CN111500469B - 一种利用dse根系（段）生产菌肥的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用DSE根系(段)生产菌肥的方法。本发明提供了一种制备DSE固态菌剂的方法，包括如下步骤：采用格孢菌Pleosporales sp.针A2‑8 CGMCC No.18812侵染植物种子，收集侵染后植物根系或侵染后植物根际土，即得到固态菌剂。本发明通过DSE真菌快速侵入植物根系，然后以侵染的植物根段作为固体菌剂，解决了传统液体菌剂在制备、运输、施用中的种种弊端，同时为绿色生物菌肥、颗粒状菌肥等的制作提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用DSE根系(段)生产菌肥的方法，更具体涉及深色有隔内生真菌通过侵入植物根系用于生产绿色微生物菌肥的应用。
背景技术
深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)具有与根系真菌类似的生物学功能，DSE生态分布广泛，在不同生境植物中的定殖表明它们很少或没有宿主特异性，并能与植物建立了互惠互利以及相互调节的生理整体，但各自具有其形态特征。
研究表明，深色有隔内生真菌在胁迫环境中发挥着更为重要的作用，其通过菌丝的生长扩大了植物根系吸收面积，提高了原根系吸收范围之外的营养元素的吸收能力。
常规的微生物菌剂在生产的整个过程中均需要严格的无菌环境，以防止污染损害微生物活性，而且微生物菌剂的活性也存在时间限制，此外，其在运输和施用过程中也需要严格的做好防护。尽管DSE可以进行纯培养，但是实际生产实践中，微生物菌剂从纯化、生产、施用等均难以达到理想的效果，同时，液体菌剂携带不方便，且容易污染。
发明内容
本发明一个目的是提供一种制备固态菌剂的方法。
本发明提供的制备DSE固态菌剂的方法，包括如下步骤：采用格孢菌Pleosporalessp.针A2-8 CGMCC No.18812侵染植物种子，收集侵染后植物根系或侵染后植物根际土，即得到固态菌剂。
上述方法中，所述采用格孢菌Pleosporales sp.针A2-8 CGMCC No.18812侵染植物种子为将所述植物种子播种在含有10％-40％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液的培养基质中侵染培养；
所述10％-40％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液按照如下方法制备：
1)将所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8的菌丝体接种在液体培养基中进行液体培养，得到菌原液；
2)将所述菌原液稀释2.5-10倍，得到10％-40％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8 菌液。
上述方法中，所述液体培养基为液体MMN培养基。
上述方法中，所述侵染培养为培养至针A2-8菌侵染所述植物的侵染率大于等于80％。
上述方法中，所述10％-40％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为0.18-0.98mg/ml；
或所述10％-40％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为 0.18-0.25mg/ml；
或所述10％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为0.23mg/ml。
在本发明的实施例中，采用的植物种子为玉米种子，侵染培养体系中，所述针A2-8菌的菌和玉米种子的质量比为4.6-18.4mg：0.8-1g；优选为4.6mg：0.8g或4.6mg：1g；
所述侵染培养的条件为：在培养第1-3天，22℃黑暗培养；在培养第4-13天，16h 光照/8h黑暗光照交替培养，所述光照的强度为1800Lux，所述光照培养时的温度为 25℃，所述黑暗培养时的温度为22℃。
上述液体培养的条件为：28℃，先180r/min黑暗振荡培养1天，然后160r/min黑暗振荡培养8天；
上述方法中，所述在收集侵染后植物根系后还包括如下步骤：将所述根系制备为长为0.8-1.5cm的根段，作为固态菌剂。
上述方法中，所述在收集侵染后植物根系后还包括如下步骤：将所述根系制备为长为0.8-1.5cm的根段，再干燥所述根段，作为固态菌剂。
在本发明的实施例中干燥为风干至含水量为4％-8％。
由上述方法制备的固态菌剂也是本发明保护的范围。
上述固态菌剂中的干燥根段和根际土可以在4度冰箱低温保存备用。
上述固态菌剂在提高所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌作为菌肥在保存和/或运输效率中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述固态菌剂在制备菌肥中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述固态菌剂在促进植物生长中的应用也是本发明保护的范围。
上述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8或其菌液或其侵染植物得到的根系或根际土在在促进植物生长中的应用也是本发明保护的范围；所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8，其保藏编号为CGMCC No.18812。
格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液为上述第一个目的中的10％-40％所述格孢菌 Pleosporales sp.针A2-8菌液。
本发明根据DSE真菌能快速侵入植物根系且没有宿主特异性的特点，在DSE液体菌剂的基础上，通过DSE真菌侵染玉米根系，然后用这些侵染后的玉米根样和根际土作为接种剂再次侵染植物，检测DSE再次侵染的能力，为绿色菌肥的快速生产提供可能，即通过DSE真菌快速侵入植物根系，然后以侵染的植物根段作为接种剂，生产绿色有机新鲜菌肥，为其未来生产颗粒状菌肥提供基础。
本发明完美解决了传统液体菌剂在制备、运输、施用中的种种弊端，同时为制作绿色生物菌肥、颗粒状菌肥等的制作提供了基础，本发明的优点具体如下：
首先，本发明在充分考虑经济效益的前提下，以10％浓度的菌液作为第一阶段接种的经济效益最高，收集根系及根系土作为固体菌剂；其次，在第二阶段以固体菌剂作为接种剂时，其侵染效率好，高于液体菌剂，尤其是随着存储时间的加长，效果更显著；而且根系作为固态菌剂的侵染效果更高于根际土作为固态菌剂的侵染效果；第三，根系的鲜样和风干样均可作为固态菌剂施用，且侵染率无显著差异，考虑到运输和存储时间，可以选择风干样；风干根系段：以1.5-2％的接菌量，可在第10天侵染率超过50％，显示了风干根系段作为菌剂的潜力，其主要优点是轻便、体积小，便于携带和储存，适用于长距离运输的规模化野外应用。因此，本发明可以明显提高微生物菌剂的存储时间、存储方式和施用限制，可以将该固态菌剂作为菌肥，促进植物生长，也可以与其他微生物菌肥和化肥共同使用，能够极大推动微生物菌肥的应用，对在矿区生态重建、土壤修复以及农业生物肥力等野外大规模应用微生物菌肥提供可能，尤其对于未来微生物菌肥的合理施用及大规模生产提供基础。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Alternaria sp.
生物材料的菌株编号：001
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年4月8日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17463
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Darksidea zeta
生物材料的菌株编号：针A1-3
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年4月8日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17464
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：格孢菌Pleosporales sp.
生物材料的菌株编号：针A2-8
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年11月19日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18812
附图说明
图1为针A2-8在根系的定殖图。
图2为针A2-8号菌第二次接种不同时间的侵染率。
图3为001号菌第二次接种不同时间的侵染率。
图4为针A1-3号菌第二次接种不同时间的侵染率。
图5为针A2-8菌液培养不同时间的侵染能力
图6为针A2-8固体和液体菌剂接种处理不同时间的株高
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PDA培养基：将马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂14.0g混合后，加入蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。
液体MMN培养基(pH5.5)：将CaCl2 0.05g、MgSO4 0.15g、NaCl 0.025g、FeCl30.01g、 KH2PO4 0.5g、Vitamin B1(硫胺素)0.0001g、(NH4)2HPO4 0.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和Malt extract(麦芽提取物)10g混合，得到混合物，然后加入蒸馏水并定容至 1L，分装，121℃高压灭菌15min，备用。
实施例1、DSE菌株的分离和鉴定及保藏
挑选从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区采集的针茅新鲜根样，用无菌水多次清洗，将根段剪成1cm左右小段，放入75％乙醇水溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，再放入10％次氯酸钠水溶液消毒5min，无菌水清洗3次，用滤纸吸去根样表面水分。放入加有抗生素(含50mg/L ampicillin和50mg/L streptomycin sulfate) 的PDA培养基，每个培养皿放2-3个根段。于28℃黑暗条件下分离培养并纯化。
分离纯化得到1号菌、2号菌和5号菌。
检测1号菌的ITS序列，如序列表中序列1所示，鉴定为深色有隔内生真菌(DSE)，命名为001。该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17463，分类命名为链格孢Alternaria sp.。
检测2号菌的ITS序列，如序列表中序列2所示，鉴定为深色有隔内生真菌(DSE)，命名为针A1-3。该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17464，分类命名为Darksidea zeta。
检测5号菌的ITS序列，如序列表中序列3所示，鉴定为深色有隔内生真菌(DSE)，命名为针A2-8。该菌株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18812，分类命名为格孢菌Pleosporales sp.。
针A2-8的形态照片见图1，具有典型的深色暗隔菌丝和由细胞壁膨大加厚的细胞紧密堆积形成的微菌核结构，其属于深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)。
实施例2、针A2-8固态菌剂的制备
供试菌株为：DSE菌种针A2-8，其分类命名为格孢菌Pleosporales sp.，保藏编号为CGMCC No.18812。
玉米品种为中糯一号(也可称为中糯1号；认证号：0103006-2000，北京中农作科技发展有限公司)。
一、菌液的制备
1、针A2-8菌液的制备
1)活化
将格孢菌Pleosporales sp.CGMCC No.18812自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基中；28℃下黑暗倒置培养7天，待菌丝布满平皿，得到菌饼；
2)菌液制备
取上述1)制备的直径为6mm的菌饼接入100ml液体MMN培养基中，28℃，先 180r/min黑暗振荡培养1天，然后160r/min黑暗振荡培养8天，得到针A2-8菌液(计算浓度为2.31mg/mL)。
上述菌液的mg/mL表示每ml菌液中菌体的干重。
2、菌液的稀释
用无菌水将步骤1培养8天得到的针A2-8菌液进行稀释，得到如下3个浓度的菌液：
10％(体积百分含量)菌液(稀释10倍)：取步骤1的针A2-8菌液10ml，用无菌水稀释至100ml，得到10％菌液针A2-8(浓度为0.23mg/mL)；
20％(体积百分含量)菌液(稀释5倍)：取步骤1的针A2-8菌液20ml，用无菌水稀释至100ml，得到20％菌液针A2-8(浓度为0.46mg/mL)；
40％(体积百分含量)菌液(稀释2.5倍)：取步骤1的针A2-8菌液40ml，用无菌水稀释至100ml，得到40％菌液针A2-8(浓度为0.92mg/mL)。
2号菌针A1-3菌液和1号菌001菌液与5号菌针A2-8菌液制备方法一致，不同的仅是菌株，分别得到10％菌液针A1-3、20％菌液针A1-3、40％菌液针A1-3、10％菌液001、20％菌液001和40％菌液001。
二、针A2-8固态菌剂的制备
通过菌液第一阶段侵染试验获得针A2-8固态DSE菌剂。
具体如下：
1、材料灭菌
沙土：过2mm筛，去除根系残留，120℃、90min高温高压灭菌，得到灭菌土样，备用；
选取大小相近，颗粒饱满的玉米种子，先用30％次氯酸钠水溶液浸泡10min，用无菌水清洗5遍，然后用70％的乙醇溶液浸泡5min，用无菌水清洗5遍，得到灭菌后的玉米种子，待用。
2、菌液侵染玉米
取125mL的小杯，每个小杯放入上述225g的灭菌土样，每种菌分别设置3个培养体系组别，每个组为9个小杯，分别如下：
第一组(10％菌液组)：每个小杯倒入20mL上述一制备的10％菌液；
第二组(20％菌液组)：每个小杯倒入20mL菌液上述一制备的20％菌液；
第三组(40％菌液组)：每个小杯倒入20mL菌液上述一制备的40％菌液；
再用镊子将上述灭菌后的玉米种子播种至小杯中(每个塑料杯播种3粒种子，种子重量为0.8g)，然后进行培养。
上述10％菌液分别为10％菌液针A2-8、10％菌液针A1-3和10％菌液001；
上述20％菌液分别为20％菌液针A2-8、20％菌液针A1-3和20％菌液001；
上述40％菌液分别为30％菌液针A2-8、30％菌液针A1-3和40％菌液001；
上述第一组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为4.6mg：0.8g；
上述第二组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为9.2mg：0.8g；
上述第三组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为18.4mg：0.8g；
上述培养过程：第1-3天(以放入种子当天记作第一天)，22℃黑暗培养，空气相对湿度为70％；第4-13天，光暗交替培养(16h光照/8h黑暗，光照培养时的光照强度为1800Lux，光照培养时的温度为25℃，黑暗培养时的温度为22℃)，空气相对湿度为70％。
培养第13天，检测各组培养体系中各种供试菌株在植株根部的定殖情况，具体方法如下：
从各组培养体系中分别选取90个1cm的小根段(随机选取)，用酸性品红染色法进行染色，在显微镜下镜检出DSE定殖的根段数，并计算A2-8菌株定殖率(也称为侵染率；定殖率＝DSE定殖的根段数/总根段数)。
结果见表1所示，可以看出，培养到第13天，与001号菌菌液和针A1-3号菌菌液相比，接种各个浓度A2-8菌液的定殖率均达到80％以上；从经济节约角度来看，可选择10％A2-8菌液进行制备固态菌剂。
表1 DSE不同浓度菌液定殖率
3、固态菌剂的获得
针A2-8固态菌剂(根系)：收集上述2中培养12天(培养第13天收集)的各组培养体系中A2-8侵染后植物根系，剪成1cm左右的小根段清洗干净，得到10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)、20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样) 和40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)。
针A2-8固态菌剂(根系干样)：将上述10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)、20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)和40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)在室温下通风阴凉的地方风干5天，使其含水率为4％-8％，得到10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)、20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)和40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)。4℃冰箱保存。
针A2-8固态菌剂(根际土壤)：收集上述2中培养12天(培养第13天收集)的各组培养体系中A2-8侵染后根系土壤，过1mm筛，彻底去除植物根系，所有根际土充分混合，得到10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)、20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)和40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)。4℃冰箱保存。
按照针A2-8固态菌剂的制备方法制备001号菌和针A2-3的各种固体菌剂，不同的仅为菌株。
上述根系干样固态菌剂和根际土壤固态菌剂均在4℃冰箱放置保存。
三、不同菌株比较针A2-8固态菌剂的侵染能力
将上述二制备的各种固体菌剂进行如下第二阶段侵染试验验证菌剂的侵染能力：
1、材料准备
沙土：过2mm筛，去除根系残留，120℃、90min高温高压灭菌，得到灭菌土样，备用；
玉米种子：选取大小相近，颗粒饱满的玉米种子，先用30％次氯酸钠水溶液浸泡10min，用无菌水清洗5遍，然后用70％的乙醇溶液浸泡5min，用无菌水清洗5遍，得到消毒后的玉米种子，待用。
2、第二阶段侵染
取125mL的小杯，每个小杯放入上述225g的灭菌土样，每种菌设置18个培养体系组别，每个组为6个小杯；
第一至第六组：将上述二得到的根系鲜样固态菌剂和根际土固态菌剂，侵染植物种子，记作第1天接种；
第七至第十二组：将上述二得到的保存11天的根系干样固态菌剂和保存11天的根际土固态菌剂，侵染植物种子，记作第11天接种；
第十三至第十八组：将上述二得到的保存21天的根系干样固态菌剂和保存21天的根际土固态菌剂，侵染植物种子，记作第21天接种；
具体如下：
第一组：10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)称取4g；
第二组：10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第三组：20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)称取4g；
第四组：20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)，称取0.5g；
第五组：40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)称取4g；
第六组：40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第七组：保存11天的10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第八组：保存11天的10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第九组：保存11天的20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第十组：保存11天的20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第十一组：保存11天的40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第十二组：保存11天的40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第十三组：保存21天的10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第十四组：保存21天的10％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第十五组：保存21天的20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第十六组：保存21天的20％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
第十七组：保存21天的40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)称取3g；
第十八组：保存21天的40％菌液针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)称取0.5g；
再用镊子(70％酒精消毒)将玉米种子播种至小杯中(每个小杯播种3粒种子，种子重量为1.0g)，然后进行二次侵染培养。
上述二次侵染培养过程：第1-3天，22℃黑暗培养，空气相对湿度为70％；第4-13天，光暗交替培养(16h光照/8h黑暗，光照培养时的光照强度为1800Lux，光照培养时的温度为25℃，黑暗培养时的温度为22℃)，空气相对湿度为70％。
二次侵染培养第7天开始，每隔3天，检测玉米根系侵染情况。
结果如图2所示，A表示第1天接种的处理，B表示第11天接种的处理，C表示第21天接种的处理；可以看出，上述二制备的根系固态菌剂和根际土固态菌剂均可侵染根系，且固态菌剂根系侵染效果高于固态菌剂根际土。此外，风干样和鲜根样一样均具有侵染能力，且侵染能力相似。
采用同样的方法检测001号菌不同固态菌剂和针A1-3号菌不同固态菌剂的第二次侵染率，方法与上述一致，不同的是菌株不同。
结果如图3和图4所示，可以看出，001号菌不同固态菌剂和针A1-3号菌不同固态菌剂侵染效果整体均小于针A2-8号菌不同固态菌；尤其在二次侵染培养培养第13 天，针A2-8号菌不同固态菌的侵染率显著高于001号菌的固态菌剂和针A1-3号菌固态菌剂，且在菌剂保存21天后，针A2-8号固体菌剂(根系干样)的侵染率显著高于 001号菌的固态菌剂和针A1-3号菌固态菌剂。
上述结果表明，针A2-8制备的固态菌剂保存时间长，且侵染效果最显著。
四、不同保存时间针A2-8液体菌剂的侵染能力
1、针A2-8液体菌剂的制备
上述一的1得到的培养8天针A2-8菌液按照2的方法进行稀释，得到10％菌液针A2-8、20％菌液针A2-8和40％菌液针A2-8作为针A2-8液体菌剂。
将上述各个针A2-8液体菌剂在28℃、160r/min继续黑暗振荡培养，在继续黑暗振荡培养后的不同时间收集培养液作为保存后液体菌剂进行如下侵染实验。
2、侵染
1)、材料准备
与二的1相同；
2)、菌液侵染玉米
取125mL的小杯，每个小杯放入上述225g的灭菌土样，每种菌分别设置3个培养体系组别，每个组为6个小杯，分别如下：
第一组：每个小杯倒入培养8天(将该以接入菌丝体的第一天，记作保存的第一天)的20mL针A2-8制备的10％液体菌剂；
第二组：每个小杯倒入培养8天的20mL针A2-8制备的20％液体菌剂；
第三组：每个小杯倒入培养8天的20mL针A2-8制备的40％液体菌剂；
第四组：每个小杯倒入培养18天(相当于保存了10天液体菌剂)的20mL针A2-8 制备的10％液体菌剂；
第五组：每个小杯倒入培养18天的20mL针A2-8制备的20％液体菌剂；
第六组：每个小杯倒入培养18天的20mL针A2-8制备的20％液体菌剂；
第七组：每个小杯倒入培养28天(相当于保存了20天液体菌剂)的20mL针A2-8 制备的10％液体菌剂；
第八组：每个小杯倒入培养28天的20mL针A2-8制备的20％液体菌剂；
第九组：每个小杯倒入培养28天的20mL针A2-8制备的20％液体菌剂；
再用镊子将上述灭菌后的玉米种子播种至小杯中(每个小杯播种3粒种子，种子重量为0.8g)，然后进行培养。
上述第一组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为4.6mg：0.8g；
上述第二组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为9.2mg：0.8g；
上述第三组培养体系中，针A2-8菌和种子的质量比为18.4mg：0.8g；
上述培养过程：第1-3天(以放入种子当天记作第一天)，22℃黑暗培养，空气相对湿度为70％；第4-13天，光暗交替培养(16h光照/8h黑暗，光照培养时的光照强度为1800Lux，光照培养时的温度为25℃，黑暗培养时的温度为22℃)，空气相对湿度为70％。
培养第13天，检测各组培养体系中各种供试菌株在植株根部的定殖情况，具体方法如下：
从各组培养体系中分别选取90个1cm的小根段(随机选取)，用酸性品红染色法进行染色，在显微镜下镜检出DSE定殖的根段数，并计算A2-8菌株定殖率(也称为侵染率；定殖率＝DSE定殖的根段数/总根段数)。
针A2-8菌液培养8、18和28天(与固体菌剂保存时间增加比例相似，均以增加10天统计一次)，分别检测液体菌剂的侵染能力。
结果如图5所示，A表示液体菌剂培养的第8天接种的处理，B表示液体菌剂培养的第18天，C表示液体菌剂培养的第28天；结果表明，随着液态菌剂保存时间的延长，液体菌剂的侵染能力大大下降，表明DSE的活性显著降低，从侧面表明，固体菌剂在存储上的优势。
实施例3、针A2-8固态菌剂作为菌肥中的应用
检测实施例2的三中针A2-8液态菌剂处理后，培养第13天玉米株高；
检测实施例2的四中针A2-8液态菌剂处理后，培养第13天玉米株高；
结果如图6所示，图6的A表示针A2-8制备的固态菌剂(根系鲜样)和针A2-8 制备的固态菌剂(根际土壤)接种的玉米株高，B表示保存11天的针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)和保存11天的针A2-8制备的固态菌剂(根际土壤)接种的玉米株高，C表示保存21天的针A2-8制备的固态菌剂(根系干样)和保存21天的针A2-8 制备的固态菌剂(根际土壤)接种的玉米株高，D表示液体菌剂培养的第8天后接种的玉米株高，E表示液体菌剂培养第18天后接种的玉米株高，F表示液体菌剂培养第 28天后接种的玉米株高。结果表明，固体菌剂处理的植物株高高于液体菌剂的处理，并且，随着放置时间的增加，固体菌剂中根系对植物株高的促进作用更加显著。
SEQUENCE LISTING
<110>中国矿业大学（北京）西安科技大学
<120>一种利用DSE根系（段）生产菌肥的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cccttccgta gggtgaacct gcggagggat cattacacaa tatgaaagcg ggctggatac 60
tctgtagtag tggattgctt tacggcgtgc gctgctggag agcctagcct tgctgaatta 120
ttcacccgtg tcttttgcgt acttcttgtt tccttggtgg gctcgcccgc cacaaggaca 180
actcataaac cttttgtaat agcaatcagc gtcagtaaca acataataat tacaactttc 240
aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtagtg 300
tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt 360
ccaaagggca tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa gctttgcttg gtgttgggcg 420
tcttgtctcc agtccgctgg agactcgcct taaagtcatt ggcagccggc ctactggttt 480
cggagcgcag cacaagtcgc actcttttcc agccaaggtc agcgtccaac aagccttttt 540
tcaacttttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 600
gaggaaaa 608
<210> 2
<211> 590
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cttccgtaag gtgacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gcgggagcta 60
gtcgcttgcg acgacgctac cgagggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120
accttttgtt gtttcctcgg caggtcacct gccgccagga accctctaaa ccttttgcaa 180
tagcatccaa acttctgaaa acaaaccaaa ttatttacaa cttttaacaa tggatctctt 240
ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag tagtgtgaat tgcagaattc 300
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccatg gtattccgtg gggcatgcct 360
gttcgagcgt catttacccc ctcaagctcc gcttggtgtt gggcgtctgt cccgcttcgc 420
gcgcggactc gccccaaagg tattggcagc ggtcgtgcca gcttctcgcg cagcacattg 480
cgcttctcga ggcaccggcg ggcccgcgtc catcaagctc acccccccag tttgacctcg 540
gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa 590
<210> 3
<211> 593
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gggggagcca 60
gtcgctcgcg acggcgctgc cttgggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120
accttttgtt gtttcctcgg caggtcctct gccgccagga accccctaaa cctttttgca 180
atagcatcca aacttctgaa aacaaaccaa atcatttaca acttttaaca atggatctct 240
tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatat gtagtgtgaa ttgcagaatt 300
cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccccat ggtattccgt ggggcatgcc 360
tgttcgagcg tcatttaccc cctcaagctc cgcttggtgt tgggcgtctg tcccgcttcg 420
cgcgcggact cgccccaaag gtattggcag cggtcatgcc agcttctcgc gcagcacatt 480
gcgcttctcg aggcaccggc gggcccgcgt ccatcaagct ctcacccccc cagtttgacc 540
tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 593
Claims (10)
1. 一种制备固态菌剂的方法，包括如下步骤：采用格孢菌Pleosporales sp.针A2-8CGMCC No.18812侵染玉米种子，收集侵染后玉米根系，即得到固态菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述采用格孢菌Pleosporales sp.针A2-8 CGMCC No.18812侵染玉米种子为将所述玉米种子播种在含有10％-40%所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液的培养基质中侵染培养；
所述10％-40%所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液按照如下方法制备：
1）将所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8的菌丝体接种在液体培养基中进行液体培养，得到菌原液；
2）将所述菌原液稀释2.5-10倍，得到10％-40%所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述液体培养基为液体MMN培养基。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述侵染培养为培养至针A2-8菌侵染所述玉米的侵染率大于等于80%。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述10％-40%所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为0.18-0.98mg/ml；
或所述10％-40%所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为0.18-0.25mg/ml；
或所述10％所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌液中菌浓度为0.23mg/ml。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述在收集侵染后玉米根系后还包括如下步骤：将所述根系制备为长为0.8-1.5cm的根段，作为固态菌剂。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述在收集侵染后玉米根系后还包括如下步骤：将所述根系制备为长为0.8-1.5cm的根段，再干燥所述根段，作为固态菌剂。
8.由权利要求1-7任一所述方法制备的固态菌剂。
9.权利要求8所述固态菌剂在提高所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8菌作为菌肥在保存和/或运输效率中的应用；
或，权利要求8所述固态菌剂在制备菌肥中的应用；
或，权利要求8所述固态菌剂在促进玉米植株生长中的应用。
10.格孢菌Pleosporales sp.针A2-8侵染玉米根系得到的固态菌剂在促进玉米植株生长中的应用；所述格孢菌Pleosporales sp.针A2-8，其保藏编号为CGMCC No.18812。
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