CN107325970B

CN107325970B - 真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的方法及其应用

Info

Publication number: CN107325970B
Application number: CN201610027125.2A
Authority: CN
Inventors: 曾凯芳; 牛晓影; 邓丽莉; 周雅涵; 姚世响; 王威浩
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: CN107325970A

Abstract

本发明涉及一种真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母保护剂的方法，其特征在于包括如下步骤：将膜醭毕赤酵母接种到新鲜的NYDA培养基上，经活化48 h后再将活化好的酵母接种到NYDB（不加琼脂的NYDA）培养基中，在28°C、180 rpm条件下培养24 h，之后在1351×g、4°C条件下离心10min，弃上清液，加入无菌水，再次离心，加入无菌水，用血球计数板制成2×10⁸ CFU/ml酵母悬浮液；保护剂悬浮液与酵母悬浮液等体积混合得到样品；分装1 mL的样品在10 mL的烧杯中，在−20°C条件下冷冻12h，之后在冷阱温度为−50°C、真空度为1–10 Pa条件下冻干。

Description

真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的方法及应用。

背景技术

膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)是一种能够有效控制果蔬采后病害的酵母菌，国内外大量研究表明，该酵母能够防治柑橘、苹果、桃、枇杷、樱桃、杨梅等水果采后的主要病害。然而关于膜醭毕赤酵母在采后领域的商业化应用研究却较少。

真空冷冻干燥是一种在研究和工业中广泛应用的保种技术。在食品领域中，常用该技术生产微生物固态制剂，例如发酵剂、益生菌剂、生防制剂等。真空冷冻干燥技术能够很好的满足微生物商业化的要求，但在冻干过程中，微生物的存活率、功能性活力例如生防效力、产酸能力等会受到影响，尤其是冻干后微生物较低的存活率，是限制其商业化应用的首要因素。大量研究表明，冻干过程中的每一步几乎都会影响微生物的存活率，包括微生物菌种、微生物培养条件、冷冻温度、干燥压力、贮藏和复水的条件等，而冻干前在微生物悬浮液中添加合适的保护剂是提高其存活率的有效手段。糖类、蛋白质类、抗氧化类试剂是常用且能够有效提高微生物存活率的几类保护剂，而在真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的应用中却未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种提高真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母存活率的保护剂复配方案；本发明的目的之二在于提供冻干膜醭毕赤酵母在柑橘果实保鲜中的应用，即使用上述复配保护剂方案进行冻干酵母。

附图说明

图1A、图1B和图1C分别为是不同浓度的糖醇类保护剂、抗氧化类保护剂、脱脂奶粉对冻干膜醭毕赤酵母存活率的影响的曲线图。

图2A和图2B、图2C和图2D、图2E和图2F分别为蔗糖和谷氨酸钠、蔗糖和脱脂奶粉、谷氨酸钠和脱脂奶粉对冻干膜醭毕赤酵母存活率交互影响的响应面和等高线图。

图3A和图3B、图3C和图3D、图3E和图3F分别为蔗糖和谷氨酸钠、蔗糖和脱脂奶粉、谷氨酸钠和脱脂奶粉对冻干膜醭毕赤酵母存活率交互影响的响应面和等高线图。

图4A和图4B、图4C和图4D、图4E和图4F分别为冻干膜醭毕赤酵母对柑橘采后绿霉病、青霉病、炭疽病的控制效果柱形图。

其中，W代表无菌水；FY代表新鲜酵母(1×10⁸CFU mL^-1)；FDY代表用无菌水复水的冻干酵母(1×10⁸CFU mL^-1)；P代表最优保护剂配方。

具体实施方式

一、酵母及酵母悬浮液的制备

膜醭毕赤酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。该酵母在NYDA培养基(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml)中、4℃条件下保藏。每两个月活化一次。

进行冻干试验前，膜醭毕赤酵母首先接种到新鲜的NYDA培养基上，在28℃条件下活化48h，再将活化好的酵母接种到NYDB(不加琼脂的NYDA)培养基中，在28℃、180rpm条件下培养24h，之后在1351×g、4℃条件下离心10min，弃上清液，加入无菌水，再次离心(进行两次，以保证培养基无残留)，加入无菌水，用血球计数板制成2×10⁸CFU/ml酵母悬浮液。

二、保护剂及保护剂悬浮液的制备

试验中所使用的保护剂包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖醇、谷氨酸钠、抗坏血酸、脱脂奶粉。所有保护剂按比例溶解到无菌水中以制备保护剂悬浮液，使得最后与酵母悬浮液混合后浓度如试验方案中所示。具体保护剂试验方案如下：

1、保护剂的单因素试验

(1)对照：无菌水

(2)1％、5％、10％、15％、20％、25％蔗糖

(3)1％、5％、10％、15％、20％、25％乳糖

(4)1％、5％、10％、15％、20％、25％半乳糖

(5)1％、5％、10％、15％、20％、25％葡萄糖

(6)1％、5％、10％、15％、20％、25％山梨糖醇

(7)0.1％、1％、3％、4％、5％、6％、7％谷氨酸钠

(8)0.1％、1％、3％、4％、5％、6％、7％抗坏血酸

(9)1％、5％、10％、15％、20％、25％脱脂奶粉

2、保护剂的正交试验

基于保护剂单因素的试验结果，使用蔗糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉进行三因素四水平的正交试验，具体试验方案见表1。

3、保护剂的第一次旋转回归试验

基于保护剂正交试验的试验结果，继续使用蔗糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉进行三元二次正交旋转回归试验，具体试验方案见表6。

4、保护剂的第二次旋转回归试验

基于保护剂第一次旋转回归试验的试验结果，改变保护剂浓度，继续使用蔗糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉进行三元二次正交旋转回归试验，具体试验方案见表9。

三、样品的制备及真空冷冻干燥

保护剂悬浮液与酵母悬浮液等体积混合得到样品。样品在漩涡振荡仪中均匀混合1min，之后在室温下静置60min。

分装1mL的样品在10mL的烧杯中，在-20℃条件下冷冻12h，之后在冷阱温度为-50℃、真空度为1–10Pa条件下冻干24h。试验重复三次。

四、酵母存活率的测定

酵母存活率用冻干前酵母的菌落总数(N₀)以及冻干后酵母的菌落总数(N_f)来表示。冻干前，稀释到合适浓度的酵母涂布在NYDA平板上。冻干后，每个冻干样品用4mL的无菌水溶解，用漩涡振荡仪均匀混合1min，再在室温下静置60min，稀释到合适的浓度，涂布在NYDA平板上。上述平板均在28℃条件下培养48h。试验重复三次，用如下公式计算存活率：

存活率＝(N_f/N₀)×100％

五、冻干膜醭毕赤酵母在柑橘果实上的应用

试验所采用柑橘品种为北碚447^#锦橙(Citrus Sinensic Osbeck.cv.Jincheng447^#)，采自重庆市北碚区。挑选新鲜无机械伤、大小均一、成熟度一致的果实作为试验材料。使用前，将挑选好的果实用2％的次氯酸钠溶液浸泡2min，用清水冲洗，在室温下(20℃)下晾干。

青霉菌(Penicillium italicum)、绿霉菌(Penicillium digitatum)和炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为本实验室保存菌种。上述病原菌分别在PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g，水1000ml)中、在4℃条件下保藏。每两个月活化一次。冻干试验前，病原菌分别接种到新鲜的PDA培养基上，在28℃条件下培养10d(此过程连续进行两次)，用无菌水将孢子洗下，四层纱布过滤后，血球计数板计数，再用无菌水稀释至所需浓度(1×10⁴spores mL^-1)。

为确定冻干膜醭毕赤酵母在柑橘果实上的生防效果，进行如下试验：用消毒后的打孔器在果实赤道部位等距离打孔2个(深4mm，直径6mm)，每个孔用微量移液器注入30μL如下处理液：无菌水、新鲜酵母(1×10⁸CFU mL^-1)、用无菌水复水的冻干酵母(1×10⁸CFU mL^-1)，最优保护剂配方。4h后，再次分别注入20μL、1×10⁴spores mL^-1的青霉菌，绿霉菌以及炭疽菌，待菌液吸收后，单果包装，在温度20℃、相对湿度85％～95％的环境下贮藏。每天记录果实的发病率和病斑直径。每组处理3个果实，重复三次。

研究结果：

一、真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母保护剂的优化

1、保护剂的单因素试验

从图1可看出，在糖醇类保护剂中，15％的蔗糖效果最佳，存活率为59.64％。在抗氧化类保护剂中，5％的谷氨酸钠效果最佳，存活率为20.95％。15％的脱脂奶粉效果最佳，存活率为33.9％。

2、保护剂的正交试验

表1真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母保护剂复配试验方案L₁₆(4⁵)及结果

表2正交试验方差分析表

表3A因素各水平均值多重比较结果(SSR法)

表4B因素各水平均值多重比较结果(SSR法)

表5C因素各水平均值多重比较结果(SSR法)

从表2可看出，蔗糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉对冻干酵母存活率的效果均极显著，说明所选用的三种保护剂是有效的，但是模型误差也是极显著的，说明此模型不适合该试验。通过表3-5，确定的最佳保护剂配比为5％蔗糖、3％谷氨酸钠和10％脱脂奶粉，三种保护剂的浓度均处在所设浓度的最低水平上。基于以上两点，扩大各保护剂浓度范围，进行三元二次正交旋转组合试验。

3、保护剂的第一次旋转回归试验

表6三元二次正交旋转组合设计编码表

表7三元二次正交旋转组合设计及结果

表8三元二次正交旋转组合设计的方差分析

从表8可看出，模型是极显著的，失拟是不显著的，故该模型有效，蔗糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉的效果是显著的，蔗糖和谷氨酸钠的交互作用是不显著的，蔗糖和脱脂奶粉、谷氨酸钠和脱脂奶粉的交互作用是显著的，图2所示符合方差分析结果。通过Design Expert软件分析结果得出最佳保护剂配比为5％蔗糖、4％谷氨酸钠和5％脱脂奶粉，存活率可达到72.83％。因试验所得最佳保护剂配比中，蔗糖和脱脂奶粉都处在所设浓度的最低水平上，故调整浓度范围再次进行三元二次正交旋转组合试验。

4、保护剂的第二次旋转回归试验

表9三元二次正交旋转组合设计编码表

表10三元二次正交旋转组合设计及结果

表11三元二次正交旋转组合设计的方差分析

从表11可看出，模型是极显著的，失拟是不显著的，故该模型有效，蔗糖、谷氨酸钠的效果是显著的，脱脂奶粉的效果是不显著的，谷氨酸钠和脱脂奶粉的交互作用是不显著的，蔗糖和谷氨酸钠、蔗糖和脱脂奶粉的交互作用是显著的，图3所示符合方差分析结果。通过Design Expert软件分析结果得出最佳保护剂配比为6.04％蔗糖、3.41％谷氨酸钠和5.34％脱脂奶粉，存活率可达到74.24％。使用该保护剂配方进行验证试验，得到冻干酵母的存活率为76.80％±4.27％(n＝3)。

综上得出，真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的保护剂最佳复配方案为6.04％蔗糖、3.41％谷氨酸钠和5.34％脱脂奶粉。

二、冻干酵母在柑橘果实上的应用

从图4可看出，与无菌水相比，新鲜酵母和冻干酵母均能够显著降低柑橘果实青绿霉病、炭疽病的发病率和病斑直径。冻干酵母与新鲜酵母相比没有显著性差异。最优保护剂配方对柑橘果实的青绿霉病、炭疽病没有防治效果。

综上，试验所得真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母可以应用在柑橘果实的保鲜上。

Claims

1.一种真空冷冻干燥膜醭毕赤酵母的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将膜醭毕赤酵母接种到新鲜的NYDA培养基上，在28℃条件下活化48h，再将活化好的酵母接种到NYDB(不加琼脂的NYDA)培养基中，在28℃、180rpm条件下培养24h，之后在1351×g、4℃条件下离心10min，弃上清液，加入无菌水，再次离心，加入无菌水，用血球计数板制成2×10⁸CFU/ml酵母悬浮液；

(2)将以下组分按比例溶解到无菌水中比例制成悬浮液，作为膜醭毕赤酵母的保护剂：6.04％蔗糖、3.41％谷氨酸钠和5.34％脱脂奶粉；

(3)将上述保护剂悬浮液与酵母悬浮液等体积混合得到样品，样品在漩涡振荡仪中均匀混合1min，之后在室温下静置60min；

(4)分装1mL的样品在10mL的烧杯中，在-20℃条件下冷冻12h，之后在冷阱温度为-50℃、真空度为1–10Pa条件下冻干。

2.一种如权利要求1所述的方法在柑橘果实保鲜上的应用。