CN101195601A - 2-二氢吲哚酮衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有式(Ⅰ)结构的2－二氢吲哚酮化合物及其或其药学上可接受的盐用途。药理实验表明，此类化合物或其药学上可接受的盐对各种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本发明还涉及该类化合物的制备方法。另外，本发明还涉及该类化合物的中间体式(Ⅱ)。
Description
技术领域
本发明涉及具有式(I)结构的2-二氢吲哚酮化合物及其用途。药理实验表明，此类化合物对各种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本发明还涉及该类化合物的制备方法及该类化合物的中间体。
背景技术
以下仅作为背景资料提供而不认为是本发明的先前技术。
哺乳动物细胞具有相似的分子机制，在整个细胞周期内调节细胞的增殖、分化和死亡。其中，蛋白质磷酸化是跨膜或细胞内信号转导的主要作用机制，具有调控细胞循环的功能，而磷酸化又受到蛋白激酶(PKs)和蛋白磷酸酶的控制。蛋白激酶是目前已知的最大蛋白家族，所有激酶都有个非常保守的催化核心和多样的调控模式。蛋白激酶的作用是将ATP的γ磷酸基转移至它们底物上特定的氨基酸残基。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类，其中主要的两类是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(STKs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)。真核生物中，细胞表面的受体和细胞核内的转录***之间存在物理的分隔和距离，细胞外信号通过受体影响某些蛋白激酶的级联***的作用，经多步蛋白质的磷酸化，最后改变转录因子的活性，使基因转录激活或阻滞。其中，蛋白酪氨酸激酶和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶在正常细胞的信号转导机制中具有重要作用，它们的异常表达将导致许多疾病的产生，如肿瘤、动脉硬化、牛皮癣和炎症反应等，因而调控这些激酶的活性，恢复生理平衡可以作为一种新的治疗手段。
酪氨酸激酶家族以跨膜受体(受体酪氨酸激酶，RTKs)或胞质形式(非受体酪氨酸激酶，CTKs)广泛地参与细胞信号转导。人体基因组中，蛋白激酶组包括30种酪氨酸激酶家族，共含有90种不同的蛋白酪氨酸激酶，其中58种是受体酪氨酸激酶。对酪氨酸激酶更为详细的讨论，参见Manning G，Science，2002，298：1912，其全文包括任何绘图作为一整体提出，通过引用结合到本文中。受体酪氨酸激酶是一类具有胞质区域的跨膜蛋白，胞外区是配体结构域，配体是可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素，包括胰岛素和多种生长因子。胞内段是蛋白酪氨酸激酶的催化部位，并具有自磷酸化位点，其内在催化活性在与配体结合时被激活。这类受体主要有EGFR(表皮生长因子受体)、VEGFR(血管内皮生长因子受体)、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)、FGFR(成纤维细胞生长因子受体)等。最重要的下游信号级联反应是由RTKs活化，其中包括ERK/MAPK信号通路，PI-3激酶-AKT信号通路以及JAK/STAT信号通路。PTKs维持所有这些不同转导途径中相互间的信号通讯，最终调控基因的转录。此外，其它的级联反应也可以被使用。非受体PTKs的调节机制差异较大，它们通过与跨膜受体发生物理性作用，进而参与细胞外信号响应(Grosios k，etal，Drugs Fut，2003，28：679)。
随着分子生物学的研究深入，在分子水平上针对细胞信号转导，调节生长因子的功能和调控致癌基因是抑制细胞增殖和***的有效途径。该途径可以减弱非正常信号通道的效应，阻止肿瘤的生长，同时也可促使肿瘤细胞死亡。迄今发现有一半原癌基因在蛋白编码上都具有PTK结构，它们通过磷酸化和去磷酸化参与细胞信号转导，同时在肿瘤发生过程中，变异或过度表达的PTK可以将正常细胞转变为癌细胞，同时促进肿瘤细胞的生长和有丝***。
同时，恶性肿瘤的生长和转移都必须通过周围新生血管以持续提供充足的营养。肿瘤生成血管的过程大致可以分为血管前期和血管期两个阶段，两阶段的转化称为血管生成开关(angiogenic switch)。肿瘤细胞转为生成血管增生表型在瘤恶性化过程中起着关键作用：当周围没有血管生成时，肿瘤细胞无法得到足够的养分同时也无法排出代谢物，主要依靠弥散在细胞周围的氧和营养物质生存，肿瘤只能生长至直径1-2mm；但一旦转变为血管增生表型时，无血管的肿瘤可以利用自身血液中的营养而快速生长，同时这些恶性细胞可引起其它细胞的表型改变，如内皮细胞等，进而促使新血管形成。血管生成因子调控血管生成开关，引起内皮细胞的迁移、增殖和形态改变，从而产生肿瘤血管，而且目前所有已知的血管生成因子主要都是PTKs的配体，如VEGF、bFGF、PD-ECGF等(Bergers G，et al，Nat Rev Cancer，2003，3：401)。因此使用酪氨酸激酶抑制剂作为抗血管生成物质，阻止肿瘤血管生成也是控制恶性肿瘤生长的有效途径。
由于酪氨酸激酶在细胞的致癌性转化过程中具有重要的作用，并与肿瘤的产生和发展有着直接或间接联系，因此将酪氨酸激酶抑制剂应用于肿瘤的治疗尤为合适。
此外，与非受体PTKs一样，STKs在细胞内占据主导地位，尽管仅具有几种STK型受体激酶。STKs是最常见的细胞溶胶激酶；即激酶在细胞质部分而不是在细胞质的细胞器和细胞骨架内发挥它们的功能。细胞溶胶是细胞内一个区域，大多数细胞在这里进行中间代谢和生物合成。
总之，PTKs和STKs全部都明显与宿主的病理状况包括癌症有关。与PKs有关的其它病理状况还包括(但不局限于)牛皮癣、肝硬化、糖尿病、血管发生、再狭窄、眼科疾病、类风湿关节炎和其它的炎症疾病、免疫疾病、心血管疾病如动脉硬化和多种肾病。
目前，已试图鉴定作为PK抑制剂的2-二氢吲哚酮类小分子化合物，例如靛玉红类化合物(PCTWO2001037819、PCTWO2002092079)、3-亚甲基吡咯-2-二氢吲哚酮类化合物(US6642251、PCT WO2001060814、PCT WO2003035009、PCT WO2005053686)和3-吡咯并环戊亚基-2-二氢吲哚酮类化合物(PCT WO2005016875)和其它2-二氢吲哚酮类化合物(PCTWO 2000012084)等全部被描述为用于治疗癌症的STK和/或PTK抑制剂。
发明内容
本发明涉及新的2-二氢吲哚酮类衍生物，它们表现出对肿瘤细胞的增殖具有抑制能力。此外，本发明涉及公开化合物的制备方法及其中间体。
在此可互换使用的术语“2-二氢吲哚酮”、“2-羟基吲哚”和“2-氧代吲哚”指的是具有以下化学结构的分子。
“吡咯并环己亚基”指的是具有以下化学结构的分子。
“3-吡咯并环己亚基-2-二氢吲哚酮”指的是具有在式(I)中显示的通式结构的化合物。
“吡咯并环己酮”指的是具有在式(II)中显示的通式结构的化合物。
“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：
(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸例如(但不限于)盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或(L)苹果酸
(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
1.化学
本发明涉及具有以下化学结构的化合物：
其中：
R1是氢、卤素、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NRR8R9、-(CH2)nR10或-C(O)NR11R12；
R2是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、氰基、-NR8R9、-NR8C(O)R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-S(O)2NR8R9或-SO2R13；
R3是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NR8R9、芳基、杂芳基、-NR8S(O)2R9、-S(O)2NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9或-SO2R13；
R4是氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基或-NR8R9；
R5是氢、烷基或-C(O)R14；
R6是羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R15)(CH2)rR16或-NR8R9；
R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R10是羟基、-C(O)R7、-NR8R9或-C(O)NR8R9；
R11和R12独立地选自氢、烷基或芳基，或者R11和R12与它们所连接的氮原子一起形成杂环基；
R13是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
R14是羟基、烷氧基、芳氧基或-NR8R9；
R15是氢或烷基；
R16是羟基、-NR8R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-N+(O-)R8R9、-N(OH)R8或-NHC(O)Ra，其中Ra为未被取代的烷基、卤代烷基或芳烷基；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
n和r独立地是1、2、3或4。
在上述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1、R3和R4优选氢；
R2优选氢、卤素或烷基；
R5优选甲基；
R6优选羟基、-NR8R9或-N(R15)(CH2)rR16；
R15优选氢；
R16优选羟基或-NR8R9；
R8和R9优选氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r优选2或3。
一种式(I)化合物的制备方法，在Lewis酸存在下，使式(III)化合物与式(II)化合物于非质子溶剂中反应，反应温度为50℃至150℃，反应时间为1小时至20小时，其反应方程式如下：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6的定义如上所述。
上述Lewis酸为AlCl3、BF3、SnCl4、SnCl2、ZnCl2或TiCl4，优选SnCl4或TiCl4，最优选TiCl4。
上述非质子溶剂为非质子亲质子性溶剂或惰性溶剂，其中非质子亲质子性溶剂可采用N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二甲亚砜、吡啶，惰性溶剂可采用戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯，优选吡啶。
上述反应温度优选为85℃至120℃，最优选为100℃至110℃。
上述反应时间优选为5小时到13小时，最优选为8小时到10小时。
在上述反应中，
R1、R3和R4优选氢；
R2优选氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR8R9、-NR8C(O)R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-S(O)2NR8R9或-SO2R13；
R5优选甲基；
R6优选羟基、烷氧基或-N(R15)(CH2)rR16；
R7优选氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R13优选烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
R15优选氢或烷基；
R16优选羟基或-NR8R9；
R8和R9优选氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r优选2或3。
本发明化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种式(II)的中间体：
其中：
R5是氢、烷基或-C(O)R14，优选是甲基；
R6是羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R15)(CH2)rR16或-NR8R9，优选是羟基、乙氧基或-N(R15)(CH2)rR16；
R15是氢或烷基；
R16是羟基、-NR8R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-N+(O-)R8R9、-N(OH)R8或-NHC(O)Ra，其中Ra为未被取代的烷基、卤代烷基或芳烷基；优选是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
r是1、2、3或4，优选是2或3。
A.一般结构特征
本发明涉及的具有式(I)结构的化合物：
其中：
R1是氢、卤素、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NR8R9、-(CH2)nR10或-C(O)NR11R12；
R2是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、氰基、-NR8R9、-NR8C(O)R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-S(O)2NR8R9或-SO2R13；
R3是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NR8R9、芳基、杂芳基、-NR8S(O)2R9、-S(O)2NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9或-SO2R13；
R4是氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基或-NR8R9；
R5是氢、烷基或-C(O)R14；
R6是羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R15)(CH2)rR16或-NR8R9；
R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R10是羟基、-C(O)R7、-NR8R9或-C(O)NR8R9；
R11和R12独立地选自氢、烷基或芳基，或者R11和R12与它们所连接的氮原子一起形成杂环基；
R13是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
R14是羟基、烷氧基、芳氧基或-NR8R9；
R15是氢或烷基；
R16是羟基、-NR8R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-N+(O-)R8R9、-N(OH)R8或-NHC(O)Ra，其中Ra为未被取代的烷基、卤代烷基或芳烷基；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
n和r独立地是1、2、3或4。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：
“烷基，，表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1-4个碳原子的烷基称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为未取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基，它们独立地优选自以下的基团：卤素、羟基、低级烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂脂环基、-C(O)R7，-NR8R9和-C(O)NR11R12，其中R7、R8、R9、R11和R12定义同上。
“环烷基”表示全部为碳的单环或稠合的环(“稠合”环意味着***中的每个环与***中的其它环共享毗邻的一对碳原子)基团，其中一个或多个环不具有完全连接的π电子***，环烷基的实例(不局限于)为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。环烷基可为取代的和未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个各自选自以下的基团，包括：烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷巯基、芳巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基，C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、氨基和-NR8R9，其中R8和R9定义同上。
“芳基”表示1至12个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子***。芳基的非限制性实例有苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选为一个、两个或三个，进而更优选为一个或两个，独立地选自由低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R8S(O)-、R8S(O)2-、-C(O)OR8、R8C(O)O-和-NR8R9组成的组，R8和R9定义同上。优选地，芳基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰氨基。
“杂芳基”表示5至12个环原子的单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子***。未取代的杂芳基地非限制性实例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。杂芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更为优选为一个、两个或三个，进而更为优选一个或两个，独立地选自以下基团，包括：低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R8S(O)-、R8S(O)2-、-C(O)OR8、R8C(O)O-和-NR8R9，其中R8和R9定义同上。优选的杂芳基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰氨基。
“杂脂环基”表示单环或稠合环基团，在环中具有5到9个环原子，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子***。未取代的杂脂环基的非限制性实例有吡咯烷基、哌啶子基、哌嗪子基、吗啉代基、硫代吗啉代基、高哌嗪子基等。杂脂环基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选为一个、两个或三个，进而更优选为一个或两个，独立地选自以下基团，包括：低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R8S(O)-、R8S(O)2-、-C(O)OR8、R8C(O)O-和-NR8R9，其中R8和R9定义同上。优选地，杂脂环基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰氨基。。
“杂环”表示3到8个环原子的饱和环状基团，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C，其中一个或两个C原子可以可选地被羰基代替。杂环基的环可以可选地独立地被一个、两个或三个取代基取代，取代基选自低级烷基(可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自羧基或酯基)、卤代烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、单烷基胺基、二烷基胺基、芳烷基、杂芳烷基和-COR(其中R是烷基)。更具体地，术语杂环基包括但不限于四氢吡喃基、2，2-二甲基-1，3-二氧戊环、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪子基、N-甲基吡咯烷-3-基、吡咯烷基、吗啉代基、硫代吗啉代基、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基哌嗪子基、3-氧代哌嗪子基、2-咪唑啉酮、2-吡咯烷酮、2-氧代高哌嗪子基、四氢嘧啶-2-酮及其衍生物。优选地，杂环基团可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、被羧基或酯基取代的低级烷基、羟基、单或二烷基胺基。
“羟基”表示-OH基团。
“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“芳氧基”表示-O-芳基和-O-杂芳基。代表性实例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等及其衍生物。
“巯基”表示-SH基团。
“酰基”表示-C(O)-R’基团，其中R’是选自以下基团：氢、未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的环烷基，可选地被一或多个、优选被1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR8R9基团的取代基取代的芳基，其中R8和R9定义同上，可选地被一个或多个、优选被1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR8R9基团的取代基取代的杂芳基(通过环碳原子键合)，以及可选地被一个或多个、优选被1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR8R9基团的取代基取代的杂脂环基(通过环碳原子键合)，代表性的酰基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“硫代酰基”表示-C(S)-R’基团，其中R’定义同上。
“酯基”表示-C(O)O-R’基团，其中R’定义同上，但是R’不能是氢。
“乙酰基”表示-C(O)CH3基团。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
“三卤甲基”表示-CX3基团，其中X是如上所定义的卤素。
“氰基”表示-CN基团。
“S-磺酰氨基”表示-S(O)2NR8R9基团，其中R8和R9定义同上。
“N-磺酰氨基”表示-NR8S(O)2R9基团，其中R8和R9定义同上。
“O-氨基甲酰基”表示-OC(O)NR11R12基团，其中R11和R12定义同上。
“N-氨基甲酰基”表示R8OC(O)NR9-基团，其中R8和R9定义同上。
“O-硫代氨基甲酰基”表示-OC(S)NR11R12基团，其中R11和R12定义同上。
“N-硫代氨基甲酰基”表示R8OC(S)NR9-基团，其中R8和R9定义同上。
“氨基”表示-NH2基团。
“C-酰氨基”表示-C(O)NR8R9基团，其中R8和R9定义同上。
“N-酰氨基”表示R8C(O)NR9-基团，其中R8和R9定义同上。
“硝基”表示-NO2基团。
“卤代烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代，例如-CH2Cl、-CF3、-CCl3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“芳烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被如上所定义的芳基取代，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基及其衍生物。
“杂芳烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被杂芳基取代，例如-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等及其衍生物。
“单烷基胺基”表示基团-NHR，其中R是如上所定义的烷基或未取代的环烷基，例如甲胺基、(1-甲基乙基)胺基、环己胺基等。
“二烷基胺基”表示基团-NRR，其中每个R独立地是如上所定义的烷基或未取代的环烷基，例如二甲基胺基、二乙基胺基、N-甲基环己基胺基等。
“哌嗪子基”指的是具有以下化学结构的基团。
“吗啉代基”指的是具有以下化学结构的基团。
“哌啶子基”指的是具有以下化学结构的基团。
“吡咯烷基”指的是具有以下化学结构的基团。
“可选”或“可选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生和不发生的场合。例如，“杂芳基可选地被一个或两个取代基取代”意味着杂芳基的取代基可以但不必是一个，该说明包括杂芳基被一个取代基取代的情形和杂芳基被两个取代基取代的情形。
B.优选的结构特征
R1、R3、R4是氢是本发明优选的特征。
R2是氢、卤素或烷基是本发明优选的特征。
R5是甲基是本发明优选的特征。
R6是羟基或-NR8R9是本发明优选的特征，或者R6是-N(R15)(CH2)rR16也是本发明优选的特征。其中R15是氢，r是2或3，R16是羟基或-NR8R9(R8和R9优选氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基)，其中-NR8R9优选为-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、吗啉代基、哌嗪子基、哌啶子基、吡咯烷基或N-甲基-哌嗪子基。
2.合成和组合库
A.组合库
本发明的一个方面是式(III)的2-羟基吲哚与式(II)的吡咯并环己酮反应形成具有式(I)结构化合物的组合库。
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6具有在一般结构中所阐明的含义。
在此使用的“组合库”指的是在多维列阵的化合物中由一维的每个化合物与其它的每一个维中的化合物反应形成的所有化合物。在本发明上下文中，所述列阵是二维的并且一维表示本发明所有的2-羟基吲哚类和第二维表示本发明所有的吡咯并环己酮。每一个2-羟基吲哚可与每一个吡咯并环己酮反应以形成如式(I)所示的3-吡咯并环己亚基-2-二氢吲哚酮化合物。以该方法形成的所有3-吡咯并环己亚基-2-二氢吲哚酮化合物处于本发明范围内。经一些2-羟基吲哚与所有吡咯并环己酮反应、所有的2-羟基吲哚与一些吡咯并环己酮反应或者一些2-羟基吲哚与一些吡咯并环己酮反应形成的更小的组合库也处于本发明范围内。
以上组合库中的2-羟基吲哚优选自2-羟基吲哚本身和取代的2-羟基吲哚，例如(但不局限于)5-氟-2-二氢吲哚酮、5-氯-2-二氢吲哚酮、5-溴-2-二氢吲哚酮、5-羟基-2-二氢吲哚酮、5-甲基-2-二氢吲哚酮、5-乙基-2-二氢吲哚酮、5-正丁基-2-二氢吲哚酮、5-甲氧基-2-二氢吲哚酮、5-乙氧基-2-二氢吲哚酮、5-氨基-2-二氢吲哚酮、5-乙酰基-2-二氢吲哚酮、5-苯基氨基磺酰基-2-二氢吲哚酮、5-氨基磺酰基-2-二氢吲哚酮、5-异丙基氨基磺酰基-2-二氢吲哚酮、5-二甲基氨基磺酰基-2-二氢吲哚酮、5-三氟甲基-2-二氢吲哚酮、6-氟-2-二氢吲哚、6-甲氧基-2-二氢吲哚酮、6-甲基-2-二氢吲哚酮、6-氯-2-二氢吲哚酮、4-甲基-2-二氢吲哚酮、4-甲基-5-氯-2-二氢吲哚酮、4，5-二甲氧基-2-二氢吲哚酮。
以上组合库中的吡咯并环己酮优选自(但不局限于)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸、2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯、N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-(2-二甲胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、2-甲基-3-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚、2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚、N-[2-(哌啶-1-基)-乙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[2-(吡咯烷-1-基)-乙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[2-(吗啉-4-基)-乙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-(3-二甲胺基丙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[3-(哌啶-1-基)-丙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[3-(吗啉-4-基)-丙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-丙基]-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺、N-(3-二乙胺基丙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺。
B.一般合成方法
(1)中间体式(II)
本发明所涉及的中间体式(II)的吡咯并环己酮按照以下路线合成：6-氨基-5-氧代己酸盐酸盐(S1)与乙酰乙酸乙酯在磷酸二氢钠水溶液中回流反应生成取代的吡咯(S2)，再以多聚磷酸(PPA)为反应溶剂、五氧化二磷(P2O5)为脱水剂，70℃下反应生成2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(S3)，随后在1mol/L LiOH水溶液中进行水解得到2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)，最后以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂、在缩合剂存在条件下，与HN(R15)(CH2)rR16室温下反应24小时制得式(II)的吡咯并环己酮。
其中各取代基如上所述，优选：
R5是甲基；
R6是-N(R15)(CH2)rR16，或R6是乙氧基(式(S3))，或R6是羟基(式(S4))；
R15是氢或烷基；
R16是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是2或3。
缩合剂包括(但不局限于)N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(CDMT)、2，4-二氯-6-甲氧基-1.3.5-三嗪(DCMT)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)和1-羟基苯并***(HOBt)，优选为EDCI和HOBt。
所述反应在室温下进行，优选的反应温度为20℃至25℃。
(2)式(I)化合物
本发明提供了用于合成式(I)的3-吡咯并环己亚基-2-二氢吲哚酮的方法(A)，该方法包括在Lewis酸存在下，使式(III)的2-羟基吲哚与式(II)的吡咯并环己酮反应于溶剂中，其中各取代基如上所述，优选：
R1、R3和R4是氢；
R2是氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR8R9、-NR8C(O)R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-S(O)2NR8R9或-SO2R13；
R5是甲基；
R6是羟基、烷氧基或-N(R15)(CH2)rR16；
R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R13是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
R15是氢或烷基；
R16是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是2或3。
方法(A)
该反应可以在Lewis酸存在下进行，其中Lewis酸包括(但不局限于)AlCl3、BF3、SnCl4、SnCl2、ZnCl2、TiCl4，在本发明优选的实施方案中，所述的Lewis酸优选为SnCl4和TiCl4，最优选为TiCl4。
所述反应进行的溶剂为非质子溶剂。“非质子溶剂”为分子中无转移性质子的溶剂，这类溶剂又可分为非质子亲质子性溶剂和惰性溶剂。“非质子亲质子性溶剂”特征在于分子中无质子，与水比较几乎无酸性，也无两性特征，但有较弱的接受质子倾向和程度不同的成氢键能力，实例包括(但不局限于)酰胺类、酮类、腈类、二甲亚砜、吡啶。“惰性溶剂”不具酸碱性质或酸碱性极弱，自身无质子转移过程，当溶质酸和碱在溶剂中起反应时，溶剂分子不参与反应，实例包括(但不局限于)戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯。
在本发明优选的实施方案中，所述溶剂为非质子溶剂，优选为吡啶。
所述反应在高于室温的温度下进行。该温度一般为50℃至150℃，优选为85℃至120℃，最优选为100℃至110℃。
所述反应的反应时间为1小时至20小时，优选的时间是5小时到13小时，最优选的时间为8小时到10小时。
本发明的另一个方面是提供了用于合成式(I)的3-吡咯并环己亚基-2-二氢吲哚酮的另一个方法(B)。该方法首先按照上述方法(A)的反应条件，通过式(III)的2-羟基吲哚与2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)反应，得到结构如式(IV)所示的化合物，然后以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，在缩合剂的存在下，与HNR8R9室温反应24小时，其中R6是-NR8R9，R1、R2、R3、R4、R8和R9定义如方法(A)中所示。
方法(B)
所述反应的缩合剂包括(但不局限于)N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(CDMT)、2，4-二氯-6-甲氧基-1.3.5-三嗪(DCMT)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)和1-羟基苯并***(HOBt)，优选为EDCI和HOBt。
此外，本发明所涉及的化合物S1可以参照本领域已有文献报道制备，如Lartillot，Serge.et al，Bulletin de la Societe Chimique de France，1964，4：783；MacGee，J.et al.Biochem Med，1977，17：31；Evans DA，et al，J.C.S.Chem.Comm，1978，17：753以及它们所引用的相关文献。式HNR8R9和HN(R15)(CH2)rR16是商业上可得到的胺。本发明提供的合成方法(A)中所涉及的中间体式(III)的2-羟基吲哚是商业上可得到的或可以参照本领域已有文献报道及其类似方法进行制备，如“Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds”第二版，S.Coffey，第IV卷A部，1973，pp.448-450；Gassman PG，et al，J Org Chem，1977，42：1340；Wright WB et al，JAm Chem Soc，1956，78：221；Kisteneva，MS.Zhumal Obshchei Khimii，1956，26：2251；BeckettAH，et al，Tetrahedron，1968，24：6093；Walker GN，J Am Chem Soc，1955，77：3844；Protiva M，et al，Collect Czech Chem Commun，1979，44：2108；McEvoy FJ，et al，J Org Chem，1973，38：3350；Simet L，J Org Chem，1963，28：3580；Wieland T，et al，Chem Ber，1963，96：253；美国专利US3882236、4006161和4160032以及它们所引用的相关文献。
同时，将为本领域技术人员领会到的是，用于生成本发明化合物的其它合成途径也是可利用的，本文所提供的实施例仅供举例而非限制。
3.生物评价方法
抑制细胞增殖测定方法采取常用的MTT法：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)为兰紫色的不溶于水的甲臢(Formazan)，甲臢的多少可通过酶标仪测定在570nm的吸收值(OD值)可得知，因而甲臢生成量在通常情况下与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤细胞的能力。
该测定方法可以用于测定不同的本发明化合物对一种或多种癌细胞增殖的抑制能力，利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。
具体实施方式
给出下列制备例和实施例，使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。它们不应被解释为限制本发明的范围，仅仅是其例证和代表。
实施例1：2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)
步骤1
6-氨基-5-氧代己酸盐酸盐(S1)22.44g(0.12mol)(Lartillot，Serge.et al，Bulletin de laSociete Chimique de France，1964，4：783)溶于大约6.1L磷酸二氢钠缓冲液中(300g磷酸二氢钠固体溶于6L水，并用1mol/L的NaOH水溶液调节pH至6.5左右)，加入16.12g(0.12mol)乙酰乙酸乙酯，升温回流反应半小时，待冷却以后反应液用Na2CO3调节pH至8左右，并用100ml氯仿萃取一次，水相用6mol/L盐酸调pH至1左右，析出大量棕色固体，过滤真空干燥得固体4-(4-乙氧基羰基-5-甲基-1H-吡咯-3-基)丁酸(S2)20.29g(71％收率)。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.89(s，1H，-COOH)，10.90(s，1H，-NH-1)，6.38(s，1H，pyrrole-2)，4.14(q，2H，-CH 2 CH3)，2.56(t，2H，-CH 2 CH2CH2COOH)，2.36(s，3H，-CH3-5)，2.18(t，2H，-CH2CH2 CH 2 -COOH)，1.71(m，2H，-CH2 CH 2 CH2COOH)，1.25(t，3H，-CH2CH3).
步骤2
142g多聚磷酸中加入7.1g五氧化二磷，70℃下搅拌30分钟，再加入6.3g(0.026mol)4-(4-乙氧基羰基-5-甲基-1H-吡咯-3-基)丁酸(S2)，在此温度下，继续搅拌反应48小时后，倒入冰水中，用饱和Na2CO3水溶液调pH至8左右，乙酸乙酯提取。用水和饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥后，浓缩除去大部分乙酸乙酯至饱和状态，-5℃下低温析晶，过滤，真空干燥得白色固体2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(S3)3.5g(61％)。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ10.23(s，1H，-NH-1)，4.30(q，2H，-CH2CH3)，3.00(t，2H，-CH2-4)，2.59(s，3H，-CH3-2)，2.50(t，2H，-CH2-6)，2.12(m，2H，-CH2-5)，1.36(t，3H，-CH2 CH 3 )；
ESI-MS：222.1[M+H]+；220.1[M-H]-.
步骤3
在25ml LiOH水溶液(1mol/L)中加入1.0g(4.5mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(S3)，在70℃下反应48小时后，倒入冰水中，用6mol/L盐酸调节pH至1～2，析出大量固体，过滤，水洗，真空干燥后得0.64g(74％)为灰色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.03(bs，2H，-NH-1，-COOH)，2.87(t，2H，-CH2-4)，2.42(s，3H，-CH3-2)，2.34(t，2H，-CH2-6)，1.98(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：194.1[M+H]+.
实施例2：N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-1)
0.2g(1.0mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)，0.16g HOBt(1.2mmol)，0.24g(1.2mmol)EDCI和0.2g(2.0mmol)三乙胺溶于10ml DMF中，室温下搅拌20min后，加入0.24g(2.1mmol)N，N-二乙基-1，2-乙二胺，室温下搅拌24个小时后，反应液倒入冰水中，用二氯甲烷提取，用水和饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥后，浓缩得到的固体经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇30∶1)得0.23g(79％)为白色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ9.67(s，1H，-NH-1)，6.41(s，1H，-CONH-)，3.46(bs，2H，-CONHCH 2 CH2-)，2.93(t，2H，-CH2-4)，2.64～2.59(m，6H，-NHCH2 CH 2 N(CH 2 CH3)2)，2.58(s，3H，-CH3-2)，2.49(t，2H，-CH2-6)，2.16(m，2H，-CH2-5)，1.04(s，6H，-(CH2 CH 3 )2)；
ESI-MS：292.2[M+H]+，314.2[M+Na]+；290.3[M-H]-.
实施例3：N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-2)
使用实施例2的方法，0.2g(1.0mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)和0.13g(2.1mmol)2-氨基乙醇反应，反应液直接浓缩得到的固体经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇10∶1)得0.20g(85％)为白色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.84(s，1H，-NH-1)，7.17(t，1H，-CONH-)，4.69(t，1H，-OH)，3.48(q，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.28(q，2H，-CH 2 OH)，2.79(t，2H，-CH2-4)，2.34～2.31(m，5H，-CH3-2，-CH2-6)，1.97(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：237.1[M+H]+，259.1[M+Na]+.
实施例4：N-(2-二甲胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-3)
使用实施例2的方法，0.2g(1.0mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)和0.19g(2.1mmol)N，N-二甲基-1，2-乙二胺反应得0.21g(80％)为白色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.80(s，1H，-NH-1)，6.17(s，1H，-CONH-)，3.51(q，2H，-CONHCH 2 CH2-)，2.80(t，2H，-CH2-4)，2.55(t，2H，-CH2-6)，2.51(s，3H，-CH3-2)，2.46(t，2H，-CH 2 N(CH3)2)，2.29(s，6H，-CH2N(CH 3 )2)，2.09(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：264.1[M+H]+，286.2[M+Na]+.
实施例5：N-(3-二甲胺基丙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-4)
使用实施例2的方法，0.2g(1.0mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)和0.21g(2.1mmol)N，N-二甲基-1，3-丙二胺反应得0.23g(83％)为白色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ10.76(s，1H，-NH-1)，7.11(s，1H，-CONH-)，3.50(t，2H，-CONHCH 2 CH2CH2-)，2.89(t，2H，-CH2-4)，2.56(s，3H，-CH3-2)，2.50～2.41(m，4H，-CH2-6，-CH 2 N(CH3)2)，2.21(s，6H，-CH2N(CH 3 )2)，2.13(m，2H，-CH2-5)，1.72(m，2H，-CONHCH2 CH 2 CH2-)；
ESI-MS：278.2[M+H]+，300.1[M+Na]+.
实施例6：2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-1)
0.37g(2.8mmol)2-羟基吲哚和0.5g(2.6mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)溶于15ml无水吡啶中，加入TiCl40.4ml，100℃～110℃下搅拌反应10小时后，倒入冰水中，析出大量固体，用6mol/L盐酸调节pH至1～2，过滤，水洗，真空干燥得0.58g(72％)为黄褐色固体的标题化合物粗品，经DMF和水重结晶后，得到黄色固体的标题化合物0.43g(54％)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.64(s，1H，-NH-1)，12.03(s，1H，-COOH)，10.91(s，1H，-NH-1’)，7.63(d，1H，J＝7.56Hz，H-4’)，7.14(t，1H，H-6’)，6.99(t，1H，H-5’)，6.91(d，1H，J＝6.69Hz，H-7’)，3.12(t，2H，-CH2-4)，2.92(t，2H，-CH2-6)，2.53(s，3H，-CH3-2)，1.94(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：307.2[M-H]-.
实施例7：2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-2)
使用实施例6的方法，反应温度调为50℃～60℃，反应20个小时，0.42g(2.8mmol)5-氟-2-羟基吲哚和0.5g(2.6mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)反应得0.30g(35％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.68(s，1H，-NH-1)，12.08(s，1H，-COOH)，10.93(s，1H，-NH-1’)，7.45(dd，1H，J＝11.91Hz，H-4’)，6.97(t，1H，H-6’)，6.87(t，1H，H-7’)，3.08(t，2H，-CH2-4)，2.92(t，2H，-CH2-6)，2.54(s，3H，-CH3-2)，1.94(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：325.2[M-H]-.
实施例8：2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-3)
使用实施例6的方法，反应温度调为145℃～150℃，反应时间1小时，0.47g(2.8mmol)5-氯-2-羟基吲哚和0.5g(2.6mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)反应得0.28g(31％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ14.60(s，1H，-NH-1)，12.04(s，1H，-COOH)，11.04(s，1H，-NH-1’)，7.60(s，1H，H-4’)，7.42(d，1H，J＝8.5Hz，H-6’)，6.91(d，1H，J＝8.2Hz，H-7’)，3.08(t，2H，-CH2-4)，2.93(t，2H，-CH2-6)，2.54(s，3H，-CH3-2)，1.96(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：341.1[M-H]-.
实施例9：2-甲基-7-[1，2-二氢-5-甲基-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-4)
使用实施例6的方法，反应温度调为80℃～90℃，反应时间13小时，0.41g(2.8mmol)5-甲基-2-羟基吲哚和0.5g(2.6mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(S4)反应得0.39g(46％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ14.66(s，1H，-NH-1)，12.03(s，1H，-COOH)，10.82(s，1H，-NH-1’)，7.46(s，1H，H-4’)，6.96(d，1H，J＝7.70Hz，H-6’)，6.80(d，1H，J＝7.75Hz，H-7’)，3.10(t，2H，-CH2-4)，2.93(t，2H，-CH2-6)，2.53(s，3H，-CH3-2)，2.32(s，3H，-CH3-5’)，1.95(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：323.2[M+H]+；321.1[M-H]-.
实施例10：2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(I-1)
使用实施例6的方法，反应温度调为115℃～120℃，反应时间6小时，0.39g(2.6mmol)5-氟-2-羟基吲哚和0.5g(2.3mmol)2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(S3)反应结束后，反应液倒入冰水后，直接用二氯甲烷提取，用水和饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥后，浓缩得到的固体经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯4∶1)得0.22g(27％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ14.36(s，1H，-NH-1)，7.74(s，1H，-NH-1’)，7.36(d，1H，J＝10.53Hz，H-4’)，6.86～6.79(m，2H，H-6’，H-5’)，4.31(q，2H，-CH 2 CH3)，3.10(t，2H，-CH2-4)，3.05(t，2H，-CH2-6)，2.62(s，3H，-CH3-2)，2.05(m，2H，-CH2-5)，1.38(t，3H，-CH2 CH 3 ).
ESI-MS：355.3[M+H]+，377.2[M+Na]+；353.2[M-H]-.
实施例11：N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-2)
0.12g(0.79mmol)5-氟-2-羟基吲哚和0.20g(0.69mmol)N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-1)溶于10ml无水吡啶中，加入TiCl40.2ml，100℃～110℃下搅拌反应10小时后，反应液倒入冰水中，用二氯甲烷提取，用水和饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥后，浓缩得到的固体经硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇30∶1)得0.09g(31％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.32(s，1H，-NH-1)，7.70(s，1H，-NH-1’)，7.36(dd，1H，J＝10.62Hz，H-4’)，6.91～6.78(m，2H，H-6’，H-7’)，6.44(bs，1H，-CONH-)，3.51(bs，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.11(t，2H，-CH2-4)，2.97(t，2H，-CH2-6)，2.62(bs，9H，-CH3-2，-NHCH2 CH 2 N(CH 2 CH3)2)，2.08(m，2H，-CH2-5)，1.07(bs，6H，-(CH2 CH 3 )2)；
ESI-MS：425.1[M+H]+.
实施例12：N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-3)
使用实施例11的方法，0.13g(0.78mmol)5-氯-2-羟基吲哚和0.20g(0.69mmol)N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-1)反应得0.08g(26％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ14.25(s，1H，-NH-1)，8.55(s，1H，-NH-1’)，7.55(s，1H，H-4’)，7.10(dd，1H，J＝8.2Hz，H-6’)，6.81(d，1H，J＝8.2Hz，H-7’)，6.48(s，1H，-CONH-)，3.51(s，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.06(t，2H，-CH2-4)，2.89(t，2H，-CH2-6)，2.68(s，2H，-CONHCH2 CH 2 -)，2.60(m，7H，-CH3-2，-NHCH2CH2N(CH 2 CH3)2)，2.03(m，2H，-CH2-5)，1.05(t，6H，-(CH2 CH 3 )2)；
ESI-MS：441.1[M+H]+，463.3[M+Na]+；439.2[M-H]-.
实施例13：N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-甲基-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-4)
使用实施例11的方法，0.12g(0.82mmol)5-甲基-2-羟基吲哚和0.20g(0.69mmol)N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-1)反应得0.09g(31％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.30(s，1H，-NH-1)，8.11(s，1H，-NH-1’)，7.42(s，1H，H-4’)，6.97(d，1H，J＝7.92Hz，H-6’)，6.80(d，1H，J＝7.83Hz，H-7’)，6.47(bs，1H，-CONH-)，3.51(m，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.14(t，2H，-CH2-4)，2.94(t，2H，-CH2-6)，2.68～2.57(m，9H，-CH3-2，-NHCH2 CH 2 N(CH 2 CH3)2)，2.38(s，3H，-CH3-5’)，2.03(m，2H，-CH2-5)，1.05(t，6H，-(CH2 CH 3 )2)；
ESI-MS：421.1[M+H]+.
实施例14：N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-5)
使用实施例11的方法，0.11g(0.83mmol)2-羟基吲哚和0.20g(0.69mmol)N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-1)反应得0.09g(32％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.27(s，1H，-NH-1)，8.06(s，1H，-NH-1’)，7.62(s，1H，J＝7.71Hz，H-4’)，7.15(t，1H，H-6’)，7.04(t，1H，H-5’)，6.91(d，1H，J＝7.56Hz，H-7’)，6.46(bs，1H，-CONH-)，3.51(m，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.15(t，2H，-CH2-4)，2.93(t，2H，-CH2-6)，2.67～2.59(m，9H，-CH3-2，-NHCH2 CH 2 N(CH 2 CH3)2)，2.05(m，2H，-CH2-5)，1.05(t，6H，-(CH2 CH 3 )2)；
ESI-MS：407.3[M+H]+.
实施例15：N-(2-二甲胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-6)
使用实施例11的方法，0.13g(0.86mmol)5-氟-2-羟基吲哚和0.18g(0.68mmol)N-(2-二甲胺基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-3)反应得0.09g(33％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.21(s，1H，-NH-1)，8.70(s，1H，-NH-1’)，7.32(d，1H，J＝12.07Hz，H-4’)，6.87～6.76(m，2H，H-6’，H-7’)，6.59(bs，1H，-CONH-)，3.57(m，2H，-CONHCH 2 CH2-)，2.99(t，2H，-CH2-4)，2.76(t，2H，-CH2-6)，2.65(s，2H，-NHCH2 CH 2 N(CH3)2)，2.57(s，3H，-CH3-2)，2.38(s，6H，-N(CH 3 )2)，1.94(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：397.3[M+H]+.
实施例16：N-(3-二甲胺基丙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-7)
使用实施例11的方法，0.13g(0.78mmol)5-氯-2-羟基吲哚和0.20g(0.72mmol)N-(3-二甲胺基丙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-4)反应得0.10g(33％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.25(s，1H，-NH-1)，7.83(s，1H，-NH-1’)，7.59(s，1H，H-4’)，7.12(m，2H，H-6’，-CONH-)，6.83(d，1H，J＝8.28Hz，H-7’)，3.54(s，2H，-CONHCH 2 CH2CH2-)，3.11(s，2H，-CH2-4)，2.94(s，2H，-CH2-6)，2.60(s，3H，-CH3-2)，2.51(s，2H，-CONHCH2CH2 CH 2 -)，2.28(s，6H，-N(CH 3 )2)，2.07(m，2H，-CH2-5)，1.79(bs，2H，-CONHCH2 CH 2 CH2-)；
ESI-MS：427.2[M+H]+.
实施例17：N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-8)
使用实施例11的方法，0.11g(0.83mmol)2-羟基吲哚和0.17g(0.72mmol)N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-2)反应得0.07g(28％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.49(s，1H，-NH-1)，10.83(s，1H，-NH-1’)，7.64(d，1H，J＝7.83Hz，H-4’)，7.26(t，1H，-CONH-)，7.13(t，1H，H-6’)，7.01～6.91(m，2H，H-5’，H-7’)，4.65(bs，1H，-OH)，3.51(s，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.31(m，2H，-CONHCH2 CH 2 -)，3.13(t，2H，-CH2-4)，2.84(t，2H，-CH2-6)，2.46(s，3H，-CH3-2)，1.99(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：352.3[M+H]+，374.1[M+Na]+；350.2[M-H]-.
实施例18：N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-9)
使用实施例11的方法，0.13g(0.86mmol)5-氟-2-羟基吲哚和0.17g(0.72mmol)N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(II-2)反应得0.08g(30％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.54(s，1H，-NH-1)，10.84(s，1H，-NH-1’)，7.44(dd，1H，J＝10.9Hz，H-4’)，7.26(t，1H，-CONH-)，6.98～6.85(m，2H，H-6’，H-7’)，4.63(t，1H，-OH)，3.52(q，2H，-CONHCH 2 CH2-)，3.32(m，2H，-CONHCH2 CH 2 -)，3.08(t，2H，-CH2-4)，2.85(t，2H，-CH2-6)，2.47(s，3H，-CH3-2)，1.98(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：368.1[M-H]-.
实施例19：2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚(I-10)
使用实施例2的方法，0.15g(0.46mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-2)和0.13g(1.5mmol)吗啉反应得0.12g(66％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.23(s，1H，-NH-1)，7.95(s，1H，-NH-1’)，7.35(dd，1H，J＝10.58Hz，H-4’)，6.88～6.77(m，2H，H-6’，H-7’)，3.69(s，4H，-N(CH 2 CH2)2O)，3.63(s，4H，-N(CH2 CH 2 )2O)，3.09(t，2H，-CH2-4)，2.70(t，2H，-CH2-6)，2.42(s，3H，-CH3-2)，2.06(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：396.2[M+H]+，418.2[M+Na]+，434.0[M+K]+；394.2[M-H]-.
实施例20：2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚(I-11)
使用实施例2的方法，0.15g(0.44mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-3)和0.12g(1.4mmol)吗啉反应得0.13g(72％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ14.19(s，1H，-NH-1)，7.90(s，1H，-NH-1’)，7.59(s，1H，H-4’)，7.12(dd，1H，J＝8.19Hz，H-6’)，6.82(d，1H，J＝8.23Hz，H-7’)，3.70(s，4H，-N(CH 2 CH2)2O)，3.63(s，4H，-N(CH2 CH 2 ) 2 O)，3.12(s，2H，-CH2-4)，2.71(s，2H，-CH2-6)，2.43(s，3H，-CH3-2)，2.06(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：412.2[M+H]+，434.1[M+Na]+；410.2[M-H]-.
实施例21：2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚(I-12)
使用实施例2的方法，0.14g(0.45mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-1)和0.13g(1.5mmol)吗啉反应得0.12g(71％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.20(s，1H，-NH-1)，8.07(s，1H，-NH-1’)，7.63(d，1H，J＝7.86Hz，H-4’)，7.16(t，1H，H-6’)，7.05(t，1H，H-5’)，6.90(dd，1H，J＝7.63Hz，H-7’)，3.70(s，4H，-N(CH 2 CH2)2O)，3.64(s，4H，-N(CH2 CH 2 )2O)，3.15(t，2H，-CH2-4)，2.70(s，2H，-CH2-6)，2.42(s，3H，-CH3-2)，2.05(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：378.1[M+H]+；376.2[M-H]-.
实施例22：2-甲基-3-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚(I-13)
使用实施例2的方法，0.15g(0.49mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-1)和0.15g(1.5mmol)N-甲基哌嗪反应得0.14g(73％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.17(s，1H，-NH-1)，7.90(s，1H，-NH-1’)，7.64(d，1H，J＝7.83Hz，H-4’)，7.15(t，1H，H-6’)，7.05(t，1H，H-5’)，6.91(d，1H，J＝7.60Hz，H-7’)，3.65(s，4H，-N(CH 2 CH2)2NCH3)，3.16(t，2H，-CH2-4)，2.70(s，2H，-CH2-6)，2.41(s，7H，-CH3-2，-N(CH2 CH 2 )2NCH3)，2.33(s，3H，-N(CH2CH2)2NCH 3 )，2.06(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：391.2[M+H]+；389.2[M-H]-.
实施例23：2-甲基-3-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚(I-14)
使用实施例2的方法，0.15g(0.46mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-2)和0.15g(1.5mmol)N-甲基哌嗪反应得0.14g(75％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ14.21(s，1H，-NH-1)，7.70(s，1H，-NH-1’)，7.36(dd，1H，J＝10.61Hz，H-4’)，6.89～6.78(m，2H，H-6’，H-7’)，3.66(bs，4H，-N(CH 2 CH2)2NCH3)，3.11(t，2H，-CH2-4)，2.71(s，2H，-CH2-6)，2.42(s，7H，-CH3-2，-N(CH2 CH 2 )2NCH3)，2.35(s，3H，-N(CH2CH2)2NCH 3 )，2.06(m，2H，-CH2-5)；
ESI-MS：409.3[M+H]+；407.3[M-H]-.
实施例24：N，N-二甲基-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺(I-15)
使用实施例2的方法，0.10g(0.32mmol)2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸(IV-1)和0.12g(1.5mmol)二甲胺盐酸盐，并加入0.23g(1.5mmol)DBU反应，得50mg(47％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ14.14(s，1H，-NH-1)，7.85(bs，1H，-NH-1’)，7.63(s，1H，J＝7.90Hz，H-4’)，7.15(t，1H，H-6’)，7.04(t，1H，H-5’)，6.90(d，1H，J＝7.64Hz，H-7’)，3.16(s，2H，-CH2-4)，3.06(s，3H，-NCH 3 (CH3))，2.71(s，2H，-CH2-6)，2.40(s，3H，-CH3-2)，2.04(m，2H，-CH2-5)，1.57(s，3H，-NCH3(CH 3 ))；
ESI-MS：336.1[M+H]+；334.2[M-H]-.
生物学实施例
采用下列试验甄别具有最佳程度的所需活性的那些化合物。
抑制肿瘤细胞增殖测定方法(MTT法)
测定按常规采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。因而，采用MTT法可测定本发明化合物的抑制细胞增殖能力，同时利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。
1.试剂和仪器
RPMI 1640培养基(RPMI 1640+12％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；
RPMI 1640培养基(RPMI 1640+12％胎牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；
高糖DMEM培养基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；
高糖DMEM培养基(DMEM+12％胎牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；
MC COYS 5-A培养基(DMEM+12％胎牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；
胰蛋白酶；
MTT(美国Amresco公司产品)；
待测化合物：本发明实施例中制备的化合物I-1～I-15；
酶标仪(TECAN infinite M200)
2.癌细胞株
2.1人胃腺癌细胞株(BGC)
2.2人非小细胞肺癌(A549)
2.3人白血病细胞株(K562)
2.4人胰腺癌细胞株(PANC-1)
2.5人小细胞肺癌(NCI-H446)
如2.1、2.2、2.3、2.4和2.5所列癌细胞株用含12％小牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
2.6人胰腺癌细胞株(BXPC-3)
2.7人膀胱癌细胞株(T24)
如2.6和2.7所列癌细胞株用12％胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
2.8人肝癌细胞株(HEPG2)
2.9人乳腺癌细胞株(MCF-7)
如2.8和2.9所列癌细胞株用12％小牛血清的高糖DMEM培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
2.10人结肠腺癌细胞株(CACO-2)
如2.10所列癌细胞株用12％胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
2.11人结肠癌细胞株(HT29)
2.12人结肠癌细胞株(HCT116)
2.13人卵巢癌细胞株(SK-OV-3)
如2.11、2.12和2.13所列癌细胞株用12％胎牛血清的MC COYS 5-A培养基，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
3.实验方法
3.1接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM或5A)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至1.67×104/ml取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔(含肿瘤细胞3000/孔)。
3.2培养：将培养板转入恒温CO2培养箱中，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养24小时。
3.3初筛：待测化合物先用DMSO配制成0.1M浓度，再作3个稀释度，用于初筛，浓度依次为10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L。加入待测化合物，20ul/孔，培养72小时。每组设3个平行孔，并重复3次，测定96孔板每孔吸光值，记录结果计算细胞生长抑制率，取三次平均值。
3.4染色：
3.4.1将MTT加入96孔板(贴壁细胞)中，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，吸弃孔内上清液，加入DMSO 100ul/孔，置平板摇床上震荡5分钟。
3.4.2将MTT加入96孔板中(悬浮细胞)，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，再加入20％SDS 50ul/孔，置于培养箱中过夜。
3.5测定：酶标仪设定波长为570nm，参考波长为630nm，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞生长抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。
3.6复筛：在初筛浓度为10-5mol/L时，3次细胞抑制率≥50％的化合物用于复筛，将0.1mol/L再作10个稀释度，浓度依次为10-5mol/L、0.5×10-5mol/L、10-6mol/L、0.8×10-6mol/L、0.6×10-6mol/L、0.4×10-6mol/L、0.2×10-6mol/L、10-7mol/L、0.8×10-7mol/L和0.4×10-7mol/L。加入受试化合物，20ul/孔，培养48小时。同样每组设3个平行孔，并重复3次，并按照初筛方法，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞生长抑制率。
3.7细胞生长抑制率以及IC50的计算：
同时根据各浓度的生长抑制率，采用以化合物浓度的对数同Logit[I]线性回归，求出抑制生长率为50％时的待测化合物浓度即IC50，取三次平均值。
4.实验结果
4.1细胞生长抑制率
在浓度为10-5mol/L，本发明化合物对不同肿瘤细胞的生长抑制率分别见表1和表2：
表1
表2
4.2细胞生长半数抑制浓度(IC50umol/L)
本发明化合物对不同肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(IC50)分别见表3和表4：
表3
表4
5.实验结论
本发明实施例中制备的具有式(I)结构的化合物I-1～I-15对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，其中化合物I-2～I-8抑制肿瘤细胞增殖的效果更为显著，其IC50在10-5mol/L以下。上述这些化合物可应用于抗肿瘤药物的制备。
Claims (18)
1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1是氢、卤素、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NR8R9、-(CH2)nR10或-C(O)NR11R12；
R2是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、氰基、-NR8R9、-NR8C(O)R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-S(O)2NR8R9或-SO2R13；
R3是氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、-C(O)R7、-NR8R9、芳基、杂芳基、-NR8S(O)2R9、-S(O)2NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9或-SO2R13；
R4是氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基或-NR8R9；
R5是氢、烷基或-C(O)R14；
R6是羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R15)(CH2)rR16或-NR8R9；
R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R10是羟基、-C(O)R7、-NR8R9或-C(O)NR8R9；
R11和R12独立地选自氢、烷基或芳基，或者R11和R12与它们所连接的氮原子一起形成杂环基；
R13是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
R14是羟基、烷氧基、芳氧基或-NR8R9；
R15是氢或烷基；
R15是羟基、-NR8R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-N+(O-)R8R9、-N(OH)R8或-NHC(O)Ra，其中Ra为未被取代的烷基、卤代烷基或芳烷基；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
n和r独立地是1、2、3或4。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1、R3和R4是氢；
R2是氢、卤素或烷基；
R5是甲基；
R6是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是2或3。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的化合物选自：
2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸；
2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸；
2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸；
2-甲基-7-[1，2-二氢-5-甲基-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸；
2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酸乙酯；
N，N-二甲基-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚；
2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚；
2-甲基-3-(吗啉-4-羰基)-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚；
2-甲基-3-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚；
2-甲基-3-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1、R3和R4是氢；
R2是氢、卤素或烷基；
R5是甲基；
R6是-N(R15)(CH2)rR16；
R15是氢；
R16是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢，烷基，环烷基，芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是2或3。
5.根据权利要求4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的化合物选自：
N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-二乙胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-甲基-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-羟基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(2-二甲胺基乙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氟-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺；
N-(3-二甲胺基丙基)-2-甲基-7-[1，2-二氢-5-氯-2-氧代-3H-吲哚-(Z)-3-亚基]-4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-3-羧酰胺。
6.一种式(I)化合物的制备方法，其特征为在Lewis酸存在下，使式(III)化合物与式(II)化合物于非质子溶剂中反应，反应温度为50℃至150℃，反应时间为1小时至20小时，其反应方程式如下：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6的定义如权利要求1所述。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述Lewis酸为AlCl3、BF3、SnCl4、SnCl2、ZnCl2或TiCl4。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述Lewis酸为SnCl4或TiCl4。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述Lewis酸为TiCl4。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述非质子溶剂为非质子亲质子性溶剂或惰性溶剂，其中非质子亲质子性溶剂可采用N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二甲亚砜、吡啶，惰性溶剂可采用戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于非质子溶剂为吡啶。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述反应温度为85℃至120℃。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于所述反应温度为100℃至110℃。
14.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述反应时间为5小时到13小时。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于所述反应时间为8小时到10小时。
16.权利要求1-5中任一项的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
17.一种式(II)的中间体：
其中：
R5是氢、烷基或-C(O)R14；
R6是羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R15)(CH2)rR16或-NR8R9；
R15是氢或烷基；
R16是羟基、-NR8R9、-C(O)R7、芳基、杂芳基、-N+(O-)R8R9、-N(OH)R8或-NHC(O)Ra，其中Ra为未被取代的烷基、卤代烷基或芳烷基；R7是氢、羟基、烷氧基或芳氧基；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是1、2、3或4。
18.根据权利要求17所述的中间体，其中
R5是甲基；
R6是羟基、乙氧基或-N(R15)(CH2)rR16；
R15是氢或烷基；
R16是羟基或-NR8R9；
R8和R9独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R8和R9合起来形成一个杂环基；
r是2或3。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080611 |