CN103205409B - 一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，属于生物技术领域。该方法包括如下步骤：用特制营养液浸泡黑豆，将浸泡后的黑豆进行蒸煮，再接种纳豆菌进行发酵；该特制营养液包括如下成分：乳糖、胰蛋白胨、Na2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2。该方法还包括将发酵产物进行提取分离和冷冻干燥。采用该方法得到的纳豆激酶酶活高，达42500IU/g，比以黄豆为原料的传统发酵方法生产的纳豆激酶酶活高、氨味低、口感好；得到的发酵黑豆渣营养成分含量也有明显提高。该方法发酵周期短、制备工艺简单、生物利用度高，利于工业化生产。

Description

一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法。
背景技术
黑豆与黄豆均属于大豆，但黑豆在营养数量和质量上都具有优势。黑豆富含异黄酮和黄酮混合物、大量的食物纤维素、不饱和脂肪酸、丰富的蛋白质、多种矿物质和微量元素，特别是黑色种皮含有多种色素和皂甙以及独特的活性物质。另外黑豆中含有大量能降低恶性胆固醇的大豆球蛋白、亚油酸以及降低中性脂肪的亚麻酸等，这些有用成分具有软化血管、扩张血管、促进血液流通的作用，并且具有降血脂、预防心血管疾病、抗氧化、延缓衰老、增加胃肠蠕动等功效。黑豆在医药工业中是廉价的重要原料，自古就有“大豆数种，唯黑入药”的记载。从黑豆中提取的卵磷脂、大豆异黄酮、皂甙等活性物质可预防和治疗心血管疾病、高血压及癌症。
心脑血管疾病严重威胁着人类的身体健康，是现今仅次于癌症的第二大病症，全世界共有血栓病人1500万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品均在不同程度上存在一定的缺陷，或者毒性比较强、副作用大，或在体内半衰期较短、药效难以发挥，或来源紧缺、价格昂贵等，很难成为一种大众药品，而纳豆激酶却有望弥补这些缺陷。
由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广应用具有重要的意义。目前纳豆激酶的生产方式主要是以发酵为主。在发酵方式上有固体发酵和液体发酵，固体发酵具有原料普遍易得、成本低、设备简单、产酶活力高等优点。目前用固体发酵方法生产纳豆激酶多是用黄豆为原料进行发酵，存在酶活不高及氨臭味大等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，包括如下步骤：用特制营养液浸泡黑豆，将浸泡后的黑豆进行蒸煮，再接种纳豆菌进行发酵。
所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖5-15g/L、胰蛋白胨10-30g/L、Na2HPO4·12H2O 1-10g/L、NaH2PO4·2H2O 0.5-1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.1-1g/L、CaCl2 0.1-0.5g/L，pH 7.0-7.5。
优选的，所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖10g/L、胰蛋白胨20g/L、Na2HPO4·12H2O 5g/L、NaH2PO4·2H2O 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2 0.2g/L，pH 7.2。
所述的黑豆与特制营养液的质量体积比（g/mL）优选为1 : 3。
所述的浸泡优选为15-25℃浸泡16-20h。
所述的蒸煮优选为0.1MPa 、121℃蒸煮30-40min。
所述的接种优选为将蒸煮后的黑豆自然冷却至40-50℃后于无菌条件下按原料（黑豆）重量的10%接种纳豆菌种子液；所述的种子液是由斜面菌株经摇瓶培养制备；种子培养液及培养条件：以LB培养基为种子培养基，pH为7.2，三角瓶装液量为25mL/250mL，培养温度37℃，摇床转速为180r/min，培养周期为16h。
所述的纳豆菌为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 203078。
所述的发酵的条件优选为温度37-42℃，湿度75%-85%，物料厚度2-3cm，发酵时间为24h。
上述以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，还包括提取分离和冷冻干燥步骤。
所述的提取分离包括浸提、沉淀、柱层析步骤，具体如下：
（1）浸提：按质量体积比（g/mL）1 : 1 的比例往发酵后的产物加入生理盐水于4℃浸提12-24h，再于4℃、8000 r/min离心15min，所得上清为发酵粗酶液；
（2）沉淀：粗酶液用饱和度为25%和65%的硫酸铵于0℃进行分级沉淀，于4℃、10000r/min 离心30min，收集沉淀，将沉淀用10mM pH7.5的PBS溶解后透析除盐后备用；
（3）柱层析：将透析酶液上CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱，然后用200mL含0～0.5 mol/L NaCl的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，控制流速为0.5mL/min，收集洗脱的酶溶液。
所述的冷冻干燥为：将收集到的酶溶液于-80℃冻结，然后放入真空冷冻干燥机中，于真空度为10 Pa、冷阱温度-50℃的条件下干燥24h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明得到的纳豆激酶的酶活高，提取分离后的酶活稳定在42500IU/g左右，酶活比现有报道的用大豆为原料固体发酵生产的纳豆激酶的酶活高。
（2）本发明得到的纳豆激酶氨臭味低、口感好，更易被人们所接受。
（3）本发明得到的发酵黑豆渣可用于生产黑豆食品或保健品，其中的营养成分如小分子多肽、游离氨基酸、可溶性糖、维生素、异黄酮等的含量都比发酵前有明显提高，有助于提高免疫力、延缓衰老、抗肿瘤等功效。这充分利用了生产纳豆激酶时的“废弃物”，提高了原料的利用率，增加了经济附加值。
（4）本发明发酵周期短、产物营养更丰富，采用硫酸铵分级沉淀和柱层析方法分离提纯纳豆激酶，工艺简便成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以黑豆为原料制备纳豆激酶的特制营养液，其成分为：乳糖10g/L、胰蛋白胨20g/L、Na2HPO4·12H2O 5g/L、NaH2PO4·2H2O 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2 0.2g/L，pH7.2。
纳豆激酶酶活的测定方法参照Astrup法制备琼脂糖纤维蛋白平板，将不同浓度的尿激酶标准品（20、40、80、160、620、640IU/mL）点样于新配制的平板上，置于37℃培养18h，测定溶纤圈的垂直直径，计算溶纤圈面积，制作标准曲线。取分离的纳豆激酶10μL点纤维蛋白平板，置37℃培养18h，计算溶纤圈面积，利用尿激酶标准曲线求得相应的酶活。
实施例1
（1）Bacillus subtilis QK02种子液的培养
种子液是由斜面菌株经摇瓶培养制备。培养条件为：以LB培养基为种子培养基，pH为7.2，三角瓶装液量为25mL/250mL，培养温度37℃，摇床转速为180r/min，培养周期为16h。
（2）固体发酵
取10kg籽粒饱满的黑豆进行除杂清洗后，加入30L上述营养液浸泡16h；将浸泡过的黑豆沥干液体后放入蒸煮设备中于0.1MPa 、121℃蒸煮40min；自然冷却至50℃后于无菌条件下按黑豆重量的10%接种Bacillus subtilis QK02种子液，然后于发酵设备中进行发酵，控制物料厚度为3cm，温度为37℃，湿度为75%，发酵时间为24h。
（3）提取分离
浸提：按质量体积比（g/mL）1: 1的比例往发酵后的产物加入生理盐水于4℃浸提20h，再于4℃、8000 r/min离心15min，所得上清即为发酵粗酶液，测得该粗酶液的酶活为2262IU/mL；
沉淀：粗酶液用饱和度为25%和65%的硫酸铵于0℃进行分级沉淀，于4℃、10000r/min 离心30min，收集沉淀，再将沉淀用10mM pH7.5的PBS溶解进行透析除盐；
柱层析：将上述透析酶液上CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱，然后用200mL含0～0.5 mol/L NaCl的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，控制流速为0.5mL/min，收集洗脱的酶溶液。
（4）冷冻干燥
将收集到的酶溶液置于-80℃超低温冰箱中冻结，然后放入预冷的真空冷冻干燥机中，于真空度为10 Pa，冷阱温度-50℃的条件下干燥24h，即得纳豆激酶冻干粉，测得该冻干粉的酶活为42500IU/g。
    按照实施例1的方法，用水代替特制营养液，得到的粗酶液和纳豆激酶冻干粉的活性分别为716 IU/mL和26900 IU/g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于包括如下步骤：用特制营养液浸泡黑豆，将浸泡后的黑豆进行蒸煮，再接种纳豆菌进行发酵；
所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖5-15g/L、胰蛋白胨10-30g/L、Na2HPO4·12H2O 1-10g/L、NaH2PO4·2H2O 0.5-1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.1-1g/L、CaCl2 0.1-0.5g/L，pH 7.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖10g/L、胰蛋白胨20g/L、Na2HPO4·12H2O 5g/L、NaH2PO4·2H2O 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2 0.2g/L，pH 7.2。
3.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的黑豆与特制营养液的质量体积比为1 : 3；所述的浸泡为15-25℃浸泡16-20h。
4.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的蒸煮为0.1MPa 、121℃蒸煮30-40min。
5.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的接种为将蒸煮后的黑豆自然冷却至40-50℃后于无菌条件下按黑豆重量的10%接种纳豆菌种子液。
6.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的纳豆菌为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 203078。
7.根据权利要求1所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的发酵的条件为温度37-42℃，湿度75%-85%，物料厚度2-3cm，发酵时间为24h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于还包括提取分离和冷冻干燥步骤。
9.根据权利要求8所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的提取分离包括浸提、沉淀、柱层析步骤；其中，浸提为用生理盐水于4℃浸提12-24h；沉淀为用饱和度为25%和65%的硫酸铵进行分级沉淀；柱层析填料用CM-Sepharose Fast Flow。
10.根据权利要求8所述的以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，其特征在于：所述的冷冻干燥的条件为真空度10 Pa、冷阱温度-50℃、干燥时间24h。
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