇总于表14中。
表14：含和不含血清的氨基酸脂质RNAi组合物在体外的PPIB基因敲除
Figure G2008800147206D01181
如表14所示，含C12-正Arg-C12的示例性的氨基酸脂质制剂，在存在和不存在血清时，提供了高体外PPIB基因敲除活性。这些氨基酸脂质制剂是通过各种再水合和稀释方法制得的。
含三种和四种脂质组分的某些氨基酸脂质制剂的体外基因敲除活性数据汇总于表15。
表15：氨基酸脂质RNAi组合物在体外的LacZ基因敲除(KD)
Figure G2008800147206D01182
Figure G2008800147206D01191
如表15所示，含有三种和四种组分的某些氨基酸脂质制剂在体外提供了高9L/LacZ基因敲除活性。在利用氨基酸脂质混合物的知己和含有CHEMS或胆固醇作为额外脂质的制剂中观察高9L/LacZ敲除活性。
实施例34
氨基酸脂质RNAi组合物的体外ApoB基因敲除浓度应答
在体外测定了多个四组分氨基酸脂质RNAi组合物的ApoB基因敲除活性。
图5中示出获自HepG2细胞体外试验的ApoB基因敲除活性的实例。显示了对干扰性-RNA的三种氨基酸脂质制剂在25、2.5和0.25nM RNA下的浓度应答的标准化ApoB mRNA表达值。制剂1是[非氨基酸阳离子脂质/DSPC/chol./DMPE-PEG2k(40/10/48/2)]。制剂2和3都是[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]。
ApoB dsRNA是DX4227(ApoB-2P2098)。
浓度应答是为了获得HepG2细胞中的ApoB mRNA表达敲除的百分比。HepG2细胞筛查的试验步骤如下：第一天，用含10％FBS、1x非基本氨基酸，和0.125％碳酸氢钠的新鲜DMEM生长培养基培养HepG2细胞。第二天，将25微升的复合物加至孔内，然后孔内加入75微升OPTIMEM中的HepG2单细胞悬浮液(15000个细胞/孔)。4小时后，将含20％FBS的100ul DMEM加至各孔。第三天，在细胞裂解24小时，制备RNA，并对ApoB和rGAPDH
mRNA进行qRT-PCR。
多个四组分的氨基酸脂质RNAi组合物的ApoB基因敲除活性汇总于表16中。
表16：氨基酸脂质RNAi组合物的体外ApoB基因敲除
Figure G2008800147206D01201
实施例35
氨基酸脂质RNAi组合物的体内ApoB基因敲除
某些三和四组分氨基酸脂质RNAi组合物ApoB基因敲除活性是在小鼠体内确定的。体内ApoB mRNA降低活性示于表17中。
表17：氨基酸脂质RNAi组合物体内ApoB基因敲除
  组合物   ％体内敲除
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)   88
  C18:1-正Arg-C16/chol./DMPE-PEG2k(50/48/2)   45
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol./DMPE-PEG2k(50/15/33/2)   46
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol./DMPE-PEG2k(50/32/16/2)   88
获得了多个四组分氨基酸脂质RNAi组合物在小鼠体内的ApoB基因敲除剂量应答，并与小鼠血清胆固醇水平相比较。体内ApoB mRNA降低和相应的血清胆固醇降低汇总于表18中.
表18：氨基酸脂质RNAi组合物在体内的ApoB基因敲除(KD)剂量应答
组合物 ApoB mRNA％KD(ApoB 9133) ApoB mRNA％KD(ApoB 12211)   ％血清胆固醇变化(+/-增加/损失)
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)(N/P1.8，2mg/kg) 72.0 72.6 -7.1
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)(N/P1.8，1mg/kg) 35.2 39.6 -4.0
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k 17.6 20.6 10.6
  (50/32/16/2)(N/P1.8，0.5mg/kg)
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)(N/P0.8，4mg/kg) 69.9 70.6 -38.9
  C18:1-正Arg-C16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)(N/P0.8，2mg/kg) 46.3 47.8 -14.5
  PBS   ---   1.2   0
实施例36
氨基酸脂质RNAi组合物的抗病毒效应
含有四种组分的氨基酸脂质干扰RNA制剂实例示于表19中。用表19的制剂来确定在小鼠流感模型体内的抗病毒活性。
表19：实例RNA递送制剂和对比制剂
Figure G2008800147206D01221
Figure G2008800147206D01231
如表20所示，表19各制剂的N/P为1.8，并显示粒径为127-183nm(除了组7-8)，分散值为约0.1-0.3。
表20：RNA递送制剂和对比制剂的特性
  组   组合物   N/P   大小(nm)   PDI
1   C12-正Arg(NH3 +Cl-)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 151.1 0.315
2   C12-正Arg(NH3 +Cl-)-C12/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 128 0.134
3   C14-正Arg(NH3 +Cl-)-C14/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 144.5 0.201
4   C14-正Arg(NH3 +Cl-)-C14/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 126.6 0.114
5   C16-正Arg(NH3 +Cl-)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 182.8 0.141
6   C16-正Arg(NH3 +Cl-)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 174 0.157
7   C18-正Arg(NH3 +Cl-)-C18/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 977.4 1
8   C18-正Arg(NH3 +Cl-)-C18/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 625 0.925
9   C18油基-正Arg(NH3 +Cl-)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 139.3 0.155
10   C18油基-正Arg(NH3 +Cl-)-C16/DSPE-PEG2k/DSPC/chol.(30；1；20；49) 1.8 130.2 0.109
表19制剂的病毒滴度降低的程度示于表21中。各病毒滴度降低值都反应的是八只小鼠的数据。
表21：RNAi递送制剂的病毒滴度降低
组 dsRNA  病毒滴度相比PBS对照的减少倍数(平均值)  病毒滴度相比PBS对照的减少倍数(中值) p值
  1   DX3030   165.0   1698.0   0.0002
  2   Qneg DX2816   2.1   2.3   0.034
  3   DX3030   25.3   100.0   0.002
  4   Qneg DX2816   3.8   5.6   0.008
  5   DX3030   13.8   17.8   0.0003
  6   Qneg DX2816   6.3   6.7   0.002
  7   DX3030   26.7   31.6   0.001
  8   Qneg DX2816   2.6   5.6   0.037
  9   DX3030   25.7   22.8   0.0002
  10   Qneg DX2816   20.0   17.8   0.0003
整体而言，表21的结果显示，干扰-RNA氨基酸脂质制剂递送干扰性-RNA至体内细胞，其中与PBS对照相比，流感病毒滴度降低了高至约1600-倍或更高。对照组是#2，4，6，8，和10，其用Qneg给药。
Figure IYZ000006652290300021
Figure IYZ000006652290300031
Figure IYZ000006652290300051
Figure IYZ000006652290300061
Figure IYZ000006652290300071

Claims (26)

1.含有如式I所示结构的化合物及其盐：
R3-(C=O)-Xaa-Z-R4            式I
其中
Xaa是正精氨酸残基(-NHCH(CH2CH2NHC(=NH)NH2)C(=O)-)
Figure FDA00002310897300011
或吡啶基丙氨酸残基(-NHCH(CH2C5H4N)C(=O)-)
Figure FDA00002310897300012
或其N-甲基化变体，其中
R3独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；
R4独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基；
Z是NH或O。
2.权利要求1所述的化合物及其盐，其中R3和R4是C(6-22)烷基，R3和R4相同或不同。
3.权利要求1所述的化合物及其盐，其中R4是C(6-22)烷基且R3是C(6-22)烯基。
4.权利要求1所述的化合物及其盐，其中Z是NH。
5.权利要求1所述的化合物及其盐，其中Z是O。
6.权利要求1所述的化合物及其盐，其中Xaa具有含pKa为5至7.5的官能团的侧链。
7.权利要求1所述的化合物及其盐，其选自(C10酰基)-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正Arg-NH-(C18烷基)、(C16酰基)-正Arg-NH-(C12烷基)、(C18油酰)-正Arg-NH-(C12烷基)、(C18油酰)-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18油酰)-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-4-Pal-NH-(C18烷基)、(C18油酰)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C10酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C16烷基)、和(C18酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C18烷基)。
8.一种组合物，其包括权利要求1所述化合物及其盐中的一种或多种和一种或多种治疗性核酸。
9.权利要求8所述的组合物，其中治疗性核酸是基因沉默剂。
10.权利要求8所述的组合物，其中治疗性核酸是RNAi诱导剂。
11.权利要求8所述的组合物，其中治疗性核酸是双链RNA。
12.权利要求8所述的组合物，其中治疗性核酸是mdRNA。
13.权利要求8述的组合物，其中治疗性核酸包括修饰核苷酸。
14.权利要求8所述的组合物，其进一步包括一种或多种非氨基酸非阳离子脂质或固醇。
15.权利要求8所述的组合物，其进一步包括胆固醇琥珀酸单酯。
16.权利要求8所述的组合物，其进一步包括一种或多种非氨基酸阳离子脂质。
17.权利要求8所述的组合物，其进一步包括一种或多种聚乙二醇化脂质或聚乙二醇化固醇。
18.权利要求8所述的组合物，其中所述核酸与权利要求1所述化合物及其盐中的一种或多种形成复合物。
19.权利要求8所述的组合物，其中该组合物包括脂质体。
20.权利要求8所述的组合物，其中该组合物是乳剂。
21.权利要求8所述的组合物，其中该组合物是胶束分散体。
22.一种药物组合物，其包括权利要求1~7中任一项所述化合物及其盐中的一种或多种和一种或多种药剂或生物活性试剂。
23.一种将治疗性核酸递送至体外细胞的非治疗目的方法，包括制备权利要求8所述的组合物和用该组合物处理细胞。
24.一种抑制基因在体外细胞中表达的非治疗目的方法，包括制备权利要求8所述的组合物和用该组合物处理细胞。
25.权利要求8所述的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、病毒性疾病、败血症和癌症。
26.如权利要求25所述的应用，其中所述病毒性疾病是肝炎或流感。
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