CN110129208B - 一株具有广谱产酸特性的解磷草酸青霉 - Google Patents
一株具有广谱产酸特性的解磷草酸青霉 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株具有广谱产酸特性的解磷草酸青霉。该菌株的保藏号为:CCTCC NO.M2019233,在以磷酸钙或磷酸铁为惟一磷源的固体培养基中良好生长,培养48小时后即能利用难溶性磷化合物为生长物质,培养3‑7天后长出大量菌落;在液体培养基中,该菌株可高效利用最大浓度为50 g/L的磷酸钙或磷酸铁,最高可产生2500 mg/L的可溶性磷酸盐。该菌株在添加固体磷酸钙培养基中,可代谢产生草酸、甲酸、苹果酸、乙酸和乳酸,且分泌的最大量可达215.73mg/L。本发明从土壤环境中首次分离得到的微生物菌种资源,对改善农田土壤磷素、提高土壤肥力以及促进重金属土壤污染综合治理等方面,具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于环境生物技术领域,具体涉及一株具有广谱产酸特性的解磷真菌草酸青霉PSF-4及其应用。
背景技术
磷是生物生长发育所必需的大量元素之一,是组成生物膜、核酸以及很多大分子(如三磷酸腺苷)的重要组成成分。磷元素对于植物生长而言,是仅次于氮元素的最重要营养元素。磷在植物、动物、微生物和土壤之间,以不同的化合物形式进行转化、流动,动物和微生物可以通过捕食或者分解代谢等作用补充所需的磷元素,而植物主要通过植物根部实现土壤中生物有效态磷(主要包括初级磷酸H2PO4 -和次级磷酸HPO4 2-)的吸收。因此,土壤中生物有效态磷的含量是影响植物生长的重要环境因素,也是土壤环境中磷化合物转化和磷元素循环的主要组成成分。
土壤中的总磷含量很高,但是95%以上的磷是以难溶态磷化合物的形式存在,生物有效态磷含量较低,从而导致土壤缺磷现象。据报道,全世界约有67%的土壤处于缺磷状态,我国约有74%的耕地土壤缺磷。施用无机磷肥虽可短时间内解决植物缺磷问题,但其增加了农业生产成本,同时磷肥中的重金属(如铅、锌等)易引入土壤环境,导致环境污染。
解磷微生物是指土壤环境中可将难溶态磷化合物(包括有机磷和无机磷化合物)转化成可溶态磷的微生物,能够驱动难溶态磷化合物分解或溶解为可溶态磷素,供植物吸收利用,从而提高土壤中生物有效态磷素的转化率和利用率,同时降低土壤磷素积累,并促进植物于缺磷、pH值偏酸性的土壤中生长。解磷微生物的解磷机制目前尚未得到完全证实,但是近年来的研究表明,难溶态磷化合物的溶解与解磷微生物分泌有机酸相关,在胞外可以溶解难溶性的无机磷化合物,如Ca3(PO4)2、FePO4等,从而将其中的H2PO4 -、HPO4 2-等可溶性的磷酸根释放出来。同时近年来的研究发现,解磷菌分泌的多种有机酸,还可作为良好的生物螯合剂用于重金属污染土壤,减少土壤重金属离子的浓度,从而达到有效修复重金属污染的目的。然而,目前国内外获得的具广谱有机酸代谢特性的解磷真菌较少,因此,对解磷菌应用于土壤修复的研究还十分有限。
发明内容
为了解决现有技术存在的缺陷和不足,本发明提供一株具有广谱产酸特性的解磷微生物草酸青霉PSF-4,该菌株已于2019年4月4日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M2019233,分类命名:草酸青霉PSF-4Penicillium oxalicumPSF-4,地址:中国.武汉.武汉大学。
本发明的另一目的在于提供了草酸青霉PSF-4的应用,本发明提供的菌株具高效解磷特性的真菌,同时可分泌产生多种有机酸类化合物。该菌株在实验室条件下在固体磷酸钙和磷酸铁解磷培养基中,PSF-4均能在72h之内生长,且形成显著的透明解磷圈。PSF-4降解磷酸钙的效率高于磷酸铁;同时,在固体磷酸钙液体摇瓶实验中,PSF-4可产生大量的有机酸,经HPLC检测发现可代谢产生草酸、甲酸、苹果酸、乙酸和乳酸等5种有机酸。在改善农田土壤磷素、提高土壤肥力以及促进重金属土壤污染综合治理等方面具有重要的运用前景。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
第一方面,提供一株草酸青霉PSF-4,该菌株已于2019年4月4日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M2019233,分类命名:草酸青霉PSF-4Penicillium oxalicum PSF-4,地址:中国.武汉.武汉大学。草酸青霉PSF-4Penicilliumoxalicum PSF-4 CCTCC NO:M2019233简称草酸青霉PSF-4。
第二方面,提供一种菌剂,该菌剂含有草酸青霉PSF-4 Penicillium oxalicumPSF-4,保藏编号为:CCTCC NO:M2019233。
该菌在液体和固体解磷培养基中的生长周期较长。液体发酵培养基摇床振荡培养48小时内达到对数生长期,解磷培养基由混浊变为澄清。在解磷固体培养基上,真菌菌落大小不规则,边缘为白色绒毛状,成熟菌落中心显绿色,气生菌丝和基生菌丝发达,易挑取。菌落为不规则圆形,扁平***,易挑起;菌落较大,边缘不整齐。在光学显微镜下观察,菌落呈绒状,间枝分叉,多为三叉状,中心不对称型分叉;孢子颜色为绿色,形状为椭圆形,球状,直径约为0.10μm;孢子梗短粗,分枝明显,叉状锐角分枝,分枝不相对称,长度约为0.25μm。菌株的ITS rDNA基因序列已进行测序分析,序列已提交至GenBank数据库,通过序列比对分析,该菌鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum),GenBank中序列号为MK720103。
草酸青霉PSF-4在固体磷酸钙和磷酸铁解磷培养基中,PSF-4均能在72h之内生长,且形成显著的透明解磷圈。在固体磷酸钙和磷酸铁浓度为5-50g/L的液体解磷培养基中,PSF-4均能生长,且在5g/L浓度下均可完全降解磷酸钙和磷酸铁。PSF-4降解磷酸钙的效率高于磷酸铁,最高溶磷量超过2400mg/L。通过改变培养温度、真菌接种浓度、转速等实验条件,PSF-4对固体磷酸钙的降解效率变化较少,最高均可实现100%降解,最大溶磷量超过3000mg/L。
在固体磷酸钙液体摇瓶实验中,PSF-4可产生大量的有机酸,经HPLC检测发现可代谢产生草酸、甲酸、苹果酸、乙酸和乳酸等5种有机酸,有机酸的分泌能够使得土壤中一部分难溶性磷酸盐溶解,从而释放生物可利用的有效磷,提高土壤可利用磷含量,且分泌的最大量可达215.7mg/L。
第三方面,提供上述草酸青霉PSF-4或菌剂在降解难溶性无机磷酸盐中的应用。
优选地,所述无机磷酸盐为磷酸钙或磷酸铁,优选为磷酸钙。
第四方面,提供上述草酸青霉PSF-4或菌剂在制备降解难溶性无机磷酸盐的产品中的应用。
第五方面,提供一种改善农田土壤磷素的方法,为采用上述草酸青霉PSF-4或菌剂处理土壤,从而降解土壤中难溶性无机磷酸盐。
本发明菌株在以土壤中最常见的难溶性磷化合物:磷酸钙和磷酸铁,为惟一磷源的固体培养基中良好生长,在培养48小时后即能利用难溶性磷化合物为生长物质,培养3-7天后长出大量生物菌落。在液体培养基中,本发明菌株可高效利用最大浓度为50g/L的磷酸钙和磷酸铁,最高可产生2500mg/L的可溶性磷酸盐。本发明也公开了真菌的广谱有机酸代谢特性,在添加固体磷酸钙培养基中,可代谢产生草酸、甲酸、苹果酸、乙酸和乳酸等5种有机酸,且分泌的最大量可达215.7mg/L。由于目前国内外获得的具广谱有机酸代谢特性的解磷真菌较少,本发明菌株为发明人从土壤环境中首次分离得到的微生物菌种资源,对改善农田土壤磷素、提高土壤肥力以及促进重金属土壤污染综合治理等方面,具有良好的应用价值。
附图说明
图1:真菌PSF-4在磷酸钙和磷酸铁固体解磷平板上的生长情况;
A为磷酸钙固体解磷平板,B为磷酸铁固体解磷平板;
图2:真菌PSF-4在光学显微镜下的孢子梗及其分子生物学***发育树;
A为真菌PSF-4在光学显微镜下的孢子梗,B为真菌PSF-4分子生物学***发育树;
图3:HPLC检测PSF-4的广谱有机酸代谢特性;
对于保藏真菌的生物学特性说明:
该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2019233。地址:中国.武汉.武汉大学,拉丁学名:Penicillium oxalicum PSF-4,中文名称为:草酸青霉PSF-4,该菌于2019年4月4日保藏。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施1】解磷真菌的筛选
实验土样湖南省岳阳市云溪区工业园污水处理厂的活性污泥中,采集后立即自然风干48h,除去多余杂质后,研磨过20目土壤筛,多余的土样置于4℃冰箱保存。取10g过筛土样,加入100mL灭菌的液体富集培养基(含无菌玻璃珠)(富集培养基成分:蛋白胨10g/L,NaCl 1.0g/L,KH2PO3 1.0g/L,pH=7),150rpm振荡7天。培养1周后,取富集培养基中的培养液1mL,按照稀释涂布平板法,取1mL上清液稀释至10-5,取其中10-4,10-5,10-6 3个稀释梯度下的溶液200μL,分别在以磷酸钙和磷酸铁为惟一磷源的解磷培养基(解磷培养基的成分为:蔗糖10g/L,Ca3(PO4)2或FePO4 10g/L,NaCl 0.3g/L,KCl 0.3g/L,MgS04·7H20 0.3g/L,FeS04 0.03g/L,MnS04 0.03g/L,(NH4)2S04 0.5g/L,酵母提取物0.5g/L,解磷液体培养基的成分和固体相同,但是不含琼脂)上进行涂布,每个处理重复3个平板,然后将平板置于28℃恒温箱培养,5天后记录每个平板上的菌株数量,并观察固体平板上微生物的菌落特征,根据解磷培养基上各菌株形成的解磷圈,划线分离得到纯种解磷微生物。
根据图1生长情况可以看出,PSF-4能在磷酸钙和磷酸铁的解磷平板上正常生长,并且具有非常高的降解能力。
【实施例2】菌株的鉴定
将纯化的菌株接种于固体PDA培养基(成分:土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH=7)培养5天后观察菌株在固体平板上的菌落形态特征,然后挑取些许菌落于光学显微镜下观察菌株的显微结构,并记录菌株的形态特征:菌落呈绒状,间枝分叉,多为三叉状,中心不对称型分叉;孢子颜色为绿色,形状为椭圆形,球状,直径约为0.10μm;孢子梗短粗,分枝明显,叉状锐角分枝,分枝不相对称,长度约为0.25μm。
真菌ITS rDNA测序包括了菌株DNA提取、ITS rDNA体外扩增(使用ITS通用引物ITS1和ITS4)和基因测序。由基因公司测序得到的序列结果,经过软件分析、合并以及带入NCBI的数据库中进行BLAST基因序列比对。根据图2形态观察以及构建的***发育树结果,该菌株确定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)
【实施例3】菌株对磷酸钙、磷酸铁的降解特性分析
使用液体解磷培养基,加入磷酸钙、磷酸铁后的终浓度分别设定为5g/L和2g/L。测定前,将本菌株接种于解磷斜面培养基中培养,28℃活化培养72小时,然后取1mL无菌水,加入斜面中,将斜面真菌的孢子和菌丝刮入无菌水中形成孢子悬浮液,以5%的体积比加入到培养基中。将所有培养基于摇床150rpm转速28℃摇床振荡培养14天,分别测定培养基pH值及可溶性磷含量。最终,PSF-4对5g/L磷酸钙产生的溶磷量为2071mg/L,溶磷率为100%,对2g/L磷酸铁产生的溶磷量为198mg/L,溶磷率为48.5%。
使用磷锑钼蓝分光光度法检测上清液中可溶性磷的含量。首先使用KH2PO4绘制磷标准曲线,绘制曲线的拟合度应超过0.995。测量实验组中可溶性磷含量时,每天使用移液枪准确吸取50μL上清液,加入到装有950μL蒸馏水的离心管中,然后12000rpm离心1min,小心将离心管中上清液加入带刻度的试管中,然后加4mL的钼锑抗试剂并定容至25mL,室温静置30min后将样品置于700nm处测量,最后根据标准曲线值求出可溶性磷含量,并计算降解特性。
设计5、10、20、25、50g/L的磷酸钙以及1、2、4、5、10g/L磷酸铁以研究PSF-4的降解能力,此外以5g/L磷酸钙、2g/L磷酸铁为底物浓度分别设计24、28、32℃温度梯度,设计106、107、108初始接种孢子浓度,100、150、200rpm转速以研究解磷活性。
表1:解磷真菌PSF-4对磷酸钙及磷酸铁降解特性研究
通过表1数据和实验现象观察得到,PSF-4对磷酸钙的降解能力非常强,最高可实现超过50g/L的降解浓度,且降解率超过19%,在低浓度条件下可实现对磷酸钙的完全降解,且在不同的实验条件下,均可实现对5g/L磷酸钙的完全降解;对磷酸铁的降解能力较弱,在培养14天之内只能实现完全降解1g/L的浓度,且培养条件变化对磷酸铁的降解效率影响较大。
【实施例4】PSF-4代谢有机酸的检测分析
使用高效液相色谱(Agilent 1260Infinity)对之前加入的磷酸钙(5g/L、107/mL、150rpm)、磷酸铁(2g/L、107/mL、150rpm)的液体培养基进行有机酸检测分析,抽取一定量培养基液体,于12000rpm离心2min,再通过0.22μm滤头收集在液相瓶中,当日检测其中有机酸含量。检测器为紫外检测器,色谱柱为迪马platisil ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,美国Platisil公司)。流动相:A相为0.01mol/L,pH=2.9磷酸二氢铵溶液,B相为乙腈。进样量:20μL,柱温:30℃,流速:0.5mL/min。首先绘制多种有机酸标准曲线,绘制曲线的拟合度超过0.995,测量有机酸浓度时,先将样品通过0.22μm滤膜,然后上机检测,通过比较样品峰面积与标准曲线之间的关系,可以求出所检测有机酸浓度。
表2:解磷真菌PSF-4对磷酸钙及磷酸铁分泌有机酸含量研究
表3:解磷真菌PSF-4对磷酸钙一周分泌有机酸含量研究
Claims (7)
1.一株草酸青霉PSF-4,其特征在于,该菌株分类命名:草酸青霉(Penicillium oxalicum) PSF-4,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为:2019年4月4日,保藏编号为:CCTCC NO:M2019233,保藏地址为:中国.武汉.武汉大学。
2.一种菌剂,其特征在于,所述菌剂含有权利要求1所述的草酸青霉(Penicillium oxalicum) PSF-4。
3.权利要求1所述的草酸青霉PSF-4或权利要求2所述的菌剂在降解难溶性无机磷酸盐中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述难溶性无机磷酸盐为磷酸钙或磷酸铁。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述难溶性无机磷酸盐为磷酸钙。
6.权利要求1所述的草酸青霉PSF-4或权利要求2所述的菌剂在制备降解难溶性无机磷酸盐的产品中的应用。
7.一种改善农田土壤磷素的方法,其特征在于,所述的方法为采用权利要求1所述的草酸青霉PSF-4或权利要求2所述的菌剂处理土壤,从而降解土壤中难溶性无机磷酸盐。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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