CN113234597A - 一种提高双歧杆菌的冻干抗逆性的培养方法及其应用 - Google Patents

一种提高双歧杆菌的冻干抗逆性的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高双歧杆菌的冻干抗逆性的培养方法及其应用，属于微生物技术领域、发酵和冻干技术领域。本发明提供了一种通过在培养基中添加相容性溶质进行高密度发酵双歧杆菌，从而提高其冻干冻干存活率的方法，将双歧杆菌接种至含相容性溶质的培养基中进行高密度培养至稳定期，能够显著提高双歧杆菌的冻干抗逆性，使双歧杆菌的冻干存活率最高提升3.02倍(相同保护剂作用下)；本此培养方法可显著提高双歧杆菌的冻干存活率，将双歧杆菌的冻干存活率由10％‑20％提升至40％‑60％。

Description

一种提高双歧杆菌的冻干抗逆性的培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种提高双歧杆菌的冻干抗逆性的培养方法及其应用，属于微生物技术领域、发酵和冻干技术领域。
背景技术
双歧杆菌(Bidifobacterium longum)是一种存在于人类胃肠道的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的杆状细菌，包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌等32种。双歧杆菌是一种微耐氧厌氧菌，被认为最早位于婴儿胃肠道中。在固体培养基厌氧环境生长时，双歧杆菌一般形成白色、光滑的凸形菌落。虽然双歧杆菌在成人胃肠道中含量较少，但它被认为是肠道微生物群的一部分，广泛分布于人体肠道中，其产生的乳酸被认为可以阻止致病微生物的生长。研究表明，双歧杆菌具有改善肠道微生物群、调节肠道通透性、提高肠道免疫力、缓解肠道易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)和抵抗肠道炎症等益生作用。此外，双歧杆菌是非致病性的，经常被添加到食品中。
随着双歧杆菌对促进健康作用的研究日益深入及其应用日益广泛，要求研究人员采用适当的储存方法。双歧杆菌作为益生菌，其培养物的工业化推广很大程度上依赖于保藏技术，这就需要保证长期稳定培养物的生存能力和活性。因此，双歧杆菌贮藏方法需要两个目标：既要长期保存纯培养物，又要为纯培养物准备随时应用。目前，冷冻干燥保存是细菌培养几十年来的首选长期保存方法，也是双歧杆菌的长期保存方法，因为维护成本低、冻干培养物易移植。目前存在许多微生物资源中心都是依靠冷冻干燥来保存各种细胞以供未来繁殖。
双歧杆菌在冷冻干燥过程中会受到低温胁迫、机械损伤、渗透压损伤等，从而导致细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH动态平衡被破坏等状况，这都将导致双歧杆菌菌株的活菌数显著降低。影响双歧杆菌冻干抗逆性的影响因素包括冻干保护剂的选择以及双歧杆菌自身的冻干抗逆性。目前虽有较多研究着重于优化菌株的冻干保护剂，但对于控制发酵条件提升菌株的冻干抗逆性有待深究。
发明内容
为了解决现有技术当中提高菌株冻干抗逆性的方法单一，效果不显著以及如何通过控制发酵条件提高双歧杆菌的冻干抗逆性等问题，本发明基于以下原理：高渗透压胁迫会降低乳酸菌的生长速度、存活率和代谢活性。理论上来说，细胞需要保持的细胞内渗透压比培养基的渗透压高来产生细胞充盈，这是细胞延伸和生长的驱动力。乳酸菌在高渗胁迫过程中可以积累相容物质以维持细胞生长所需的膨胀压力。相容溶质主要是指极性的、可溶性的、在生理条件下不带电荷的、可在细胞内高浓度积累(1mol/kg)而不影响其功能和蛋白质折叠的小分子有机物。高渗条件诱导细胞在胞内积累相容性溶质，在冷冻干燥过程中会有效缓解胞内冰晶损伤和渗透压损伤、维持细胞膜和蛋白的结构，从而提高双歧杆菌的冻干存活率。这将降低生产费用、提高生产效率和企业受益，有利于推动双歧杆菌的工业化生产应用，本发明提供了一种在初始培养基中添加相容性溶质的培养基进行高密度培养至稳定期，在高密度发酵中后期双歧杆菌处于相对高渗条件，双歧杆菌在高深胁迫下在胞内积累相容性溶质，从而提高双歧杆菌的冻干存活率。
本发明还提供了一种冻干存活率提高的双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将双歧杆菌接种至含有相容性溶质的发酵培养基中进行发酵，所述相容性溶质包括氨基酸、季铵盐、糖、糖醇中的一种或多种；发酵结束后离心收菌得到的菌体；
(2)将步骤(1)制备得到的菌体采用渗透压为550～1100mOsm/kg的溶液洗涤后，将菌体与保护剂混合，冷冻干燥制备得到双歧杆菌菌粉。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌为经活化后双歧杆菌的种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述渗透压为550～1100mOsm/kg的溶液是指接近双歧杆菌的完全抑制渗透压状态的溶液，NaCl溶液浓度在16.5-33g/L的溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述相容性溶质包括：谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、乳糖、水苏糖、***糖、山梨糖醇、甘露醇、肌醇中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述相容性溶质为甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌包括：长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵结束是指培养至稳定期。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，当双歧杆菌为青春双歧杆菌时，渗透压调整为750～950mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：22.5-28.5g/L)；当双歧杆菌为两歧双歧杆菌时，渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)；当双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌时，渗透压调整为900～1000mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：27-30g/L)。
在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌包括但不限于：Bifidobacteriumlongum subsp.infantis CCFM 687、Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102、Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077。
在本发明的一种实施方式中，所述短双歧杆菌包括但不限于：Bifidobacteriumbreve CCFM1026、Bifidobacterium breve CCFM 1067、Bifidobacterium breve CCFM1078。
在本发明的一种实施方式中，所述青春双歧杆菌包括但不限于：Bifidobacteriumadolescentis CCFM 1108、Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062、Bifidobacteriumadolescentis CCFM1061。
在本发明的一种实施方式中，所述两歧双歧杆菌包括但不限于：Bifidobacteriumbifidum CCFM1063、Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632、Bifidobacteriumbifidum HNJ6、Bifidobacterium bifidum CCFM1150。
在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌包括但不限于：Bifidobacteriumanimalis CCFM1148、Bifidobacterium animalis BB12。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：氮源1～50g/L，碳源1～100g/L，缓冲盐0.1～30g/L，七水合硫酸镁0.01～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，吐温-800.1～2mL/L，半胱氨酸0.1～2g/L，相容性溶质10-30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源包括：葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚糖的一种或多种糖。
在本发明的一种实施方式中，所述氮源包括：酵母浸粉、酵母提取物、牛肉浸粉、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、乳清蛋白粉的一种或多种有机氮。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲盐为：磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸钾或磷酸钠中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，将双歧杆菌的培养液液接种至含有相容性溶质的发酵培养基中进行发酵；所述双歧杆菌培养液的制备方法为：挑取双歧杆菌单菌落，接种于MRS液体培养基中，在37℃的厌氧条件下，活化培养18～24h，得到活化液；将活化液以1～5％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基，继续活化培养18～24h，得到双歧杆菌种子液；将制备得到的种子液按照1～5％(v/v)的接种量接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，在37℃厌氧培养24h，得到培养液。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的双歧杆菌培养以1～5％(v/v)的接种量接种至含有相容性溶质的发酵培养基中，培养温度为30～40℃，pH为5.0～6.0，培养14～24h，得到发酵液；将制备得到的发酵液离心收菌，制备得到菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述菌体与所述保护剂按照1:1的比例混合。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的双歧杆菌种子液以1～5％(v/v)的接种量接种至含有相容性溶质的发酵培养基中，培养温度为37℃，pH为5.0～7.0，培养20h，得到发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂为20％的山梨糖醇溶液、海藻糖或蔗糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖60g/L，氮源24g/L，MgSO4·7H2O0.35g/L，吐温-80 1mL，半胱氨酸1g/L，相容性溶质20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述相容性溶质为脯氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：氮源10～50g/L，无水葡萄糖20～100g/L，缓冲盐0.1～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，吐温-80 0.5～1mL/L，半胱氨酸0.5～2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：酵母浸粉24g/L，无水葡萄糖60g/L，七水合硫酸镁0.35g/L，吐温-80 1mL/L，半胱氨酸1g/L，脯氨酸20g/L。
本发明还提供了一种提高双歧杆菌冻干存活率的方法，其特征在于，所述方法为：将双歧杆菌接种至含有相容性溶质的发酵培养基中进行发酵，所述相容性溶质包括氨基酸、季铵盐、糖、糖醇中的一种或多种；发酵结束后离心收菌得到的菌体；将菌体采渗透压为550～1100mOsm/kg的溶液洗涤后，将菌体与保护剂混合，冷冻干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述相容性溶质包括：谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、乳糖、水苏糖、***糖、山梨糖醇、甘露醇、肌醇中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述菌体与所述保护剂按照1:1的比例混合。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂为海藻糖、蔗糖或山梨糖醇。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：氮源1～50g/L，碳源1～100g/L，缓冲盐0.1～30g/L，七水合硫酸镁0.01～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，吐温-800.1～2mL/L，半胱氨酸0.1～2g/L，相容性溶质10-30g/L。
本发明还提供了采用上述方法制备得到的双歧杆菌冻干粉。
有益效果
(1)本发明提供一种通过在培养基中添加相容性溶质进行高密度发酵双歧杆菌，从而提高其冻干冻干存活率的方法。将双歧杆菌接种至含相容性溶质的培养基中进行恒pH培养至稳定期，确保最终发酵液是因高渗胁迫而停止发酵(富含碳源和氮源以及适宜的温度和pH)。离心收菌并洗菌两次，与冻干保护剂混合进行冷冻干燥。相比空白组，实验组双歧杆菌的冷冻干燥的存活率显著提高。
(2)本发明提供了一种通过添加脯氨酸可提高双歧杆菌冻干存活率的培养策略，即在10-30g/L脯氨酸的培养基中接入双歧杆菌种子液进行厌氧恒温(37℃)恒pH(5.0)培养，发酵至至稳定期收菌。此培养策略可显著提高双歧杆菌的冻干存活率，此培养策略可显著提高双歧杆菌的冻干存活率，将双歧杆菌的冻干存活率由10％-20％提升至40％-60％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的菌株的信息如下：
所述Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687记载于公开号为CN110693919A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM1102记载于公开号为CN111073834A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium longumsubsp.longum CCFM 1077记载于公开号为CN111073828A的专利申请文本中。
所述Bifidobacterium breve CCFM 1026记载于公开号为CN109576185B的专利文本中；所述Bifidobacterium breve CCFM 1067记载于公开号为CN110616167A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium breve CCFM 1078记载于公开号为CN112111424A的专利申请文本中；
所述Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108记载于公开号为CN111534453A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062记载于公开号为CN110432332A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium adolescentis CCFM1061记载于公开号为CN110331118B的专利文本中；
所述Bifidobacterium bifidum CCFM1063记载于公开号为CN110331119A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632记载于公开号为CN106834187B的专利文本中；所述Bifidobacterium bifidum HNJ6记载于公开号为CN107629988A的专利申请文本中；所述Bifidobacterium bifidum CCFM1150记载于公开号为CN112694992A的专利申请文本中；
所述Bifidobacterium animalis CCFM1148记载于公开号为CN112159778A的专利文本中；所述Bifidobacterium animalis BB12记载于公开号为CN107893044A的专利文本中。
下述实施例中涉及的安琪酵母FM803、七水硫酸镁、一水硫酸锰、吐温80、半胱氨酸盐酸盐、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、琼脂粉、酵母提取物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、琼脂粉、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、乳糖、水苏糖、***糖、山梨糖醇、甘露醇、肌醇购自上海创赛科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂粉15g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
乳酸菌活菌数的测定：
采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
乳酸菌冻干存活率的测定：
按照以下公式计算双歧杆菌的冻干存活率：
Figure BDA0003090682390000061
实施例1：双歧杆菌的发酵与冻干工艺
具体步骤如下：
(1)双歧杆菌种子液的制备：
取保藏的双歧杆菌在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，得到种子液；
(2)将制备得到的种子液以5％(v/v)的接种量接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，在37℃厌氧培养24h，得到培养液；
(3)配制含有相容性溶质的发酵培养基
酵母浸粉FM803 24g/L、无水葡萄糖60g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐1g/L、MgSO4·7H2O 0.35g/L，10-30g/L的相容性溶质；将发酵培养基置于5L发酵罐，115℃15min高温灭菌，充氮气保压0.1Mpa冷却；
(4)将步骤(2)制备得到的培养液按5％(v/v)的接种量接种至步骤(3)的发酵培养基中，在pH 5.0、37℃恒温培养，每隔2h取样测定OD600，至稳定期，此时OD600为15～20，发酵结束，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；
(5)使用渗透压为550～1100mOsm/kg的溶液(NaCl溶液)对菌体洗涤两次后，将菌体与保护剂山梨糖醇按照1：1的比例重悬于浓度为200g/L的山梨糖醇溶液中，得到重悬液；当双歧杆菌为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis时，渗透压调整为750～950mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：22.5-28.5g/L)；
当双歧杆菌为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum时，渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)；
当双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌时，渗透压调整为900～1000mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：27-30g/L)。
(6)将重悬液冻干，冻干工艺：将重悬液置于-50℃环境，维持4h；一次干燥，-30℃及200μbar，保持30h；二次干燥，25℃及0μbar，保持20h；制备得到双歧杆菌菌粉。
实施例2：Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687的发酵与冻干
具体步骤如下：
方案一：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L无水葡萄糖，制备得Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测收菌时期培养基中的葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案二：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的谷氨酸，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案三：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的精氨酸，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案四：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的甘氨酸，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案五：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的脯氨酸，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案六：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的甘氨酸甜菜碱，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案七：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的海藻糖，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案八：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的乳糖，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案九：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的水苏糖，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的***糖，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十一：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的山梨糖醇，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十二：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的甘露醇，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十三：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的肌醇，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十四：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的棉籽糖，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。
方案十五：具体实施方式同实施例1，区别在于，将步骤(3)中的相容性溶质调整为20g/L的赤藓糖醇，制备得到Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687菌粉，并检测发酵终点葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和冻干存活率。结果如表1所示：
表1：Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000081
Figure BDA0003090682390000091
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中以添加脯氨酸效果最为显著，其冻干后活菌数由2.17±0.3×1011CFU/g提升至10.36±0.33×1011CFU/g，冻干存活率由22.18±0.26％提升至98.88±0.17％，冻干存活率提升了约4.68倍。
实施例3：Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102的发酵与冻干
在实施例2基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM687替换为Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102，实验结果如表2所示。
表2：Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000092
Figure BDA0003090682390000101
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加***糖提升效果较小；添加脯氨酸效果最为显著，其冻干后活菌数由2.42±0.47×1011CFU/g提升至10.28±0.35×1011CFU/g，冻干存活率由26.6±0.41％提升至99.43±0.37％，冻干存活率提升了约3.89倍。
实施例4：Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077的发酵与冻干
在实施例2基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM687替换为Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077，实验结果如表3。
表3 Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000102
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.09±0.31×1011CFU/g提升至9.71±0.18×1011CFU/g，冻干存活率由31.39±0.19％提升至97.93±0.06％，冻干存活率提升了约3.12倍。
实施例5：Bifidobacterium breve CCFM 1026的发酵与冻干
在实施例2基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM687替换为Bifidobacterium breve CCFM 1026，实验结果如表4。
表4 Bifidobacterium breve CCFM 1026利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000111
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.78±0.3×1011CFU/g提升至9.12±0.44×1011CFU/g，冻干存活率由41.47±0.3％提升至91.21±0.33％，冻干存活率提升了约2.20倍。
实施例6：Bifidobacterium breve CCFM 1067的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium breve CCFM 1067，实验结果如表5。
表5 Bifidobacterium breve CCFM 1067利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000121
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.84±0.23×1011CFU/g提升至9.68±0.28×1011CFU/g，冻干存活率由30.67±0.49％提升至97.77±0.28％，冻干存活率提升了约3.19倍。
实施例7：Bifidobacterium breve CCFM 1078的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium breve CCFM 1078，实验结果如表6。
表6 Bifidobacterium breve CCFM 1078利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000122
Figure BDA0003090682390000131
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.88±0.22×1011CFU/g提升至9.69±0.33×1011CFU/g，冻干存活率由39.4±0.24％提升至97.41±0.15％，冻干存活率提升了约2.90倍。
实施例8：Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108，并且渗透压调整为750～950mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：22.5-28.5g/L)，实验结果如表7。
表7 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000132
Figure BDA0003090682390000141
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.71±0.19×1011CFU/g提升至9.59±0.45×1011CFU/g，冻干存活率由27.84±0.37％提升至96.87±0.61％，冻干存活率提升了约3.48倍。
实施例9：Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062，并且渗透压调整为750～950mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：22.5-28.5g/L)，实验结果如表8。
表8：Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000142
Figure BDA0003090682390000151
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥18.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.41±0.24×1011CFU/g提升至10.65±0.45×1011CFU/g，冻干存活率由37.27±0.07％提升至99.52±0.27％，冻干存活率提升了约2.85倍。
实施例10：Bifidobacterium adolescentis CCFM 1061的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium adolescentis CCFM 1061，并且渗透压调整为750～950mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：22.5-28.5g/L)，实验结果如表9。
表9 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1061利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000152
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥18.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.81±0.29×1011CFU/g提升至9.91±0.37×1011CFU/g，冻干存活率由31.07±0.56％提升至99.22±0.33％，冻干存活率提升了约3.19倍。
实施例11：Bifidobacterium bifidum CCFM 1063的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium bifidum CCFM 1063，并且渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)，实验结果如表10。
表10 Bifidobacterium bifidum CCFM 1063利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000161
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥18.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由1.76±0.34×1011CFU/g提升至9.19±0.44×1011CFU/g，冻干存活率由20.7±0.4％提升至92.63±0.44％，冻干存活率提升了约4.47倍。
实施例12：Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632，并且渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)，实验结果如表11。
表11 Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000171
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥18.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.14±0.24×1011CFU/g提升至9.82±0.31×1011CFU/g，冻干存活率由23.05±0.27％提升至98.34±0.38％，冻干存活率提升了约4.27倍。
实施例13：Bifidobacterium bifidum HNJ6的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium bifidum HNJ6，并且渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)，实验结果如表12。
表12 Bifidobacterium bifidum HNJ6利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000181
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥18.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.71±0.35×1011CFU/g提升至9.81±0.36×1011CFU/g，冻干存活率由27.87±0.58％提升至98.46±0.58％，冻干存活率提升了约3.53倍。
实施例14：Bifidobacterium bifidum CCFM 1150的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium bifidum CCFM 1150，并且渗透压调整为550～850mOsm/kg(NaCl溶液浓度为：16.5-25.5g/L)，实验结果如表13。
表13 Bifidobacterium bifidum CCFM 1150利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000191
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥19.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由2.6±0.42×1011CFU/g提升至10.77±0.18×1011CFU/g，冻干存活率由30.35±0.16％提升至99.03±0.42％，冻干存活率提升了约3.56倍。
实施例15：Bifidobacterium animalis CCFM 1148的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium animalis CCFM 1148，实验结果如表14。
表14 Bifidobacterium animalis CCFM 1148利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000192
Figure BDA0003090682390000201
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥16.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.58±0.23×1011CFU/g提升至9.72±0.41×1011CFU/g，冻干存活率由39.07±0.5％提升至97.7±0.36％，冻干存活率提升了约2.50倍。
实施例16：Bifidobacterium animalis BB12的发酵与冻干
在实施例2的基础上，将实施例2的Bifidobacterium longum subsp.infantisCCFM 687替换为Bifidobacterium animalis BB12，实验结果如表15。
表15 Bifidobacterium animalis BB12利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000202
Figure BDA0003090682390000211
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥17.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；相比空白组，实验组冻干后活菌数以及冻干存活率均有显著提高，其中添加脯氨酸冻干后活菌数以及冻干存活率最高，其冻干后活菌数由3.15±0.2×1011CFU/g提升至9.87±0.37×1011CFU/g，冻干存活率由33.85±0.41％提升至99.05±0.52％，冻干存活率提升了约2.92倍。
实施例17：添加不同量脯氨酸发酵与冻干双歧杆菌
本实施例参考实施例2～7的结果，选择添加脯氨酸发酵以提高双歧杆菌的冻干存活率，具体方法如下。
在实施例2的基础上，将脯氨酸的浓度设定为10g/L、20g/L、30g/L，并设置对照：将相容性溶质调整为浓度为30g/L的无水葡萄糖；然后分别制备冻干双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687、Bifidobacterium longumsubsp.longum CCFM 1102、Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077、Bifidobacterium breve CCFM 1026、Bifidobacterium breve CCFM 1067、Bifidobacterium breve CCFM 1078、Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108、Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062、Bifidobacterium adolescentic CCFM1061、Bifidobacterium bifidum CCFM1063、Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632、Bifidobacterium bifidum HNJ6、Bifidobacterium bifidum CCFM 1150、Bifidobacterium animalis CCFM1148、Bifidobacterium animalis BB12)，探究相容性溶质的最适添加量，结果如表16～表30所示。
表16 Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000212
表17 Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000221
表18 Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000222
表19 Bifidobacterium breve CCFM 1026利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000223
表20 Bifidobacterium breve CCFM 1067利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000224
表21 Bifidobacterium breve CCFM 1078利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000225
表22 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000231
表23 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000232
表24 Bifidobacterium adolescentic CCFM 1061利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000233
表25 Bifidobacterium bifidum CCFM 1063利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000234
表26 Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000235
Figure BDA0003090682390000241
表27 Bifidobacterium bifidum HNJ6利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000242
表28 Bifidobacterium bifidum CCFM 1150利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000243
表29 Bifidobacterium animalis CCFM 1148利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000244
表30 Bifidobacterium animalis BB12利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000245
根据表16-30的结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量均≥8.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；脯氨酸添加量在0-30g/L之间时，双歧杆菌的冻干存活率和冻干后活菌数都随着脯氨酸添加量的增加而显著提高，在20-30g/L时达到最大。
由于双歧杆菌最高耐渗透压较低，而过量添加脯氨酸虽然会提高菌株的冻干存活率但也会在一定程度引起渗透压的升高，从而降低双歧杆菌发酵液菌泥的产量，因此选取添加20g/L进行后续试验。
实施例18：添加脯氨酸发酵双歧杆菌在不同渗透压下收菌与冻干
参考实施例8的结果，选择添加20g/L脯氨酸发酵以提高双歧杆菌的冻干存活率。
为探究添加脯氨酸提升双歧杆菌冻干存活率的条件，在实施例2的基础上，以方案一为空白组(A组)；
将脯氨酸的浓度设定20g/L并改变发酵培养基中添加的葡萄糖含量，分别添加20g/L、60g/L的无水葡萄糖设为B组和C组，分别制备冻干双歧杆菌(长双歧杆菌CCFM1102、长双歧杆菌CCFM1109、短双歧杆菌CCFM1067、短双歧杆菌CCFM1078、青春双歧杆菌CCFM1061、两歧双歧杆菌CCFM116)至稳定期收菌，探究添加相容性溶质提高双歧杆菌冻干存活率的条件。
表31 Bifidobacterium longum subsp.infantis CCFM 687利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000251
表32 Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1102利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000252
表33 Bifidobacterium longum subsp.longum CCFM 1077利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000253
表34 Bifidobacterium breve CCFM 1026利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000254
Figure BDA0003090682390000261
表35 Bifidobacterium breve CCFM 1067利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000262
表36 Bifidobacterium breve CCFM 1078利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000263
表37 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1108利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000264
表38 Bifidobacterium adolescentis CCFM 1062利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000265
表39 Bifidobacterium adolescentic CCFM 1061利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000266
表40 Bifidobacterium bifidum CCFM 1063利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000271
表41 Bifidobacterium bifidum CGMCC NO.13632利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000272
表42 Bifidobacterium bifidum HNJ6利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000273
表43 Bifidobacterium bifidum CCFM 1150利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000274
表44 Bifidobacterium animalis CCFM 1148利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000275
表45 Bifidobacterium animalis BB12利用本实施例方法发酵冻干结果
Figure BDA0003090682390000276
Figure BDA0003090682390000281
根据表31-45的结果表明，比较A组和B组可知，添加脯氨酸发酵至低渗透压下收菌未能显著提高双歧杆菌的冻干存活率；对比B组和C组可知，在添加脯氨酸和高渗胁迫的协同作用下，渗透压达到接近完全抑制渗透压，才能显著提高双歧杆菌的冻干存活率和冻干后活菌数。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将双歧杆菌接种至含有相容性溶质的发酵培养基中进行发酵，所述相容性溶质包括氨基酸、季铵盐、糖、糖醇中的一种或多种；发酵结束后离心收菌得到的菌体；
(2)将步骤(1)制备得到的菌体采用渗透压值为550～1100mOsm/kg的溶液洗涤后，将菌体与保护剂混合，冷冻干燥制备得到双歧杆菌菌粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相容性溶质包括：谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、乳糖、水苏糖、***糖、山梨糖醇、甘露醇、肌醇中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌包括：长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：氮源1～50g/L，碳源1～100g/L，缓冲盐0～30g/L，七水合硫酸镁0.01～0.30g/L，一水合硫酸锰0～0.1g/L，吐温-80 0.1～2mL/L，半胱氨酸0.1～2g/L，相容性溶质10-30g/L。
5.一种提高双歧杆菌冻干存活率的方法，其特征在于，所述方法为：将双歧杆菌接种至含有相容性溶质的发酵培养基中进行发酵，所述相容性溶质包括氨基酸、季铵盐、糖、糖醇中的一种或多种；发酵结束后离心收菌得到的菌体；将菌体采用渗透压为550～1100mOsm/kg的溶液洗涤后，将菌体与保护剂混合，冷冻干燥。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述相容性溶质包括：谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、乳糖、水苏糖、***糖、山梨糖醇、甘露醇、肌醇中的一种或多种。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述菌体与所述保护剂按照1:1的比例混合。
8.如权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述保护剂为山梨糖醇溶液、海藻糖或蔗糖。
9.如权利要求5～8任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：氮源1～50g/L，碳源1～100g/L，缓冲盐0～30g/L，七水合硫酸镁0.01～0.30g/L，一水合硫酸锰0～0.1g/L，吐温-80 0.1～2mL/L，半胱氨酸0.1～2g/L，相容性溶质10-30g/L。
10.权利要求1～4任一所述的方法制备得到的双歧杆菌冻干粉。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534434A (zh) * 2020-06-28 2020-08-14 江南大学 一种冻干保护剂及其在冻干青春双歧杆菌中的应用
CN114292773A (zh) * 2021-12-07 2022-04-08 上海珈凯生物科技有限公司 一种青春双歧杆菌及其筛选、培养方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102408993A (zh) * 2011-11-23 2012-04-11 陕西农产品加工技术研究院 一种两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法
WO2016200048A1 (ko) * 2015-06-11 2016-12-15 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
CN111534435A (zh) * 2020-06-30 2020-08-14 江南大学 一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102408993A (zh) * 2011-11-23 2012-04-11 陕西农产品加工技术研究院 一种两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法
WO2016200048A1 (ko) * 2015-06-11 2016-12-15 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
CN111534435A (zh) * 2020-06-30 2020-08-14 江南大学 一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAUDE P. CHAMPAGNE，ET AL: "Effect of water activity and protective solutes on growth and subsequent survival to air-drying of Lactobacillus and Bifidobacterium cultures", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
朱校适等: "青春双歧杆菌YBN2的发酵放大及工业化生产", 《食品工业》 *
胡曼: "两歧双歧杆菌培养及冻干保护剂的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534434A (zh) * 2020-06-28 2020-08-14 江南大学 一种冻干保护剂及其在冻干青春双歧杆菌中的应用
CN111534434B (zh) * 2020-06-28 2022-07-05 江南大学 一种冻干保护剂及其在冻干青春双歧杆菌中的应用
CN114292773A (zh) * 2021-12-07 2022-04-08 上海珈凯生物科技有限公司 一种青春双歧杆菌及其筛选、培养方法和应用
CN114292773B (zh) * 2021-12-07 2023-09-26 上海珈凯生物股份有限公司 一种青春双歧杆菌及其筛选、培养方法和应用

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