KR20010069179A

KR20010069179A - 유전자 전달용 양이온성 리피드 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20010069179A
Application number: KR1020000016261A
Authority: KR
Inventors: 최준식; 이은정; 장형석; 박종상
Original assignee: 박종상
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2001-07-23
Also published as: KR100454881B1; KR20020013528A; EP1185674A1; AU5110200A; WO2000073471A1; JP2003501363A

Abstract

본 발명은 유전자 전달용 양이온성 리피드 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콜레스테롤에 라이신이나 오르니틴 같은 아미노산 그룹을 도입하여 유전자 치료나 형질변환에 필요한 유전자 전달용 양이온성 리피드, 리포좀 및 그의 합성방법을 개시하며, 본 발명에 의하면 낮은 세포독성 및 높은 유전자 전달효율을 갖는 새로운 유형의 양이온성 리피드들을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 고체상 합성 방법을 통하여 여러 가지 양이온성 리피드를 빠르고 효과적으로 합성하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

유전자 전달용 양이온성 리피드 및 그 제조방법 {Cationic lipids for gene transfer and Preparation Method thereof}

본 발명은 유전자 전달용 양이온성 리피드 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콜레스테롤에 라이신이나 오르니틴 같은 아미노산 그룹을 도입하여 유전자 치료나 형질변환에 필요한 유전자 전달용 벡터 및 그의 합성방법에 관한 것이다. 최근, 여러 선진국에서는 이 분야에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며 또한 이와 관련한 유전자 전달물질이 상품화되어 매우 큰 시장을 형성하고 있는 실정이다. 그러나, 이와 관련하여 국내의 연구 상황 및 신 물질개발은 매우 빈약한 상황으로, 앞으로 형성될 엄청난 생명공학관련 시장으로 미루어 볼 때 순수 국내 독자기술에 대한 요구가 시급한 상황이다.

일반적으로 유전자 치료에 쓰이는 전달체(Vehicle)로써, 최근에는 주로 아데노 바이러스 혹은 레트로 바이러스 등을 이용하는 바이럴 벡터시스템(viral vector system)이 이용되고 있다. 이와 같은 바이럴 벡터시스템은 효율은 좋으나 분자량이 큰 DNA를 전달하기가 어렵고, 바이러스의 재감염, 면역반응 유발 혹은 발암유전자의 활성화와 같은 심각한 부작용을 유발할 수 있는 문제점이 있어 유전자 치료에 적용하기에는 많은 어려움이 있다.

이에 따라, 현재는 바이러스(virus)를 사용하지 않는 유전자 전달방법이 많이 연구되고 있으며, 추후에도 이러한 방법이 생명공학분야에서 주종을 이룰 것으로 전망한다. 바이러스(virus)를 사용하지 않는 유전자 전달방법에 사용되는 물질로는 화학적으로 합성한 벡터들로서 우선, 양이온성 폴리머가많이이용되고있으며,폴리라이신(poly-L-lysine),폴리오르니틴(poly-L-ornithine),폴리에틸렌이민(polyethylenimine,PEI),폴리스퍼민(polyspermine), 덴드리머(dendrimer) 등이 이에 해당한다. 그리고 이보다 더욱 많이 이용되고 있는 것으로는 여러 가지 양이온성 리피드들이 있으며, 양이온성 리피드를 이용하는 방법(Nature, vol. 337, pp 387-388, 1989)으로 몇 가지 예를 들면 다음과 같다. 즉, 디씨-콜(Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 179, pp280-285, 1991), 슈퍼미딘-콜레스테롤(Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 221, pp82-88, 1996), 비.지.티.씨(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. vol. 93, pp9682-9686), 리포펙틴(Promega사), 트랜스펙탐(Promega사), 에스코트(Sigma사), 이펙텐(Qiagen사), 진포터(Genetherapy Systems사)와 같은 리피드들이 차세대 유전자 전달 물질로서 각광받고 있으며, 위와 같이 이들은 외국의 유명한 분자생물학 혹은 화학 관련 회사에서 이미 상품화되어 판매되고 있는 실정이다.

상기의 양이온성 폴리머 혹은 양이온성 리피드를 유전자 전달에 사용하는 방법은 원료물질의 합성이 용이하고 분자량이 큰 DNA를 전달할 수 있으며, 또한 생체에 적용시에 안전하게 사용할 수 있는 장점이 있으나, 아직까지는 바이러스를 사용하는 방법보다 효율면에서 떨어지고 단가가 높은 문제점을 지니고 있다.

본 발명자는 바이러스를 사용하지 않는 유전자 치료 혹은 유전자 전달 방법에서 일반적으로 많이 쓰이며, 장차 응용성이 많은 양이온성 리피드로서 유전자 전달효율이 높고 세포에 대한 독성이 낮으며, 또한 생체대사가 가능하여 인체에도 무해한 새로운 양이온성 리피드를 연구하던 중 라이신-콜레스테롤 또는 오르니틴-콜레스테롤이 상기와 같은 요건을 충족시킬 수 있다는 사실을 알아내고서 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 유전자 전달 효율이 높고 세포에 대한 독성이 낮은 새로운 유형의 양이온성 리피드를 제공하는 데에 있으며,

또한 본 발명의 또다른 목적으로는 양이온성 리피드들을 이용하여 제조되는 리포좀을 제공하는 데에 있으며,

또한 본 발명의 또 다른 목적으로는 이들 양이온성 리피드들을 합성하는데 있어서, 고체 지지체를 사용하여 손쉽게 합성하는 고체상 합성방법을 제공하는 데에 있다.

도 1a는 라이신-콜레스테롤(K1-Chol,K2-Chol)의 합성도,

도 1b는 오르니틴-콜레스테롤(O1-Chol,O2-Chol)의 합성도.

도 2a는 HepG2 세포에 대한 독성 실험결과를 나타내는 그래프.

도 2b는 NIH3T3 세포에 대한 독성 실험결과를 나타내는 그래프.

도 2c는 293 세포에 대한 독성 실험결과를 나타내는 그래프.

도 3은 K-Chol/DNA 복합체의 크기 측정결과를 나타내는 사진.

도 4는 본 발명의 양이온성 리피드를 이용한 293T 세포와 HepG2 세포에 대한 트렌스펙션 결과를 나타내는 그래프.

도 5는 양이온성 리포좀을 이용한 293T 세포와 NIH3T3 세포 및 HepG2 세포에 대한 트렌스펙션 결과를 나타내는 그래프.

도 6은 트렌스펙션된 HepG2 세포를 X-gal을 이용하여 염색한 사진.

도 7은 293세포를 대상으로 트랜스펙션 시간을 달리하여 측정한 시간과 혈청의존성 트랜스팩션실험결과

본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 양이온성 리피드를 포함한다.

상기에서 R은 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺또는 -CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺에서 선택된 1종을 나타내며, 중합체는 라이신 또는 오르니틴이 단독으로 또는 혼합되어진 호모 또는 헤테로인 것 중 n= 1∼10을 만족한다.

상기 일반식으로 표시되는 본 발명의 양이온성 리피드는 양전하를 띠는 아미노잔기를 가지는 아미노산 그룹과 소수성으로 4개의 환구조를 특징으로 하는 콜레스테롤이 결합에 관여한다.

상기 본 발명의 양이온성 리피드를 구성하는 아미노산 그룹으로는 라이신(Lysine, K) 또는 오르니틴(Ornithine, O)이 이에 해당하며, 상기 두 아미노산은 정상적인 세포환경에서의 pH인 중성영역에서 라이신은 ε-NH₃ ⁺, 오르니틴은 δ-NH₃ ⁺의 형태로 존재하게 되므로 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 전체적으로 세포내에서 양전하의 하전상태를 보유하게 된다. 상기 화합물(Ⅰ)의 양이온 특성은 본 발명의 양이온성 리피드가 중성영역에서 음전하를 띠고 있는 각종 올리고뉴클레오티드와 복합체를 형성하는 것을 가능하게 하고 또한 상대적으로 음전하를 보유하고 있는 타겟 세포막과의 접착을 효율적으로 이행하는 데 도움을 준다.

또한 상기 일반식(Ⅰ)중에 소수성부위인 리피드는 바람직하기로는 콜레스테롤을 사용한다. 콜레스테롤은 3번 탄소의 수산기(-OH)를 제외하고는 분자전체가 소수성으로 세포막을 구성하는 지질간의 지지체 역할을 하는 화합물로서 뿐만 아니라 트랜스펙션에 비히클(Vehicle)로 이용시 타겟세포와의 융합을 가능하게 한다.

상기 본 발명의 양이온성 리피드는 친수성부위인 아미노산 그룹과 소수성부위인 리피드부위로 구성된 양친매성 화합물로서 카르복시기가 아미드 형태로 된 아미노산 그룹의 α탄소의 아민기(-NH₂)와 클로로포르메이트로 활성화된 리피드인 콜레스테롤의 3번 탄소의 수산기(-O-CO-Cl)간의 카바메이트에스테르 형성반응에 의하여 형성하는 것이 바람직하다.

또한 상기 아미노산 부위의 라이신 또는 오르니틴은 중합시 호모 또는 헤테로의 형태 어느 것으로도 본 발명의 실시에 적합하다. 중합에 있어 상기 n의 값은 1∼10으로 하는 것이 좋으며, 보다 바람직하기로는 n이 1∼5로 하는 것이 세포내로의 트랜스펙션효율과 경제성을 고려할 때 좋다. 더욱 바람직하기로는 상기 양이온성 리피드는 n이 1∼2의 범위를 갖는 3β[L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤이다.

상기 본 발명의 양이온성 리피드는 거대분자와 함께 복합체를 형성함으로써 목적으로 하는 세포내로의 트랜스펙션을 행할 수 있다. 상기 복합체를 형성하는 거대분자로는 올리고뉴클레오티드와 올리고머 등을 포함하며 이때 올리고뉴클레오티드로는 단일사슬 또는 이중사슬의 DNA 또는 RNA 및 플라즈미드를 포함한다.

상기 올리고뉴클레오티드로는 DNA 또는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라즈미드, RNA일 수 있으며 RNA는 mRNA, tRNA, rRNA 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA, RNA 서열과 상보적인 엔티센스 RNA 및 리보자임(Rybozyme)을 포함한다.

상기 단백질을 코딩하는 유전자로는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드로는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 올리고뉴클레오티드로는 유전자발현조절인자, 예를 들면 전사 프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 양이온성 리피드는 리포좀의 형태를 포함한다(이하 양이온성 리피드로 구성되어진 리포좀을 '양이온성 리포좀'이라 칭하기로 한다.).

리포좀은 합성지질막으로 이루어진 소포(vesicle)로서 내부에 수용성 물질을 함유하는 구조물을 말한다. 리포좀은 내부에 약제학적으로 유용한 각종 물질을 표적세포까지 운반하는 기능을 한다. 상기 리포좀을 약제학적으로 사용하는 경우에 지질막이 서서히 용해되기 때문에 서방성 의약품으로 할 수 있고, 경구투여나 주사로도 체내의 흡수를 촉진할 수 있으며, 표적기관이나 조직의 주변에만 의약품의 농도를 증대시킬 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 양이온성 리포좀은 상기한 본 발명의 양이온성 리피드만을 이용하여 구성할 수도 있으며, 바람직하기로는 10∼90몰의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 양이온성 리피드와 중성의 보조 리피드 10∼90몰로 구성된다. 상기 리포좀에 사용하는양이온성 리피드로 바람직하기로는 n이 1∼5로 하는 것이 세포내로의 트랜스펙션효율과 경제성을 고려할 때 좋으며, 더욱 바람직하기로는 상기 양이온성 리피드는 n이 1∼2의 범위를 갖는 3β[L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤, 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤이다.

상기 중성 보조리피드로는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 콜레스테롤이 여기에 포함되나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 양이온성 리포좀은 리피드분자를 수용액내에서 부유한 후 초음파를 처리함으로써 매우 균일한 사이즈의 구형 소포(Vesicle)를 형성할 수도 있으며, 또한 에탄올내의 리피드용액을 물과 급속한 혼합에 의하여 형성하는 것도 본 발명의 실시에 있어 바람직하다.

또한 본 발명은 전술한 양이온성 리피드 또는 리포좀을 유전자 전달용 벡터로 하는 약제학적 조성물을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 양이온성 리피드(또는 양이온성 리포좀)와 질병치료에 유용한 유전자를 포함하는 올리고 뉴클레오티드로 구성된 양이온성 리피드 복합체를 유효성분으로 하는 것이 바람직하다. 약제학적 조성물로 사용시 첨가량은 투입되어지는 기타 조성물과의 관계, 환자의 상태, 질병의 종류에 따라 각각 허용량을 달리하므로 특별한 한정을 요하지는 아니한다.

본 발명은 또한 양이온성 리피드의 합성방법을 포함한다.

본 발명의 양이온성 리피드는 도 1에 도시한 바와 같이 라이신 또는 오르니틴을 콜레스테릴 클로로포르메이트와 카바메이트 에스테르 결합반응에 의하여 이루어진다. 하지만 본 발명의 양이온성 리피드가 상기 방법에 의해 제조되는 것으로 한정적으로 해석되어져서는 아니되고 당업자라면 본 발명의 방법과 다른 절차에 의하여 상기 본 발명의 양이온성 리피드를 제조하는 것도 가능하다.

도 1에서와 같이 본 발명에 의한 양이온성 리피드는

(1) 링크아마이드수지(Rinkamideresin)를 적절한 유기용매에 넣어 팽윤시킨 후, 피페리딘을 포함하고 있는 유기용매를 일정시간 처리하여 Fmoc(9-플르오로메톡시카보닐)보호기를 제거하는 단계.

(2) 상기 과정에 의하여 처리가 완료된 수지에 Nα-Fmoc-Nε-tBoc(터셔리부톡시카보닐)-라이신 또는 Nα-Fmoc-Nε-tBoc-오르니틴의 카르복시 그룹을 활성화시켜 연결한 후 아미노산의 Fmoc 보호기를 제거하는 단계,

상기 (2)의 단계에서 필요에 따라 동일과정을 거쳐 라이신과 오르니틴을 호모 또는 헤테로 폴리머로 중합할 수 있다. 이 경우 바람직한 n의 수치는 1∼10, 더욱 바람직하기로는 1∼5임은 이미 전술한 바와 같다.

(3) 콜레스테릴 클로로포르메이트를 메틸렌클로라이드에 녹이고 여기에 DIPEA를 가한 후 아미노산의 아민기에 연결시키는 단계.

(4) (3)과정에서 얻어진 결과물에 TFA(트리플루오로아세트산)/메틸렌클로라이드를 첨가하여 고체지지체로부터 라이신-콜레스테롤 또는 오르니틴 콜레스테롤과측쇄 보호기를 탈리하는 단계로 구성되어 최종적으로 원하는 양이온성 리피드를 합성하게 된다.

또한 상기 본 발명의 양이온성 리포좀은 그 표면에 리포좀 복합체의 혈액순환시간을 연장하는데 효과적인 친수성 폴리머사슬을 구비할 수 있다. 상기 친수성 폴리머로는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린 등을 포함할 수 있다. 상기 친수성 폴리머로 바람직하기로는 폴리에틸렌 글리콜로 상기 화합물은 에틸렌글리콜을 중합시켜 얻어지는 폴리머로서 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자내에 소수부분과 친수부분이 존재하는 양친매성 물질로서 본 발명의 양이온성 리피드복합체/리포좀복합체에 화학적으로 결합하면 항원성이 감소되는 효과를 지닌다. 상기 친수성 폴리머는 양이온성 리피드의 라이신 또는 오르니틴의 ε-아미노그룹 또는 δ-아미노그룹에 결합이 가능하며, 바람직하기로는 하기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 바와 같이 폴리펩티드 말단 카복시 그룹의 아마이드기에 결합하는 것을 포함한다.

상기와 같이 친수성 폴리머로서 폴리에틸렌글리콜이 결합되는 경우에 바람직하기로는 분자량 0.5∼20K dalton 인 것을 사용하는 것이 본 발명의 실시에 있어서 적합하다.

또한 본 발명의 양이온성 리피드는 타겟이 되는 세포에 특이적으로 결합될수 있도록 상기 양이온성 리피드에 특이적인 '마커'(marker) 또는 리간드를 부가할 수 있다. 상기 마커 또는 리간드로는 각종 항체, 트랜스페린, 비오틴, 엽산, 저비중 지단백질(low-density lipoprotein, LDL), 탄수화물로서 단당류인 만노스, 글루코스, 갈락토스 및 이당류인 락토오스가 바람직하다. 상기 식별자들은 세포마다 상이하며 각 세포에는 대응하는 수용체가 존재하여 특이적으로 반응하게 된다. 특정 세포에 대한 상기 식별자는 본 발명의 기재로부터 당업자라면 필요에 따라 선택적으로 부가할 수 있는 사항으로 더 이상의 자세한 설명은 피하기로 한다.

상기 양이온성 리피드복합체 또는 리포좀복합체의 타겟 세포내로의 이행기작으로는 엔도시토시스 또는 세포막과 리포좀 또는 복합체와의 융합에 의하여 이루어진다. 엔도시토시스의 경우에는 세포내에서 엔도좀을 형성하는 과정을 거쳐 트랜스펙션이 일어나며, 융합의 경우 리포좀의 막은 타겟 세포막과 일체화되고 리포좀내의 내용물은 세포질내로 이행이 이루어지는 과정을 통하여 타겟 세포를 트랜스펙션하게 된다. 트랜스펙션의 정확한 기작은 아직 알려진 바는 없고 다만 복합체를 함유하고 있는 엔도좀이 세포핵주위에서 핵막에 연결된 큰 소포체로 융합되는 과정에 의해 핵주위로 리피드복합체의 이동이 이루어진 후, 올리고 뉴틀레오티드가 핵속으로 들어가 전사와 단백질 합성에 관여하거나, 양이온성 리피드복합체가 엔도좀의 음이온성 리피드와 정전기적 상호교환이 일어나면서 복합체내의 올리고뉴클레오티드가 해리되어 세포질로 방출된 후 핵속으로 전달되어 전사와 합성에 관여하게 되는 과정을 거치게 된다.

본 발명의 양이온성 리피드 및 양이온성 리포좀은 세포내 분해가 가능하고 또한 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 세포내 독성이 종래의 유전자 전달체에 비하여 현저히 낮은 특징이 있어 유전자 전달체로서 매우 우수하다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 예시에 불과하며 이들이 본 발명의 권리범위를 제한하는 어떠한 의미로도 사용되어서는 아니된다.

<실시예 1> 라이신-콜레스테롤(K-Chol) 및 오르니틴-콜레스테롤(O-kol)의 합성

50∼100mg 정도의 링크아마이드 (Rink Amide) 수지 (Anaspec, USA)를 DMF (N,N-dimethylformamide)에 1시간 이상 넣어두어 팽윤시킨 다음, 피페리딘 (piperidine)을 포함하고 있는 DMF 용액을 30분 이상 처리하여 Fmoc (9-Fluoromethoxycarbonyl) 보호기를 제거하였다. 그 다음, 1당량의 HBTU (2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluoro phosphate), 1당량의 HOBt (N-hydroxybenzotriazole- H₂O), 2당량의 DIPEA (diisopropylethylamine)가 포함되어 있는 DMF 용액을 사용하여 N_α-Fmoc-N_ε-Boc(tertiarybutoxycarbonyl)-라이신 혹은 N_α-Fmoc-N_ε-Boc-오르니틴의 카복시 그룹을 활성화 시켜서 수지에 연결한 다음 수지를 DMF로 여러 번 세척하였다. 이어서, 아미노산의 Fmoc 보호기를 피페리딘으로 제거한 다음 역시 DMF로 세척하였다. 필요한 경우, 라이신 혹은 오르니틴을 각각 1회씩 더 반복하여 수지에 아미노산이 2개까지 붙을 수 있도록 하였다.

그 다음, 콜레스테릴 클로로포르메이트 (cholesterylchloroformate)를 메틸렌클로라이드 (methlyene chloride)에 녹이고 여기에 DIPEA를 넣은 후, 아미노산의 아민기에 연결시켰다. 그리고, 수지를 DMF, 메틸렌클로라이드, 메탄올을 이용하여 순서대로 충분히 세척하여 진공상태에서 하룻밤 건조하였다.

고체 지지체로부터 라이신-콜레스테롤(이하 K-Chol이라 약칭함) 혹은 오르니틴-콜레스테롤(이하 O-Chol이라 약칭함)의 탈리와 측쇄 보호기의 탈리는 TFA(trifluoroacetic acid)/methylene chloride를 첨가하여 수행하였다. 이상의 과정으로 합성된 양이온성 리피드는 에틸에테르상에서 침전하여 서너 번 이상 세척하였고, 그 다음 물에 녹여서 동결건조를 시행하였다. 이것의 분자량을 FAB MS (fast atom bombardment mass spectroscopy) 방법, 혹은 MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionization- time-of-flight mass spectroscopy) 방법으로 확인하였다.

K1-Chol: 1H NMR (300MHz,d6-DMSO) δ in ppm 0.65-2.26 (m, skeleton of cholesterol, -(CH2)3- of Lys), 2.75 (br, s, -CH2 of Lys), 4.3 (br, s, -CH of Lys) 7.2 (br, -NH2 of Lys) 7.7 (br, -CO-NH- of Lys).

분자량 (FAB-MS) m/z 558 [M+H]+, (MALDI-TOF MS) m/z 576 [M+Na]+.

K2-Chol: 0.65-2.26 (m, skeleton of cholesterol, -(CH2)3- of Lys), 2.75 (br,s, -CH2 of Lys), 4.3 (br, d, -CH of Lys), 7.2 (br, -NH2 of Lys), 7.7 (br, -CO-NH- of Lys). 분자량 (FAB-MS) m/z 686 [M+H]+.

* K1: 라이신 1개를 의미, K2: 라이신 2개를 의미

O1-Chol: 1H NMR (300MHz,d6-DMSO) δ in ppm 0.65-2.26 (m, skeleton of cholesterol, -(CH2)2- of Orn), 2.75 (br, s, -CH2 of Orn), 4.3 (br, s, -CH of Orn) 7.2 (br, -NH2 of Orn) 7.7 (br, -CO-NH- of Orn)

분자량 (MALDI-TOF MS) m/z 560.2 [M+Na]+.

O2-Chol: 1H NMR (300MHz,d6-DMSO) δ in ppm 0.65-2.26 (m, skeleton of cholesterol, -(CH2)2- of Orn), 2.75 (br, s, -CH2 of Orn), 4.3 (br, s, -CH of Orn) 7.2 (br, -NH2 of Orn) 7.7 (br, -CO-NH- of Orn)

분자량 (MALDI-TOF MS) m/z 673.2 [M+Na]+.

* O1: 오르니틴 1개를 의미, O2: 오르니틴 2개를 의미

<실시예 2> 리포좀의 제조.

상기 실시예 1에 의해 합성한 K-Chol을 적당량 물에 녹여 냉장고에 보관하였다. 그리고, 일반적으로 많이 사용되는 중성의 보조 리피드인 DOPE를 적당량 덜어서 클로로포름에 녹여둔 것을 질소가스로 불어서 말린 다음, 진공상태에서 완전하게 말렸다. 다음으로 물에 녹여둔 양이온성 리피드를 DOPE와 질량비가 50:50 정도되도록 넣고 상기 수용액을 잠시 흔들어 섞어준 다음 냉장고에 넣어서 밤새도록 방치하였다. 그런 다음, 수조 모양의 sonicator를 이용하여 수 분 정도 처리하여 리포좀을 형성하였다. 상기 리포좀은 말번 4700 시스템(Malvern Instrument Ltd., UK)를 이용한 다이나믹 라이트 스캐터링 방법에 의해 그 크기를 측정한 결과 표 1에서와 같이 5회 측정 평균치가 146.9±8.2로 나타났다.

<표 1>

횟수	크기(나노미터)
1	138.3
2	143.8
3	151.3
4	158.8
5	142.3

<실시예 3> 293, NIH3T3, HepG2 세포에 대한 독성 실험.

293, NIH3T3, HepG2 세포를 96well plate에서 10FBS (fetal bovine serum)을 함유하는 MEM(Minimum essential medium)을 배지로 하여 37℃, 5이산화탄소 조건의 배양기에서 배양한 다음, 적당한 량의 폴리에틸렌이민 및 각종 양이온성 리포좀을 첨가하였다. 이틀 동안 세포를 더 키운 다음, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 PBS (phosphate buffered saline)에 녹인 후 세포에 첨가하여 4시간을 배양기에서 더욱 키웠다. 그 다음 DMSO (dimethylsulfoxide)를 첨가하여 반응물을 녹여서, 570 nm 에서의 흡광도를 측정하여 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조구와 비교하였다. 표 2 및 도 2(a), (b), (c)에서 보여지는 바와 같이, K-Chol/DOPE 리포좀 및 O-Chol/DOPE 리포좀이 다른유전자 전달 물질인 리포펙틴(Lipofectin), DC-Chol/DOPE 리포좀 및 폴리에틸렌이민(PEI)과 비교한 결과, 같은 농도범위에서 세포독성이 현저히 낮음이 확인되었다.

<표 2> 세포독성 비교

트렌스펙션시약	IC₅₀(㎍/㎖)
트렌스펙션시약	293	NIH3T3	HepG2
폴리에틸렌이민	9.45	4.54미만	14.7
리포펙틴	35.5	17.9	21.2
DC-Chol/DOPE	ND*	17.2	15.5
K-Chol/DOPE	57.5	21.9	39.2
O-Chol/DOPE	ND	40.9	ND

* ND(Not determined): 각 시약의 농도가 60㎍/㎖를 초과한 경우임에도 아직 IC₅₀에 도달하지 못한 경우를 의미함.

<실시예 4> K-Chol/DNA 복합체의 크기 측정.

K-Chol/DNA 복합체는 베타갈락토스 분해효소 유전자가 도입된 플라즈미드 DNA(상품명: pSV-β-gal, Promega)와 K-Chol을 HEPES 버퍼(25mM, pH 7.4, 10mM MgCl₂)하에 혼합시켜 형성하였고, 상온에서 30분간 정온방치하였다. 상기 복합체 용액 1㎕를 신선한 스프리트 미카 디스크 표면에 분주하여 1 내지 2분간 동안 흡착을 한 후 여액을 여과지로 여과하여 제거하고 순수(Pure water)로 씻어주었다. 미카 표면에 N₂가스를 불어준 후에 상온에서 건조하였다. 상기 과정에 의하여 얻어진 K-Chol과 플라즈미드 DNA 복합체의 모양 및 입자크기는 Atomic force microscopy method(NanoScope Ⅲa system, Digital Instruments, Inc., Santa Barbara, CA)를 이용하여 측정한 결과 도 3에서와 같이 150∼200nm임을 확인하였다.

< 실시예 5 > 양이온성 리피드를 이용한 293T 세포와 HepG2 세포에 대한 트렌스펙션(transfection)실험.

293T 세포 (embryonic human kidney cells)와 HepG2 세포 (human liver carcinoma cell line)을 각각 DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) 혹은 MEM (Minimum essential medium) 배지에서 키웠다. 24well plate에 적당량 세포를 나누어 키운 다음, 베타갈락토스 분해효소를 합성하는 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA와 K-Chol을 섞어서 복합체를 형성하여 세포에 트렌스펙션을 실시하였다. 리포펙틴 및 폴리에틸렌이민을 대조구로 하여 각각 실험하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, K-Chol이 일반적으로 높은 유전자 전달효율을 갖고 있음을 확인하였다. 특히, 표 3에서 나타낸 바와 같이 10의 FBS (fetal bovine serum)가 있는 상황에서 약 48시간 처리했을 때, 다른 물질들보다 유전자 전달 및 발현효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

<표 3> 유전자 전달체별 전달효율 비교표

	베타갈락토스 분해효소의 발현정도 (mUnits / well)
유전자 전달체	HepG2, (-)FBS, 4시간 transfection	293T, (-)FBS,4시간 transfection	293T, (+)FBS,48시간 transfection
리포펙틴	2.25±0.12	12.7±0.50	3.53±0.83
폴리에틸렌이민	20.9±1.8	14.1±0.93	0±0거의 측정되지 않음.
K-Chol	11.4±2.4	19.8±1.6	12.3±0.62

* 표 안의 수치는 3회씩 실험한 값들의 평균±표준오차임.

<실시예 6> 양이온성 리포좀을 이용한 293T 세포, NIH3T3 세포 및 HepG2 세포에의트렌스펙션(transfection)실험.

293T 세포 (human embryonic kidney cells), NIH3T3 세포 (mouse embryonic fobroblast cells) 및 HepG2 세포 (human liver carcinoma cell line)에 대하여 트렌스펙션을 실시하였다. 293T과 NIH3T3는 DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) 배지에서, 그리고 HepG2 세포는 MEM (Minimum essential medium) 배지에서 키웠다. 24well plate에 적당량 세포를 나누어 키운 다음, 베타갈락토스 분해효소를 합성하는 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA와 K-Chol/DOPE 리포좀 및 O-Chol/DOPE 리포좀을 섞어서 복합체를 실온에서 형성하여 세포에 트렌스펙션을 실시하였다. 트렌스펙션은 FBS가 없는 상태에서 4시간 동안 실시하였다. 리포펙틴, DC-Chol/DOPE 리포좀 및 폴리에틸렌이민을 대조구로 하여 각각 실험하였다. 아래 표 4 및 도 5에서 볼 수 있듯이, K-Chol/DOPE 리포좀 및 O-Chol/DOPE 리포좀이 각종 세포에 대해서 높은 유전자 전달 및 발현효율을 갖고 있음을 확인하였다. 특히, O-Chol/DOPE 리포좀이 매우 뛰어난 유전자 전달 및 발현효율이 있음을 발견하였다.

<표 4> 유전자 전달체별 전달 및 발현효율 비교표

유전자 전달체	베타갈락토스 분해효소의 발현정도 (mUnits/mg protein)(-) FBS, 4시간 트렌스펙션 결과값
유전자 전달체	NIH3T3 세포	HepG2 세포	293 세포
폴리에틸렌이민	1267.60±23.05^*	1210.82±217.89	2601.91±286.69
리포펙틴	51.00±9.93	137.40±68.95	358.81±158.64
DC-Chol/DOPE	35.41±1.10	107.46±14.90	784.87±97.20
K-Chol/DOPE	831.92±288.32	830.63±159.87	1059.75±156.82
O-Chol/DOPE	978.84±284.1	1364.64±261.34	2604.61±97.46

* 표 안의 수치는 3회씩 실험한 값들의 평균±표준오차임.

<실시예 7> 트렌스펙션(Transfection)된 HepG2 세포의 X-gal 염색실험.

실시예 1에 의해 제조된 라이신-콜레스테롤(K-Chol)을 이용하여 HepG2 세포에 플라스미드 DNA를 트렌스펙션시켰다. 그 다음, X-gal을 넣어주어서 베타갈락토스 분해효소가 발현된 세포를 확인할 수 있었다. 도 6은 염색된 세포에 대한 사진이다.

<실시예 8> 293세포에 대한 시간에 따른 트랜스펙션 효율 및 FBS 영향측정.

도 7은 293세포를 대상으로 트랜스펙션 시간을 달리하여 측정한 시간과 혈청의존성 트랜스팩션실험결과를 나타낸다. 293세포에 상기 K-Chol/DNA 복합체를 최적의 트랜스펙션조건하에서 처리하였다. 트랜스펙션 효율에 대한 혈청의존성을 검사하기 위하여 10FBS를 첨가한 트랜스펙션 배지와 첨가하지 않은 배지에 세포를 배양하여 배양시간별로 미리 정해놓은 시간대가 경과한 후에 상기 복합체를 함유한 트랜스펙션 배지를 제거하고, 상기 세포를 FBS를 함유하는 새로운 배지로 옮겨 재배양하였다. 배양시간별로 구분된 세포를 새로운 배지에서 48시간 동안 발현시킨 베타갈락토스 분해효소 활성에 대한 측정 결과는 도 7과 같다. 상기 결과에 의하면 배양시간을 2∼4시간으로 한 세포군에서 최대 트랜스펙션 효율을 보였으며 트랜스펙션 능력은 배지내의 혈청의 존재에 의존하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 상기 복합체의 존재하에서 세포를 48시간 증식시켜도 트랜스펙션 효율은 변화가 없는 것으로 보아 본 발명의 양이온성 리피드는 세포 독성이 거의 완화된 것임을 확인할 수 있었다. 반면에 트랜스펙션 배지에 혈청이 없는 경우 효율은 급격하게 떨어지는데 이는 기아로 인한 세포의 사멸에 기인하는 것으로 판단된다.

본 발명에 의하면 낮은 세포독성 및 높은 유전자 전달효율을 갖는 새로운 유형의 양이온성 리피드들을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 고체상 합성 방법을 통하여 여러 가지 양이온성 리피드를 빠르고 효과적으로 합성하는 방법을 제공할 수가 있다. 한편, 이와같은 고체상 합성방법은 합성의 자동화 및 대량 합성을 가능하게 해준다. 또한 본 발명에 의한 라이신-콜레스테롤(K-Chol) 및 오르니틴-콜레스테롤 (O-Chol)은 리포펙틴(Lipofectin), 디씨-콜 (DC-Chol) 및 폴리에틸렌이민(PEI) 에 비하여 독성이 매우 낮았으며, 여러 가지 세포들에 대해서도 유전자 전달 및 발현효과가 더욱 뛰어남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아미노산-콜레스테롤 유도체는 새로운 유형의 유전자 전달용 양이온성 리피드로서, 그 자체 혹은 리포좀 형태로서의 활용가치가 매우 크다고 할 수 있다.

Claims

유전자 전달용 양이온성 리피드에 있어서,

하기의 일반식으로 표시되는 양이온성 리피드.

상기에서 R은 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺또는 -CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺에서 선택된 1종을 나타내며, 중합체는 라이신 또는 오르니틴이 단독으로 또는 혼합되어진 호모 또는 헤테로인 것 중 n= 1∼10을 만족한다.
제 1항에 있어서, 상기 일반식에서 n은 1∼5인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드에 의하여 전달되는 유전자로는 DNA, 또는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라즈미드, RNA일 수 있으며 RNA는 mRNA, tRNA, rRNA 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA, RNA 서열과 상보적인 엔티센스 RNA 및 리보자임(Rybozyme)인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 3항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자로는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 4항에 있어서, 상기 폴리펩티드로는 각종 호르몬, 조직적합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[디-L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드의 라이신 또는 오르니틴의 ε-아미노그룹 또는 δ-아미노그룹, 또는 일반식(Ⅱ)로 표시되는 바와 같이 폴리펩티드 말단 카복시 그룹의 아마이드기에 분자량이 0.5∼20K daltons인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 생분해가 가능한 양이온성 리피드.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 리피드에 세포에 특이적으로 결합될 수 있도록 하기의 마커 또는 리간드가 부착되어진 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드;

각종 항체, 트랜스페린, 비오틴, 엽산, 저비중 지단백질, 탄수화물로서 단당류인 만노스, 클루코스, 갈락토스 및 이당류인 락토오스
청구항 1의 양이온성 리피드와 질병치료에 유용한 유전자를 포함하는 올리고 뉴클레오티드로 구성된 양이온성 리피드 복합체를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 유전자는 각종 호르몬, 조직적합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드 복합체를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물.
유전자 전달용 양이온성 리포좀에 있어서, 청구항 1의 양이온성 리피드 단독으로 또는 상기 양이온성 리피드 10∼90몰와 중성 리피드 10∼90몰로 혼합구성되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 중성 리피드는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀에 의하여 전달되는 유전자로는 DNA, 또는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라즈미드, RNA일 수 있으며 RNA는 mRNA, tRNA, rRNA 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA, RNA 서열과 상보적인 엔티센스 RNA 및 리보자임(Rybozyme)인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 16항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자로는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 17항에 있어서, 상기 폴리펩티드로는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[디-L-라이신아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
제 14항에 있어서, 상기 양이온성 리피드는 생분해가 가능한 3β[디-L-오르니틴아마이드-카바모일]콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 양이온성 리포좀.
청구항 14의 양이온성 리피드와 질병치료에 유용한 유전자를 포함하는 올리고 뉴클레오티드로 구성된 양이온성 리피드 복합체를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물.
제 23항에 있어서,

상기 유전자는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리피드 복합체를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물.
유전자 전달용 양이온성 리피드의 제조방법에 있어서, 라이신 또는 오르니틴을 콜레스테릴 클로로포르메이트와 카바메이트 에스터(Carbamate ester)결합반응에 의하여 하기 일반식으로 표시되는 유전자 전달용 양이온성 리피드를 제조하는 방법.

상기에서 R은 -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺또는 -CH₂-CH₂-CH₂-NH₃ ⁺에서 선택된 1종을 나타내며, 중합체는 라이신 또는 오르니틴이 단독으로 또는 혼합되어진 호모 또는 헤테로인 것 중 n= 1∼10을 만족한다.