CN100344750C - 酵母拮抗菌的真空冷冻干燥制品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了酵母拮抗菌的真空冷冻干燥制品及其制备方法。该真空冷冻干燥制品的制备方法是，收集经培养24-48h的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)菌体，将其用保护剂制成浓度为(1-5)×108～(1-5)×109CFU/mL的菌悬液，孵育1-2h，再进行真空冷冻干燥后得到产品；所述保护剂为质量百分含量为5-10%的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、谷氨酸钠或脱脂奶粉水溶液。用本发明的方法制备的粘红酵母真空冷冻干燥制品具有较高的生物活性，活菌率可达100%。本发明制备工艺简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性，将在粘红酵母及其它微生物的保藏及其相关产品的制备中发挥巨大作用。
Description
技术领域
本发明涉及酵母拮抗菌的真空冷冻干燥制品及其制备方法，特别是涉及粘红酵母的一种真空冷冻干燥制品及其制备方法。
背景技术
酵母拮抗菌-粘红酵母(Rhodotorula glutinis)对苹果、桃、梨、猕猴桃、甜樱桃等果实的主要采后病害均具有明显抑制效果(Chand-Goyal T，Spotts R A.Control of postharvest pear diseases using natural saprophytic yeast colonistsand their combination with a low dosage of thiabendazole.Postharvest Biol.Technol.，1996，7：51-64；Lima G.，De-Curtis F.，Castoria R，De-Cicoo V.Activity of the yeast Cryptoccus laurentii and Rhodotorula glutinis againstpost-harvest rots on different fruits.Biocontrol Sci.Technol.，1998，8：257-267)；可以耐受低温、低氧和高二氧化碳等果实采后的主要贮藏条件(Qin G Z，Tian S P，Xu Y.Biocontrol of postharvest diseases on sweet cherries by fourantagonist ic yeasts in different storage conditions.Postharvest Biol.Technol.，2004b，31：51-58)，能够与鉬酸铵、碳酸氢钠、水杨酸以及低剂量的杀菌剂配合使用(Tian S P，Yao H J，Qin G Z，Xu Y，Feng X Y.Sensitivity of fouryeasts to fungicides and CO2 concentrations，and their antagonistic abilityin combination with fungicide to pathogenic fungi iv vitro.AgriculturalSciences in China，2004，3：205-215.Wan Y K，Tian S P，Qin G Z.Enhancementof biocontrol activity of yeasts by adding sodium bicarbonate or ammoniummolybdate to control postharvest disease of jujube fruits.Lett.Appl.Microbiol.，2003，37：1-5.)，并能在采前田间喷施(Tian S P，Qin G Z，Xu Y.Survivalof antagonistic yeasts under field conditions and their biocontrol abilityagainst postharvest diseases of sweet cherry.Postharvest Biol.Technol.，2004，33：327-331)，具有良好的应用前景。
目前保持酵母菌生活力的方式主要有：传代培养保藏、液体石蜡低温保藏、斜面低温保藏、半固体穿刺保藏、液氮冷冻保藏和真空冷冻干燥保藏等(Ashwood-Smith MJ.Preservation of microorganisms by freezing，freeze-drying and desiccation.In：Ashwood-Smith M J(Eds).Low Temperature Preservation in Medicine andBiology.Tunbridge Wells：Pitman Medical，1980，pp219-252；李钟庆编微生物菌种保藏技术.北京：科学出版社，1989，pp19-28)。由于真空冷冻干燥保藏法具有保藏期长、可避免其它杂菌污染、便于运输和易于实现商品化生产等优点，因而成为目前保存细菌、酵母菌真菌孢子及霉菌最有效、成功的方法之一(李华，骆艳娥，刘延琳.真空冷冻干燥微生物的研究进展.微生物学通报，2002，29：78-82)。然而，并非所有的微生物都适合于真空冷冻干燥保存，既使能采用真空冷冻干燥保存的微生物，其存活率也可能低于0.1％(Benny J F，Hennebert G L.Viability andstability of yeast cells and filamentous fungus spores during freeze-drying：effects of protectants and cooling rates.Mycologia，1991，83：805-815.)。据报道，影响微生物真空冷冻干燥效果的因素主要包括：悬浮液浓度、预冻速度、保护剂的种类和浓度以及复水方式等(Bozoglu T F，Ozilgen M，Bakir U.Survivalkinetics of lactic acid starter cultures during and after freez drying.EnzmymeMicrobial Technology，1987，9：531-537.；Champage C P，Gardner N，Brochu E，Beaulier Y.The freeze-drying of lactic acid bacteria：a review.Can.Inst.Sci.Technol.J.，1991，24：118-126)。为了获得理想的真空冷冻干燥效果，需要筛选有效地制备方式及其保护剂。但目前国内外尚未见有对酵母拮抗菌粘红酵母(Rhodotorula glutinis)真空冷冻干燥方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种酵母拮抗菌的真空冷冻干燥制品及其制备方法。
本发明所提供的酵母拮抗菌真空冷冻干燥制品的制备方法，是收集经培养24-48h的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的菌体，将其用保护剂制成浓度为1-5×108～1-5×109CFU/mL的菌悬液，孵育1-2h，再进行真空冷冻干燥后得到的产品；所述保护剂为质量百分含量为2-10％的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、谷氨酸钠或脱脂奶粉水溶液。
所述粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的培养条件为：将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)接种于专用培养基中，在25℃，200rpm下振荡培养24-48小时；所述专用培养基的配方为：蔗糖20g，大豆蛋白胨30g，磷酸二氢钾0.68g，氯化钠0.29g，加水定容至1000mL，pH5.8。
所述培养基中，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的初始菌体密度为2.5×106细胞/mL。
所述培养时间优选为48小时，所述保护剂的浓度优选为10％。
所述保护剂优选为10％葡萄糖水溶液或10％的蔗糖水溶液或10％的脱脂奶粉水溶液。
所述菌悬液的浓度优选为5×108CFU/mL，孵育时间优选为2h。
所述真空冷冻干燥条件可采用一般的微生物制品的真空冷冻干燥条件，如干燥温度-45℃，真空度0.54MPa，干燥时间24h。
由上述方法得到的酵母拮抗菌真空冷冻干燥制品也属于本发明的保护范围。
本发明首先通过正交实验确定影响粘红酵母(Rhodotorula glutinis)真空冷冻干燥效果的主要因子为生长阶段和保护剂，再通过进一步的实验确定较佳的生长阶段和保护剂，得到酵母拮抗菌R.glutiniis空冷冻干燥的有效地制备方法。用本发明的方法制备的酵母拮抗菌R.glutiniis空冷冻干燥制品具有较高的生物活性，活菌率可达100％。本发明制备工艺简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性，将在酵母拮抗菌R.glutinis及其它微生物的保藏及其相关产品的制备中发挥巨大作用。
附图说明
图1为鉴定不同保护剂对酵母拮抗菌R.glutinis真空冷冻干燥效果的影响的实验结果
图2为鉴定不同保护剂对酵母拮抗菌R.glutinis真空冷冻干燥制品货架期影响的实验结果
图3为鉴定不同保护剂对酵母拮抗菌R.glutinis真空冷冻干燥制品0℃贮藏3月后细胞膜完整性与活性氧产生影响的实验结果
具体实施方式
下述实施例中如无特别说明均为常规方法。
实施例1、影响酵母拮抗菌R.glutinis冷冻干燥效果的各因素筛选
一、酵母拮抗菌R.glutinis菌种的保存、活化及其发酵培养
1、菌种的分离及保存
从苹果果实表面分离获得粘红酵母(Rhodotorula glutinis)菌种，置于甘油中-20℃保存。
2、菌种的活化
从-20℃中保存的甘油管中吸取菌液，在NYDA培养基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，琼脂18，单位：gL-1；pH5.5)铺板并在28℃下培养，72h后取生长良好的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)接种在NYDB培养基(葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7.5，单位：gL-1；pH5.5)中进一步活化，铺板，并在NYDA培养基上分离单菌落。
3、菌种的培养
挑取单菌落接入粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的专用培养基(蔗糖20，大豆蛋白胨30，磷酸二氢钾0.68，氯化钠0.29，单位：g L-1；pH5.8)中(1000mL三角瓶中含200mL培养液)，振荡培养(25℃，200rpm)12-18h。
4、发酵培养
将步骤3培养的菌种接种到含80L培养液(蔗糖20，大豆蛋白胨30，磷酸二氢钾0.68，氯化钠0.29，单位：gL-1；pH5.8)的120L发酵罐中，使其初始菌体密度均为2.5×106细胞/mL培养基，25℃下培养48小时，进行扩大培养。
二、影响粘红酵母(Rhodotorula glutinis)真空冷冻干燥效果的因素分析实验
采用四因素，三水平的正交实验L9(43)，确定不同培养时间、悬浮液浓度、保护剂种类以及孵育时间对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)真空冷冻干燥效果的影响，找到酵母拮抗菌真空冷冻干燥效果的最主要因素，以便进一步确定对其进行真空冷冻干燥的方式。正交实验L9(43)所选用的不同因素与水平的设计如表1所示。
表1影响酵母拮抗菌粘红酵母(Rhodotorula glutinis)真空冷冻干燥效果的正交实验L9(34)的因素与水平
具体实验方法为：用步骤-3中的方法对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)进行培养，每种菌设三个不同的发酵培养时间(24、48和72h)，培养结束后，离心收集菌体，将菌体用无菌水冲洗3次，再按表1所示将经不同时间培养的菌体用不同保护剂配成不同浓度的菌悬液，孵育不同时间后，置于-18℃冰箱中冷冻，24h后将冷冻样品放入冷冻干燥机(FD-1型，北京博医康公司)中干燥。干燥温度为-45℃，真空度0.54MPa，干燥时间为24h。干燥结束后立即加入无菌水复水，并进行1/10，1/100，1/1000，1/10000梯度稀释，铺板，28℃培养2d，统计菌落数。实验数据采用一般正交分析的方法进行(Montagomery，D C.Design and analysis of experiments，4thed.New York：Wiley，1996，pp 627-631)，实验结果如表2所示：
表2不同培养时间、菌悬液浓度，孵育时间和保护剂对粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)冷冻干燥效果的正交实验结果及直观分析表
| 实验组号 | 培养时间(h) | 酵母菌悬液的浓度(CFU/mL) | 孵育时间(h) | 保护剂(5％，质量百分含量) | 存活率(％) |
| 123456789K1 aK2K3k1 bk2k3Rc | 24242448484872727261.1266.7851.3430.5633.3925.678.12 | 1×1085×1085×1091×1085×1085×1091×1085×1085×10969.5868.4640.3934.7934.2320.2014.59 | 12323131263.9060.1954.3431.9530.1027.174.78 | 葡萄糖海藻糖水水葡萄糖海藻糖海藻糖水葡萄糖53.7790.0634.6026.8945.0317.3027.73 | 35.050.76.026.432.641.443.019.513.2 |
aKi A＝∑存活率Ai.实验数据为三个重复实验的平均值
bki A＝Ki A/2.实验数据为三个重复实验的平均值
cRi A＝最大(ki A)-最小(ki A).实验数据为三个重复实验的平均值
影响粘红酵母(Rhodotorula glutinis)冷冻干燥效果的不同因素正交实验结果及直观分析如表3-5所示，根据R值的大小，确定各因素对R.glutinis冷冻干燥效果的影响程度依次为：保护剂种类＞菌悬液浓度＞酵母菌培养时间＞保护剂孵育时间，结果表明不同保护剂对R.glutinis冷冻干燥的影响最大。
比较各因素不同水平之间的均值(k1，k2，k3)可以看出，除保护剂外，其他因素的1，2水平之间的差别并不大，因此初步确定R.glutinis的冷冻干燥条件为：酵母菌培养时间24-48h，菌悬液浓度1-5×108CFU/mL，海藻糖为保护剂，孵育时间1-2h。但是，由于海藻糖的价格相对较高，而且不同因素之间可能也存在着相互作用，同时考虑到生物制剂制备中的实际情况，将菌悬液浓度和保护剂孵育时间分别确定为5×108CFU/mL和1-2h，并在此基础上进一步确定培养时间和保护剂的种类及浓度对酵母拮抗菌R.glutinis冷冻干燥效果的影响。
实施例2、不同保护剂对酵母拮抗菌真空冷冻干燥制品生活力的影响
将用实施例1步骤一3中的方法分别培养24h和48h的粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)菌液离心，收集沉淀，无菌水冲洗3次。将沉淀分别用不同浓度的保护剂(葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、柠檬酸钠、醋酸钠、脱脂奶粉、谷氨酸钠)、无菌水和专用培养基(蔗糖20，大豆蛋白胨30，磷酸二氢钾0.68，氯化钠0.29，单位：gL-1；pH5.8)悬浮，其中以无菌水、专用培养基为保护剂对照，使最终菌悬液浓度为5×108CFU/mL，室温孵育1-2h后，放入-18℃冰箱中冷冻24h，然后将冷冻样品放入FD-1型冷冻干燥机中干燥，干燥温度-45℃，真空度0.54MPa，时间24h。
干燥结束后将样品取出，一部分立即用无菌水复水至冷冻干燥前的体积，采用稀释平板法计数，考察不同保护剂对酵母菌冷冻干燥后存活率的影响。另一部分冷冻干燥样品用离心管包装、密封，0℃下贮藏3个月后，再用无菌水复水，稀释平板法计数，以鉴定不同冷冻干燥条件对酵母拮抗菌冷冻干燥制品货架期的影响。
对不同保护剂筛选单因素实验的部分数据利用SPSS软件分析，通过ANOVA方式，采用邓肯式多重差异分析(Duncan’s multiple range tests)方法对处理之间的差异性在P＜0.05水平上进行分析。实验结果如图1所示，仅以无菌水悬浮的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)冷冻干燥后存活率在4.7-17.9％之间，而以培养液悬浮细胞时，无论培养24h还是48h，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)冷冻干燥后存活率均在1％以下，说明培养液中存在不利于R.glutinis的冷冻干燥的成分。粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)冷冻干燥后的存活率因保护剂种类和浓度不同而有明显差异。四种糖类对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的保护效果较好，其中又以10％葡萄糖和蔗糖的效果最好，培养24h的拮抗菌存活率便超过50％，而培养48h的拮抗菌存活率分别高达82.5％和100％。相比之下，三种钠盐之间的作用效果差别很大：两种浓度的谷氨酸钠对不同培养时间的酵母菌均有明显保护效果，柠檬酸钠只是在浓度为10％时对培养48h的酵母菌保护作用较好，而以乙酸钠悬浮细胞时，无论酵母菌培养24h还是48h，冷冻干燥后R.glutinis存活率均低于1％。脱脂奶粉是微生物冷冻干燥中的常用保护剂，本实验结果也表明，培养48h时的酵母菌在10％脱脂奶粉中悬浮时，冻干后存活率达85.4％，充分证明了脱脂奶粉对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的有效性。同时可以看出，增加各保护剂浓度均能显著提高R.glutinis冷冻干燥后的存活率。
粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的不同生长阶段对其冷冻干燥效果的影响因保护剂种类和浓度不同也有明显差异。以葡萄糖、谷氨酸钠和脱脂奶粉为保护剂时，延长酵母菌培养时间均能显著提高冻干制品的存活率。但以海藻糖为保护剂时，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)冷冻干燥后的存活率随拮抗菌培养时间的延长而显著降低。相比而言，对乳糖、蔗糖和柠檬酸钠来说，延长培养时间的增效作用只是在浓度为10％时较明显，而其中又以柠檬酸钠的作用最为显著。
实施例3、不同保护剂对酵母拮抗菌R.glutinis的冷冻干燥制品耐贮性的影响
实施例2获得的酵母拮抗菌R.glutinis冷冻干制品在0℃下贮藏3个月后，各处理的拮抗菌R.glutinis冷冻干燥样品的存活率都大幅度下降(图2)。当保护剂浓度为2％时，所有处理的酵母菌存活率都降至15％以下。既使保护剂浓度为10％时，在酵母菌培养24h后的冷冻干燥样品中，只有葡萄糖和蔗糖处理的酵母菌存活率超过20％；培养48h后，R.glutinis在保护效果最好的柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖中的存活率也只有48.8％、43.0％和38.6％。
实施例4、不同保护剂对酵母拮抗菌R.glutinis冷冻干制品细胞膜完整性与活性氧的影响
用活细胞荧光标记法测定实施例3获得的酵母拮抗菌R.glutinis冷冻干制品的细胞膜完整性与活性氧产生。结果如图3所示，其中Bright Field(明场)为所有细胞总数，PI标记的细胞为红色(膜***破坏)，H2DCFDA标记的细胞呈绿色(产生ROS)，双染料(Integrated，用PI，H2DCFDA共同标记)标记的细胞为黄色(正在死亡)；G-葡萄糖，S-蔗糖，C-柠檬酸钠，W-无菌水；Bar，20μm。表明0℃下贮藏3个月后，不同处理之间PI(+)的R.glutinis细胞数有显著性差异，在不加保护剂(无菌水)的冻干制品中，0℃下贮藏3个月后几乎所有细胞均被PI染色，而在R.glutinis培养48h，并以10％葡萄糖、蔗糖或柠檬酸钠为保护剂的冷冻干燥样品中，PI(+)的细胞在50-70％之间(图3，PI)，不同处理之间的这些差异与利用平板稀释法得到的结果基本一致(图2)。然而需要指出的是，部分细胞的质膜破坏可能是在冷冻干燥过程中造成的。H2DCFDA标记的结果表明，不加保护剂(图3，W)或加入其他保护剂的R.glutinis制品中则没有检测到ROS的存在。而在培养48h，并以10％葡萄糖、蔗糖或柠檬酸钠为保护剂的R.glutinis冷冻干燥样品中，一些细胞能产生ROS(图3，H2DCFDA，绿色)。其中，大多数产生ROS的细胞能同时被PI标记(图3，Integrated，黄色)，表明细胞正在走向死亡，此外，还有少数产生ROS的细胞，其细胞膜并没有破坏(图3，Integrated，绿色)。同时，稀释平板法的结果表明这三种处理(葡萄糖、蔗糖或柠檬酸钠)为保护剂贮藏3月后的活菌率最高，达到40％左右(图2)。
Claims (7)
1、一种酵母拮抗菌真空冷冻干燥制品的制备方法，是收集经培养24-48h的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)菌体，将其用保护剂制成浓度为(1-5)×108～(1-5)×109CFU/mL的菌悬液，孵育1-2h，再进行真空冷冻干燥后得到产品；所述保护剂为质量百分含量为2-10％的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、谷氨酸钠或脱脂奶粉水溶液。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粘红酵母的培养条件为：将粘红酵母接种于专用培养基中，在25℃，200rpm下振荡培养24-48小时；所述专用培养基的配方为：蔗糖20g，大豆蛋白胨30g，磷酸二氢钾0.68g，氯化钠0.29g，加水定容至1000mL，pH 5.8。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述培养基中，粘红酵母的初始菌体密度为2.5×106细胞/mL。
4、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述培养时间为48小时，所述保护剂的浓度为10％。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述保护剂为10％的葡萄糖水溶液或10％的蔗糖水溶液或10％的脱脂奶粉水溶液。
6、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述菌悬液的浓度为5×108CFU/mL，孵育时间为2h。
7、由权利要求1至6中任一所述方法制备的酵母拮抗菌真空冷冻干燥制品。
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