CN112946153B

CN112946153B - 一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法

Info

Publication number: CN112946153B
Application number: CN202110148047.2A
Authority: CN
Inventors: 董浩; 徐燕; 曾晓房; 白卫东; 赵晓娟; 杨娟; 于立梅; 曾永青; 何金银; 王远
Original assignee: Guangzhou Zhongquan Product Test Co ltd; Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Guangzhou Zhongquan Product Test Co ltd; Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112946153A

Abstract

本发明公开了一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法，包括如下步骤：(1)使用阴离子交换吸附剂PAX作为吸附材料，通过分散微固相萃取技术对食用油样品进行提取和净化；(2)对净化后的提取液采用C18色谱柱和甲醇‑0.05％氨水溶液通过浓度梯度和流速梯度洗脱分离，电喷雾离子源正负切换模式下电离，MS/MS多反应监测模式(MRM)测定；(3)内标法定量。本发明的方法适用于塑料桶装植物油中常见的3大类(真菌毒素类、双酚类、烷基酚类)7种污染物的同时测定，弥补了检测目标物单一的缺陷，具有检测限低、检测准确度高的优点。

Description

一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法

技术领域

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法。

背景技术

黄曲霉毒素是由真菌寄生曲霉和黄曲霉产生的代谢物，是真菌毒素的一种。黄曲霉毒素易污染多种农作物和食品，常存在于各种霉变的坚果特别是花生及其制品中。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素B1为毒性及致癌性最强的物质之一。世界各国对主要食品中黄曲霉毒素，尤其是黄曲霉毒素B1的含量规定了允许限量值。我国也明确规定了食品中真菌毒素的限量，其中规定花生及其制品中黄曲霉毒素B1的允许限量值为20μg/kg。因此，需要可靠灵敏的检测方法以保证食品安全。

双酚类化合物是生产聚碳酸酯等多种高分子材料的重要原料，被广泛应用于食品包装材料等工业生产中。4-壬基酚、辛基酚等烷基酚也被广泛应用于塑料工业的生产中，以改善塑料制品的性能。这两大类化合物均具有与***类似的作用，能扰乱人体内分泌，影响生殖与发育机能，并具有致畸、致癌和致突变等毒效应，而且易富集，不易降解，对人类健康和生态环境均有潜在的危害。欧盟和和我国对双酚A、双酚S和双酚F等的使用和限量均有严格规定，如与食品接触塑料制品中，双酚A和双酚S的迁移量应分别小于0.6mg/kg和0.05mg/kg。在花生油等食用植物油的加工生产中，难以避免的会使用一些塑料制品，若这些塑料制品含有壬基酚、双酚A等污染物，则在与植物油接触过程中有可能发生迁移，造成污染。国内外对塑料桶装植物油中这两类污染物的污染情况尚处于风险监测阶段，旨为进一步提出限值要求积累基础数据。因此，也需要建立可靠灵敏的检测方法。

目前，国内外对于植物油中黄曲霉毒素的检测方法研究较为成熟，对于双酚类化合物、烷基酚类化合物的检测方法研究则较为零散，但均是采用不同的前处理方法和不同的仪器检测条件分别进行检测，检测效率受限。鉴于液相色谱-串联质谱具有高选择性和高灵敏度等优点，食品中痕微量污染物的检测研究一般以液相色谱-串联质谱检测法为主流。前处理方法则有液液萃取、固相萃取净化、GPC净化等多种方式。但从高油食品中提取净化脂溶性较好的化合物，一直是检测研究的难点。

已报道的食用油中污染物的检测研究均为单一类别化合物的检测，尚未见真菌毒素、双酚和烷基酚3大类污染物的同时检测研究，因此，开展食用油中多类别污染物的高通量检测具有重要意义。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺陷和不足之处，本发明的目的在于提供一种塑料桶装植物油中3大类(真菌毒素类、双酚类、烷基酚类)污染物的同时检测方法，该检测方法利用PAX吸附分散微固相萃取结合超高效液相色谱串联三重四级杆质谱技术，可以快速、准确的同时测定和监测食用油中的多种污染物，回收率高、重现性好，能够满足痕量的分析要求。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法，包括如下步骤：

(1)样品提取和净化

使用阴离子交换吸附剂PAX作为吸附材料，通过分散微固相萃取技术对食用油样品进行提取和净化；

(2)液相色谱串联三重四级杆质谱测定

对步骤(1)净化后的提取液，采用C18色谱柱和甲醇-0.05％氨水溶液通过浓度梯度和流速梯度洗脱分离，电喷雾离子源正负切换模式下电离，MS/MS多反应监测模式(MRM)测定；

(3)内标法定量

用甲醇-水-甲酸混合溶液按梯度配制系列浓度混合标准工作溶液，其中均加入内标物，内标物为U-[¹³C₁₇]-黄曲霉毒素B1、双酚A-d₄、4-壬基酚-d₄；

在相同的上述色谱质谱条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品提取离子色谱图，各待测物以定量离子峰面积与对应的内标物定量离子峰面积比值为纵坐标，组分浓度与内标物浓度比值为横坐标，绘制标准工作曲线，进而通过标准曲线计算样品中待测物浓度。

优选地，步骤(2)所述液相色谱条件：

流动相浓度和流速梯度洗脱程序如下：

表1

流动相：A为甲醇，B为0.05％(v/v)氨水溶液。

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，50mm×2.1mm，1.7μm；或Phenomenex kinetex C18色谱柱，100mm×3.0mm，2.6μm；

柱温：30-35℃，进样量：5μL。

优选地，步骤(2)所述串联三重四级杆质谱条件：在0-1.5min，ESI正离子模式电离；在1.5-6min，ESI负离子模式电离；多反应监测(MRM)模式检测；毛细管电压均为1.0kV；离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气：氮气，800L/h；锥孔气：氮气，50L/h；碰撞气：高纯氩气，0.15mL/min；每个化合物选取2个丰度较高的二级质谱特征碎片离子作为定性和定量离子，内标物用于校正和定量。

优选地，所述污染物的质谱测定条件、定性定量离子以及对应的内标物如下：

表2

优选地，步骤(3)所述混合溶液中甲醇、水、甲酸的体积比为(48.0～49.9)：(48.0～49.9)：(0.2～1.0)。

优选地，步骤(3)所述按梯度配制系列浓度混合标准工作溶液，其中黄曲霉毒素B1的浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0μg/L，双酚A、双酚B、双酚F、双酚S、4-壬基酚和辛基酚的浓度为0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100μg/L，均加入内标物，使内标物浓度为10μg/L。

优选地，步骤(1)所述样品提取和净化：取植物油样品，加入同位素内标后，经正己烷分散，氨化甲醇水溶液提取，阴离子交换吸附剂PAX分散吸附，酸化甲醇洗脱，得到提取液。

更优选地，步骤(1)所述样品提取和净化：取食用油样品，加入正己烷和微量体积的同位素内标混合溶液，使内标物最终浓度为5-20μg/L，涡旋分散，然后加入甲醇-水-氨水混合溶液，涡旋萃取1-3min，2500-5000r/min离心3-5min，将下层的萃取液转移至含有40-60mg已预先活化的PAX的离心管中，涡旋吸附40-60s，10000-12000r/min离心2-5min，弃去上清液，加入甲醇-水-氨水混合溶液，10000-12000r/min离心2-5min，弃去上清液；然后，用甲酸-甲醇溶液洗脱，涡旋40-60s，10000-12000r/min离心2-5min，合并上清液，置于30-40℃水浴中缓慢氮吹浓缩至干，加入甲醇-水溶液，涡旋复溶，过0.22μm聚四氟乙烯真孔滤膜，得到提取液。

优选地，步骤(1)所述样品提取和净化中，第一次加入甲醇-水-氨水混合溶液的体积比为60:38:2；第二次加入甲醇-水-氨水混合溶液的体积比为80:18:2；甲酸甲醇溶液的体积比为2:98，甲醇-水溶液的体积比为50:50。

标准溶液配制：分别称取适量的各种待测物质标准品和同位素标准品(标准物质：黄曲霉毒素B1、双酚A、双酚B、双酚S、双酚F、4-壬基酚、辛基酚；内标物：U-[¹³C₁₇]-黄曲霉毒素B1、双酚A-d₄、4-壬基酚-d₄)，用甲醇配成质量浓度均为100mg/L的单标储备液，置于-20℃保存。使用前，采用甲醇将单标储备液稀释成所需浓度的混合标准溶液和混合同位素内标溶液。用甲醇-水-甲酸(49.8:49.8:0.4，v/v/v)混合溶液配制系列浓度混合标准工作溶液，其中含一定浓度的内标溶液。

本发明采用PAX吸附分散微固相萃取结合超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法同时检测食用油中的7种污染物，与现有检测技术相比，具有如下有益效果：

(1)针对食用油的样品基质，本发明首次使用阴离子交换吸附剂(PAX)作为吸附材料，通过分散微固相萃取技术，可快速、高效提取样品中的黄曲霉毒素B1、双酚A、双酚B、双酚S、双酚F、4-壬基酚、辛基酚，方法简单可靠，提取得到的目标物回收率高，能够满足痕量分析要求。

(2)针对目前食品中真菌毒素类、双酚类、烷基酚类污染物检测的各自为战、检测方法不统一的缺陷，本发明首次将这三大类污染物统一处理，建立了可同时测定食用油中3大类7种污染物的检测方法，弥补了检测目标物单一的缺陷，有效的提高了食用油中污染物的检测效率，本方法检测限低、检测准确度高、对于食用油中7种污染物的定量限可达0.2-1.0μg/kg。

附图说明

图1为阳性样品中黄曲霉毒素B1和4-壬基酚的提取离子色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例：塑料桶装花生油中黄曲霉毒素B1等7种污染物的同时测定，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：塑料桶装花生油中黄曲霉毒素B1等7种污染物的同时测定

(1)样品提取和净化条件

称取1.0g花生油样品，加入3mL正己烷和微量体积的同位素内标混合溶液(使内标物最终浓度为10μg/L)，涡旋分散，然后加入1mL甲醇-水-氨水(60:38:2，v/v/v)混合溶液，涡旋萃取3min，3000r/min离心5min，用1mL注射器将下层的萃取液转移至2mL含有50mg PAX(已预先活化)的离心管中，涡旋吸附40s，12000r/min离心5min，弃去上清液，加入1mL甲醇-水-氨水(80:18:2，v/v/v)溶液，12000r/min离心2min，弃去上清液。然后，用2mL甲酸甲醇(2:98，v/v)分2次洗脱，每次1mL，涡旋50s，12000r/min离心2min，合并上清液，置于35℃水浴中缓慢氮吹浓缩至干，加入1.0mL甲醇-水(50:50，v/v)，涡旋复溶，过0.22μm聚四氟乙烯真孔滤膜，滤液待超高效液相色谱串联质谱测定。

(2)色谱分离与质谱检测条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)。

流动相：A为甲醇，B为0.05％(v/v)氨水溶液。

柱温：35℃。

进样量：5μL。

浓度和流速梯度洗脱程序见表1。

在0-1.5min，ESI正离子模式电离；在1.5-6min，ESI负离子模式电离；多反应监测(MRM)模式检测；

毛细管电压均为1.0kV；离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气：氮气，800L/h；锥孔气：氮气，50L/h；碰撞气：高纯氩气，0.15mL/min。

每个化合物选取2个丰度较高的二级质谱特征碎片离子作为定性和定量离子，内标物用于校正和定量。7种污染物的质谱测定条件、定性定量离子以及对应的内标物见表2。

(3)内标法定量

按梯度配制系列标准物质溶液，其中黄曲霉毒素B1的浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0μg/L，双酚A、双酚B、双酚F、双酚S、4-壬基酚和辛基酚的浓度为0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100μg/L，均加入一定量内标物，使内标物浓度为10μg/L，在相同的上述色谱质谱条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品提取离子色谱图，各待测物以定量离子峰面积与对应的内标物定量离子峰面积比值为纵坐标，组分浓度与内标物浓度比值为横坐标，绘制标准工作曲线，进而通过标准曲线推算样品中待测物浓度。

(4)选择性和确定性

取阴性花生油样品15个，按本发明的样品前处理方法和仪器条件进行检测，考察样品中其他组分对待测物的测定是否存在干扰。结果表明，由于三重四极杆质谱具有高选择性，试样溶液中的共存物质对待测物的定性定量无干扰。

(5)线性关系、检出限和基质效应

7种待测物的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应见表3。可见，各待测目标物在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。检出限为0.06-0.3μg/L之间，定量限为0.2-1.0μg/kg之间，基质效应在0.88-1.11之间。

表3花生油样品测定的线性关系、检出限和基质效应

(6)方法回收率、准确度和精密度

方法回收率、准确度和精密度通过阴性样品的添加回收试验(n＝6)进行考察。即分别在阴性花生油样品中添加3个浓度水平的混合标准溶液，按本发明的条件进行样品处理和测定，平行6次试验，取中间添加浓度连续测定5天，计算回收率、日内精密度(n＝6)和日间精密度(n＝5)，结果见表4。可见，在3个加标浓度下，日内回收率为81.1％-111.4％，日内精密度(n＝6)在3.1％-9.4％之间；日间平均回收率为87.4％-106.5％，日间精密度(n＝5)为7.3％-13.0％。表明本发明的方法具有较满意的回收率，良好的准确度和精密度。

表4花生油样品测定的回收率和精密度结果

实施例2实际花生油样品的检测

使用本发明实施例1的方法测定了36份市售塑料桶装花生油样品，有27个样品检测出黄曲霉毒素B1，含量在0.6-78.2μg/kg之间，有8个样品黄曲霉毒素B1含量超过国标规定的限量值20μg/kg；有7个样品检出4-壬基酚，含量在11.2-80.4μg/kg之间。阳性样品的提取离子色谱图见图1。

Claims

1.一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品提取和净化

使用阴离子交换吸附剂PAX作为吸附材料，通过分散微固相萃取技术对食用油样品进行提取和净化；所述样品提取和净化：取植物油样品，加入同位素内标后，经正己烷分散，氨化甲醇水溶液提取，阴离子交换吸附剂PAX分散吸附，酸化甲醇洗脱，得到提取液；

(2)液相色谱串联三重四级杆质谱测定

对步骤(1)净化后的提取液，采用C18色谱柱和甲醇-0.05％氨水溶液通过浓度梯度和流速梯度洗脱分离，电喷雾离子源正负切换模式下电离，MS/MS多反应监测模式测定；所述C18色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱或Phenomenex kinetex C18色谱柱；

(3)内标法定量

在相同的色谱质谱条件下，等体积准确进样，采集不同浓度的标准品提取离子色谱图，各待测物以定量离子峰面积与对应的内标物定量离子峰面积比值为纵坐标，组分浓度与内标物浓度比值为横坐标，绘制标准工作曲线，进而通过标准曲线计算样品中待测物浓度；

步骤(2)所述液相色谱条件：

流动相浓度和流速梯度洗脱程序如下：

流动相：A为甲醇，B为0.05％v/v氨水溶液；

所述污染物为黄曲霉毒素B1、双酚A、双酚B、双酚F、双酚S、4-壬基酚和辛基酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，50mm×2.1mm，1.7μm；或Phenomenexkinetex C18色谱柱，100mm×3.0mm，2.6μm；

柱温：30-35℃，进样量：5μL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述串联三重四级杆质谱条件：在0-1.5min，ESI正离子模式电离；在1.5-6min，ESI负离子模式电离；毛细管电压均为1.0kV；离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气：氮气，800L/h；锥孔气：氮气，50L/h；碰撞气：高纯氩气，0.15mL/min；每个化合物选取2个丰度较高的二级质谱特征碎片离子作为定性和定量离子，内标物用于校正和定量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述污染物的质谱测定条件、定性定量离子以及对应的内标物如下：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述混合溶液中甲醇、水、甲酸的体积比为(48.0～49.9)：(48.0～49.9)：(0.2～1.0)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述按梯度配制系列浓度混合标准工作溶液，其中黄曲霉毒素B1的浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0μg/L，双酚A、双酚B、双酚F、双酚S、4-壬基酚和辛基酚的浓度为0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100μg/L，均加入内标物，使内标物浓度为10μg/L。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品提取和净化：

取食用油样品，加入正己烷和微量体积的同位素内标混合溶液，使内标物最终浓度为5-20μg/L，涡旋分散，然后加入甲醇-水-氨水混合溶液，涡旋萃取1-3min，2500-5000r/min离心3-5min，将下层的萃取液转移至含有40-60mg已预先活化的PAX的离心管中，涡旋吸附40-60s，10000-12000r/min离心2-5min，弃去上清液，加入甲醇-水-氨水混合溶液，10000-12000r/min离心2-5min，弃去上清液；然后，用甲酸-甲醇溶液洗脱，涡旋40-60s，10000-12000r/min离心2-5min，合并上清液，置于30-40℃水浴中缓慢氮吹浓缩至干，加入甲醇-水溶液，涡旋复溶，过0.22μm聚四氟乙烯针孔滤膜，得到提取液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品提取和净化中，第一次加入甲醇-水-氨水混合溶液的体积比为60:38:2；第二次加入甲醇-水-氨水混合溶液的体积比为80:18:2；甲酸甲醇溶液的体积比为2:98，甲醇-水溶液的体积比为50:50。