CN115838643A - 一种茶树内生真菌及在促进铁皮石斛生长的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶树内生真菌及在促进铁皮石斛生长的应用，属于微生物技术领域。本发明涉及的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)，于2022年09月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏名称为：KLBMP0506，保藏编号为：CGMCCNo.25719。其在促进铁皮石斛生长及次级代谢产物积累等方面具有显著作用，为开发珍稀药用石斛属植物促生菌肥提供优良的菌种资源，促进石斛产业化发展，具有良好的应用开发前景。

Description

一种茶树内生真菌及在促进铁皮石斛生长的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种茶树内生真菌的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)及其在促进铁皮石斛生长中的应用。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，又名黑节草，隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)，是我国特有珍稀濒危药用植物。具有养阴生津、护肝利胆、养胃护肠、降糖明目、抗癌防老等功效。现已被列入《中国药典》(TheState PharmacopoeiaCommissionofP.R.China,2010)及药食同源目录。由于其极高的药用、经济价值，市场对铁皮石斛的需求量不断扩大，导致了严重的滥采滥挖现象，加上其自身在自然环境下生长速度缓慢，种子萌发率低，对生境要求苛刻，铁皮石斛的野生资源已近乎枯竭。人工栽培是解决其野生资源短缺问题的有效途径。但人工种植铁皮石斛仍面临生长周期长、平均产量低等问题，为追求高产、缩短生长周期，目前铁皮石斛石斛种植产业存在的植物生长调节剂、化肥使用超标现象十分严重，导致人工种植的铁皮石斛品质差，这些问题在一定程度上限制了铁皮石斛的产业化发展。

植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在健康植物组织或器官内，并对宿主植物没有引起明显病害症状的一类微生物群，主要包括内生真菌、内生细菌、内生放线菌。植物内生菌作为一类重要的微生物资源，在对植物的生长发育、次生代谢物的积累、抗逆性的提高等方面具有重要的促进作用。近年来，探究内生菌与药用植物的互作关系，利用内生菌提高药用植物的产量及品质已成为多个领域的研究热点。高产和优质一直是中药材研究追求的目标，利用内生菌资源提高药用植物的产量和质量，对保护和开发药用植物资源具有重要的生态意义。

目前已有一些关于利用内生菌促进铁皮石斛生长的研究，但效果并不理想，目前利用的功能菌株很难达到既能促进铁皮石斛生长，同时又能提高其次级代谢产物的含量。胡秀芳等人利用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)实现了促进铁皮石斛组培苗的生长，但鲜重和干重仅增加了10％左右。

发明内容

针对现有技术的不足之处，提供一种对铁皮石斛有明显促生作用的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)该菌株可促进铁皮石斛的生长及次级代谢产物的积累，有利于解决铁皮石斛培育及栽培过程中生长速度慢、周期长、品质差等技术难题。

为了实现上述技术目的，本发明的一种茶树内生真菌，其特征在于：该茶树内生真菌的分类明命名为异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：KLBMP0506，保藏编号为：CGMCCNo.25719，保藏日期为2022年09月15日。

一种如权利要求1所述的茶树内生真菌的应用，能够促进铁皮石斛生长及次级代谢产物的积累。

一种制备茶树内生真菌菌剂的方法，利用权利要求1所述的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)，进行如下处理：

将菌株KLBMP0506接种于新鲜的YPD液体培养基中，于28℃摇床，200rpm/min培养16h，活化菌株；

按照体积比为1:100的比例将已活化好的菌液2mL转接至200mLYPD液体培养基中，于28℃，200rpm/min摇床培养至OD₆₀₀＝0.6；

对培养产物进行6000rpm/min离心10min，弃上清收集菌体，并用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5。

进一步，将KLBMP0506菌液接种于铁皮石斛组培苗，每瓶组培苗接种200μL菌液，菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5，菌液接在组培苗基部附近，从而促进铁皮石斛的生长及次级代谢产物的积累。

进一步，所述YPD液体培养基为：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，定容至1000mL蒸馏水中，PH自然。

进一步，所述菌剂为微生物肥料。

一种组合物，包含权利要求1所述的茶树内生真菌。

本发明的一种茶树内生真菌为异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)，菌株KLBMP0506从茶树果实中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，具体分离纯化方法如下：

1)取采自江西高安的茶树果实，流水冲洗10min，并将冲洗过后的样本超声波清洗10min，以避免组织表面附着的难冲洗物质影响分离结果，然后在超净工作台内将冲洗后的样本先用75％乙醇浸泡消毒1min，无菌水冲洗1次，然后用2％次氯酸钠溶液浸泡消毒6min，无菌水洗3遍，表面消毒后的样本用剪刀剪成小组织后平铺在YPD固体培养基上，于28℃环境培养2-5d，直至长出单菌落；

2)挑取单菌落于同上述步骤(1)中的YPD平板划线纯化，于28℃环境培养，并进行划线纯化分离，获得纯培养物。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

本发明的菌株KLBMP0506对铁皮石斛促生效果显著，同时可以有效促进铁皮石斛次级代谢产物的积累。该菌株可作为微生物菌肥，用于铁皮石斛的种苗培育及人工种植过程，提升其药材的质量，保证药材使用的有效性及安全性，能够减轻化肥滥用带来的环境污染问题。

本发明从植物内生菌的角度出发，利用菌株KLBMP0506显著促进了铁皮石斛生长，同时有效提高了铁皮石斛次级代谢产物的含量。本发明提供的菌株可作为微生物菌肥，用于铁皮石斛的种苗培育及人工栽培过程，提升铁皮石斛药材的质量，保证其药材使用的有效性及安全性，同时也能够减轻大量使用化肥带来的环境污染问题。

本发明的菌株KLBMP0506培养条件简单、容易保存、遗传稳定、易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的菌株KLBMP0506在YPD固体培养基上的形态图，图中A为平板正面；B为平板反面。

图2为本发明所述的菌株KLBMP0506对铁皮石斛生长的影响(CK为对照组，3w、6w、9w分别代表菌株KLBMP0506与铁皮石斛共培养3周、6周和9周)，图中A为鲜重；B为干重。

图3为本发明所述的菌株KLBMP0506对铁皮石斛多糖积累的影响，图中A为总多糖标准曲线；B为各组总多糖含量。

图4为本发明所述的菌株KLBMP0506对铁皮石斛石斛碱积累的影响，图中A为石斛碱标准曲线；B为各组石斛碱含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，帮助更好地理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：菌株KLBMP0506的分离纯化与鉴定

一、菌株的分离纯化

(1)菌株是从采自江西高安的健康茶树果实中分离获得，将采摘的新鲜茶树果实封装于自封袋内低温带回实验室4℃保存，用于后续植物内生真菌的分离。

(2)将茶树果实用流水冲洗10min，并将冲洗过后的样本超声波清洗10min，以避免组织表面附着的难冲洗物影响分离结果。

(3)将清洗后的样本在超净工作台中进行表面消毒处理，先用75％乙醇溶液处理1min，无菌水冲洗1次，然后用2％次氯酸钠溶液处理6min，无菌水冲洗3次，最后一遍冲洗的无菌水保留待用，将表面消毒后的样本放在无菌的滤纸上吸干水分待用。

(4)将消毒后的样本用灭菌后的剪刀剪成碎组织，然后将剪碎组织平铺于YPD平板上，28℃环境培养2-5d，同时对上述步骤(3)中最后一遍冲洗的无菌水进行常规的无菌检测，以确保样本的表面消毒彻底。

(5)挑取YPD平板上长出的单菌落，并接种于相同培养基(YPD)进行划线纯化分离，置于28℃培养2-5d，继续挑取单菌落，重复多次分离纯化培养，直至获得纯培养物为止。

二、菌株的鉴定

茶树内生真菌的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomycessp.)所具有的菌落及形态特征和生理生化特征如下：

(1)菌株的形态特征

纯化后的菌株在YPD固体培养基上生长良好，菌落成圆形，乳白色，表面光滑较湿润、边缘整齐、菌落正反面颜色相同(如图1)。

(2)菌株的生理生化特征

菌株KLBMP0506能利用葡萄糖，水解尿素、甘露醇、木糖、明胶，不水解淀粉，氧化酶反应、V-P反应为阴性，能够解磷，产色氨酸，在6％NaCl中生长，8％NaCl中不生长，适宜生长温度28℃。

(3)菌株ITS序列测序

对纯化后的菌株进行ITS序列PCR扩增并测序(按常规PCR方法扩增)，ITS序列测序结果如SEQ ID NO.1所示，将测序结果与NCBI数据库进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，比对结果表明菌株KLBMP0506与Wickerhamomycessp.strainLP8的相似性为99.82％。结合形态特征及分子手段鉴定菌株KLBMP0506为异常威克汉姆酵母属(Wickerhamomycessp.)

实施例2：菌株KLBMP0506对铁皮石斛生长的影响，如图2所示，

(1)将菌株KLBMP0506接种于新鲜的YPD液体培养基中，于28℃摇床，200rpm培养约16h，活化菌株；然后按照1:100的比例转接至200mLYPD液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，6000rpm离心10min，弃上清收集菌体，并用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5。

(2)在超净工作台内挑选长势一致的铁皮石斛组培苗，称取重量后转接到新的培养基中(每瓶组培苗约4.5g)，每瓶按照三角形接种3丛植株，共转接50瓶苗放于组培室培养，培养条件为25℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。

(3)上述步骤(2)中转接苗在培养的第0周、第3周、第6周分别吸取200μL上述步骤(1)中的菌液接种在每瓶三丛组培苗中间，每个处理时间重复10瓶；另外设置空白对照组，即不接菌的铁皮石斛组培苗，对照组同样10瓶重复。

(4)各组均在转接到新培养基培养9周后收获，即获得对照组、与菌共培养3周、与菌共培养6周、与菌共培养9周，共4组材料。

称量4组材料的鲜重和干重，结果如图2所示，与菌株KLBMP0506共培养3周、6周、9周的铁皮石斛组培苗鲜重较对照组分别增加了5.8％、9.8％以及16.1％，干重较对照组也呈递增趋势，分别增加了30.4％、42.0％以及47.3％。

实施例3：菌株KLBMP0506对铁皮石斛多糖积累的影响，如图3所示，

对实施例2中4组材料的多糖含量进行测定。具体测定方法如下：1.将待测样品烘干，称取样品约0.05g，加入1mL蒸馏水研磨均匀；然后于100℃沸水浴加热2h，静置冷却，10000rcf离心10min；吸取上清200μL，缓慢加入800μL的无水乙醇，上下颠倒混匀后放在4℃冰箱中过夜沉降；吸取200μL上述溶液，加入100μL苯酚以及500μL浓硫酸，混合均匀后90℃水浴反应20min，流水冷却至室温；取200μL加入酶标板，测定490nm处吸光值，记为A490；绘制标准曲线：将葡萄糖标准品配制为1mg/mL的溶液，并梯度稀释，然后按上述方法检测。样品总多糖含量计算：总多糖含量(mg/g)

样品体积稀释5倍，y为带入标准曲线所得值，V为上清液体积(0.2mL)，W为样品的质量(g)。

基于绘制的标准曲线(图3-A)，计算获得各组的多糖含量(图3-B)，对照组的多糖含量为53.799mg/g，而与KLBMP0506共生3周、6周、9周的3组材料多糖含量分别为93.911mg/g、117.542mg/g以及144.365mg/g，比对照组分别增加了74.6％、118.5％以及168.3％。

实施例4：菌株KLBMP0506对铁皮石斛石斛碱积累的影响，如图4所示，

对实施例2中4组材料的石斛碱含量进行测定，石斛碱的测定参考《中国药典》2020版，采用气相色谱法检测。

将待测的植物样品恒温干燥后用研钵研磨成粉末，准确称量粉末0.1g，加入甲醇10mL(含有0.05％的甲酸)，加热回流约3h，冷却至室温后将提取液转移至新的烧杯中并定容至10mL，混匀后取提取液过滤膜待用。检测条件：色谱柱DB-1：长度30m，内径宽0.25mm，膜厚0.25μm，柱温80℃，进样量5μL，检测温度为250℃。绘制标准曲线:将石斛碱标准品分别稀释至0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL以及2.5μg/mL，然后按上述方法进行检测。

通过石斛碱标准品检测得到石斛碱的标准曲线：y＝7.7016x-0.1856，R²＝0.9993(图4-A)。将4组通过气相色谱检测得到的结果带入标准曲线，计算获得4组材料的石斛碱含量(图4-B)，对照组的石斛碱含量为2.045μg/g，与菌株KLBMP0506共生3周、6周、9周的3组材料石斛碱含量分别为2.443μg/g、4.792μg/g以及5.271μg/g，相比对照组分别增加了19.5％，134.3％以及157.8％。

综合以上实施例的结果，本发明提供的菌株KLBMP0506能够有效促进铁皮石斛的生长及次级代谢产物的积累，该菌株可作为微生物菌肥，用于铁皮石斛的种苗培育及人工栽培过程，提升药材的质量，对保证铁皮石斛药材使用的有效性和安全性具有重要意义。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种茶树内生真菌，其特征在于：该茶树内生真菌的分类明命名为异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomyces sp.)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：KLBMP0506，保藏编号为：CGMCC No.25719，保藏日期为2022年09月15日。

2.一种如权利要求1所述的茶树内生真菌的应用，其特征在于：促进铁皮石斛生长及次级代谢产物的积累。

3.一种制备茶树内生真菌菌剂的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的异常威克汉姆酵母属菌株(Wickerhamomyces sp.)，进行如下处理：

将菌株KLBMP0506接种于新鲜的YPD液体培养基中，于28℃摇床，200rpm/min培养16h，活化菌株；

按照体积比为1:100的比例将已活化好的菌液2mL转接至200mL YPD液体培养基中，于28℃，200rpm/min摇床培养至OD₆₀₀＝0.6；

对培养产物进行6000rpm/min离心10min，弃上清收集菌体，并用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5。

4.根据权利要求3所述的茶树内生真菌的应用，其特征在于：将KLBMP0506菌液接种于铁皮石斛组培苗，每瓶组培苗接种200μL菌液，菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5，菌液接在组培苗基部附近，从而促进铁皮石斛的生长及次级代谢产物的积累。

5.根据权利要求3所述的制备茶树内生真菌菌剂的方法，其特征在于：所述YPD液体培养基为：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，定容至1000mL蒸馏水中，PH自然。

6.根据权利要求3所述的制备茶树内生真菌菌剂的方法，其特征在于：所述菌剂为微生物肥料。

7.一种组合物，包含权利要求1所述的茶树内生真菌。

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