CN105941899A - 一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法 - Google Patents

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刘伟
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Abstract

本发明公开了一种以凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌的混合微生物发酵，来生产饲用微生态制剂替代抗生素物的生产方法。属于微生物发酵技术领域。方法包括(1)凝结芽孢杆菌的种子液培养；(2)凝结芽孢杆菌的有氧固体发酵；(3)植物乳杆菌的种子液培养；(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵等步骤、工艺。本发明利用在生产凝结芽孢杆菌的同时生产植物乳杆菌，而且采用不灭菌的生料混合发酵方法，显著降低了产品的生产成本，可推动该产品在畜禽、水产等饲料中的应用。

Description

一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及以凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌的一种混合微生物发酵，来生产饲用微生态制剂替代抗生素物的生产方法。
技术背景
抗生素在畜禽上的广泛使用，使养殖场能够限制牲畜的饲养空间和活动,同时保持动物处于最佳健康状态，抗生素的应用促进了畜牧业的发展，让更多人以低廉的价格购买更多的肉制品。就畜禽养殖业而言,长期或超标滥用抗生素,尤其是把抗生素作为饲料添加剂所带来的危害也日益凸显。欧盟、日本和韩国分别于2006年和2008年禁止在饲料中使用抗生素，美国已计划在2017年禁止饲料中使用抗生素。我国虽没有明确提出禁止使用抗生素的时间表，但已开展了大量饲用抗生素替代品的研究与生产示范，近年来在抗生素替代品中饲用微生物制剂显示出良好的发展势头显示出良好的发展势头。
凝结芽孢杆菌是一种能产乳酸又能形成芽孢的益生菌，在有氧和厌氧的条件下均能生长。具有抗逆性强、耐高温高热、易贮藏等特性，能顺利通过胃酸和消化酶的双重作用进入肠道定殖。并在肠道迅速萌发生长成为营养体活菌并代谢产生乳酸，从而改善其肠道菌群平衡，能显著降低动物肠道中有害微生物的数量和腹泻率，能提高日增重、饲料转化率，因此，凝结芽孢杆菌在饲料工业中具有广泛的应用前景。
植物乳杆菌这一类的乳酸菌已证实具有改善动物肠道健康和提高免疫力的作用，其产的乳酸和乳酸菌素可以直接作用于病源细菌。被认为是理想的促生长替代抗生素的有益微生物，具有广阔的发展应用前景。
由于植物乳杆菌的营养条件要求苛刻，目前主要是以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖等物质为培养基，再添加一些生长刺激物。这些用来做培养基的物质其市场售价较麸皮、豆粕、玉米粉等普通农副产品贵出许多倍，用这些物质来生产植物乳杆菌，其成本对养殖行业作为饲料添加剂来说较高，在一定程度上阻碍了植物乳杆菌的生产与在养殖行业的推广、应用。
发明内容
本发明目的在于，提供一种以价格低廉、材料易得的农副产品为原料，辅以合理的发酵工艺，在生产凝结芽孢杆菌的同时，以较低成本混合生产植物乳杆菌的方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。
一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法，该方法按以下步骤进行：
(1)凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans菌株编号ACCC00403)(本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的菌株编号为00403，从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进)液体种子培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,500ml三角瓶培养基装量为100ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养14～18h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为(g/L)：乳糖1,蛋白胨1,牛肉浸膏0.5,氯化钠0.5，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕，加豆粕重量0.6倍的水配制而成,将步骤(1)每瓶三角瓶液体种子按每瓶种子∶以固形物重量计的20～30公斤豆粕的比例接种，无需灭菌，装入曲盘至发酵物料厚度为5～7cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，备用；
(3)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum菌株编号ACCC11016)(本发明所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的菌株编号为11016，从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进)的种子液培养：在500ml三角瓶中装入300ml液体MRS培养基，接入植物乳杆菌菌种，经35～38℃培养12～14h后，于0～4℃保存，备用；所述MRS培养基为(g/L)：葡萄糖2,蛋白胨1,牛肉浸膏1,酵母浸膏0.5,磷酸氢二钾0.2,柠檬酸二铵0.2,乙酸钠0.5，吐温0.1,硫酸镁0.058,硫酸锰0.025,调pH为5.8～6.2，121℃灭菌15min；
(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵：混合固体发酵培养基为：脱脂米糠∶步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养物(按发酵前豆粕重量计)∶碳酸钙按重量份70～90∶10～30∶4～10比例配制而成，并按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的0.5～0.7倍加入自来水，无需灭菌，将步骤(3)的植物乳杆菌种子液，按该混合发酵培养基中脱脂米糠的重量的1％～3％接种，拌匀，直接转入塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养30～36h后停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
另一方面，本发明提供一种通过权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂在制备断奶仔猪饲料中来替代抗生素的用途。优选的，其中，所述的饲料由以下成分组成：玉米60.8％、豆粕15.0％、膨化大豆10.0％、鱼粉5.0％、乳清粉6.0％、磷酸氢钙1.2％、石粉0.6％、盐0.3％、赖氨酸0.1％、预混料1.0％，0.4的如权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂。
一方面，本发明提供一种断奶仔猪用复合饲料，其中，该饲料由如下成分组成：玉米60.8％、豆粕15.0％、膨化大豆10.0％、鱼粉5.0％、乳清粉6.0％、磷酸氢钙1.2％、石粉0.6％、盐0.3％、赖氨酸0.1％、预混料1.0％，0.4％的如权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂。
本发明的有益效果
1、本发明工艺先将凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌分别制备成种子后，再将它们按一定比例混合接种，进行混合固体发酵。当凝结芽孢杆菌进行发酵时，能产生一定量淀粉酶和蛋白酶，能将豆粕中的蛋白和脱脂米糠中的淀粉进行分解，生成氨基酸和单糖等小分子物质，这样植物乳杆菌就能利用的蛋白质和淀粉分解而成的氨基酸和单糖等小分子物质，为植物乳杆菌的高效生长繁殖能连续不断地提供所需营养物质；其次，凝结芽孢杆菌在生长和形成芽孢的同时产生蛋白酶、淀粉酶等生物活性物质，这些物质能与凝结芽孢杆菌芽孢、植物乳杆菌及其代谢产物同时作为添加剂加入饲料后，就更能促进畜禽的健康和加强肠道对营养物质的消化吸收，从而也提高了本发明混合发酵产品的应用优势。
2、本发明以豆粕、脱脂米糠等易得、廉价农副产品替代了以往如牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖等的发酵原料，在生产凝结芽孢杆菌的同时生产植物乳杆菌，而且采用不灭菌的生料混合发酵方法，显著降低了产品的生产成本，可推动该产品在畜禽、水产等饲料中的应用。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但其发明内容并不受这些内容所限止。
本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的菌株编号为00403，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株编号为11016均从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进。
实施例1：(一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法1)
本发明具体工艺如下：
(1)凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans菌株编号ACCC00403)的种子液培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,500ml三角瓶培养基装量为100ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养14～18h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为(g/L)：乳糖1,蛋白胨1,牛肉浸膏0.5,氯化钠0.5，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕，加豆粕重量0.6倍的水配制而成,将步骤(1)每瓶三角瓶液体种子按每瓶种子∶以固形物重量计的20公斤豆粕的比例接种，无需灭菌，装入曲盘至发酵物料厚度为5～7cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，备用；
(3)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum菌株编号ACCC11016)(本发明所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的菌株编号为11016，从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进)的种子液培养：在500ml三角瓶中装入300ml液体MRS培养基，接入植物乳杆菌菌种，经35～38℃培养12～14h后，于0～4℃保存，备用；所述MRS培养基为(g/L)：葡萄糖2,蛋白胨1,牛肉浸膏1,酵母浸膏0.5,磷酸氢二钾0.2,柠檬酸二铵0.2,乙酸钠0.5，吐温0.1,硫酸镁0.058,硫酸锰0.025,调pH为5.8～6.2，121℃灭菌15min；
(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵：混合固体发酵培养基为：脱脂米糠∶步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养物(按发酵前豆粕重量计)∶碳酸钙按重量份90∶10∶10比例配制而成，并按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的0.5倍加入自来水，无需灭菌，将步骤(3)的植物乳杆菌种子液，按该混合发酵培养基中脱脂米糠的重量的1％接种，拌匀，直接转入塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养30～36h后停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
实施例2：(一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法2)
本例中，步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕，加豆粕重量0.6的水比例配制而成,将步骤(1)每瓶三角瓶液体种子按每瓶种子∶以固形物重量计的25公斤豆粕的比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为5～7cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，备用；
步骤(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵：混合固体发酵培养基为：脱脂米糠∶步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养物(按发酵前豆粕重量计)∶碳酸钙按重量份80∶20∶7比例混合，并按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的0.6倍加入自来水，无需灭菌，将步骤(3)的植物乳杆菌种子液按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的2％接种，拌匀，直接转入塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养30～36h后停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
其余工艺、步骤同实施例1。
实施例3：(一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法3)
本例中，步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕，加豆粕重量0.6的水比例配制而成,将步骤(1)每瓶三角瓶液体种子按每瓶种子∶以固形物重量计的30公斤豆粕的比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为5～7cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，备用；
步骤(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵：混合固体发酵培养基为：脱脂米糠∶步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养物(按发酵前豆粕重量计)∶碳酸钙按重量份70∶30∶4比例混合，并按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的0.7倍加入水，无需灭菌，将步骤(3)的植物乳杆菌种子液按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的3％接种，拌匀，直接转入塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养30～36h后停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
其余工艺、步骤同实施例1。
实施例4(断奶仔猪喂养效果对比试验)
本例中采用的预混料：由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所生产并提供。选用35日龄断奶三元杂交仔猪120头，分为三个处理组，每组40头:
负对照组(不添加抗生素)、正对照组(抗生素组)和试验组(不加抗生素，添加本发明产品)。试验期间自由采食，自由饮水。计算试验起始平均体重、试验结束平均体重、平均日增重、平均日采食量、料肉比，每日观察记录腹泻情况，计算腹泻概率。
负对照组日粮配方为：玉米60.8％、豆粕15.0％、膨化大豆10.0％、鱼粉(秘鲁)5.0％、乳清粉6.0％、磷酸氢钙1.2％、石粉0.6％、盐0.3％、赖氨酸0.1％、预混料(一些微量元素、维生素，氨基酸，填充料载体混合物)1.0％(不加抗生素)。
正对照组(抗生素组)为负对照组日粮基础上添加抗生素(抗生素为黄霉素和金霉素)(400克/1000公斤的负对照日粮配)(先和匀混料混合，然后在和其它组分混合)。
试验组(添加本发明产品)日粮配方为负对照组日粮配方基础上添加0.4％实施例1的发酵产品，分别于添加后30天统计测定仔猪生长性能。结果见表1。
结果分析:本发明产品与不添加抗生素组相比，在增重和腹泻率方面有显著的改善，与使用抗生素组相比，防治腹泻率有所改善，在增重方面接近抗生素的水平。本发明产品能替代抗生素在断奶仔猪上应用。
表1：复合微生态制剂对断奶仔猪生产性能的影响(实施例子1)。
另外，按照以上方法，对试验组(添加本发明产品)日粮配方为负对照组日粮配方基础上添加0.4％实施例2或3的发酵产品，分别于添加后30天统计测定仔猪生长性能，结果也表明，实验组的平均日增重(kg/d)为523.14±134.91(实施例2)和521.14±134.91(实施例3)，腹泻分别为3.1和3.5％。
同样，当采用单独本发明的凝结芽孢杆菌发酵或者植物乳杆菌(即在实施例子1中把植物乳杆菌的量替换为凝结芽孢杆菌，或者把凝结芽孢杆菌的量替换为植物乳杆菌)的发酵产物进行如实施例子4同样的实验，使用的配方一致，获得的结果如下：当单独采用凝结芽孢杆菌发酵产物的时候，实验组的平均日增重(kg/d)为510.14±140.91，腹泻分别为6.2％；当单独采用植物乳杆菌发酵产物的时候，实验组的平均日增重(kg/d)为494.14±134.91，腹泻分别为5.1％。从而说明凝结芽孢杆菌发酵和植物乳杆菌混合发酵的产物，不仅可以想对提高平均日增重，而且降低腹泻率，进一步说明他们有相互协同增效作用。从而，二者最好一起配合使用，一起混合发酵可以发挥他们更好的替换抗生素的作用。

Claims (4)

1.一种断奶仔猪用复合微生态制剂的生产方法，该方法按以下步骤进行：
(1)保藏号为ACCC No.00403菌株的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)液体种子培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,500ml三角瓶培养基装量为100ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养14～18h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为(g/L)：乳糖1,蛋白胨1,牛肉浸膏0.5,氯化钠0.5，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕，加豆粕重量0.6倍的水配制而成,将步骤(1)每瓶三角瓶液体种子按每瓶种子∶以固形物重量计的20～30公斤豆粕的比例接种，无需灭菌，装入曲盘至发酵物料厚度为5～7cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，备用；
(3)保藏号为ACCC No.11016菌株的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的种子液培养：在500ml三角瓶中装入300ml液体MRS培养基，接入植物乳杆菌菌种，经35～38℃培养12～14h后，于0～4℃保存，备用；所述MRS培养基为(g/L)：葡萄糖2,蛋白胨1,牛肉浸膏1,酵母浸膏0.5,磷酸氢二钾0.2,柠檬酸二铵0.2,乙酸钠0.5，吐温0.1,硫酸镁0.058,硫酸锰0.025,调pH为5.8～6.2，121℃灭菌15min；
(4)凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌混合固体发酵：混合固体发酵培养基为：脱脂米糠∶步骤(2)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养物(按发酵前豆粕重量计)∶碳酸钙按重量份70～90∶10～30∶4～10 比例配制而成，并按该发酵培养基中脱脂米糠的重量的0.5～0.7倍加入自来水，无需灭菌，将步骤(3)的植物乳杆菌种子液，按该混合发酵培养基中脱脂米糠的重量的1％～3％接种，拌匀，直接转入塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养30～36h后停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
2.一种通过权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂在制备断奶仔猪饲料中来替代抗生素的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述的饲料由以下成分组成：玉米60.8％、豆粕15.0％、膨化大豆10.0％、鱼粉5.0％、乳清粉6.0％、磷酸氢钙1.2％、石粉0.6％、盐0.3％、赖氨酸0.1％、预混料1.0％，0.4的如权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂。
4.一种断奶仔猪用复合饲料，其中，该饲料由如下成分组成：玉米60.8％、豆粕15.0％、膨化大豆10.0％、鱼粉5.0％、乳清粉6.0％、磷酸氢钙1.2％、石粉0.6％、盐0.3％、赖氨酸0.1％、预混料1.0％，0.4％的如权利要求1所述方法生产的复合微生态制剂。
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