CN101031344A - 一种仪器部件和采用该仪器部件检测分析物的存在的方法 - Google Patents
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Abstract
公开一种包括适合用于亲和柱的刚性载体的仪器部件、亲和柱以及与分析柱(例如,在高压液相色谱(HPLC)柱中的)流体联通的亲和柱。还公开采用该仪器部件检测一种或多种分析物的存在的方法。
Description
技术领域
本发明一般地涉及一种包括适合用于亲和柱的刚性载体的仪器部件、亲和柱以及包含与分析柱(例如,高压液相色谱(HPLC)柱)流体联通的亲和柱的仪器。本发明还涉及采用该仪器部件检测一种或多种分析物的存在的方法。
背景技术
用于分析潜在地含有一种或多种分析物的试样的仪器部件和方法是公知的。然而,目前样品分析技术需要以下功效之一或多项:
(1)单独或彼此组合使用、能减少样品制备步骤或减少样品操作步骤的仪器部件;
(2)能减少样品制备步骤和减少样品操作步骤的方法;
(3)单独或彼此组合使用、能高度精确地分析复杂试样中给定分析物的仪器部件,同时极少受来自以下因素的干扰:(i)复杂试样内的非-分析物组分(即,非标的分析物的材料与仪器中使用的一种或多种配体(之间)不希望的结合),以及(ii)标的分析物与非仪器中所用配体的反应活性部位不希望的结合;
(4)单独或彼此组合使用、能高度精确地分析复杂试样中特异分析物(例如,具有***活性的分析物)的仪器部件,同时极少受来自以下因素的干扰:(i)复杂试样内非-分析物组分(即,非标的分析物的材料与仪器中使用的一种或多种配体不希望的结合),以及(ii)标的分析物与非仪器中所用配体的反应活性部位不希望的结合;以及
(5)与分析柱在线或流体联通地使用亲和柱的能力。
发明概述
本发明涉及一种包括适用于亲和柱的刚性载体的仪器部件、包含刚性载体的亲和柱以及包含与分析柱(例如,高压液相色谱(HPLC)柱)流体联通的亲和柱的仪器。该仪器部件可用于从各种各样复杂混合物中俘获并定量化一种或多种分析物。
在本发明的一种实施方案中,该仪器部件包含适用于亲和柱的刚性载体。本发明的一种范例刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含(i)无机基材;(ii)某种改性基材表面,它减少非分析物材料对无机基材的非特异结合(即,非标的分析物材料的非特异结合)和配体-特异性分析物材料对无机基材的非特异结合(即,标的分析物与由一种或多种配体提供的反应活性部位以外的其它反应活性部位的非特异结合);以及(iii)结合在无机基材上的一种或多种配体,其中该一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。在本发明范例实施方案中,无机颗粒包含无机金属氧化物颗粒,例如,二氧化硅或硅胶颗粒。
本发明还涉及包含刚性载体材料的亲和柱。在本发明范例实施方案中,该亲和柱包含具有一定柱体积的柱结构;以及位于柱结构的柱体积内的刚性载体,其中刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含(i)无机基材;(ii)减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料在无机基材上的非特异结合的改性基材表面;以及(iii)一种或多种结合在无机基材上的配体,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
本发明另外还涉及包含与分析柱流体联通的亲和柱的仪器,其中亲和柱包含刚性载体,它(i)能耐受最高约200bar的柱压力,和(ii)具有一种或多种结合在其上的配体,其中一种或多种配体能选择性地结合到给定样品溶液内的一种或多种分析物上。在一种范例实施方案中,仪器的亲和柱包含本发明的刚性载体材料。
本发明还涉及制备刚性载体、免疫亲和柱以及包含免疫亲和柱的仪器的方法,以及采用刚性载体、免疫亲和柱以及仪器检测在给定样品中一种或多种分析物的存在的方法。本发明方法可用于分析潜在地含有至少一种分析物的试样。
在本发明的一种范例实施方案中,本发明涉及制造包含无机基材的刚性载体材料的方法。在一种范例方法中,该方法包括以下步骤:(1)在无机基材表面的至少第一部分上固定R基团,其中R基团的反应活性小于固定步骤之前的无机基材表面上任何官能团的;(2)在无机基材表面的至少第二部分上固定一种或多种连接基,其中一种或多种连接基包含醛官能团;以及(3)在一种或多种连接基上选择性地结合一种或多种配体。
在本发明一种范例实施方案中,本发明涉及分析潜在地含有至少一种分析物的试样的方法。在一种范例实施方案中,分析潜在地含有至少一种分析物的试样的该方法包括以下步骤:(a)向包含刚性载体的亲和柱中引入试样,其中刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含(i)无机基材;(ii)减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料在无机基材上的非特异结合的改性基材表面;以及(iii)一种或多种结合在无机基材上的配体,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
分析潜在地含有至少一种分析物的试样的范例方法还可包括以下步骤:(a)令试样接触刚性载体和其上的配体;(b)清洗掉刚性载体上的任何未结合到配体上的试样组分;(c)向亲和柱中引入洗脱液以便使洗脱液接触结合在刚性载体上的配体上的一种或多种分析物;(d)令洗脱液保持与刚性载体接触一段时间以便形成潜在地包含一种或多种分析物的洗脱样品;以及(e)分析在分析柱上的内容物以确定一种或多种分析物在试样中的存在。
在另一种范例实施方案中,本发明涉及一种分析潜在地含有至少一种具有***活性的化合物的试样的方法,其中该方法包括以下步骤:向亲和柱中引入试样,其中亲和柱包含具有结合在其上的一种或多种配体的刚性载体,其中一种或多种配体能选择性地结合到具有***活性的一种或多种化合物上。
本发明进一步涉及分析洗脱样品的方法,其中该方法包括将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定一种或多种分析物在洗脱样品中的存在的步骤。例如,洗脱样品可含有真菌毒素、叶酸、维生素B12(氰钴铵)或其组合。
在一种范例实施方案中,分析洗脱样品的方法包括分析潜在地含有至少一种真菌毒素的洗脱样品,其中该方法包括将将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定至少一种真菌毒素在洗脱样品中的存在的步骤。
在另一种范例实施方案中,分析洗脱样品的方法包括分析潜在地含有叶酸、维生素B12(氰钴铵)或其组合的洗脱样品,其中该方法包括将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定叶酸、维生素B12(氰钴铵)或二者在洗脱样品中的存在的步骤。
本发明的这些以及其它特征和优点在研读了下面公开的实施方案和所附权利要求的详细描述之后自会了然。
附图简述
下面将参考附图进一步描述本发明,附图中:
图1画出本发明范例仪器的示意图;
图2画出本发明范例亲和柱;
图3画出本发明另一种范例仪器,显示样品加载到样品回路期间流体穿过仪器的流动;
图4画出样品注入亲和柱期间图3的范例仪器;
图5画出样品被从亲和柱洗脱期间图3的范例仪器;以及
图6画出样品检测期间图3的范例仪器。
发明详述
本发明涉及一种仪器部件,包括(i)适用于亲和柱的刚性载体,(ii)包含刚性载体的亲和柱,(iii)包含本发明刚性载体和/或亲和柱与分析柱,例如,高压液相色谱(HPLC)柱的组合的仪器,以及(iv)包含与分析柱,例如,高压液相色谱(HPLC)柱流体联通的亲和柱的仪器。本发明还涉及制造该仪器部件之一或多种的方法,以及使用该仪器部件之一或多种分析试样(包括潜在地含有一种或多种分析物的复杂混合物)的方法。本发明还涉及使用仪器部件之一或多种以从各种复杂混合物中俘获和/或定量化一种或多种分析物的方法。
本发明一种范例仪器10表示在图1中。范例仪器10包括亲和柱11、分析柱12、检测器13、第一泵14、第二泵15、第一阀门16、第二阀门17、试样进口20、第一缓冲液进口21、洗脱缓冲液进口22、第一废液出口23以及亲和柱废液出口24。在本发明的一种要求的实施方案中,亲和柱11和分析柱12通过偶联器(未画出)彼此连接以便使亲和柱11与分析柱12流体联通。这里所使用的术语“与...流体联通”描述本发明的一种实施方案,其中离开亲和柱的洗脱样品经过亲和柱与分析柱之间的偶联器直接流入到分析柱中。此种结构(本文也称其为“在线组态”)消除了在亲和柱与分析柱之间处理和/或存储洗脱样品的需要。
在本发明其它实施方案中,亲和柱11和分析柱12彼此不流体联通。在此种实施方案中,离开亲和柱的洗脱样品可被收集和/或储存起来以备将来使用(即,用于未来向分析柱12中的引入)。此种结构在本文亦称作“离线组态”。
如上所示,本发明范例仪器10可包含多个部件。各个部件的描述和单独或组合使用各个部件的方法将在下面给出。
I.仪器部件
本发明仪器可包含但不限于,以下部件之一或多种。
A.亲和柱
本发明涉及亲和柱,例如,图1所示范例亲和柱11,它包含一个或多个以下部件。本文所使用的术语“亲和柱”包括具有以下部件之一或多种的柱,包括诸如免疫亲和柱之类的亲和柱。
1.柱结构
本发明亲和柱包含具有要求尺寸、柱体积和结构整体性的柱结构。就典型而言,柱结构包含管式结构,在管式结构的两端具有可拆卸端盖。端盖与管式结构构成防漏密封以防止物料不可心地从管式结构中流走。一种本发明范例亲和柱11表示在图2中。
如图2所示,范例亲和柱11包含管式结构110,它具有第一端111和第二端112。端盖113和114分别在第一和第二端111和112构成防漏密封。端盖113和114在范例亲和柱11的储存期间特别有用,这样防止(i)范例亲和柱11内物料的泄漏和/或(ii)物料在范例亲和柱11内变干。范例亲和柱11还包含位于范例亲和柱11柱腔32内的刚性载体材料30和第一缓冲液31(如下所述)。
管式结构110可由各种不同材料制成并具有耐受管式结构110内较高压力的壁结构。可心的是,管式结构110具有耐受最高约6000psi(400bar),更可心地约3000psi(200bar)~约4500psi(300bar)恒定压力的结构整体性。适合构成管式结构110的材料包括但不限于,聚合物,例如,聚醚醚酮(PEEK)和聚丙烯;金属如不锈钢;以及无机材料如玻璃。在本发明的一种要求的实施方案中,管式结构110包含聚醚醚酮(PEEK)。
管式结构110的尺寸可随多种因素变化,包括但不限于,颗粒尺寸和几何参数、流动速率、注入体积、要求的板数等。就典型而言,管式结构110具有圆形断面面积、介于约2mm~约20mm的外径和介于约1mm~约10mm的内径,以及介于约2mm~约250mm的总长。在本发明一种要求的实施方案中,管式结构110具有圆形断面面积,约11mm的外径、约4.6mm的内径和约50mm的总长。
用于管式结构110的端盖113和114一般由PEEK制成,其尺寸与管式结构110的端部构成防漏密封。
要指出的是,虽然具有圆形断面面积的管式结构是要求的,但具有其它断面面积的管式结构也在本发明范围内。适合各种不同管式结构的断面构型包括但不限于,方形、矩形、三角形、椭圆形、五角形和六角形断面构型。
2.刚性载体材料
本发明还涉及适合用于亲和柱的刚性载体材料,例如,图2所示范例刚性载体材料30。本发明刚性载体材料包含以下部件之一或多种。
a.无机基材
适用于本发明的无机基材包括作为色谱介质销售的产品。该无机基材可采用技术上公知的方法制备。该无机基材给一种或多种加载到该无机基材表面的附加组分提供支撑。一般而言,无机基材是无机氧化物,更适合地是无机金属氧化物、硅酸盐或硅铝酸盐或受控多孔玻璃。无机金属氧化物更可心。适合用于本发明的无机氧化物通常具有能与其它化学官能团键合或起反应的游离羟基基团。可心的是,无机氧化物具有约1~约10个羟基基团每平方纳米固体无机氧化物。
合适的无机金属氧化物包括但不限于,二氧化硅如色谱级二氧化硅或硅胶,氧化铝、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、锆酸盐、受控多孔玻璃或氧化钛。在本发明的一种要求的实施方案中,无机金属氧化物是二氧化硅、更可心地,色谱级二氧化硅或硅胶。磁响应无机金属氧化物,例如,公开在WO 98/31461(在此将其公开内容全文收作参考)中的硅质氧化物-涂布的磁性颗粒,也可用于本发明。混合的无机金属氧化物,例如,二氧化硅和氧化铝的复合凝胶,或共沉淀物,也可使用。
固体无机金属氧化物可具有颗粒、纤维片状物或其组合的物理形式。可心的是,固体无机金属氧化物处于具有基本球形的粒状或颗粒的物理形式。不论物理形式如何,固体无机金属氧化物通常具有最多约100μm的最长尺寸(即,长度、宽度或直径)。当固体无机金属氧化物包含大量具有基本球形的颗粒时,该大量颗粒可心地具有约1μm~约100μm的平均颗粒直径。在本发明的一种要求的实施方案中,固体无机金属氧化物包含大量具有基本球形形状的二氧化硅或硅胶颗粒,其中大量二氧化硅或硅胶颗粒的平均颗粒直径介于约15μm~约20μm。
各种各样市售供应的固体无机金属氧化物可用于本发明。合适的固体无机金属氧化物包括但不限于,由Grace Vydac(Columbia,MD)以商品名DAVISIL市售供应的二氧化硅颗粒,例如,DAVISILXWP(超宽孔隙)二氧化硅介质,具有无规形状,平均孔隙尺寸介于约500埃~约3000埃,可心地介于约500埃~约1500埃,或者VYDAC二氧化硅,具有近似球体的形状并且平均孔隙尺寸为约300埃。在本发明的一种要求的实施方案中,VYDAC二氧化硅,具有近似球体形状并且初始平均孔隙尺寸为约300埃,经改性以增加平均孔隙尺寸至约800埃以后使用。
b.改性无机基材表面
对上述无机基材的表面实施处理或改性,以便在无机基材上减少非分析物材料的非特异、非选择性结合和/或吸附(即,非标的分析物材料的非特异结合)和配体-特异性分析物材料的非特异、非选择性结合或吸附(即,标的分析物与由一种或多种配体提供的反应活性部位以外的其它反应活性部位的非特异结合)。获得的改性基材表面具有(i)较小的对非分析物材料(即,除标的分析物以外的材料)的亲和力,由于在无机表面存在着相对惰性的R基团,以及(ii)受控数量的用于,直接或通过连接基,将一种或多种配体(如下所述)选择性地结合到无机基材表面的反应活性部位。用于选择性地结合到一种或多种配体上的反应活性部位的数量导致一种或多种感兴趣的分析物与固定在无机基材表面上的一种或多种配体之间选择性地受控结合。
该改性基材表面包含固定在无机表面表面的至少一部分上的相对惰性R基团。本文所使用的术语“相对惰性R基团”用于描述被固定在无机基材表面上的R基团,其中R基团的反应活性小于原来(即,未改性的)无机基材表面的。例如,当无机基材包含二氧化硅颗粒时,被固定在无机表面表面的至少一部分上的相对惰性R基团的反应活性小于存在于原来或未改性二氧化硅表面上的羟基基团的。
相对惰性R基团可利用各种各样的技术固定在无机表面表面的至少一部分上,包括但不限于,本文所描述的技术,以及在美国专利申请序列号09/929,621,题为″SOLID COMPOSITIONS FORSELECTIVE ADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″,2001-08-14提交,中描述的技术,在此将其主题全部收作参考。
在本发明的一种范例实施方案中,相对惰性R基团被固定到无机表面表面的至少一部分上,其中相对惰性R基团包含R10表面部分。合适的R10表面部分包括但不限于,-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。在本发明的一种范例实施方案中,R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH或-CH(OH)CH2(OH)。在本发明的一种要求的实施方案中,R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3或-CH2CH2OH,更可心地,R10表面部分包括-CH2OH。
部分R10位于无机物质的至少一个表面上。所谓“位于”指的是,R10可直接固定到初始无机物质的表面的官能团上。R10可位于存在于无机物质周边的表面区域上,或者可位于存在于孔隙内的表面区域上,该孔隙伸入到无机物质内部并在该物质的周边上具有(孔隙)敞口。
R10也可这样“位于”无机物质的表面,即,通过二价部分或原子(-X-)形成通式为-X-R10的基团从而固定在无机物质表面上。在该实施方案中连接R10的二价部分或原子在该物质与反应物起反应之前不存在于初始无机物质的组合物中。该部分或原子可源于用于产生R10的反应物,例如,来源于硅烷反应物的残余金属原子(例如,硅原子)。该残余部分或原子直接固定到无机基材上,但可心的是,通过无机基材表面上的羟基基团。此反应物中的-X-基团随反应物之不同而不同,但可以是金属原子也可以是其它化学部分。例如,X可由金属原子如硅、铝、锆之类衍生而来。选择的无机基材也可能确定-X-及其所联系的反应物的选择。一般而言,任何含-X-的反应物都将是能与无机基材上的反应活性官能团起反应的反应物。在无机氧化物的情况下,合适的反应物通常是能与羟基基团起反应的那些。
反应化合物,例如,能在无机基材上生成R10的那些,的化学方面在技术上是公知的,例如,Smith,Organic Synthesis,John Wiley & Sons,1994;March,Advanced Organic Chemistry,John Wiley & Sons,Fourth Edition,1992;Larock,Comprehensive OrganicTransformations,John Wiley & Sons,Second Edition,1999;Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,ThirdEdition,1999;Brook,Silicon in Organic,Organometallic,和PolymerChemistry,John Wiley & Sons,2000;Hermanson等,ImmobilizedAffinity Ligand Techniques,1992;Weetall,″Covalent CouplingMethods for Inorganic Support Materials″,in Methods in Enzymology,vol.XLIV,编著K.Mosbach,pp.134-148,1976;Abbott,美国专利4298500;和Arkles,美国专利5371262;在此将这些文献中的每一篇的公开内容全部收作参考。例如,包含位于无机基材表面上的R10基团的刚性载体可由反应物或涂布剂如带有R10前体基团的烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷或三烷氧基硅烷来制备。例如,乙酰氧基甲基可以是羟甲基的前体基团。随后,令涂布剂与无机物质的表面起反应,然后使前体水解以生成具有被固定的R10基团的无机物质。
改性基材表面还包含用于选择性地结合到一种或多种配体(如下所述)上的受控数量反应活性部位。反应活性部位可直接在无机基材的表面上,或者可通过固定在无机基材表面上的连接基形成。配体可采用技术上公知的方法(例如,Hermanson等,Immobilized Affinity LigandTechniques,Academic Press,1992,以及前面有关固定R10部分所援引的其它参考文献)直接固定在无机基材的表面。例如,配体可通过与表面官能团(即,反应活性部位),例如,羟基,起反应而固定在初始无机氧化物上。
替代地,配体可通过固定在无机基材表面的连接基(即,替代的活性反应部位)而固定在无机基材上。连接基可以是二价化学基团,任选地是取代的。该任选取代的二价化学基团可包含n个-R-基团,其中n是-R-基团的数目,n是至少为1的整数,优选不大于30,更优选不大于15。更典型的是,二价化学基团为约1~约30个原子,优选约1~约20个原子,更优选约5~约15个原子长,从配体量到无机物质。化学基团-R-可选自:-C(R1)H-、-C(R2)=C(R3)-和-C≡C-,其中R1、R2和R3彼此独立地是氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基,所述-R-基团任选用-O-、-S-、羰基、硫羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)=N-、-N=C(R5)-、-C(R5)=NO-、-ON=C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亚芳基、取代的亚芳基、亚环烷基、取代的亚环烷基、亚环烯基、取代的亚环烯基、二价杂环基或二价取代的杂环基替代,其中R4和R5彼此独立地是氢、烷基、取代的烷基、环烷基;取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。化学基团的例子是包含n个-R-基团的“烃基”,并且其中n如上所述,至少一个-R-基团是-CH2-并且(n-1)个-R-基团任选地被上面提到的R基团,例如,-O-、-S-等替代。
连接基与无机基材的反应化学在文献中有充分描述(参见Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,1992和Weetall,Methods in Enzymology,vol.XLTV,pp.134-148,1976)。关于连接基和无机基材具体的反应化学取决于使用的无机基材和连接基。同样,连接基与配体之间的反应化学取决于所采用的连接基和配体。适宜连接基/配体偶联化学的具体例子描述在美国专利申请09/929,621,题为″SOLID COMPOSITIONS FOR SELECTIVEADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″,2001-08-14提交,在此将其主题内容全部收作参考。正如在,例如,美国专利申请序列号09/929,621中公开的,配体可通过配体和/或连接基上的氨基、巯基、羰基或羧基基团,或者活性氢原子偶联到连接基上。
在本发明的一种范例实施方案中,一种或多种配体通过在其上具有至少一个醛官能团的连接基被偶联到无机基材上。该醛官能团可用于结合到配体、固定在无机基材上的第一连接基,或二者。在本发明的一种要求的实施方案中,一种或多种配体通过第一和第二连接基而偶联到无机基材上,其中第一连接基结合在无机基材上,而第二连接基则结合在第一连接基上。在本发明的一种要求的实施方案中,第一连接基包含氨基官能硅氧烷,例如,氨基丙基三甲氧基硅烷,而第二连接基包含二醛,例如,戊二醛。在这一实施方案中,游离醛部分被用于将配体结合到无机基材上。本发明这一范例实施方案描述在下面的实施例1中。
在制造具有改性基材表面的本发明刚性载体中,其中刚性载体包含连接基团,形成连接基团以及将R10基团加到无机物质上的顺序可以变化。R10基团可以在连接基固定上以后在无机表面上生成,或者R10可在无机基材与连接基起反应之前生成。替代地,可先生成和/或固定R10或者连接基或二者的前体,然后,再由前体起反应生成最终R10和/或连接基。
连接基在改性无机表面上的浓度可以变化。在本发明的某些实施方案中,配体包含大蛋白分子,它可“遮盖”刚性载体表面面积的大区域。结果,连接基部位在刚性载体表面上的浓度就不需要比较高。该浓度可根据所考虑的配体/分析物络合物的尺寸来优化。确定R10和配体浓度的因素包括但不限于,R10基团和配体的本性、无机物质上的反应活性部位浓度、连接基基团的浓度,以及分析物的本性。
一般而言,R10的浓度可介于约1~约10个基团每平方纳米(nm2)刚性载体表面面积,基于按BET测定的表面面积。在某些实施方案中,配体浓度主要取决于使用该组合物时要回收的分析物。如上面所指出,配体浓度也可取决于任何任选使用的连接基的浓度。然而,一般地,配体浓度可介于0.04~约4个基团每平方纳米。另外,给定的配体不总是按照1∶1的化学式量比固定在连接基上。在某些实施方案中,例如,当配体是由大蛋白分子制备时,配体可由几个连接基基团固定。在采用较小配体的其它实施方案中,采用数量少于化学式量的配体,同时将任何未反应的连接基基团“封堵”起来以避免当采用本发明分离时起干扰作用。
R10和配体或任选连接基的数量也可用在初始无机物质上有多少官能团与(i)R10基团和(ii)配体和/或任选连接基起反应或用其覆盖来表示。例如,在无机基材上,约50%~约99%的反应活性部位,例如,表面羟基基团,可覆盖以R10表面部分,同时约50%~约1%的反应活性部位可覆盖以配体和/或任选连接基。
在本发明的某些实施方案中,在无机基材表面,约70%~约95%反应活性部位覆盖以R10表面部分,同时约30%~约5%反应活性部位覆盖以配体和/或任选连接基。
c.配体
本发明刚性载体材料还包含一种或多种结合在上面描述的无机基材上的配体。该一种或多种配体可直接固定在无机基材上的反应活性部位上,或者任选地通过固定在无机基材上的连接基,正如上面所描述的。该配体可以是任何分子或分子片段,只要能结合到另一部分或分子-基分析物上,例如,通过疏水相互作用、共价键合或库仑相互作用的结合。此类配体乃是分离工业技术人员熟知的。生物分离工业中使用的典型配体包括但不限于,生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、天然和非天然蛋白、肽、抗原和核酸。在本发明中,配体优选是受体或抗体。
适合用于本发明的配体包括任何配体,只要选择性地结合在给定分析物上。适合用于本发明的配体的非限制性例子包括但不限于,单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲除莠剂抗体(例如,溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆和/或氟磺隆的单克隆抗体)、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-有机磷杀虫剂抗体(例如,杀螟松、毒死蜱和/或嘧啶磷的单克隆抗体)、抗-儿茶酚胺抗体(例如,肾上腺素、去肾上腺素和/或多巴胺的单克隆抗体)、重组人***受体(hER)及其组合。
如下表1所示,各种各样配体可用于俘获给定的分析物。
表1.要检测的范例配体和分析物
用于俘获分析物的配体 | 要检测和分析的分析物 |
单克隆抗-黄曲霉毒素B1 | 黄曲霉毒素B1 |
单克隆抗-黄曲霉毒素g1 | 黄曲霉毒素g1 |
单克隆抗-黄曲霉毒素Q1 | 黄曲霉毒素Q1 |
单克隆抗-黄曲霉毒素B2 | 黄曲霉毒素B2 |
单克隆抗-黄曲霉毒素G2 | 黄曲霉毒素G2 |
抗-双酚A | 双酚A |
单克隆抗-2,4-D抗体 | 氯苯氧基乙酸 |
单克隆抗-雌酮 | 雌酮 |
单克隆抗-17-β-*** | 17-β-*** |
单克隆抗-17-α-乙炔基*** | 17-α-乙炔基*** |
抗-人乳铁蛋白 | 乳铁蛋白 |
单克隆抗-睾酮 | 睾酮 |
单克隆抗-去*** | 去*** |
单克隆抗-苯基脲抗体 | 苯基脲除莠剂,例如,溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆和氟磺隆 |
单克隆抗-烯菌酮 | 烯菌酮 |
单克隆抗-叶酸 | 叶酸 |
单克隆抗-维生素B12 | 维生素B12(氰钴铵) |
多克隆抗杀螟松、抗毒死蜱和抗嘧啶磷 | 杀螟松、毒死蜱和嘧啶磷 |
重组人***受体(hER) | 任何表现出***活性的化合物 |
上面的范例配体可从许多来源购得。合适的市售供应用于本发明的配体包括但不限于下表2中所示配体。
表2.范例市售供应的配体
用于俘获分析物的配体 | 货源 | 产品名称/代号 |
单克隆抗-黄曲霉毒素B1 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | A9555 |
单克隆抗-黄曲霉毒素g1 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | A9655 |
单克隆抗-黄曲霉毒素Q1 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | A9555 |
单克隆抗-黄曲霉毒素B2 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | A9555 |
单克隆抗-黄曲霉毒素G2 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | A9555 |
单克隆抗-双酚A | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-606-E |
单克隆抗-2,4-D抗体 | EltiSupport(Malden,the Netherlands) | 抗-2,4-D |
单克隆抗-雌酮 | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-210,FKA-210-E,FKA-212,FKA-212-E,FKA-214,FKA-214-E |
单克隆抗-17-β-*** | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-204,FKA-236,FKA-236-E |
单克隆抗-17-α-乙炔基*** | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-220,FKA-220-E,FKA-608-E |
抗-人乳铁蛋白 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | L3262 |
单克隆抗-睾酮 | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-118,FKA-118-E,FKA-128,FKA-128-E |
单克隆抗-去*** | COSMO BIO CO.,LTD.(Tokyo,JAPAN) | FKA-120和FKA-120-E |
单克隆抗-苯基脲抗体 | EltiSupport(Malden,the Netherlands) | 2/C8/C8 IgG |
单克隆抗-烯菌酮 | Rikilt(Wageningen,theNetherlands) | 30-1D2G4G7 |
单克隆抗-叶酸 | R-Biopharm(Glasgow,UK) | 抗-叶酸 |
单克隆抗-维生素B12 | Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) | V9505 |
重组人***受体(hER) | Axxora,LLC(San Diego,CA) | ALX-201-033 |
在本发明的一种要求的实施方案中,配体包含能从复杂混合物中选择性地结合真菌毒素的抗体。在这一实施方案中,配体可心地包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体,或其组合。另外,在这一实施方案中,复杂混合物可包括但不限于,坚果或坚果产品、谷类、干果、草本植物、香料、咖啡、可可、椰子、动物饲料、植物油、啤酒、水、生物学流体等。
在本发明另一要求的实施方案中,配体包含能从复杂混合物中选择性地结合叶酸、维生素B12(氰钴铵)或二者的抗体。在这一实施方案中,配体可心地包含单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体,或其组合。另外,在这一实施方案中,复杂混合物可包括但不限于,食物样品(例如,婴儿配方物、宠物饲料、运动饮料和维生素片剂)、生物学样品(例如,动物组织、生物学样品等)。
在本发明又一种实施方案中,配体包含天然***受体、重组***受体或其任何衍生物,重组蛋白和/或任何其它模仿能从复杂混合物中选择性地结合一种或多种内分泌干扰剂的受体生物活性部分的配体。术语“内分泌干扰剂”用来指一类被怀疑干扰人类和野生生物的内分泌***的化合物。“内分泌干扰剂”(亦称作“外源***”)干扰荷尔蒙平衡并在人和动物及其后代体内具有不利效应。公知的范例内分泌干扰剂包括但不限于,双酚A、雌酮、17-α-***、17-β-***、17-α-乙炔基***、烷基酚、二乙基己烯雌酚、甲氧滴滴涕、玉米赤霉烯酮、染料木黄酮、o,p′-DDT、p,p′-DDT和邻苯二甲酸丁基苄基酯。然而,有许多据信是未知的内分泌干扰剂,潜在地干扰人类和野生生物的正常内分泌***的机能。因此,本发明这一实施方案可能对于识别复杂混合物中一种或多种已知或未知内分泌干扰剂是有用的。在这一实施方案中,复杂混合物可包括但不限于,人和牛生物学流体(例如,血清和尿)、自来水、地下水、工艺水、环境样品(像一般地,土地、污泥、地表水,以及特殊地,包含可能的药物污染物的地表水)、工业化学制剂、由于化学品从包装材料泄漏而污染的食品,以及包装材料。
在这一实施方案中,配体可心地包含***受体。该***受体配体从复杂混合物中提取具有***活性的化合物,而同时对于混合物中不具有***活性的化合物又基本上没有亲和性。本文所使用的术语“具有***活性的化合物”指的是被定义为内分泌干扰剂的化合物(例如,干扰负责维持体内稳态和调节生长过程的体内天然荷尔蒙的生产、释放、运输、代谢、结合、作用和消除的外源试剂(Kavlock等,″Research needs for the risk assessment of health and environmentaleffects of endocrine disruptors:A report of the U.S.EPA-sponsoredworkshop.″
Environ.Health Perspect.104 Suppl 4:715-740(1996))并且描述于Endocrine Disruptor Knowledge Base(EDKB),可从以下FDA公众网站获得:
http://edkb.fda.gov。适用于本发明使用的***受体配体包括天然人***受体、重组人***受体(hER)或其衍生物、模拟***受体的生物活性部分的重组蛋白或其衍生物,或任何选择性识别对其生物学活性而言为内分泌干扰剂的化合物的配体。可心的是,***受体配体包含重组人***受体(hER)。
在本发明的另一种要求的实施方案中,配体包含能从复杂混合物中选择性地结合一种或多种类固醇激素的抗体。类固醇激素包括但不限于,***、雌酮、乙炔基***、睾酮和去***。在这一实施方案中,复杂混合物可包括但不限于,自来水、地下水、工艺水、环境样品(像一般地,土地、污泥、地表水,以及特殊地,包含可能的药物污染物的地表水)、药物制剂、人和动物生物学流体(例如,血清和尿),以及其它生物学样品(例如,动物组织、生物学样品等)。
本发明亲和柱可心地具有尽可能小的分析物俘获能力。给定亲和柱要求的分析物俘获能力可随多种因素变化,包括但不限于,分析物的含量和类型、现有试样大小、测定装置的灵敏度和检测极限等。就典型而言,本发明亲和柱能俘获最高约500皮可摩尔(pMol)给定分析物。可心的是,亲和柱能俘获约50pMol~约1000pMol给定分析物。
3.缓冲液
本发明亲和柱还可包含缓冲液,例如,图2所示范例第一缓冲液31。合适的第一缓冲液给亲和柱内的刚性载体材料提供贮存和/或使用亲和柱期间的非反应性保护介质。适合用于本发明的第一缓冲液包括但不限于,磷酸盐缓冲的盐水(PBS)缓冲液,或含有约0.02wt%叠氮化钠的PBS缓冲液。具体第一缓冲液包括但不限于,0.01M磷酸盐+0.15M NaCl缓冲液,pH值为约7.0。
典型地,第一缓冲液的pH值为约6.0-约8.0。可心地是,第一缓冲液的pH值为约6.8-约7.4。更可心的是,pH值为约7.0-约7.4,还更可心的是pH值为约7.0。
可心的是,第一缓冲液在装有如上所述刚性载体材料的亲和柱贮存期间包含含有约0.02wt%叠氮化钠的PBS缓冲液。亲和柱可心地贮存在约+4℃~约+8℃的PBS缓冲液中。另外,第一缓冲液可心地在装有刚性载体材料的亲和柱使用期间包含pH值为约7.0的PBS缓冲液。
B.分析柱
本发明仪器还可包含一种或多种分析柱,如图1所示范例分析柱12。每个分析柱可用于俘获存在于洗脱样品中的一种或多种分析物。任何市售供应的分析柱皆可与任何上面描述的仪器部件组合用于本发明。
合适的市售供应的分析柱包括但不限于,由Grace GmbH & Co.KG(Worms,德国)以商品名GENESIS和DENALITM售的分析柱,例如,GENESIS C8 e/c,具有各种不同尺寸,包括5μm,4.6×250mm;和5μm,4.6×150mm;GENESISC18,具有各种不同尺寸,包括4μm,4.6×250mm;和DENALITM C18,具有各种不同尺寸,包括5μm,4.6×150mm;由Grom Analytik+HPLC公司(Rottenburg-Hailfingen,德国)以商品名GROM-SiL销售的分析柱,例如,GROM-SiL ODS型柱,具有各种不同尺寸,包括5μm,4.6×150mm;和由Amersham Biosciences(Uppsala,瑞典)以商品名Mono S销售的阳离子交换柱,例如,Mono S hr5/5,具有各种不同尺寸,包括10μm,1mL。
在本发明的一种要求的实施方案中,分析柱连接到亲和柱上,从而使亲和柱与分析柱流体联通。在这一实施方案中,可心的是,由材料制成分析柱的管式结构并具有足以耐受较高管式结构内压力(即,最高约6000psi(400bar),更可心的是约3000psi(200bar)~约4500psi(300bar))的壁结构。合适的管式结构材料包括上面描述的用于形成本发明亲和柱的管式结构的材料。
就典型而言,该分析柱构成液相色谱装置如高压液相色谱(HPLC)装置的一部分。适合本发明使用的液相色谱设备包括但不限于以下市售供应的液相色谱设备,例如:Shimadzu(Columbia,MD),AgilentTechnologies(Wilmington,DE),Applied Biosystems(Fostercity,CA),Dionex Corporation(Sunnyvale,CA),Varian Inc.(Palo Alto,CA),和Waters Inc.(Milford,MA)。
C.检测器
本发明仪器还可包含一种或多种检测器,例如,在图1中所示范例检测器13。检测器可用于检测和定量化移动相样品中分析物的存在。任何市售供应的检测器皆可在本发明中与任何上面描述的仪器部件组合使用。
合适的市售供应的检测器包括但不限于,由Shimadzu Inc.(Columbia,MD)销售的紫外-可见光检测器,例如,系列SPD10 UV/Vis检测器,或者其它类型检测器,例如但不限于,荧光检测器、折光指数检测器、物质-选择性检测器和电化学检测器,这些都有市售供应,例如但不限于由以下公司获得:Agilent Technologies(Wilmington,DE),Applied Biosystems(Fostercity,CA),Dionex Corporation(Sunnyvale,CA),Varian Inc.(Palo Alto,CA),和Waters Inc.(Milford,MA)。可心的是,该检测器包含操作在约230nm~约400nm波长的紫外-可见光检测器。例如,以下范例波长可用于本发明:紫外-可见光,在230nm;紫外-可见光,在240nm(烯菌酮);和紫外-可见光,在361nm(维生素B12)。
D.偶联器
本发明仪器还可包含亲和柱与一个或多个分析柱之间的偶联器。任何传统上用于色谱法中的偶联材料皆可用于本发明。就典型而言,该偶联器包含由塑料、金属或玻璃管构成的低死体积连接。在亲和柱与分析柱流体联通的本发明实施方案中,偶联器由各种材料制成并且壁结构应足以耐受在偶联器内的相对高压(即,最高约6000psi(400bar),更可心地,约3000psi(200bar)~约4500psi(300bar))。
E.泵
本发明仪器还可包含一种或多种泵,例如,在图1中表示的范例第一泵14和第二泵15。每台泵提供穿过上面描述的仪器部件的流体流动。任何市售供应的泵皆可在本发明中与任何上面描述的仪器部件组合使用。
合适的市售供应的泵包括但不限于可获自以下的泵Shimadzu(Columbia,MD),Agilent Technologies(Wilmington,DE),Applied Biosystems(Fostercity,CA),Dionex Corporation(Sunnyvale,CA),Varian Inc.(Palo Alto,CA),和Waters Inc.(Milford,MA)。
可心的是,泵包含由Agilent Technologies(Wilmington,DE)以商品名1100系列销售的具有至少3通路的可编程低或高压力梯度泵,例如,四级(quaternary)1100型泵。
在本发明的一种要求的实施方案中,第一泵用于提供第一缓冲液和试样穿过亲和柱的流体流动,而第二泵则用于提供洗脱缓冲液和洗脱样品穿过分析柱的流体流动。
F.阀
本发明仪器还可包含一种或多种阀,例如,在图1中所示范例第一阀16和第二阀17。每个阀各自控制流体穿过上面描述的仪器部件的流动。任何市售供应的阀皆可在本发明中与任何上面描述的仪器部件组合使用。
合适的市售供应阀包括但不限于,由VICI Valco Instruments Co.,Inc.(Houston,TX)或VWR International Ltd.(Dorset,UK)销售的阀。可心的是,阀包含可编程2-位置6-路阀(这里称作可编程6-路阀),由VWR International Ltd.(Dorset,UK)以商品名RHEODYNE销售,例如,型号7725样品注入器。
在本发明的一种要求的实施方案中,采用第一可编程6-路阀控制第一缓冲液和/或试样穿过亲和柱的流体流动,并用第二可编程6-路阀控制洗脱缓冲液和洗脱样品穿过分析柱的流体流动。
II.制造仪器部件的方法
本发明还涉及制造上面描述的仪器部件的方法。刚性载体材料可,例如,按照上面的描述和下面的实施例制造。大致地,制造本发明刚性载体材料的方法包括以下步骤:
(1)对无机基材外表面实施改性以便减少非分析物材料在无机基材上的非特异、非选择性结合和/或吸附;和
(2)令一种或多种配体选择性地结合到无机基材表面。
如上所述,无机基材表面的改性步骤包括(i)令相对惰性的R基团固定到无机基材表面的至少一部分上,并任选地(ii)固定一种或多种连接基到无机基材表面的至少一部分上。固定相对惰性的R基团到无机基材表面的至少一部分上的步骤可发生在固定一种或多种连接基到无机基材表面的至少一部分上这一任选步骤之前或以后。令一种或多种配体选择性地结合到无机基材表面的步骤可包括(i)令受控数量的一种或多种配体直接结合到无机基材表面的反应活性部位上,或者(ii)令受控数量的一种或多种配体结合到从无机基材表面伸出的一种或多种连接基上。当受控数量的一种或多种配体直接结合到无机基材表面的反应活性部位上时,该一种或多种配体选择性地结合到无机基材表面的步骤可发生在将相对惰性的R基团固定到无机基材表面的至少一部分上这一步骤之前或以后。
在本发明的一种要求的实施方案中,制造刚性载体材料的方法包括以下步骤:
(1)令R基团固定到无机基材表面的至少第一部分上,其中R基团的反应活性小于固定步骤之前的无机基材表面上任何官能团的;
(2)令一种或多种连接基固定到无机基材表面的至少第二部分上;以及
(3)令一种或多种配体选择性地结合到一种或多种连接基上。
步骤(1)和(2)可按照任何顺序实施。可心的是,一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。更可心的是,一种或多种连接基包含氨基丙基三甲氧基硅烷与戊二醛的组合。
本发明亲和柱可采用以下步骤制备:
(1)密封管式结构的第一端;
(2)以刚性载体材料,例如,上面描述的刚性载体材料中的任何一种,至少部分地充填管式结构的柱腔;
(3)以第一缓冲液至少部分地填充管式结构的柱腔以包封刚性载体材料;并且,任选地,
(4)密封管式结构的另一端(即,第二端)。可贮存亲和柱以备将来使用,或者可随后将其连接到包含上面描述的仪器部件之一或全部的仪器上。
III.分析样品的方法
本发明进一步涉及分析潜在地包含一种或多种感兴趣的分析物的试样的方法。在本发明的一种范例实施方案中,该方法包括以下步骤:(a)将试样引入到包含刚性载体的亲和柱中,其中刚性载体包含大量无机金属氧化物颗粒,其中每个颗粒包含(i)金属氧化物基材;(ii)改性基材表面,该表面减少,在无机基材上,非分析物材料的非特异性结合(即,非标的分析物材料的非特异结合)和配体-特异性分析物材料的非特异性结合(即,标的分析物与由一种或多种配体提供的反应活性部位以外的其它反应活性部位的非特异性结合);以及(iii)结合在无机基材上的一种或多种配体。
本发明分析试样的方法可采用各种不同配体,包括但不限于,单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
该分析试样的方法还可包括以下步骤:(b)令试样接触刚性载体和其上的配体;(c)清洗掉刚性载体上的任何未结合到配体上的试样组分;(d)向亲和柱中引入洗脱液以便使洗脱液接触结合在刚性载体上的配体上的一种或多种分析物;(e)令洗脱液保持与刚性载体接触一段时间以便形成潜在地包含一种或多种分析物的洗脱样品;以及(f)分析分析柱的内容物以确定一种或多种分析物在试样中的存在。
图3~6画出在采用一种或多种上面描述的仪器部件分析试样的范例方法中的各个步骤。如图3~6所示,范例仪器40包含亲和柱41、分析柱42、检测器43、第一泵44、第二泵45、第一阀46、第二阀47、试样回路48、试样进口50、第一缓冲液进口51、洗脱缓冲液进口52、第一废液出口53和亲和柱废液出口54。在本发明这一实施方案中,亲和柱41和分析柱42彼此流体联通。另外,试样回路48被用来在试样与流经亲和柱41的第一缓冲液合并前暂时储存试样。
图3画出试样加载步骤期间的范例仪器40。试样被加载到试样进口50中。如图3所示,在此步骤期间,可编程6-路第一阀46处于“位置A”,而可编程6-路第二阀47处于“位置B”,这允许(i)试样从试样进口50流到试样回路48中,以及(ii)第一缓冲液流过亲和柱41。可能的试样可包含上面提到的复杂混合物中的分析物中的任何一种。可用于范例仪器40中的合适的第一缓冲液包括上面描述的第一缓冲液中的任何一种。
在单独的步骤中,试样如图4所示流过亲和柱41。在此步骤期间,可编程6-路第一阀46处于“位置B”而可编程6-路第二阀47处于“位置A”,这允许(i)试样与第一缓冲液从试样回路48流到并穿过亲和柱41,(ii)流体从试样进口50流到第一废液出口53,以及(iii)洗脱缓冲液从洗脱缓冲液进口52流过分析柱42,而不流过亲和柱41。
在此步骤期间,可以使用各种不同洗脱缓冲液。合适的洗脱缓冲液随着洗脱缓冲液穿过亲和柱41流动而有效地释放结合在刚性载体材料上的分析物。适合用于本发明的洗脱缓冲液包括但不限于,0.1M甘氨酸,pH2.5,5M NaCl,10mM磷酸盐,pH7.2,3.5M MgCl2,10mM磷酸盐,pH7.2,2~8M脲,2M盐酸胍,3~5M硫氰酸盐,10%二烷,50%乙二醇,含乙腈的水溶液,及其组合。具体洗脱缓冲液包括但不限于,35%(v/v)乙腈/65%(v/v)水洗脱缓冲液(例如,用于双酚A、17-α-***、17α-乙炔基***、睾酮和去***);10%(v/v)乙腈/90%(v/v)水洗脱缓冲液(例如,用于氯苯氧基乙酸除莠剂);0.01MHCl+0.15M NaCl缓冲液(例如,用于乳铁蛋白和维生素B12);以及10%(v/v)甲醇在0.01M HCl+0.15M NaCl中的洗脱缓冲液(例如,用于烯菌酮)。
在图5中所示另一单独的步骤中,洗脱缓冲液流过亲和柱41和分析柱42。在此步骤期间,可编程6-路第一阀46处于“位置B”,而可编程6-路第二阀47处于“位置B”,这允许(i)流体从第一缓冲液进口51流到亲和柱废液出口54,(ii)流体从试样进口50流到第一废液出口53,以及(iii)洗脱缓冲液从洗脱缓冲液进口52流经亲和柱41,然后直接到分析柱42中。
在图6所示的另一种分开的步骤中,移动相溶液流经分析柱42。在此步骤期间,可编程6-路第一阀46处于“位置B”,而可编程6-路第二阀47处于“位置A”,这允许(i)流体从第一缓冲液进口51经过亲和柱41流到亲和柱废液出口54,(ii)流体从试样进口50流到第一废液出口53,以及(iii)移动相溶液从洗脱缓冲液进口52经分析柱42到流检测器43。
各种不同移动相溶液可用于本发明。合适的移动相溶液随着移动相溶液穿过分析柱42流过而有效地释放被结合在分析柱42内的载体结构上的分析物。适合用于本发明的移动相溶液包括但不限于,含甲醇或乙腈的水溶液、盐酸溶液、甲醇/盐酸溶液、磷酸盐/氯化钠溶液、乙酸钠溶液、甲醇/乙酸钠溶液、乙腈/盐酸溶液和甲醇/盐酸/氯化钠溶液,及其组合。
适合用于本发明的具体移动相溶液包括但不限于,45%(v/v)乙腈/55%(v/v)水移动相溶液(例如,用于双酚A分析物);0.01M HCl移动相溶液(例如,用于氯苯氧基乙酸除莠剂分析物);60%(v/v)甲醇在0.01M HCl中的移动相溶液(例如,用于氯苯氧基乙酸除莠剂分析物);70%(v/v)乙腈/30%(v/v)水(例如,用于17-α-***,17-α-乙炔基***、睾酮和去***);0.10M磷酸盐+1.5M NaCl(pH7.0)移动相溶液(例如,用于乳铁蛋白);50mM乙酸钠(pH6.0)移动相溶液(例如,用于苯基脲除莠剂);55%(v/v)甲醇在50mM乙酸钠(pH6.0)中的移动相溶液(例如,用于苯基脲除莠剂);64%(v/v)乙腈在0.01M HCl中的移动相溶液(例如,用于烯菌酮);以及30%(v/v)甲醇/70%(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl移动相溶液(例如,用于维生素B12)。
在本发明的一种要求的实施方案中,分析样品的方法包括分析洗脱样品的方法,其中该方法包括将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定一种或多种分析物在洗脱样品中的存在的步骤。例如,该分析洗脱样品的方法可用于分析潜在地包含一种或多种选自以下分析物的样品:黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、双酚A、2,4-二氯苯氧基乙酸、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-***、17-α-乙炔基***、乳铁蛋白、睾酮、去***、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、叶酸、维生素B12(氰钴铵)、杀螟松、毒死蜱、嘧啶磷、肾上腺素、去肾上腺素、多巴胺,一种内分泌干扰剂(例如,具有***活性的化合物),及其组合。
在这一实施方案中,在分析洗脱样品的方法中,亲和柱与分析柱流体联通,该方法还可包括下列步骤之一或多步:
(1)向装有能耐受最高约200bar柱压力的刚性载体的亲和柱中引入试样,其中刚性载体上具有结合在其上的一种或多种配体,其中一种或多种配体能选择性地结合一种或多种分析物;
(2)令试样与刚性载体和其上的配体接触;
(3)清洗掉刚性载体上除一种或多种分析物以外的任何试样组分;
(4)将洗脱液引入到亲和柱中,以便使洗脱液接触结合在刚性载体上的配体上的一种或多种分析物;以及
(5)令洗脱液保持与刚性载体接触一段时间以便形成洗脱样品。就典型而言,洗脱液与刚性载体维持接触介于约5min~约15min的时间。
在分析洗脱样品的一种范例方法中,该方法包括分析潜在地包含真菌毒素的洗脱样品的方法。在这一范例实施方案中,该方法包含将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定至少一种真菌毒素在洗脱样品中的存在的步骤。洗脱样品可接受分析以确定黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2或其组合的存在。
在分析洗脱样品的另一种范例方法中,该方法包括分析潜在地包含叶酸、维生素B12(氰钴铵)或其组合的方法,其中该方法包含将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱的步骤,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及分析分析柱的内容物以确定叶酸、维生素B12(氰钴铵)或二者在洗脱样品中的存在的步骤。
本发明还涉及分析试样的方法,其中试样潜在地包含至少一种具有***活性的化合物。在这一实施方案中,该方法包含将试样引入到装有其上结合了一种或多种配体的刚性载体的亲和柱中,其中一种或多种配体能选择性地结合一种或多种具有***活性的化合物,例如天然人***受体、重组人***受体(hER)或其衍生物、模拟***受体的生物学活性部分的重组蛋白或其衍生物,或任何选择性识别对其生物学活性而言为内分泌干扰剂的化合物的配体。在一种要求的实施方案中,一种或多种配体包含重组人***受体(hER)。
分析潜在地包含至少一种具有***活性的化合物的试样的范例方法还可包括以下步骤之一或多步:
(1)令试样接触刚性载体和其上的配体;
(2)清洗掉刚性载体上不表现出***活性的任何试样组分;
(3)将洗脱液引入到亲和柱中,以便使洗脱液接触结合在刚性载体上的配体上的一种或多种具有***活性的化合物;
(4)令洗脱液保持与刚性载体接触一段时间以便形成含具有***活性的化合物的洗脱样品;以及
(5)分析分析柱的内容物以确定一种或多种具有***活性的化合物在洗脱样品中的存在。
在这一实施方案的一种要求的变体中,刚性载体能耐受最高约200bar的柱压,并且亲和柱与分析柱流体联通。
本发明亲和柱可反复使用。因此,上述范例方法中任何一种可进一步包括以下步骤之一或多步:
(1)以第一缓冲液冲洗亲和柱;以及
(2)向亲和柱中引入第二试样。
本发明已在上面做了描述并将在下面以实施例的方式做进一步说明,但这些实施例从任何意义上都不应被视为构成对本发明范围的限制。相反,应当清楚地理解,可以诉诸各种各样其它实施方案、修改及其等价物,本领域技术人员在研读了这里的描述以后自然明了,所有这些都不偏离本发明精神和/或所附权利要求的范围。
实施例1
包含单克隆抗-维生素B12抗体的刚性载体的制备
一种范例刚性载体按如下所述制备。500g甲苯和1.52g 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的溶液加入到1000mL圆底烧瓶中。100g预先在200℃烘烤过2h的具有800埃扩大的平均孔隙尺寸(平均颗粒尺寸介于约15~约20μ)的Grace Vydac二氧化硅被加入到圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于加热罩内并安装冷凝器。将加热罩固定在轨道摇动器顶部,后者将操作在115rpm速度下。在整个反应期间将N2通过圆底烧瓶和冷凝器以带走空气。
圆底***物料在沸腾(~110℃)下加热4h。样品经过滤并以2×100mL甲苯洗涤,在115℃干燥,随后在150℃烘烤2h。所获得的样品被贴上中间体A的标签。
-C3H6NH2基团在二氧化硅上的浓度是0.54,根据二氧化硅载体的表面面积(BET)(43m2/g),中间体的碳含量(LECO)(0.41%)计算。参见ASTM D5373(关于煤的)和ASTM 5291。
400mL 1M NaCl与中间体A在烧杯内进行混合并以磁搅拌子搅拌。初始pH值是4.79。滴加1M HCl直至pH达到2.0。将pH在2.0维持15min。随后,样品进行过滤并以5×100mL去离子水洗涤,在115℃干燥,随后在200℃烘烤2h。该样品被贴上中间体B的标签。
400g甲苯和48.78g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷与中间体B在圆底烧瓶中进行混合。将圆底烧瓶放在安装了冷凝器的加热罩内。将加热罩固定在操作在115rpm速度下的轨道摇动器顶部。在整个反应期间将N2通过圆底烧瓶和冷凝器以带走空气。样品在沸腾(~110℃)下加热24h,过滤并以3×100mL甲苯洗涤,在115℃干燥,随后在150℃烘烤2h。该样品被贴上中间体C的标签。
在下一个反应步骤中,20g中间体C被加入到80mL 0.1M盐酸中并沸腾4h。滤出二氧化硅并以60mL去离子水洗涤4次。该样品被贴上中间体D的标签。
20g中间体D和300mL偶联缓冲液(0.1M Na2PO4+0.15M NaCl;pH=7.0)在1000mL烧杯内进行混合并搅拌5min。样品进行过滤从而得到湿滤饼。随后,在烧杯中加入57.53g 50wt%戊二醛和2.89gNaCNBH3,随后加入中间体D的湿滤饼。样品搅拌4h,过滤,以400mL偶联缓冲液洗涤并在400mL偶联缓冲液内再调浆从而获得新样品,后者经过滤,以200mL偶联缓冲液洗涤并在200mL偶联缓冲液内再调浆2次。该再洗涤并再调浆的样品进行过滤,随后以400mL偶联缓冲液洗涤。该样品被贴上中间体E的标签。
1.5g偶联缓冲液和250μL单克隆抗-维生素B12抗体(产品号V9505,由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO销售)浓度为约10~15mg抗体每毫升)加入到10mL圆底烧瓶中。在该烧瓶中加入160mg NaCNBH3和1g中间体E并在摇动器上混合4h。样品过滤,并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。随后,在10mL圆底烧瓶中加入1.5g偶联缓冲液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺,随后在摇动器上混合4h。样品过滤并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。获得的刚性载体材料被置于含0.02%叠氮化钠的PBS缓冲液内并在4℃下储存。
实施例2
检测维生素B12的亲和柱的制备
一种范例亲和柱通过在4.6×50mm内径亲和柱中充填实施例1制备的刚性载体材料而制成。充填的柱随后灌注以含0.02wt%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。获得的范例亲和柱在4℃温度下储存。
实施例3
含维生素B12的组合物的分析
实施例2的范例亲和柱被偶联到类似于图3所示范例仪器40的仪器上。该仪器包含高效液相色谱(HPLC)(型号1100系列,AgilentTechnologies,Wilmington,DE)。利用配备了200μL样品回路的型号RHEODYNE 7725的样品注入器(VWR International Ltd.,Dorset,UK)进行注入。借助型号RHEODYNE 7725的样品注入器可将亲和柱从HPLC的在线组态(即,亲和柱与HPLC流体联通)转换到离线组态(即,亲和柱未与HPLC流体联通)。借助型号LC10AD高压液体泵(Shimadzu,Columbia,MD)使样品从样品注入器转移流过亲和柱。型号1100紫外-可见光检测器(Agilent Technologies,Wilmington,DE)在361nm检测到峰。
结合缓冲液,包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl;pH 7.0),被泵送通过亲和柱以使该柱达到平衡。总共使用了10个柱体积的结合缓冲液。
按如下所述制备含维生素B12的试样。将含有约1mg/g维生素B12并重0.1g试样的固体材料溶解在100mL结合缓冲液中形成混合物。该混合物利用0.22μm过滤器进行过滤。
在加载该试样之前,采取以下步骤:
(1)给RP-HPLC按下面的规定编程;
(2)所有缓冲液接受脱气处理并采用0.45μm过滤器进行过滤;
(3)给泵管充填适当的缓冲液,然后再将亲和柱和分析柱连接到仪器上,以防止空气带入到柱内;
(4)从柱上拆下端盖,将柱连接到仪器上;
(5)每个柱使用至少10个柱体积的结合缓冲液平衡或直至在流出液中检测不到信号;以及
(6)将试样加载到样品回路中。
采用以下色谱条件:
柱1 :抗-维生素B12免疫亲和柱
柱2 :GENESISC18,4μm,4.6×250mm
流率 :1ml/min
检测器 :紫外-可见光,361nm
结合缓冲液 :0.01M磷酸盐+0.15M NaCl,pH7.0
洗脱缓冲液 :0.01M HCl+0.15M NaCl
移动相 :30%(v/v)甲醇/70%(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl
将以下时间周期编程到仪器设定中:
时间(min) | 柱1 | 柱2 | %结合缓冲液 | %洗脱缓冲液 | %移动相 |
0~10 | 在线 | 离线 | 100 | 0 | 0 |
10.1~20 | 在线 | 在线 | 0 | 100 | 0 |
20.1~35.0 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 100 |
35.1 | 在线 | 在线 | 100 | 0 | 0 |
实施例4
含有单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体的刚性载体的制备
按如下所述制备范例刚性载体。1.5g偶联缓冲液和250μg单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体(产品号A9555,由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,)销售,浓度为约7.6mg抗体每毫升)加入到10mL圆底烧瓶中。在该烧瓶中加入160mg NaCNBH3和1g实施例1的中间体E并在摇动器上混合4h。样品过滤,并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。随后,在10mL圆底烧瓶中加入1.5g偶联缓冲液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺,随后在摇动器上混合4h。样品过滤并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。获得的刚性载体材料被置于含0.02%叠氮化钠的PBS缓冲液内并在4℃下储存。
实施例5
检测黄曲霉毒素B1的亲和柱的制备
一种范例亲和柱通过在4.6×50mm内径的亲和柱中充填实施例4制备的刚性载体材料而制成。充填的柱随后灌注以含0.02wt%叠氮化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)。获得的范例亲和柱在4℃温度下储存。
实施例6
含黄曲霉毒素的组合物的分析
实施例5的范例亲和柱被偶联到类似于图3所示范例仪器40的仪器上。该仪器包含配备了后柱型号为Cobra cell(Lamers & Pleuger′s,Hertogenbosch,NL)的高效液相色谱(HPLC)(型号1100系列,AgilentTechnologies(Wilmington,DE))。利用配备了500μL样品回路的型号RHEODYNE 7725的样品注入器(VWR International Ltd,Dorset,UK)进行注入。借助型号RHEODYNE 7725的样品注入器可将亲和柱切换到与HPLC的在线或离线。借助型号LC10AD高压液体泵(Shimadzu,Columbia,MD),使样品从样品注入器转移流过亲和柱。型号1100紫外-可见光检测器(Agilent Technologies,Wilmington,DE)在365nm和型号1046A可编程荧光检测器(Agilent Technologies,Wilmington,DE)在365/430nm检测到峰。
结合缓冲液,包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl;pH 7.0),被泵送通过亲和柱以使该柱达到平衡。总共使用了10个柱体积的结合缓冲液。
按如下所述制备含黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的试样。含有10~100ng/g黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2并重25g的固体材料被悬浮在100mL乙腈中。样品在超声波作用下提取15min。液体部分以6000rpm离心处理10min。100μL上层清液以900μL结合缓冲液进行稀释。
在加载试样之前,采取以下步骤:
(1)给RP-HPLC按下面的规定编程;
(2)所有缓冲液接受脱气处理并采用0.45μm过滤器进行过滤;
(3)给泵管充填适当的缓冲液,然后再将亲和柱和分析柱连接到仪器上,以防止空气带入到柱内;
(4)从柱上拆下端盖,将柱连接到仪器上;
(5)每个柱使用至少10个柱体积的结合缓冲液平衡或直至在流出液中检测不到信号;以及
(6)将试样加载到样品回路中。
采用以下色谱条件:
柱1 :抗-黄曲霉毒素B1免疫亲和柱
柱2 :GENESISC18,4μm,4.6×250mm
检测器1 :紫外-可见光,365nm
检测器2 :荧光检测器(365/430nm)
结合缓冲液 :0.01M磷酸盐+0.15M NaCl,pH7.0
流率 :0.5ml/min
洗脱缓冲液 :20%(v/v)乙腈水溶液
移动相 :600mL甲醇+80mL乙腈+200μL浓硝酸+50mg溴
化钾并以水调整到1000mL
流率 :0.8ml/min
将以下时间周期编程到仪器设定中:
时间(min) | 柱1 | 柱2 | %结合缓冲液 | %洗脱缓冲液 | %移动相 |
0-5 | 在线 | 离线 | 100 | 0 | 0 |
5-10 | 在线 | 离线 | 100 | 0 | 0 |
10-14.5 | 在线 | 在线 | 0 | 100 | 0 |
14.6-40 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 100 |
40.1-50.1 | 在线 | 在线 | 100 | 0 | 0 |
实施例7
含有重组人***受体(hER)作为活性配体的刚性载体的制备
按如下所述制备范例刚性载体。1.5g偶联缓冲液和50μg重组人***受体(产品号AB RP-310,由10P′s(Breda,NL)销售)加入到10mL圆底烧瓶中。在该烧瓶中加入160mg NaCNBH3和实施例1的1g中间体E并在摇动器上混合4h。样品过滤,并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。随后,在10mL圆底烧瓶中加入1.5g偶联缓冲液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺,随后在摇动器上混合4h。样品过滤并以10mL偶联缓冲液洗涤4次。获得的刚性载体材料被置于含0.02%叠氮化钠的PBS缓冲液内并在4℃下储存。
实施例8
检测内分泌干扰剂的亲和柱的制备
一种范例亲和柱通过在4.6mm×50mm内径的亲和柱中充填实施例7制备的刚性载体材料而制成。充填的柱随后灌注以含0.02wt%叠氮化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)。获得的范例亲和柱在4℃温度下储存。
实施例9
含内分泌干扰剂的组合物的分析
实施例8的范例亲和柱被偶联到类似于实施例3中使用的仪器的仪器上。结合缓冲液,包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl;pH 7.0),被泵送通过亲和柱以使该柱达到平衡。总共使用了10个柱体积的结合缓冲液。
按如下所述制备含17-β-***、17-α-***、17-α-乙炔基***、雌酮、双酚A、壬基酚和邻苯二甲酸丁基苄基酯的混合物的试样。含250~1000mg/l 17-β-***、17-α-***、17-α-乙炔基***、雌酮、双酚A、壬基酚和邻苯二甲酸丁基苄基酯的储备溶液在100mL结合缓冲液中稀释1000倍配成混合物。
在加载试样之前,采取以下步骤:
(1)给RP-HPLC按下面的规定编程;
(2)所有缓冲液接受脱气处理并采用0.45μm过滤器进行过滤;
(3)给泵管充填适当的缓冲液,然后再将亲和柱和分析柱连接到仪器上,以防止空气带入到柱内;
(4)从柱上拆下端盖,将柱连接到仪器上;
(5)每个柱使用至少10个柱体积的结合缓冲液平衡或直至在流出液中检测不到信号;以及
(6)将试样加载到样品回路中。
采用以下色谱条件:
柱1 :重组人***受体(hER)亲和柱
柱2 :GENESISC18,4μm,4.6×250mm
流率 :0.8ml/min
检测器 :紫外-可见光,230nm
结合缓冲液 :0.01M磷酸盐+0.15M NaCl,pH7.0
洗脱缓冲液 :25%(v/v)6M硫氰酸钾,50%(v/v)结合缓冲液,
25%(v/v)甲醇
移动相A :0.01N HCl水溶液
移动相B :乙腈
将以下时间周期编程到仪器设定中:
时间(min) | 柱1 | 柱2 | %结合缓冲液 | %洗脱缓冲液 | %移动相A | %移动相B |
0-5 | 在线 | 离线 | 100 | 0 | 0 | 0 |
5.1-10 | 在线 | 在线 | 0 | 100 | 0 | 0 |
10.1-20.1 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 100 | 0 |
20.1-35.0 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 65 | 45 |
50.0 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 0 | 100 |
50.1-55 | 离线 | 在线 | 0 | 0 | 0 | 100 |
55.1-65.1 | 在线 | 在线 | 100 | 0 | 0 |
虽然以结合本发明具体实施方案对本发明做了描述,但本领域技术人员在研读了上面的内容以后可以轻易地想到对于这些实施方案的替代、变换和等价方案。因此,本发明的范围应按照所附权利要求及其任何等价物的范围来评估。
Claims (98)
1.一种包含与分析柱流体联通的亲和柱的仪器,其中亲和柱包含刚性载体,它能耐受最高约200bar的柱压力,所述刚性载体具有一种或多种结合在其上的配体,所述一种或多种配体能选择性地结合到给定样品溶液内的一种或多种分析物上。
2.权利要求1的仪器,其中刚性载体包含大量无机颗粒。
3.权利要求2的仪器,其中每个无机颗粒包含(i)无机基材;(ii)改性基材表面,它减少不希望的材料与无机基材之间的非特异结合。
4.权利要求3的仪器,其中改性基材表面包含一个或多个固定在无机基材上的R10基团,其中每个R10基团独立地选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
5.权利要求4的仪器,其中每个R10基团包含-CH2OH。
6.权利要求1的仪器,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
7.权利要求1的仪器,其中一种或多种分析物包含黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、双酚A、2,4-二氯苯氧基乙酸、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-***、17-α-乙炔基***、乳铁蛋白、睾酮、去***、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、叶酸、维生素B12(氰钴铵)、杀螟松、毒死蜱、嘧啶磷、肾上腺素、去肾上腺素、多巴胺、具有***活性的化合物,或其组合。
8.权利要求1的仪器,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体,或其组合。
9.权利要求1的仪器,其中一种或多种配体包含单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体,或其组合。
10.权利要求1的仪器,其中一种或多种配体包含重组人***受体(hER)。
11.权利要求1的仪器,其中亲和柱通过管式偶联器连接到分析柱上。
12.权利要求1的仪器,其中分析柱构成反相高效液相色谱(RP-HPLC)装置的一部分。
13.权利要求12的仪器,还包含荧光检测装置。
14.权利要求1的仪器,其中刚性载体包含大量硅胶颗粒。
15.权利要求14的仪器,其中硅胶颗粒具有球体的形状和介于约500埃~800埃的平均孔隙尺寸。
16.一种适用于亲和柱的刚性载体,所述刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含:
无机基材;
改性基材表面,它减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料在无机基材上的非特异结合;以及
结合在无机基材上的一种或多种配体,其中该一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
17.权利要求16的刚性载体,其中改性基材表面包含一个或多个固定在无机基材上的R10基团,其中每个R10基团独立地选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
18.权利要求17的刚性载体,其中一个或多个R10基团是通过二价部分-X-固定在无机基材上的。
19.权利要求16的刚性载体,其中一种或多种配体通过一种或多种在无机基材上的反应活性部位与一种或多种配体上的官能团之间形成连接的连接基固定到无机基材上。
20.权利要求19的刚性载体,其中一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。
21.权利要求20的刚性载体,其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷,而二醛则包含戊二醛。
22.权利要求16的刚性载体,其中一种或多种配体直接固定在无机基材的反应活性部位上。
23.权利要求16的刚性载体,其中改性基材表面包含反应活性部位,其中约50%~约99%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约1%~约50%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
24.权利要求23的刚性载体,其中约70%~约95%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约5%~约30%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
25.权利要求16的刚性载体,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体,或其组合。
26.权利要求16的刚性载体,其中一种或多种配体包含单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体,或其组合。
27.权利要求16的刚性载体,其中一种或多种配体包含重组人***受体(hER)。
28.权利要求16的刚性载体,其中刚性载体包含大量硅胶颗粒。
29.权利要求28的刚性载体,其中硅胶颗粒具有球体的形状和介于约500埃~约800埃的平均孔隙尺寸。
30.一种亲和柱,包含权利要求16~29中任何一项的刚性载体。
31.一种仪器,包含与分析柱流体联通的亲和柱,其中亲和柱包含权利要求30的亲和柱。
32.一种亲和柱,包含:
具有一定柱体积的柱结构;以及
位于柱结构的柱体积内的刚性载体,所述刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含:
无机基材;
改性基材表面,它减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料与无机基材之间的非特异结合;以及
结合在无机基材上的一种或多种配体,其中该一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER)及其组合。
33.权利要求32的亲和柱,其中改性基材表面包含一个或多个固定在无机基材上的R10基团,其中每个R10基团独立地选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
34.权利要求33的亲和柱,其中一个或多个R10基团是通过二价部分-X-固定在无机基材上的。
35.权利要求32的亲和柱,其中一种或多种配体通过一种或多种在无机基材上的反应活性部位与一种或多种配体上的官能团之间形成连接的连接基固定到无机基材上。
36.权利要求35的亲和柱,其中一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。
37.权利要求36的亲和柱,其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷,而二醛则包含戊二醛。
38.权利要求32的亲和柱,其中一种或多种配体直接固定在无机基材的反应活性部位上。
39.权利要求32的亲和柱,其中改性基材表面包含反应活性部位,其中约50%~约99%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约50%~约1%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
40.权利要求39的亲和柱,其中约70%~约95%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约30%~约5%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
41.权利要求32的亲和柱,其中一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素g1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体,或其组合。
42.权利要求32的亲和柱,其中一种或多种配体包含单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体,或其组合。
43.权利要求32的亲和柱,其中一种或多种配体包含重组人***受体(hER)。
44.权利要求32的亲和柱,其中刚性载体包含大量硅胶颗粒。
45.权利要求44的亲和柱,其中硅胶颗粒具有球体的形状和介于约500埃~约800埃的平均孔隙尺寸。
46.一种仪器,包含与分析柱流体联通的亲和柱,其中亲和柱包含权利要求30和32~45中任何一项的亲和柱。
47.一种分析试样的方法,所述方法包括以下步骤:
令试样与权利要求1~46中任何一项的仪器、刚性载体或亲和柱接触。
48.一种分析洗脱样品的方法,所述方法包括以下步骤:
将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及
分析分析柱的内容物以确定一种或多种分析物在洗脱样品中的存在。
49.权利要求48的方法,其中洗脱样品包含一种或多种在溶剂中的分析物,所述一种或多种分析物选自黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、双酚A、2,4-二氯苯氧基乙酸、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-***、17-α-乙炔基***、乳铁蛋白、睾酮、去***、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、叶酸、维生素B12(氰钴铵)、杀螟松、毒死蜱、嘧啶磷、肾上腺素、去肾上腺素、多巴胺、具有***活性的化合物,或其组合。
50.权利要求49的方法,其中洗脱样品包含可检测数量的至少一种真菌毒素。
51.权利要求49的方法,其中洗脱样品包含可检测数量的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2或其组合。
52.权利要求49的方法,其中洗脱样品包含可检测数量的叶酸、维生素B12(氰钴铵),或其组合。
53.权利要求49的方法,其中洗脱样品包含可检测数量的至少一种具有***活性的化合物。
54.权利要求48的方法,其中转移步骤包括对洗脱样品施加流体压力以便将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱。
55.权利要求54的方法,其中流体压力是通过泵施加的。
56.权利要求48的方法,其中分析步骤包括检测一种或多种分析物在洗脱样品中的存在,将一种或多种分析物彼此分离,在洗脱样品中定量化一种或多种分析物,或其任意组合。
57.权利要求56的方法,其中分析步骤包括对洗脱样品实施反相高效液相色谱(RP-HPLC)、荧光检测或这两种处理。
58.权利要求48~57中任何一项的方法,其中亲和柱包含能耐受最高约300bar的柱压的刚性载体,所述刚性载体具有一种或多种结合在其上的配体,所述一种或多种配体能选择性地结合试样内的一种或多种分析物。
59.权利要求58的方法,其中刚性载体包含大量无机颗粒。
60.权利要求59的方法,其中每个无机颗粒包含无机基材;和减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料对无机基材的非特异结合的改性基材表面。
61.权利要求60的方法,其中改性基材表面包含一个或多个固定在无机基材上的R10基团,其中每个R10基团独立地选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
62.权利要求61的方法,其中每个R10基团包含-CH2OH。
63.权利要求61的方法,其中一个或多个R10基团是通过二价部分-X-固定在无机基材上的。
64.权利要求58的方法,其中一种或多种配体通过一种或多种在无机基材上的反应活性部位与一种或多种配体上的官能团之间形成连接的连接基固定到无机基材上。
65.权利要求64的方法,其中一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。
66.权利要求65的方法,其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷,而二醛则包含戊二醛。
67.权利要求58的方法,其中一种或多种配体直接固定在无机基材的反应活性部位上。
68.权利要求60的方法,其中改性基材表面包含反应活性部位,其中约50%~约99%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约50%~约1%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
69.权利要求68的方法,其中约70%~约95%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约30%~约5%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
70.权利要求59的方法,其中无机颗粒包含大量硅胶颗粒。
71.权利要求70的方法,其中硅胶颗粒具有球体的形状和介于约500埃~约800埃的平均孔隙尺寸。
72.权利要求48~71中任何一项的方法,还包括以下步骤:
将试样引入到包含能耐受最高约200bar柱压的刚性载体的亲和柱中,所述刚性载体具有一种或多种固定在其上的配体,所述一种或多种配体能选择性地结合一种或多种分析物;
令试样接触刚性载体和其上的配体;
清洗刚性载体以便洗掉任何除一种或多种分析物以外的试样组分;
将洗脱液引入到亲和柱中以便使洗脱液接触一种或多种结合在刚性载体上的配体上的分析物;以及
让洗脱液维持与刚性载体接触一段时间以便形成洗脱样品。
73.权利要求72的方法,其中该段时间介于约5分钟~约15分钟。
74.权利要求72的方法,还包括以下步骤:
以第一缓冲液冲洗亲和柱;以及
将第二试样引入到亲和柱中。
75.一种分析潜在地包含至少一种真菌毒素的洗脱样品的方法,所述方法包括以下步骤:
将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及
分析分析柱的内容物以确定至少一种真菌毒素在洗脱样品中的存在。
76.权利要求75的方法,其中洗脱样品包含可检测数量的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素Q1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2或其组合。
77.一种分析潜在地包含叶酸、维生素B12(氰钴铵)或其组合的洗脱样品的方法,其中该方法包含以下步骤:
将洗脱样品从亲和柱转移到分析柱,其中亲和柱与分析柱流体联通,以及
分析分析柱的内容物以确定叶酸、维生素B12(氰钴铵)或二者在洗脱样品中的存在。
78.一种分析潜在地包含至少一种具有***活性的化合物的试样的方法,所述方法包括以下步骤:
将试样引入到亲和柱中,该亲和柱包含刚性载体,后者具有结合在其上的一种或多种配体,所述一种或多种配体能选择性地结合到一种或多种具有***活性的化合物上。
79.权利要求78的方法,其中一种或多种配体包含天然人***受体、重组人***受体(hER)或其衍生物、模拟***受体或其衍生物的生物学活性部分的重组蛋白,或任何选择性识别作为内分泌干扰剂的具有生物活性的化合物的其它配体。
80.权利要求78的方法,其中一种或多种配体包含重组人***受体(hER)。
81.权利要求78的方法,还包括以下步骤:
令试样接触刚性载体和其上的配体;
清洗刚性载体以便洗掉任何未显示***活性的试样组分;
将洗脱液引入到亲和柱中以便使洗脱液接触一种或多种结合在刚性载体上的配体上的具有***活性的化合物;以及
让洗脱液维持与刚性载体接触一段时间以便形成包含具有***活性的化合物的洗脱样品;以及
分析分析柱的内容物以确定一种或多种具有***活性的化合物在洗脱样品中的存在。
82.权利要求81的方法,其中刚性载体能耐受最高约200bar的柱压,并且亲和柱与分析柱流体联通。
83.一种分析潜在地包含至少一种分析物的试样的方法,所述方法包括以下步骤:
向包含刚性载体的亲和柱中引入试样,所述刚性载体包含大量无机颗粒,其中每个颗粒包含:
无机基材;
改性基材表面,它减少非分析物材料和配体-特异性分析物材料与无机基材之间的非特异结合;以及
结合在无机基材上的一种或多种配体,其中该一种或多种配体包含单克隆抗-黄曲霉毒素B1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素Q1抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素B2抗体、单克隆抗-黄曲霉毒素G2抗体、单克隆抗-双酚A抗体、单克隆抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-2,4,5-三氯苯氧基乙酸抗体、单克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗体、单克隆抗-4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸抗体、单克隆抗-雌酮抗体、单克隆抗-17-β-***抗体、单克隆抗-17-α-乙炔基***抗体、单克隆抗-乳铁蛋白抗体、单克隆抗-睾酮抗体、单克隆抗-去***抗体、单克隆抗-苯基脲抗体、单克隆抗-烯菌酮抗体、单克隆抗-叶酸抗体、单克隆抗-维生素B12(氰钴铵)抗体、单克隆抗-杀螟松抗体、单克隆抗-毒死蜱抗体、单克隆抗-嘧啶磷抗体、抗-儿茶酚胺抗体、重组人***受体(hER),及其组合;
令试样接触刚性载体和其上的配体;
清洗刚性载体以便洗掉任何不结合配体的试样组分;
将洗脱液引入到亲和柱中以便使洗脱液接触一种或多种结合在刚性载体上的配体上的分析物;以及
让洗脱液维持与刚性载体接触一段时间以便形成潜在地包含一种或多种分析物的洗脱样品;以及
分析分析柱的内容物以确定一种或多种分析物在试样中的存在。
84.权利要求83的方法,其中改性基材表面包含一个或多个固定在无机基材上的R10基团,其中每个R10基团独立地选自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
85.权利要求84的方法,其中一个或多个R10基团是通过二价部分-X-固定在无机基材上的。
86.权利要求83的方法,其中一种或多种配体通过一种或多种在无机基材上的反应活性部位与一种或多种配体上的官能团之间形成连接的连接基固定到无机基材上。
87.权利要求86的方法,其中一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。
88.权利要求87的方法,其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷,而二醛则包含戊二醛。
89.权利要求83的方法,其中一种或多种配体直接固定在无机基材的反应活性部位上。
90.权利要求83的方法,其中改性基材表面包含反应活性部位,其中约50%~约99%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约50%~约1%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
91.权利要求90的方法,其中约70%~约95%反应活性部位覆盖以R基团,该基团的反应活性小于改性前基材表面上的任何官能团的,并且约30%~约5%反应活性部位覆盖以一种或多种配体或任选的连接基。
92.权利要求83的方法,其中无机颗粒包含大量硅胶颗粒。
93.权利要求92的方法,其中硅胶颗粒具有球体的形状和介于约500埃~约800埃的平均孔隙尺寸。
94.一种制造包含无机基材的刚性载体材料的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)令R基团固定到无机基材表面的至少第一部分上,其中R基团的反应活性小于固定步骤之前无机基材表面上的任何官能团的;
(2)令一种或多种连接基固定到无机基材表面的至少第二部分上,其中一种或多种连接基包含醛官能团;以及
(3)令一种或多种配体选择性地结合到一种或多种连接基上。
95.权利要求94的方法,其中步骤(2)在步骤(1)之前实施。
96.权利要求94的方法,其中一种或多种连接基包含氨基取代的硅氧烷与二醛的组合。
97.权利要求96的方法,其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷,而二醛则包含戊二醛。
98.一种制造亲和柱的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)密封管式结构的第一端;
(2)以权利要求16~29中任何一项的刚性载体材料或按照权利要求94~97中任何一项的方法成形的刚性载体材料,至少部分地充填管式结构的柱腔;
(3)以第一缓冲液至少部分地填充管式结构的柱腔以包封刚性载体材料;并且,任选地,
(4)密封管式结构的另一端。
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