CH653557A5 - Zur behandlung von allergischen zustaenden, immunkomplexkrankheiten und tumoren geeignetes therapeutisches mittel. - Google Patents

Description

Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein therapeutisches Mittel für die Behandlung von allergischen Zuständen, Immunkomplexkrankheiten und Tumoren zu entwickeln, welche 20 keine nachteiligen Nebenwirkungen hat.

Die Erfindung betrifft deshalb ein zur Behandlung von allergischen Zuständen, Immunkomplexkrankheiten und Tumoren geeignetes therapeutisches Mittel, welches als wirksame Komponente eine im menschlichen Urin vorkom-25 mende saure Protease mit den in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften enthält.

Die Erfindung wird anhand von Versuchen und Figuren veranschaulicht. Die einzelnen Figuren zeigen:

Fig. 1 die Resultate des Versuches 1;

30 Fig. 2 und Fig. 3 die Resultate des Versuches 7;

Fig. 4 die Resultate der Messungen des Proteingehaltes im Urin gemäss Versuch 8.

Der Proteingehalt im Urin wurde mit Hilfe der Färbung von im Handel erhältlichen Proteintestpapier, dessen Farb-35 stufen von 0 bis 4 eingeteilt wurden, bestimmt.

Der durchschnittliche Proteingehalt wurde für jede Gruppe berechnet.

Vor dem oben genannten Hintergrund haben die Erfinder ausgedehnte Versuche zur Entwicklung eines wirksamen 40 therapeutischen Mittels für die Behandlung von allergischen Zuständen, Immunkomplexkrankheiten und Tumoren durchgeführt. Es wurde gefunden, dass eine im menschlichen Urin vorkommende saure Protease eine starke antiallergische Wirksamkeit hat, verschiedene Immunkomplexkrank-45 heiten in bemerkenswerter Weise unterdrückt und auch ausgezeichnete Antitumorwirksamkeit zeigt. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Befunden.

Die saure Protease, welche die wirksame Komponente der erfindungsgemässen Mittel bildet, ist ein bekanntes En-50 zym (Mirsky et al, J. Cli. Invest. 27, 818,1948), das jedoch nie als therapeutisches Mittel zur Behandlung von allergischen Zuständen, Immunkomplexkrankheiten und Tumoren verwendet wurde. Die saure Protease kann aus menschlichem Urin, durch geeignete Kombination von üblichen, für 55 die Isolierung von Proteinen bekannten, Methoden, wie Aussalzen, Adsorptionschromatographie auf anorganischen Adsorbentien, Ionenaustauschchromatographie auf einem Ionenaustauscherharz oder Gelchromatographie unter Verwendung von Molekularsieben, erhalten werden. 60 Beispielsweise wird menschlicher Urin durch eine DEAE-Cellulosesäule, die mit 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 5,3) nach der Methode von Seijffers et al (American Journal of Physiology, 206,1106,1964) behandelt wurde, geleitet, um die saure Protease an der Säule zu adsorbieren. 65 Die Protease wird dann mit der gleichen Pufferlösung, enthaltend 0,3M Natriumchlorid, eluiert. Das Eluat wird konzentriert und mit Gelchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-100 gereinigt und einer Säurebehand

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4

lung unterworfen. Die Säurebehandlung kann beispielsweise durch Einstellung des pH-Wertes der Fraktion auf kleiner als 5, mit Salzsäure, und nachfolgender Inkubation bei einer geeigneten Temperatur während einer geeigneten Zeit erfolgen. Dabei wird die saure Protease des erfindungsgemässen Mittels erhalten.

Es wurde gefunden, dass die nach diesem Verfahren erhaltene saure Protease ein Molekulargewicht von 32 000 bis 38 000 nach der gelchromatographischen Methode auf Se-phadex G-100 hat. Ein isoelektrischer Punkt im Bereich vom pH 1 bis 3 wurde durch isoelektrische Fokussierung auf Am-pholin gefunden. Die Protease hat die maximale Adsorption bei 278 nm, zeigt eine positive Reaktion mit Ninhydrin und ist gut wasserlöslich, jedoch unlöslich in Äther und Chloroform.

Die saure Protease zeigt im sauren bereich, bei pH-Werten <7, eine ausgezeichnete hydrolytische Aktivität, wenn Hämoglobin als Substrat verwendet wird.

Die saure Protease wird von Pepstatin inhibiert. Die Aktivität der sauren Protease bleibt im sauren Bereich, bei pH-Werten < 7, stabil, währenddem sie ihre Aktivität im alkalischen Bereich, bei pH-Werten >8, verliert.

Nachfolgend wird das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der sauren Protease, wie sie erfindungsgemäss verwendet wird, anhand eines Herstellungsbeispieles erläutert. Dieses Beispiel dient jedoch nur zur Veranschaulichung des Isolier- und Reinigungsverfahrens, da auch andere Verfahren in Frage kommen.

Beispiel für ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung.

1001 menschlicher Urin wurden auf etwa lOOOstel ihres ursprünglichen Volumens unter Verwendung von Druckultrafiltration («Pellicon», Millipore Co. und «Diaflo», Amicon Co.), welche einen Trennfaktor von 10 000 Dalton hatten, konzentriert. 100 ml des konzentrierten Urins wurden auf eine DEAE-Cellulosesäule (Whattman Co.) (2,5 x 20 cm), die mit 0,1 M Acetatpuffer (pH 6,0) eingestellt war, gegeben und mit dem gleichen Puffer, der 0,3M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Das Eluat wurde auf etwa 100 ml durch Ultrafiltration konzentriert und dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann auf eine DEAE-Sepharosesäule (Pharmacia Co.) (2,5 x 20 cm) unter den bereits oben beschriebenen Bedingungen gegeben. Die eluierte Fraktion wurde auf etwa 10 ml konzentriert und auf eine Sephadex G-100 Gelfiltrationsäule (2,5 x 90 cm) für die weitere Reinigung und die gleichzeitige Entfernung von Pyrogenen gegeben. Etwa 80 ml der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurden mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und nachfolgend 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Lösung lyophylisiert und ergab 20 mg der sauren Protease.

Die pharmakologische Wirksamkeit und die Toxizität dieser sauren Protease wird mit Hilfe der nachfolgenden Versuche beschrieben.

Versuch 1

Suppressionswirkung auf die Bildung von Anti-Ovalbumin IgE-Antikörper

0,1 mg Ovalbumin und 20 mg Aluminiumhydroxidgel wurden einer Gruppe von 10 männlichen Wistar-Ratten, von 180 bis ungefähr 200 g Gewicht, intraperitoneal injiziert. Beginnend mit dem nächsten Tag wurde saure Protease 1-mal täglich während 14 Tagen intravenös injiziert. Die Seren wurden 7, 10 und 14 Tage nach der Injektion des Oval-bumins gesammelt und die Menge des Antiovalbumin-IgE-Antikörpers im Serum wurde durch homologe PCA-Reak-tion der Ratte bestimmt (H. Maruyama, et al., Folia Phar-macologica Japonica 74, 179,1978). Die Resultate werden in Figur 1 gezeigt.

Die Produktion von Antiovalbumin IgE-Antikörper wurde bedeutend gehemmt.

Versuch 2

s Suppressive Wirkung auf Bronchialasthma

0,1 mg Ovalbumin und 20 mg Aluminiumhydroxidgel wurden einer Gruppe von 10 männlichen Wistar-Ratten, von 180 bis ungefähr 200 g Gewicht, intraperitoneal injiziert. Vom nachfolgenden Tag an wurde 1-mal täglich, während io 14 Tagen, saure Protease intravenös injiziert. Am 14. Tag wurden intravenös 25 mg/kg Ovalbumin zur Erzeugung von Bronchialasthma injiziert. Die derart bewirkte tracheale Kontraktion wurde nach der Methode von Konzett und Rössler (Arch. Exptl. Path. Pharmacol 195, 71,1940) gemes-i5 sen. Das Kontraktionsmass der Trachea wurde mit Bezug auf die Kontrollgruppe, deren Kontraktion mit 100 bewertet wurde, berechnet. Die Resultate werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

20

Kontraktionsmass der Trachea (%)

Kontrolle 100

25 Saure Protease 0,05 mg/kg 72

0,5 mg/kg 47

5 mg/kg 24

Die tracheale Kontraktion wurde durch die Verabrei-30 chung von saurer Protease bedeutend gehemmt.

Versuch 3 Hydrolyse eines Immunkomplexes

15 mg eines löslichen Immunkomplexes (human IgG-35 Kaninchen anti-human IgG-Antikörper) und je 3 mg der sauren Protease, Trypsin, a-Chymotrypsin oder Plasmin wurden in 1 ml Phosphatpufferlösung (0,06M, pH 6,0) gelöst und während 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml einer 20%igen wässrigen 40 Lösung von Perchlorsäure beendet. Die Absorbtion der überstehenden Flüssigkeit wurde bei 280 nm gemessen und das Mass der Hydrolyse wurde berechnet.

Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung von human IgG anstelle des Immunkomplexes wiederholt. Das 45 Verhältnis der erzielten Hydrolyse des Immunkomplexes zu jenem der human IgG wurde berechnet. Die Resultate werden in Tabelle 2 gezeigt.

Verglichen mit anderen Proteasen hydrolysierte die saure Protease den löslichen Immunkomplex selektiver als das so normale human IgG.

Tabelle 2

Relatives Mass der

Hydrolyse

55

Hydrolyse verhältnis

Human

Immun

(Immunkomplex/

IgG

komplex

Human IgG)

saure Protease

100

380

3,8

60 Trypsin

130

169

1,3

a-Chymotrypsin

22

26

1,2

Plasmin

26

29

1,1

Versuch 4

65 Hydrolyse eines Immunkomplexes

15 mg eines löslichen Immunkomplexes (human IgG-Kaninchen anti-human IgG-Antikörper) und 0,3 mg der sauren Protease oder von Trypsin wurden in 1 ml Phosphat-

5

653 557

Pufferlösung (0,06M, pH 6,0) gelöst und 250 jxl Rattenserum oder der gleichen Phosphatpufferlösung wurden zum Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde während 60 Minuten bei 37 "C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde das verbleibende human IgG durch einfache radiale Immundiffusion (single radial immunodiffusion method) unter Verwendung von anti-human IgG Serum des Kaninchens gemessen, um das Verhältnis des hydrolysierten Immunkomplexes zum ursprünglich inkubierten Immunkomplex zu bestimmen. Die Resultate werden in Tabelle 3 gezeigt.

Es wurde gefunden, dass die hydrolytische Wirkung der sauren Protease auf Immunkomplexe durch ein zusätzliches Serum nicht beeinflusst worden ist. Demgegenüber wurde die hydrolytische Wirkung von Trypsin durch die Zugabe des Serums merklich reduziert.

Tabelle 3 Hydrolyseverhältnis (%)

Abwesenheit von Serum

Gegenwart von Serum saure Protease Trypsin

35 19

35 2

Vorkommen (%)

Schwere

Kontrolle 90 saure Protease

1 mg/kg 80

3 mg/kg 60

10 mg/kg 40*

*; <0,05, **; p<0,01

3,4 + 0,3

2,8 + 0,4 2,0 + 0,1* 1,3 + 0,1**

die Fluoreszenzantikörpertechnik unter Verwendung von antihasen IgG-Antikörper der Ziege, der mit Fluoreszein-isothiocyanat markiert war, beobachtet. Weiterhin wurde der Immunkomplexgehalt im Serum mit der Clq Bindungs-5 methode gemessen. Der Proteingehalt des Urins wurde mit im Handel erhältlichem Testpapier bei 34 Mäusen gemessen, deren Urin vor dem Opfern gesammelt wurde. Die saure Protease wurde 3-mal täglich, das erste Mal sofort nach der Injektion des Immunkomplexes, intravenös verabreicht. Als io Kontrolle wurde inaktivierte saure Protease gegeben. Die Resultate werden in der Tabelle 5 gezeigt.

Durch die Verabreichung der sauren Protease wurde der Gehalt an Immunkomplex im Serum vermindert und die Häufigkeit von Proteinurie und abgelagertem Immunkomis plex in Glomeruli war auch vermindert.

Tabelle 5

20

Versuch 5 Suppressive Wirkung auf Thyroiditis Die suppressive Wirkung der sauren Protease auf Thyroiditis wurde nach der Methode von Kotani et al. (Clinical Immunology, 9,635,1977) untersucht. Eine Gruppe von 10 männlichen BFU/HDK-Ratten (sechs Wochen alt) wurde der Thymectomie und vier wiederholter Röntgenbestrahlungen von jeweils 200 rad zweiwöchentlich unterworfen. 14 Wochen nach der Thymectomie wurden die Ratten geopfert. Die Schilddrüse wurde jeder Ratte entfernt und in einen Pa-raffmblock eingebettet, dann mit Hematoxylin-Eosin oder mit Azan eingefärbt und auf den Grad der Infiltration von mononuklearen Zellen, Zerstörung des endoplasmischen Retikulums und Drüsenfibrosis untersucht, um die Schwere der Thyroiditis nach der Gradeinteilung 0 bis 4 zu bestimmen. Die saure Protease wurde täglich einmal intravenös verabreicht. Für die Kontrolle wurde die saure Protease inaktiviert und verabreicht. Die Resultate werden in Tabelle 4 gezeigt.

Es wurde gefunden, dass, verglichen mit der Kontrolle, die saure Protease das Vorkommen und die Schwere von Thyroiditis in Abhängigkeit von der Dosierung verminderte.

Tabelle 4

Immunkom

Proteinurie

Ablagerung des

plexgehalt

(Zahl der posi

Immunkomplexes

im Serum tiven Mäuse+/

auf Glomerulus

(M-g/ml)

Gesamtzahl der

(Zahl der posi

Mäuse tiven Mäuse/

Gesamtzahl der

Mäuse

Kontrolle

156+18

7/8

10/10

saure Protease

0,3 mg/kg

128+ 9

5/7

8/10

1,0 mg/kg

88+12*

4/10

5/10*

3,0 mg/kg

53+ 7**

3/9*

2/10**

Versuch 6

Suppressive Wirkung auf Immunkomplex-Nephritis Einer Gruppe von 10 männlichen C57BL Mäusen wurden 200 mg/kg human IgG-Kaninchen anti-human IgG-Antikörperkomplex täglich 3-mal in Abständen von 8 Stunden während 3 Tagen intravenös injiziert. Am 4. Tag wurden die Tiere geopfert und die Nieren wurden entfernt. Die Ablagerung des Immunkomplexes in den Glomeruli wurde durch

+ ; Mäuse mit Proteinurie vom Grad 3 oder 4 *; p<0,05, **; p<0,01

35 Versuch 7

Suppressive Wirkung auf Masugi-Nephritis

Nach der Methode von Suzuki et al. (Folia Pharmacolo-gica Japonica, 68,572,1972) wurde einer Gruppe von 10 männlichen Wistar-Ratten Antirattennierenserum von Ka-40 ninchen intravenös mit einer Dosis von 5 ml/kg verabreicht. Die saure Protease wurde täglich 1-mal nach der Verabreichung des Antinierenserums intravenös gegeben. Der Gehalt an Immunkomplex im Serum und der Gehalt an Protein im Urin wurden wöchentlich gemessen. Als Kontrolle wurde 45 inaktivierte saure Protease verabreicht. Die Resultate werden in Figur 2 und 3 gezeigt.

Bei der mit saurer Protease behandelten Gruppe wurde eine Abnahme des Proteingehaltes im Urin und des Gehaltes an Immunkomplex im Serum beobachtet.

50

Versuch 8

Suppressive Wirkung auf spontane Lupus Nephritis bei Mäusen

Bei diesem Versuch wurde die Methode von Abe et al. 55 (The Ryumachi, 14,43,1974) angewendet.

Einer Gruppe von 16,16-Wochen alten weiblichen Mäusen (NZB x NZW)Fj, wurde die saure Protease intravenös in einer Dosis von 10 mg/kg 1-mal täglich verabreicht. Als Kontrolle wurde inaktivierte saure Protease verabreicht. In 60 Abständen von 4 Wochen wurde der Proteingehalt im Urin mit einem im Handel erhältlichen Testpapier mit der Gradeinteilung von 0 bis 4, getestet. Die Resultate werden in Figur 4 gezeigt.

Zur Beobachtung der Zelleninfiltration in die Nierenglo-65 meruli wurden 6 Mäuse von jeder Gruppe im Alter von 32 Wochen geopfert.

Um den Anteil an überlebenden Mäusen im Alter von 50 Wochen zu bestimmen, wurde die Verabreichung der sauren

653 557

6

Protease bei jeder Gruppe der verbleibenden Mäuse fortgesetzt. Die Resultate werden in Tabelle 6 gezeigt.

Durch die Verabreichung der sauren Protease wurde die Erhöhung an Urinprotein bedeutend gehemmt, die Zelleninfiltration wurde vermindert und die Anzahl der Überlebenden wurde erhöht. Die Resultate zeigen, dass saure Protease Lupus Nephritis bei Mäusen unterdrückt.

Tabelle 6

Kontrollgruppe Mit saurer Protease behandelte Gruppe

Zelleninfiltration

Anteil der Überlebenden

Starke Infiltra- Leichte Infiltration tion von kleinen um die Gefäss-

Lymphozyt- und wand Plasmazellen

20%

80%*

*;p<0,05

Versuch 9

Suppressive Wirkung auf chronisch aktive Hepatitis Nach der Methode von Mayer et al. (British Journal of Expérimental Pathology, 55,498,1974) wurde human-Leber LSP (leberspezifisches Membranlipoprotein) wiederholt zusammen mit komplettem Freund-Adjuvans einer Gruppe von 10 Kaninchen injiziert, um chronisch aktive Hepatitis zu verursachen. Die saure Protease wurde den Kaninchen täglich 1-mal während 2 Wochen intravenös verabreicht. Zwei Wochen nach der Einleitung des Hepatitis wurden GOT-und GPT-Aktivitäten im Serum gemessen. Als Kontrolle wurde inaktivierte saure Protease gegeben. Die Resultate werden in Tabelle 7 gezeigt.

Die saure Protease hemmte die Erhöhung von GOT- und GPT-Aktivitäten im Serum in Abhängigkeit von der Dosierung.

Tabelle 7

GOT-Aktivität (Einheit/ml)

GPT-Aktivität (Einheit/ml)

Kontrolle saure Protease 1 mg/kg 3 mg/kg 10 mg/kg

**; p<0,01

337,5 ±34,5

311,5 + 27,4 256,2+41,1 193,3 + 36,3**

In der Kontrollgruppe wurde Hyperplasie der Zellen der Synovialis, Pannusbildung und Zellinfiltration von lymphoi-den Follikeln, welche frei von germinalen Zentren waren, beobachtet. Demgegenüber war in der behandelten Gruppe die Pannusbildung und die Zellinfiltration von lymphoiden Follikeln wesentlich vermindert.

Tabelle 8 Pathohistologische Beobachtung

Hyperplasie

Pannusbil

Zellinfiltration

von synovial dung von lymphoiden

Belagzellen

Follikeln

Kontrolle

10/10

9/10

8/10

saure Protease

1 mg/kg

10/10

5/10

4/10

3 mg/kg

10/10

4/10*

2/10*

20 10 mg/kg

10/10

3/10**

2/10*

395,1+40,5

351,2+37,8 301,5+29,7 245,7 + 31,4**

Ausgedrückt als Anzahl postitiver Tiere/Anzahl verwendeter Tiere *p<0,05 **p<0,01

Versuch 11 Hydrolyse von human Immunkomplex Sera von Patienten mit Rheumatoidarthritis, systemischem Lupus erythematosus (SLE) und Hepatitis, welche 30 Immunkomplex aufwiesen, wurden gesammelt. 1 ml des Serums wurde mit 10,30 und 100 jig der sauren Protease bei 37 °C während 60 Minuten bebrütet. Dann wurde der Immunkomplexgehalt durch die hemolytische Reaktion von roten Blutzellen des Schafes unter Verwendung von Meer-35 schweinchenkomplement und human aggregiertes IgG als Standard nach der Methode von Füst et al. (Artherosclero-sis, 29,181,1978) bestimmt. Zusätzlich wurden die Sera von den Patienten mit Rheumatoidarthritis auf rheumatoiden Faktor (RA-Faktor) durch die Hemagglutinationreaktion 40 (RAHA-Test) nach der Methode von Azuma et al. (The Ry-umachi, 12, 330,1972) untersucht. Die Resultate werden in Tabelle 9 und 10 gezeigt.

Saure Protease verminderte den Immunkomplexgehalt im Serum der Patienten in Abhängigkeit von der Dosierung. 45 Die saure Protease verminderte auch den RA-Faktorgehalt der Patienten mit rheumatoider Arthritis.

50

Tabelle 9

Hydrolyse von Humanimmunkomplex

Versuch 10

Krankheit

Serum

Menge der zu

Immunkomplex

Nr.

gegebenen gehalt (ng/ml)

Suppressive Wirkung auf Arthritis

sauren Protease

Nach der Methode von Tsukada et al. (The Ryumachi,

55

(Hg/ml)

16,255,1976) wurden in bilaterale Kniegelenke von Kanin

chen (10 Tiere pro Gruppe) 4 ml eines löslichen Rinderse

Rheumatoid

1

0

75

rumalbumin (BSA)-Kaninchen anti-BSA Antikörperkom arthritis

10

63

plexes, enthaltend 2 mg Antikörperstickstoff 1-mal täglich

30

52

während 6 Tagen injiziert, um allergische Arthritis zu bewir

60

100

<50

ken. Die saure Protease wurde intraartikulär 1-mal täglich

2

0

234

vom ersten Tag der Verabreichung des BSA-anti-BSA Anti

10

180

körperkomplexes verabreicht. Zehn Tage nach der ersten

30

151

Verabreichung des Komplexes wurden die Kaninchen geop

100

120

fert. Die Kniegelenke wurden mit Formalin fixiert, mit He

65

3

0

103

matoxylin-Eosin gefärbt und mikroskopisch untersucht. Als

10

84

Kontrolle wurde inaktivierte saure Protease gegeben. Resul

30

63

tate werden in Tabelle 8 gezeigt.

100

<50

7

653 557

Tabelle 9 (Fortsetzung)

Krankheit

Serum Menge der zu-Nr. gegebenen sauren Protease (Hg/ml)

Immunkomplexgehalt (ng/ml)

Mass der Wachstumshemmung =

Anzahl lebensfähiger Zellen in der behandelten Gruppe

(1-

Anzahl lebensfähiger Zellen in der Kontrollgruppe

•)x 100

systemisches Lupus erythematosus

Hepatitis

1

0

426

10

384

30

203

100

150

2

0

120

10

74

30

56

100

<50

3

0

153

10

108

30

63

100

50

1

0

63

10

59

30

<50

100

<50

2

0

72

10

68

30

59

100

52

Tabelle 11

10

Zugegebene Konzentration (ng/ml)

Mass der Wachstumshemmung (%) MX-1 L1210

saure Protease

Mitomycin C

30 100 300 100

15 33 55 47

21 30 62

20

Die saure Protease hemmte das Wachstum von Tumorzellen sogar bei niedrigen Konzentrationen

Tabelle 10 Wirkung auf den RA-Faktor

Versuch 13

25 Wirkung auf human Brustkrebszellen MX-1 tragende nackte Mäuse Ein quadratisches Stück mit der Seitenlänge 2 mm von human Brustkrebs MX-1 wurde subcutan einer Gruppe von 5 nackten Mäusen (BALB/C, nu/nu) transplantiert. Zwei 30 Wochen nach der Transplantation wurde die saure Protease täglich 2-mal während 18 Tagen intravenös injiziert. Der Tumor wurde 32 Tage nach der Transplantation gewogen. Die Resultate werden in Tabelle 12 gezeigt.

Serum

Zugegebene saure grösste Verdünnung zur Erzielung

Nr.

Protease (p.g/ml)

positiver Reaktion mit RAHA

1

0

2048

10

1024

30

256

100

32

2

0

512

10

128

30

64

100

64

3

0

1024

10

512

30

128

100

64

4

0

256

10

128

30

64

100

16

35

Tabelle 12

Dosis (mg/kg)

Gewicht des Tumors (g)

40

Kontrolle saure Protease

45 *p < 0,05

0,3 3,0

1,32 + 0,09 0,79 + 0,2* 0,65 + 0,15*

Versuch 12

Wirkung auf das Wachstum von kultivierten human Brustkrebszellen MX-1 und Mausleukämiezellen L1210 Human Brustkrebszellen MX-1 und Mausleukämiezellen L1210 wurden mit je einer Zellenkonzentration von 105/ml in Eagle's Medium, enthaltend 10% Kalbserum und Testsubstanzen, suspendiert. Die Zellen wurden während 48 Stunden unter 5% C02 bei 37 °C gezüchtet. Dann wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Anfärben mit Tripan Blue bestimmt. Das Mass der Wachstumshemmung wurde nach der nachfolgenden Gleichung berechnet. Die Resultate werden in der Tabelle 11 gezeigt.

55

60

65

Die saure Protease zeigte eine signifikante Wirksamkeit gegen den Tumor.

Versuch 14

Wirkung auf Leukemiazellen P388 tragenden Mäusen

105 Leukemiazellen P388 wurden intraperitoneal einer Gruppe von 5 männlichen BDFi Mäusen transplantiert.

Die saure Protease wurde den Mäusen täglich 2-mal vom Tag nach der Transplantation bis zum Tod der Mäuse intravenös injiziert. Der mittlere Lebensbereich wurde berechnet und als prozentuale Änderung des Kontrollwertes ausgedrückt. Die Resultate werden in Tabelle 13 gezeigt.

Mittlere Lebensdauer (%) =

Durchschnittliche Überlebenstage d. behandelten Guppe Durchschnittliche Überlebenstage d. Kontrollgruppe x 100

653 557

Tabelle 13

Dosis durchschnittliche

(mg/kg) Lebensdauer (%)

Kontrolle 100 + 5

saure Protease 0,3 110 + 5

1,0 121 ±9

3,0 123 + 9*

MytomycinC 0,5 136+17

*p<0,05

Saure Protease bewirkte eine klare Erhöhung der Lebensdauer.

Versuch 15 Akute Toxizität

Einer Gruppe von 10 männlichen ddY Mäusen von 20 ± 1 g Gewicht wurde je in physiologischer Salzlösung gelöste saure Protease intravenös oder intraperitoneal mit einer Dosierung von 2 g/kg verabreicht. Die Mäuse wurden während 1 Woche täglich auf toxikologische Symptome beobachtet. Während dieser Zeit wurden keine Zeichen einer Toxizität festgestellt.

Wie in den obigen Versuchen beschrieben wurde, unterdrückte die saure Protease, welche die aktive Komponente des erfmdungsgemässen therapeutischen Mittels ist, die Bildung von IgE-Antikörpern und hatte eine klare therapeutische Wirkung auf Bronchialasthma. Weiterhin unterdrückte sie eindeutig die Entstehung und Entwicklung einer Anzahl von Krankheiten, welche vermutlich durch Immunkomplexe bewirkt werden, beispielsweise von Thyroiditis und Nephritis. Weiterhin zeigte die saure Protease eine starke Antitu-morwirkung.

Die Menge an saurer Protease, welche zur Erzielung dieser Wirkungen notwendig ist, liegt gemäss den Resultaten der Untersuchung über der akuten Toxizität, innerhalb eines genügend sicheren Bereiches. Da die saure Protease, ein vom Menschen stammendes Protein ist, wird angenommen, dass die Wahrscheinlichkeit zur Verursachung nachteiliger Reaktionen durch die antigene Wirksamkeit, wie von anaphylak-tischem Schock, ausserordentlich klein ist. Deshalb bildet saure Protease ein stark wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung von allergischen Zuständen, wie Bronchialasthma, Urticaria, Heufieber, Heuschnupfen, Kontakt-dermatitis, Lebensmittelallergie, Medikamentenallergie, allergische Rhinitis, Hypersensibilitätspneumonitis, verschiedene Immunkomplexkrankheiten wie systemischer Lupus erythematosus, Glomerulonephritis mit Immunkomplex, Pe-riarteritis nodosa, Rheumatiodarthritis, Immunkomplexhepatitis, Thyrioditis, Serumkrankheit, Myasthenia gravis, verschiedene Tumoren wie Magenkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Kolonkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Leukämie, Speiseröhrenkrebs und Lymphoma.

Obwohl das erfindungsgemässe therapeutische Mittel im allgemeinen in Form von Lösungen für die intravenöse, subkutane, intramuskuläre oder intraartikulare Injektion hergestellt wird, kann es auch in Form eines oral zu verabreichenden Mittels, Inhalationsmittels oder rektalen Supposito-riums eingesetzt werden. Obwohl die tägliche Dosis der sauren Protease für einen Erwachsenen im Bereich von 1 bis 1000 mg, vorzugsweise von 50 bis 500 mg, liegt, kann sie entsprechend den Symptomen und der Verabreichungsart erhöht oder vermindert werden.

Bei den Zubereitungen für Injektionen kann es sich um lyophilisierte Zubereitungen, welche unmittelbar vor der Verabreichung aufgelöst werden, wie auch um flüssige Zubereitungen handeln. Orale Zubereitungen sind Kapseln, Tabletten, Körnchen und Stäube und flüssige orale Zubereitungen. Ein Inhalationsmittel kann in Form einer lyophilisierten Zubereitung vorliegen. Für die rektale Verabreichung ist die Form des Suppositoriums am besten geeignet.

Die erfindungsgemäss eingesetzte saure Protease kann nach einer der üblichen Methoden unter Verwendung von pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Excipientien formuliert werden. Beispiele für feste Träger und Excipientien, welche vorteilhaft eingesetzt werden können, sind übliche Excipientien wie Lactose, Mannitol, Maisstärke und Kartoffelstärke; Bindemittel wie kristalline Cellulose, Cellu-losederivate, Gummiarabicum, Maisstärke und Gelatine; Sprengmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke und Calcium-carbohydroxymethylcellulose; und Gleitmittel wie Talk und Magnesiumstearat. Beispiele von flüssigen Trägerstoffen, welche erfindungsgemäss eingesetzt werden können, sind destilliertes Wasser für Injektion, physiologische Salzlösung, pflanzliche Öle für Injektion und Glycole, wie Propylengly-col und Polyäthylenglycol.

Nachfolgend werden typische Formulierungen für das erfindungsgemässe therapeutische Mittel gezeigt.

Formulierung 1:

In 10 ml physiologische Salzlösung wurde 100 mg der sauren Protease gelöst. Die Lösung wurde durch Filtrieren durch einen Membranfilter sterilisiert. 1 ml des Filtrâtes wurde in einem bereits sterilisierten Glasbehälter gefüllt und dann lyophilisiert. Der Behälter, enthaltend die lyophilisierte pulverförmige Zubereitung, wurde dann fest verschlossen.

Formulierung 2:

100 g lyophilisierter saurer Protease, 97 g Lactose und 3 g Magnesiumstearat wurden gewogen und bis zur Homogenität vermischt. Je 200 g des erhaltenen Gemisches wurde in Nr. 2 Gelatinekapseln gefüllt und die Kapseln wurden mit einem im Darm löslichen Überzug versehen, wodurch im Darm lösliche Kapseln erhalten wurden.

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3 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

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   PATENTANSPRÜCHE

   1. Zur Behandlung von allergischen Zuständen, Immunkomplexkrankheiten und Tumoren geeignetes therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es als wirksame Komponente eine im menschlichen Urin vorkommende saure Protease enthält, die die nachfolgenden Eigenschaften aufweist:

   a) Molekulargewicht im Bereich von 32 000 bis 38 000, ermittelt durch Gelchromatographie auf «Sephadex G-100»;

   b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 1 bis pH 3, ermittelt durch isoelektrische Fokussierung auf «Am-pholine»;

   c) ein Absorptionsmaximum bei 278 nm;

   d) ausgezeichnete hydrolytische Aktivität im sauren Bereich, bei pH-Werten <7, wenn Hämoglobin als Substrat eingesetzt wird;

   e) positive Reaktivität mit Ninhydrin;

   f) Löslichkeit in Wasser, Unlöslichkeit in Äther und Chloroform;

   g) wird durch Pepstatin inhibiert; und h) stabil im sauren Bereich, bei pH-Werten <7, und instabil im alkalischen Bereich, bei pH-Werten > 8.
2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die aktive Komponente zusammen mit einem Trägerstoff und/oder Excipient enthält.
3. 3. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Behandlung von allergischen Zuständen.
4. 4. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Behandlung von Immunkomplexkrankheiten.
5. 5. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Behandlung von Tumoren.
6. 6. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form einer Injektionslösung vorliegt.
7. 7. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form oral verabreichbarer Zubereitungen vorliegt.
8. 8. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines rektalen Suppositoriums vorliegt.
9. 9. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form einer Inhalationszubereitung vorliegt.
10. 10. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Form, die eine Tagesdosis von 1 bis 1000 mg saurer Protease für einen Erwachsenen ermöglicht, vorliegt.
11. 11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Form vorliegt, die eine Tagesdosis von 50 bis 500 mg ermöglicht.

    Allergische Zustände werden durch Antigen-Antikörper-Reaktionen verursacht. Wenn ein Individuum immunologisch sensibilisiert wurde, kann eine weitere Berührung mit dem Antigen nicht nur zur sekundären Verstärkung der Immunantwort führen, sondern sie kann auch gewebeschädigende Reaktionen, d.h. allergische Zustände, verursachen. Gegenwärtig wird vermutet, dass der Mechanismus der Pathogenese von allergischen Zuständen der folgende ist:

    Nach der Einwirkung eines pathogenen Antigens produziert das Individuum Antikörper. Sekundäre Antigeneinwir-kung bewirkt eine Antigen-Antikörper-Reaktion und die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe lagern sich auf den Geweben ab, wobei chemische Mediatoren von den sensibili-

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    sierten Zellen abgegeben werden. Diese Mediatoren und/ oder die abgelagerten Antigen-Antikörper-Komplexe schädigen dann die Gewebe.

    Pathogene Antigene sind xenogene Anitgene (Inhalla-s tions-Allergene, Lebensmittel-Allergene, Medikamente und dergleichen), allogene Antigene und autologe Antigene, welche denaturierte autologe Komponente von Geweben oder Organen sind, wirken wie Fremdsubstanzen.

    Die sogenannten allergischen Zustände können in vier io Gruppen oder Typen unterteilt werden.

    (1) Allergie des Typs I (anaphylaktischer Typ), wobei das Antigen mit einer spezifischen Klasse von Antikörpern reagiert, die durch einen spezialisierten Bereich des Antikörpers an Mastzellen oder zirkulierenden basophilen Zellen gebun-

    15 den sind. Dies führt zu Degranulation der Zellen und Freisetzung von vasoaktiven Mediatoren.

    (2) Allergie des Typs II (cytotoxischer Typ), wobei die Antikörper an der Zelloberfläche an ein Antigen gebunden werden und verschiedene Reaktionen, wie Opsonin- oder

    20 Immunphagozytosis der Zelle und Zellysis durch die Aktion des Komplementsystems bewirken.

    (3) Allergie des Typs III (Arthus Typ; durch Immunkomplex bewirkt), wobei zwischen Antigen und humoralem Antikörper ein Komplex gebildet und Aktivierung des Komple-

    25 mentsystems, Plättchenaggregation, Bildung von Mikro-thrombi und so weiter, bewirkt wird.

    (4) Allergie des Typs IV (zell-bewirkter oder verzögerter Typ), wobei aus dem Thymus stammende Lymphozyten (T Zellen), welche spezifische Rezeptoren aufweisen, durch An-

    30 tigene und freigesetzte Mediatoren stimuliert werden. Bei Gewebeabstossung werden diese Lymphozyten umgewandelt, um bestimmte Zellen mit dem Histocompatibilitäts-Antigen des Transplantats zu töten.

    Unter den allergischen Reaktionen, an denen die Aller-35 gien des Typs I, III und IV beteiligt sind, befindet sich z.B. Bronchialasthma, wobei jede dieser Reaktionen einzeln oder zusammen mit den anderen Reaktionen für diese Zustände verantwortlich gemacht wird. Es wird vermutet, dass allergische Zustände durch folgenden Mechanismus bewirkt wer-40 den: Ein Antigen, das in den Organismus eintritt, wird von Makrophagen angegriffen und die immunologische Information zum T-Zellen-B-Zellensystem übermittelt. Die B-Zellen, welche die Information erhalten haben, produzieren Antikörper (IgE-Antikörper werden hauptsächlich bei Aller-45 gie des Typs I und IgG-Antikörper bei Allergie des Typs II und III produziert. IgE-Antikörper werden an basophile Zellen im Kreislauf oder an Mastzellen in den Geweben gebunden, wodurch der sensibilisierte Zustand bewirkt wird. Danach verbindet sich das gleiche Antigen, das in den sensi-50 bilisierten Organismus eintritt, mit dem Antikörper dieser Zellen und setzt chemische Mediatoren, wie Histamin oder langsam reagierende anaphylaktisch wirksame Substanzen (SRS-A) frei. Die derart freigesetzten chemischen Mediatoren verursachen allergische Symptome wie Erythema, Oede-55 ma oder Erhöhung der Drüsensekretion durch Kontraktion von glatten Muskeln und Erhöhung der kapillaren Permeabilität. Andererseits bindet ein IgG-Antikörper polymorpho-nukleare Leukozyten, wodurch Sensibilisierung erzielt wird und vermutlich SRS-A als chemischer Mediator ausgeschie-6o den wird.

    Mittel zur Behandlung von allergischen Zuständen können ihr therapeutisches Ziel durch Behinderung irgendeines Schrittes in den oben beschriebenen Vorgängen erreichen. Beispielsweise werden Xanthinderivate, ß-adrenergische Sti-65 mulantien (ß-Stimulantien) oder Corticosteroide für die Behandlung von Bronchialasthma eingesetzt. Im Zusammenhang mit diesen Medikamenten wurden jedoch oft nachteilige Reaktionen beobachtet. Beispielsweise wird beschrieben.

    dass bei Patienten, welche Xanthinderivate und ß-Stimulan-tien erhalten haben, Herzklopfen und Tachykardie beobachtet wurde. Ausserdem bewirken Corticosteroide nachteilige Reaktionen wie peptische Geschwüre und bakterielle Infektionskomplikationen. Antihistamine sind bei Bronchialasthma unwirksam. Sie bewirken manchmal sogar eine Verschlechterung der asthmatischen Zustände, indem sie den Auswurf trachialer Sekrete erschweren.

    Immunkomplexkrankheiten, wie rheumatoide Arthritis, systemische Lupus erythematosus (SLE) und Lupus Nephritis werden, wie schon der Name zeigt, durch Komplexe von Antigenen mit Antikörpern, d.h. Immunkomplexe, verursacht und gehören zu den Allergien des Typs III. Obwohl der Entstehungsmechanismus dieser Krankheiten kompliziert ist und viele Punkte noch unklar sind, wird im allgemeinen vermutet, dass sie dem unten beschriebenen Weg folgen.

    Wenn Gewebe durch bakterielle oder virale Infektionen beschädigt werden, werden Antikörper gegen neu gebildete Autoantigene oder viral infizierte Zellen produziert, was zur Bildung von Immunkomplexen führt. Da diese Immunkomplexe das Komplementsystem und die Blutplättchen aktivieren, werden vasoaktive Substanzen, wie Histamin und Serotonin, freigesetzt und die Durchlässigkeit der Blutgefässe erhöht. Dann treten die im Kreislauf befindlichen Immunkomplexe in die Blutgefässe ein und lagern sich entlang der Basalmembran der Gefässwand ab, deren Durchlässigkeit erhöht worden ist. Wo die Immunkomplexe abgelagert wurden, sammeln sich polymorphonukleare Leukozyten, infolge der Wirkung der chemotaktischen Leukozytfaktoren, die durch die Aktion des Komplementes mit den abgelagerten Immunkomplexen gebildet wurden. Die mit den Immunkomplexen reagierenden polymorphonuklearen Leukozyten setzen verschiedene gewebebeschädigende Substanzen, wie Cathepsin D und E, Kollagenase, Elastase und Durchlässigkeitsfaktoren, frei und diese Substanzen, schliesslich, schädigen das Gewebe. Bei Patienten mit Immunkomplexkrankheiten, wie SLE, ist der Gehalt an Komplement im Serum im allgemeinen niedrig und die Verschlimmerung der Krankheit ist eng mit der Abnahme des Komplementgehaltes verbunden. Es wird vermutet, dass die Abnahme durch den starken Verbrauch des Komplementes an Orten der Reaktion zwischen Antigenen und Antikörpern, wie in den Nieren und den Blutgefässen, bewirkt wird. Weiterhin besteht ein Zusammenhang zwischen den Immunkomplexen und den Koagulationssystemen des Blutes und es wird vermutet, dass die Immunkomplexe durch verschiedene Mechanismen ernsthafte Symptome verursachen, beispielsweise durch Beschleunigung der Fibrinoidablagerung auf die beschädigten Gewebe.

    Es gibt verschiedene Arten von Mitteln zur Behandlung von Immunkomplexkrankheiten: Immunsuppressive Mittel wie Steroide, welche ein aktiviertes Immunsystem hemmen, entzündungshemmende Mittel, welche die lokale Entzündung und Schmerzen mindern oder antikoagulative Mittel und Mittel, welche die Blutplättchen beeinflussen und den Abnormalitäten des Koagulation-Fibrinolyse-Systems in den Blutgefässen entgegenwirken. Die Wirksamkeit dieser Mittel ist jedoch nicht befriedigend und sie haben starke nachteilige Wirkungen. Deshalb ist die Entwicklung eines Medikamentes, das sicher in der Anwendung und bei der Behandlung dieser Krankheiten stark wirksam ist, sehr erwünscht.

    Andererseits wurden bereits viele Mittel zur Behandlung von bösartigen Tumoren entwickelt.

    Die Antitumormittel werden in zwei grosse Klassen unterteilt. Zu der ersten Gruppe gehören die sogenannten zytotoxischen Medikamente, welche das Wachstum der Tumore direkt unterdrücken. Zur zweiten Gruppe gehören jene Me3 653 557

    dikamente, die das Wachstum von Tumoren indirekt, durch Aktivierung der Immunschutzfunktionen des Kranken, kontrollieren. Das erstgenannte Mittel ist jedoch nicht genügend selektiv zytotoxisch gegenüber Tumorzellen und ist gleich-5 zeitig toxisch gegenüber den normalen Zellen, wodurch die verabreichbare Gesamtmenge des Mittels beträchtlich eingeschränkt wird. Andererseits ist die Verwendung der zweitgenannten Mittel, d.h. der Immunopotentiatoren, im allgemeinen sicherer, da sie, verglichen mit dem erstgenannten Mit-lo tel, seltener unvorteilhafte oder nachteilige Reaktionen bewirken. Da jedoch Tumore aus den normalen Zellen des Patienten entstehen, vermag der Tumor nicht immer in genügendem Mass als Fremdsubstanz erkannt werden. Darum ergibt sich bei manchen Immunopotentiatoren ein wesentli-15 ches Problem, das sie keine genügende Antitumorwirksam-keit hervorrufen.