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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Erkrankung Erworbenes-Immunschwächesyndrom,
oder AIDS, bleibt im wesentlichen unempfindlich gegenüber einer
Behandlung. Trotz intensiver Bemühungen,
Verbindungen zu entwickeln, die das Virus, HIV, inhibieren, das
die Erkrankung verursacht, schreitet die Infektion fast gleichmäßig voran,
und das Immunsystem des Individuums wird dysfunktionell gemacht.
Infizierte Patienten werden extrem empfindlich gegenüber Sekundärerkrankungen,
wie zum Beispiel Pneumonie und Kaposi's-Sarkom, die oft lebensbedrohlich sind. Während Wirkstoffe,
wie zum Beispiel 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT),
2',3'-Didesoxyinosin (ddI)
und 2',3'-Didesoxycytosin
(ddC) zur Verwendung in infizierten Individuen zugelassen wurden,
sind profunde Toxizitäten
und das Entstehen von Wirkstoff-resistenten viralen Stämmen mit
deren Verwendung assoziiert. Es verbleibt ein kritischer Bedarf,
neue antiretrovirale Mittel allein oder in Kombination mit anderen
antiviralen Mitteln zu identifizieren.
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Eine
effektive anti-retrovirale Therapie hängt von der Identifizierung
von antiviralen Mitteln ab, denen eine signifikante Toxizität fehlt
und die, wenn in der Therapie verwendet, nicht leicht zu der Entstehung
von Wirkstoff-resistenten viralen Isolaten führen. Potentiell brauchbare
Verbindungen bei der Inhibierung von HIV und anderen retroviralen
Infektionen werden in einer Zahl von Systemen gescreent. Anfänglich wird
das Screening in in vitro-Modellen von empfindlichen Zellinien durchgeführt. Dann
werden Tiermodelle verwendet, um diejenigen Verbindungen mit anti-retroviraler
Aktivität
in vivo zu identifizieren, die außerdem akzeptable Spiegel von
Wirtstoxizität
besitzen. Die Modelle untersuchen bevorzugterweise die Aktivität gegen
retrovirale Virämie
sowie die Fähigkeit,
retroviral-induzierte Erkrankung zu unterdrücken, wie zum Beispiel im Fall
von HIV die Zerstörung
des Immunsystems und Erkrankung des zentralen Nervensystems.
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Ein
Modell, von dem gefunden wurde, das es als ein Modell von retroviraler
Infektion, einschließlich HIV-Infektion,
besonders brauchbar ist, ist die Rauscher-Leukämievirus (RLV)-Infektion von Mäusen. RLV
ist in erwachsenen Mäusen
infektiös
und pathogen und ist erythrotropisch, was eine Splenomegalie verursacht, die
mit dem viralen Titer proportional ist.
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Chirigos,
Cancer Res. 24: 1035–1041
(1964). Kurz nach der Inokulation werden abnormale Milzkolonien
gebildet, deren Zahlen die viralen Titer widerspiegeln. Jede Kolonie
ist das Ergebnis eines erfolgreichen viralen "Treffers" und die Kolonie fährt fort, sich zu vergrößern, während neue
Zielzellen kontinuierlich während der
Virämie
transformiert werden. RLV induziert auch B-Zell-Neoplasmen. Daher
führt die
RLV-Infektion zu einer massiven Splenomegalie und Erythroleukämie, die
infizierte Tiere innerhalb von 4–5 Wochen nach der Inokulation
tötet.
Weiss, Teich, Varmus, et al., RNA Tumor Viruses, 2d ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, pp 78–79,
Cold Spring Harbor, NY (1984). Von der RLV-Infektion in Mäusen wurde
auch gezeigt, daß sie
bestimmte immunologische Aspekte der HIV-Infektion in Menschen reproduziert.
Siehe, z. B. Gabrilovich et al., Immunology 82: 82–87 (1994)
und Gabrilovich et al., Eur. J. Immunol. 23: 2932–2938 (1993).
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Die
Verwendung des RLV-Modells, um anti-HIV-Mittel zu identifizieren
und zu evaluieren, hat sich weit verbreitet. Zum Beispiel wurde
RLV als ein Modell der HIV-Infektion zur Evaluierung von AZT (Ruprecht
et al., Nature 323: 467–469
(1986); Ruprecht, Intervirol. 30 (S1) 2–11 (1989)), neuen lipophilen
Derivaten von AZT (Schendener et al., Antiviral Res. 24: 79–93 (1994)),
Derivaten von Tetrahydroimidazol [4,5,1-jk] [1,4]-Benzodiazepin-2
(1H)-thion (Buckheit et al., AIDS Res. Human Retrovir. 9: 1097–1106 (1993),
biologischen Antwortmodifikatoren, einschließlich Tests, die durch die
US Food and Drug Administration durchgeführt wurden, wie z. B. für Poly[I,
C]-LC, MVE-2 und CL 246, 738 berichtet (Black et al., Annl. N. Y.
Acad. Sci. 685: 467–470 (1993))
und Kombinations-anti-HIV-Therapien (z. B. Ruprecht, supra, Buchkeit
et al., supra, und Black et al., supra) berichtet. Und da RLV Leukämien in
infizierten Tieren induziert, wird das RLV-Modell auch extensiv
als ein Modell für
die Behandlung von verschiedenen Typen von Krebs, insbesondere Leukämien, verwendet.
Sydow und Wunderlich, Cancer Lett. 82: 89–94 (1994)).
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Neue
therapeutische Weisen werden dringend benötigt, um effektivere Behandlungen
zur Inhibierung von retroviraler Infektion zur Verfügung zu
stellen. Auch werden effektive Mittel gebraucht, um die Entwicklung von
Krebs zu inhibieren, wie zum Beispiel Leukämien oder anderen Neoplasmen.
Für diese
Zwecke brauchbare Zusammensetzungen sollten relativ einfach herzustellen
und zu verabreichen sein, relativ nicht-toxisch sein und effektive
Inhibitoren von retroviraler Infektion oder besonderen Neoplasmen
darstellen. Relativ überraschend
richtet sich die vorliegende Erfindung auf diese und andere damit
zusammenhängende
Bedürfnisse.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Verfahren zur Herstellung
von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen
Erkrankungen in einer empfindlichen Säugerzelle nützlich ist zur Verfügung. Im
allgemeinen wird das Haifischserum durch eine Ethanol-Haiblut-Mischung,
gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen der
Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen
Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber
nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren, hergestellt.
Das Serum wird dann von jeglichem Niederschlag getrennt und direkt
verwendet oder dazu verwendet, Zusammensetzungen zu bilden, einschließlich pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen Erkrankungen
nützlich
sind. Alternativ kann die aktive Fraktion durch Ethylacetat oder ähnliche
Fraktionierung von Haiblut hergestellt werden.
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In
einem ersten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren
zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen
in einem Säuger
nützlich
ist, zur Verfügung
gestellt, umfassend:
- (a) Zugeben von Ethanol
zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten
Blutkörperchen
und Serum zu bewirken, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet
wird;
- (b) Erwärmen
der Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen
Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber
nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren; und
- (c) Trennen der Mischung in Niederschlag und Haiserumkonzentrat;
und
- (d) wenigstens 3-maliges Wiederholen der Schritte (a) bis (c)
mit dem Haiserumkonzentrat.
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In
einem zweiten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren
zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen
in einem Säuger
nützlich
ist, zur Verfügung
gestellt, umfassend:
- (a) Zugeben von Ethanol
zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten
Blutkörperchen
und Serum zu bewirken bei einer Temperatur von ungefähr 10°C, wodurch
eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird;
- (b) Trennen der Mischung in Niederschlag und einen Überstand,
der das Haiserumkonzentrat umfaßt;
und
- (c) Zugeben von ausreichend Ethanol zum Überstand von Schritt (b), um
eine Endkonzentration von etwa 60% Ethanol zu erreichen, um einen
Niederschlag zu bilden;
- (d) Abtrennen des Niederschlags von Schritt (c);
- (e) Zugeben eines ausreichenden Volumens NaCl, um den Niederschlag
aus Schritt (d) löslich
zu machen und einen Niederschlag zu bilden, der Haiserum-Immunglobulin
umfaßt;
- (f) Abtrennen des Niederschlags aus Schritt (e) von der Lösung;
- (g) Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol zum Filtrat
aus Schritt (f), um eine Endkonzentration von etwa 40% Ethanol zu
erreichen, um einen Niederschlag und einen Überstand zu bilden;
- (h) Zugeben einer ausreichenden Menge NaCl zum Niederschlag
aus Schritt (g), um den Niederschlag löslich zu machen, Einstellen
des pHs der Lösung
auf etwa 7,4 und Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol, um
eine Endkonzentration von etwa 25% Ethanol zu erreichen, um einen
Niederschlag zu bilden, der Hai-Immunglobulin umfaßt;
- (i) Abtrennen des Niederschlags, der Hai-Immunglobulin umfaßt, aus
Schritt (h) von der Lösung.
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In
einem dritten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren
zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen
in Säugern
nützlich
ist, zur Verfügung
gestellt, umfassend:
- (a) Zugeben eines gleichen
Volumens von destilliertem Wasser und Ethylacetat zu einem Volumen
Haiblut;
- (b) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
- (c) Abtrennen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
- (d) Zugeben des Volumens von Ethylacetat aus Schritt (a) und
Vermischen mit der Wasser-Phase
von Schritt (c);
- (e) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
- (f) Abtrennen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
- (g) Wiederholen der Schritte (d) bis (f);
- (h) Entfernen des Wassers aus den Ethylacetat-Phasen;
- (i) Zugeben von Aceton zur Ethylacetat-Phase aus Schritt (h),
um das Hai-Immunglobulin auszufällen;
und
- (j) Abtrennen des gereinigten Hai-Immunglobulins von der Ethylacetat-Phase.
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In
einem vierten Aspekt der vorliegende Erfindung wird eine Zusammensetzung,
erhältlich
durch eines der Verfahren der vorliegenden Erfindung, zur Hemmung
von Rauscher-Mäuseleukämie-virus-Proliferation oder
Tumorzell-Proliferation in einem Säuger zur Verfügung gestellt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Verfahren zur Herstellung
von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung einer retroviralen und
neoplastischen Erkrankungen in einer empfindlichen Säugerzelle
nützlich
ist zur Verfügung.
Im allgemeinen wird das Haifischserum durch eine Ethanol-Haiblut-Mischung,
gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen der
Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen
Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber
nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren, hergestellt.
Das Serum wird dann von jeglichem Niederschlag getrennt und direkt
verwendet oder dazu verwendet, Zusammensetzungen zu bilden, einschließlich pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen Erkrankungen
nützlich
sind. Alternativ kann die aktive Fraktion durch Ethylacetat oder ähnliche
Fraktionierung von Haiblut hergestellt werden.
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Daher
wird in einem Verfahren zur Herstellung von Serumextrakten Ethanol
zu Haiblut in einer ausreichenden Menge hinzugefügt, um die Trennung von roten
Blutkörperchen
und Serum zu bewirken, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet
wird. Typischerweise wird das Haiblut gefroren erhalten und wird
vor dem Zugeben des Ethanols auf, z. B. Raumtemperatur aufgetaut.
Ethanol kann in einer Menge von 20 bis 35% Vol./Vol., weiter gewöhnlich ungefähr 25% Vol.
zugegeben werden. Die Ethanol-Haiblut-Mischung wird auf eine Temperatur,
z. B. etwa 21°C
bis etwa 30°C
(70–85°F) und eine
Zeitdauer erwärmt,
die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber typischerweise
nicht ausreichend sind, um das Serumkomplement zu inaktivieren.
Das Gemisch wird dann durch Zentrifugation, Filtration oder ähnliches
in Niederschlag und Hai-Serumkonzentrat getrennt. Das Verfahren
kann bis zu dreimal oder mehr mit dem Serum durchgeführt werden, um
eine weitere Klärung
und Konzentration der Immunglobuline, einschließlich IgM und/oder jeglichen IgG-ähnlichen
Molekülen
zu erreichen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung,
einschließlich
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Verfügung, die Hai-Serum umfaßt, wobei
das Serum durch eine Verfahren von Mischen von Ethanol mit Haiblut,
gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen aber
wobei das Serumkomplement nicht inaktiviert wird, und Abtrennen
des Serums von jeglichen sich ergebenden Partikeln hergestellt wurde.
Alternativ kann die Zusammensetzung durch Ethylacetat-Extraktion hergestellt
werden. Die Zusammensetzung kann in Mengen formuliert werden, die
ausreichend sind, um die retrovirale Replikation in empfindlichen
Zellen zu inhibieren oder in Mengen, die für die Behandlung von neoplastischer
Erkrankung geeignet sind und weiter einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger
oder Stabilisator, wie zum Beispiel Maltose oder ähnliches
umfassen. Die Zusammensetzungen von Haiserum IgM und/oder IgG-ähnlichen
Molekülen
kann mit Haimarkpräparationen
für eine
synergistische anti-retrovirale Wirkung kombiniert werden. Die Haiserumzusammensetzung
und Immunglobuline darin können
auch lyophilisiert sein.
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In
anderen Ausführungsformen
stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Hemmung einer retroviralen
Infektion von empfindlichen Säugerzellen
zur Verfügung.
Eine Menge von Haiserum, gereinigtem IgM- und/oder IgG-ähnlichen
Molekülen
oder sogar Gesamtblut, die ausreichend ist, die retrovirale Infektion
zu inhibieren oder ihr vorzubeugen, soll an die infizierten oder
Infektions-empfindlichen Zellen verabreicht werden und dadurch in
Kontakt gebracht werden. Der für
eine Inhibierung empfindliche Retrovirus schließt den Maus-Rauscher-Leukämie-Virus (RLV) ein. Das Haiserumkonzentrat,
gereinigte IgM- und/oder IgG-ähnliche Fraktionen,
einzeln oder mit Markpräparation
kombiniert, sollen auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden,
einschließlich
intravenös,
topisch, intramuskulär
oder oral.
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In
einem weiteren Aspekt beschreibt die Erfindung Zusammensetzungen
zur Inhibierung von Tumorzellen. Wie hier beschriebenes Haiserumkonzentrat
soll für
eine Verabreichung an die Tumorzellen in einer ausreichenden Menge,
um das Wachstum des Tumors zu inhibieren, vorgesehen sein. Die inhibierten
Tumorzellen können
in einer Kultur, z. B. in vitro, in einem betroffenen Säuger vorliegen
oder für
eine ex vivo-Behandlung aus dem Säuger entfernt werden. Die für die Inhibierung
empfindlichen Tumore schließen
eine Vielzahl von Sarkomen und Leukämien ein und schließen weiter
diejenigen ein, die durch ein retrovirales Gen induziert werden.
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Beschreibung
der spezifischen Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt Zusammensetzungen, die für die Inhibierung
oder Reversion von retroviral-vermittelter Erkrankung in einem infizierten
Säuger
nützlich
sind. Es wurde als Teil der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß Präparationen
von Haiserum und daraus gereinigte Immunglobuline, IgM- und/oder
IgG-ähnliche
Moleküle,
Manifestationen von retroviraler Erkrankung in einem infizierten
Säuger
inhibieren. Das Haiserum und die Immunglobulinpräparationen sind in der Lage,
den retroviralen Titer und den damit assoziierte Symptome zu inhibieren
und entweder die zellulären
Funktionen wiederherzustellen oder deren weitere Störung vorzubeugen.
In anderen Aspekten der Erfindung werden die Haiserumpräparationen
und Immunglobuline dazu verwendet, um die Entwicklung von neoplastischer
Erkrankung, wie zum Beispiel Sarkomen oder Lymphomen, in betroffenen
Säugern,
zu inhibieren.
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Als
Teil der vorliegenden Erfindungen wurde gezeigt, daß Haiblut,
Serum und Immunglobulin-enthaltende Fraktionen hergestellt werden
können,
die signifikante anti-retrovirale und anti-neoplastische Aktivität besitzen.
Das Haiserumkonzentrat und die Immunglobulinfraktion(en), wenn an
Tier verabreicht, die mit dem Rauscher-Maus-Leukämie-Virus infiziert sind, inhibiert
oder beugt der Entwicklung von Splenomegalie in den Tieren auf eine
Dosisabhängige
Weise vor, wohingegen unbehandelte Tiere schwere Splenomegalie entwickeln.
Der Rauscher-Leukämie-Virus
ist ein weit als ein in vivo-Modell der HIV-Retrovirusinfektion
verwendeter Retrovirus. Ein Standardmaß der Wirkstoffeffektivität in dem
Rauscher-Modell war die Fähigkeit,
die Splenomegalie in infizierten Tieren zu inhibieren. In den hier
beschriebenen Experimenten beugen das Haiserumkonzentrat, Haifischblut,
Serum-Immunglobulinfraktionen
und Ethylacetatfraktionen von Haiblut im wesentlichen und in einigen
Fällen
vollständig
der in Rauscher-infizierten Kontrolltieren beobachteten Splenomegalie
vor. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Symptome einer retroviralen
Erkrankung, inhibiert oder vollständig verhindert werden können, wodurch
es dem Immunsystem des infizierten Individuums ermöglicht wird,
weiter geeignet auf andere Antigene zu antworten, für die eine
Antwort des Individuums schwer unterdrückt wurde, wodurch die Lebensdauer
des Individuums verlängert
wird.
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Die
Präparationen
des hier beschriebenen Haiserumkonzentrats können dazu verwendet werden,
um pathologische Zustände
zu behandeln, die mit der retroviralen Infektion auf dem zellulären Niveau
assoziiert sind, wie zum Beispiel RLV-induzierte neurologische Schädigung,
retroviral-induzierte neoplastische Erkrankungen, programmierter
Zelltod und ähnliches.
Retroviren, die durch die Serumzusammensetzungen behandelt werden
können,
schließen
Rauscher-Maus-Leukämie-Virus
ein. Eine für
die Behandlung oder Inhibierung durch das Haiserum oder Immunglobulin
(IgM- und/oder IgG-ähnliches
Molekül)
und eine Fraktionen) davon geeignete Erkrankung wird unter der Verwendung
von z. B. Säugerzellen
oder Tieren von denen vermutet wird, daß sie eine Erkrankung durchlaufen,
z. B. Sarkoma-Zellen, identifiziert, die als empfindlich gegenüber dem Verfahren
bestätigt
werden, z. B. im Fall der Sarkoma-Zellen tumorigen. Um zu bestimmen,
daß das
Haiserum oder eine andere Präparation
das Fortschreiten der Erkrankung inhibiert, werden die Zellen mit
dem Haiserum oder spezifischer Immunglobulinpräparation behandelt und die
Ergebnisse mit einer unbehandelten Zellprobe verglichen. In beeinträchtigten
Zellen, die behandelt wurden und die eine Inhibierung oder Reversion
einer bequem überwachten
funktionellen Eigenschaft/Eigenschaften zeigen, wie zum Beispiel
die neoplastische Zellteilungsfähigkeit,
wird das Verfahren als empfindlich gegenüber der Behandlung gemäß der vorliegenden
Erfindung bestimmt. Die vorliegenden Verfahren können auch bei der Behandlung
von Autoimmun- oder Autoimmun-assoziierten Erkrankungen verwendet
werden, insbesondere denjenigen, die mit Immunschwächen assoziiert
sind, wie sie mit der RLV-Infektion oder ähnlichen assoziiert sein können.
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In
einer Ausführungsform
wird eine Haiserumpräparation
der vorliegenden Erfindung durch sorgfältige Abtrennung von Blutkomponenten,
wie zum Beispiel Hämoglobin
und Zellen von Serumkomponenten hergestellt. In einer hier bevorzugten
Ausführungsform
wird das Blut anfänglich
von einem Zulieferer gefroren erhalten. Haiblut wird durch eine
Vielzahl von verschiedenen Mitteln geerntet. Da das Haiblut direkt
nach der Tötung anfängt zu verklumpen,
muß das
Bluten so früh
wie möglich
beginnen. In einem Verfahren wird der Kopf des Haifisches angehoben
und der Schwanz entfernt und es dem Blut ermöglicht, in einen geeigneten
Behälter abzulaufen.
Das Blut kann auch ohne ein Töten
des Haifisches erhalten werden, wie zum Beispiel durch die Anwendung
von Venipunktur eines betäubten
oder immobilisierten Haifisches, jedoch werden kleinere Mengen erhalten.
Bevorzugterweise wird das geerntete Blut sofort eingefroren, um
eine Zersetzung zu verhindern. Das Blut kann aus einer Zahl von
verschiedenen Haifischen verwendet werden, wie z. B. dem Mako-,
Thresher-, Schwarzspitzen- oder gewöhnlicher Riffhai, jedoch sind
andere Spezies auch ausreichend, z. B. der Großrücken-Flossenhai oder Ammenhaie.
Die Titer der antiretroviralen und anti-Tumorserumaktivität können durch in vitro-Tests wie
hier beschrieben für
eine bestimmte Spezies oder Quelle bestimmt werden. Serum oder isolierte und
gereinigte Immunglobuline von verschiedenen Spezies können, falls
gewünscht,
vereinigt werden, um einen bestimmten Aktivitätsspiegel zu erreichen. Verschiedene
Immunglobuline können
kombiniert werden, z. B. IgM- und/oder IgG-ähnliche Moleküle und verschiedene
Kombinationen mit Haifischmark können
auch zur effektiven Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen
Verfahren hergestellt werden.
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Um
das Serum von den zellulären
Komponenten zu trennen, wird es dem gefrorenen Blut ermöglicht, aufzutauen,
typischerweise auf Raumtemperatur oder ähnliches. In einem bevorzugten
Abtrennungs- und Konzentrationsverfahren wird das getaute Blut mit
Ethanol oder geeigneten alternativen, z. B. fluorierten Derivaten
von Ethanol, in einem Verhältnis
von ungefähr
15–60%
Ethanol zu Blut (Volumen/Volumen), weiter bevorzugt ungefähr 20–35% Ethanol
zu Blut, gemischt werden und am meisten bevorzugt wird in dem hier
beschriebenen Beispiel ein 25% Ethanol zu Blutgemisch verwendet.
Reines Ethanol (100%) wird bevorzugterweise in diesem Abtrennverfahren
verwendet. Das Gemisch wird allmählich
auf eine Temperatur von ungefähr 21°C–32°C (70°–90°F) unter
sanften Mischen gebracht, weiter bevorzugt ungefähr 21°C–30°C (70°–85°F) und am meisten bevorzugt
in einen Bereich von 21°C–26°C (70°C–75°C). Eine
Heizplatte oder ähnliche
Vorrichtung kann zu diesem Zweck verwendet werden. Das Mischen sollte
ausreichend sein, um ein gründliches
Mischen des Bluts und Alkohols zu bewirken und gleichzeitig ein
Sieden der Präparation
an der Heizoberfläche zu
vermeiden. Das sanfte Mischen der erwärmten Präparation wird fortgeführt, bis
der Alkohol im wesentlichen aus dem Gemisch verdampft wurde, im
allgemeinen ungefähr
1 bis 1½ Stunden
für eine
100 ml Präparation. Die
erhaltene Präparation
wird typischerweise einen Niederschlag enthalten und diese Fraktion
wird von der Flüssigkeit
(Serumkonzentrat) abgetrennt, typischerweise durch Zentrifugation,
Filtration oder ähnliches.
Das Konzentrationsverfahren kann gegebenenfalls mit dem Serumkonzentrat
wiederholt werden, d. h. Wiederholen der Ethanolbehandlung, Erwärmen und
Mischen und Abtrennen, bis das erhaltene Serumkonzentrat im wesentlichen
klar ist und der Niederschlag im finalen Abtrennschritt im wesentlichen
beseitigt ist. Typischerweise wird das Verfahren drei- oder viermal
wiederholt, um das Endprodukt zu erreichen. Ein anschließender Test
der finalen Präparation
wird durch Mischen einer Probe davon mit Ethanol, Erhitzen und Mischen
durchgeführt;
das Fehlen von weiteren Niederschlag zeigt ein im wesentlichen reines
Serumprodukt an.
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Zur
Herstellung einer pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzung wird
das Haiserumkonzentrat und daraus erhaltene Fraktionen, z. B. gereinigtes
IgM- und/oder IgG-ähnliche
Moleküle,
typischerweise auf eine dem Fachmann in der Herstellung von pharmazeutisch
akzeptablen Serumpräparationen
gut bekannte Weise sterilisiert werden, z. B. durch Filtration,
Bestrahlung, usw. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen
Serumpräparationen
sind in z. B. U.S.-Patent Nrn. 4,587,121; 3,903,262 und 4,186,192
beschrieben.
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Die
Haifischserum- oder Immunglobulinzusammensetzungen können an
Personen oder Säuger
verabreicht werden, die an retroviral-assoziierter Erkrankung oder
Krebs leiden oder dafür
empfänglich
sind. Von dem Haiserum und dem Immunglobulin davon wird geglaubt,
daß es
die Funktionalität
wieder herstellt, wie zum Beispiel die immunproliferative Fähigkeit.
Daher wird nicht nur die Vermehrung oder Verbreitung des Virus durch
die Behandlung verhindert, sondern der Säuger erlangt sein responsives
Immunsystem wieder zurück oder
behält
dies bei und ist daher in der Lage, auf andere Antigenangriffe zu
reagieren.
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Die
Zusammensetzungen finden auch Verwendung für die prä- oder post-Expositionsprophylaxe, im Anschluß an Verletzungen
mit schmutzigen Nadeln für
Pflegepersonal oder routinemäßig begleitend
bei Bluttransfusionen oder für
Personen, die in Gefahr sind, gegenüber infizierten Körper- oder
Kulturflüssigkeiten
ausgesetzt zu werden. Für
die post-Expositionsprophylaxe wird die Verabreichung kurz nach
der vermuteten Inokulation begonnen und für mindestens ungefähr 2 bis
4 Wochen danach fortgeführt,
gefolgt von zusätzlichen Dosen
oder lange Zeit aufrechterhaltenen Dosen, wie sie möglicherweise
erforderlich sein können,
um das Wachstum des Virus und die Erkrankung zu inhibieren und/oder
eine Immunität
dagegen aufrecht zu erhalten.
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Die
pharmazeutischen Serum- und Immunglobulin-Zusammensetzungen sind
für die
parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung für die prophylaktische
und/oder therapeutische Behandlung vorgesehen. Bevorzugterweise
werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen oral oder parenteral
verabreicht, d. h. intravenös,
intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär. Daher stellt die vorliegende
Erfindung Zusammensetzungen für
die orale, topische oder parenterale Verabreichung zur Verfügung, die
eine Lösung
eines Haiserumkonzentrats, im wesentlichen gereinigten Immunglobulins
und/oder Haifischmarks in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugterweise
einem wäßrigen Träger, umfassen.
Eine Vielzahl von wäßrigen Trägern kann
verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3%
Glycin und ähnliches
und kann andere Proteine für
eine verbessertes Stabilität
enthalten, wie zum Beispiel Albumin, Lipoprotein, Globulin usw.,
die milden chemischen Modifikationen oder ähnliches unterzogen werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch in eine Creme oder
Salbe für
die topische oder transdermale Verabreichung, z. B. bei einer 25%igen
Konzentration, formuliert werden. Die Zusammensetzungen können durch
herkömmliche
gut bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die sich
ergebenden Lösungen können zur
Verwendung verpackt werden oder unter aseptischen Bedingungen filtriert
werden und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Präparation
mit einer sterilen Lösung
vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch
akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie für geeignete physiologische
Bedingungen erforderlich, wie zum Beispiel ein pH einstellendes
und pufferndes Mittel, die Tonizität einstellende Mittel und ähnliches,
zum Beispiel, Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Kalziumchlorid, Stabilisatoren (z. B. Maltose (1–20%)), usw.
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Die
Konzentration des Haiserums, der Immunglobulinpräparation und/oder des Marks
in diesen pharmazeutischen Formulierungen kann weit variieren, d.
h. von weniger als ungefähr
10%, gewöhnlich
bei oder mindestens ungefähr
25%, bis zu so viel wie 75 oder 90 Gew.-% und wird vorherrschend
durch Flüssigkeitsvolumen,
Viskositäten,
usw. in Übereinstimmung
mit der bestimmten Verabreichungsart und der zu behandelnden Erkrankung
ausgewählt.
Aktuelle Verfahren zur Herstellung von oral, topisch und parenteral
verabreichbaren Zusammensetzungen werden dem Fachmann bekannt oder
ersichtlich sein und sind im Detail in, zum Beispiel, Remington's Pharmaceutical
Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) beschrieben.
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Die
Bestimmung einer effektiven Menge einer Zusammensetzung der Erfindung,
um die retroviral-vermittelte Erkrankung oder den Krebs in einem
Patienten zu inhibieren, kann durch empirische Standardverfahren
bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum
Beispiel kann eine Reversion der Beeinträchtigung der Immunfunktion,
z. B. eine Wiederherstellung der lymphoproliferativen Antwort auf
ein "Recall"-Antigen (z. B. Influenza),
Alloantigene oder Mitogene, wie zum Beispiel PWM oder PHA, und so
die Effizienz der betreffenden Zusammensetzungen mit einer Vielzahl
von gut bekannten in vitro T-Zell Zellteilungs-Antwortverfahren überwacht
werden.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung sollen an einen Wirt verabreicht
werden, der bereits an einer retroviralen Infektion oder Neoplasma,
wie oben beschrieben, leidet, in einer Menge, die ausreichend ist,
um die Entwicklung der darauf folgenden Immunschwächeerkrankung
und ihrer Komplikationen oder dem empfindlichen Tumor vorzubeugen
oder deren Entwicklung zumindest teilweise aufzuhalten, wie genauer
unten beschrieben wird. Eine geeignete Menge, um dies zu erreichen,
wird als eine "therapeutische
effektive Dosis" definiert.
Für diese
Verwendung effektive Mengen werden beträchtlich variieren und von der
Schwere der Infektion oder Erkrankung und dem Gewicht und generellen
Zustand des Patienten, der behandelt wird, abhängen, jedoch im allgemeinen
von ungefähr
5 mg/kg bis ungefähr
1.000 mg/kg Wirtskörpergewicht
von Haiserumkonzentrat; Immunglobulin und/oder Mark pro Anwendung
erreichen, wobei Dosen von ungefähr
10 mg/kg bis ungefähr
200 mg/kg pro Anwendung häufiger
verwendet werden. Die Verabreichung ist täglich, wöchentlich oder weniger häufig, wie
in Abhängigkeit
von der Antwort auf die Erkrankung und der Toleranz des Patienten gegenüber der
Therapie erforderlich. Aufrechterhaltende Dosierungen über eine
andauernde Zeitdauer hinweg können
erforderlich sein, und die Dosierungen können wie er forderlich eingestellt
werden. Die Zeitdauer der Verabreichung wird im allgemeinen ausreichend
sein, um das Immunsystem des Wirts wiederherzustellen, so daß effektive
Immunantworten gegen eine Vielzahl von Antigenen aufgebaut werden
können,
am meisten wünschenswert
dem RLV-Virus im Fall von mit RLV infizierten Säugern, oder um das Wachstum
der Krebszellen zu beseitigen oder wesentlich zu inhibieren. Falls
das wiederhergestellte Immunsystem eines Individuums nicht in der
Lage ist, die Erkrankung zu beseitigen, können Aufrechterhaltungsdosierungen über eine
verlängerte
Zeitdauer hinweg erforderlich sein. Auch muß berücksichtigt werden, daß die Materialien
der vorliegenden Erfindung in lebensbedrohenden oder potentiell
lebensbedrohenden Situationen verwendet werden können. In solchen Fällen ist
es möglich
und kann es durch den behandelnden Arzt wünschenswert sein, wesentliche Überschüsse dieser
Verbindungen zu verabreichen. Für
veterinäre
Verwendungen können
höhere
Spiegel als erforderlich verabreicht werden.
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In
prophylaktischen Anwendungen sollen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung an einen Säuger
verabreicht werden, der empfindlich gegenüber einer retroviral-vermittelten
Erkrankung ist oder auf eine andere Weise einem Risiko einer retroviral-vermittelten
Erkrankung unterliegt, um die eigenen immunologischen Fähigkeiten
des Patienten zu verbessern. Solch eine Menge wird als eine "prophylaktisch-effektive Dosis" definiert. Bei dieser
Verwendung werden die genauen Mengen wiederum von dem Gesundheitszustand und
dem Gewicht des Patienten abhängen,
jedoch allgemein von ungefähr
1 mg/kg bis ungefähr
250 mg/kg Körpergewicht,
weiter herkömmlich
von ungefähr
10 mg/kg bis ungefähr
100 mg/kg Körpergewicht
reichen.
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Einzelne
oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen werden durchgeführt, wobei
die Dosisspiegel und -muster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden.
In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen des Haiserumkonzentrats,
der gereinigten Immunglobulinpräparation
und/oder Mark eine Menge des Inhibitors zur Verfügung stellen, die ausreichend
ist, um die retroviral-vermittelte Erkrankung oder den Tumor in
dem behandelten Wirt effektiv zu inhibieren.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können auch für die ex vivo-Therapie verwendet
werden. Mit ex vivo- oder extrakorporaler Therapie ist gemeint,
daß therapeutische
Manipulationen an Wirtszellen und Flüssigkeiten außerhalb
des Körpers
durchgeführt
werden. Zum Beispiel können
Lymphozyten oder andere Zielzellen aus einem Patienten entfernt
werden und mit hohen Dosen der Zusammensetzung behandelt werden,
wobei eine Konzentration von Inhibitor zu der Zelle weit im Überschuß von Spiegeln
zur Verfügung
gestellt wird, die von einem Patienten toleriert werden könnten oder
in ihm erreicht werden könnten.
Im Anschluß an die
Behandlung werden die Zellen in den Wirt zurückgegeben, um die Erkrankung
zu behandeln.
-
Eine
Zusammensetzung der Erfindung kann mit einer oder mehreren anderen
pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Vielzahl von therapeutischen
Verwendungen, z. B. einer verstärkten
therapeutischen Aktivität
gegen RLV-Retroviren oder Krebs, kombiniert werden. Zum Beispiel
können
bei der Behandlung von RLV-Infektion die pharmazeutischen Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung allein oder als eine zusätzlich Therapie
und Haiserumkonzentrat verabreicht werden. Die IgM-Fraktion kann
auch mit der IgG-ähnlichen
Fraktion kombiniert werden, um eine verstärkte Effizienz zu erreichen.
Serum und/oder gereinigte Immunglobuline können auch mit Haimarkpräparationen
kombiniert werden. Wenn als eine zusätzliche Therapie verabreicht,
können
die Präparationen
in Verbindung mit den anderen Behandlungsmodalitäten oder getrennt zu verschiedenen
Intervallen verabreicht werden.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden auch Verwendung
in vitro. Die Zusammensetzungen können dazu verwendet werden,
um retroviral-induzierten Tod von kultivierten Zellen, wie zum Beispiel
bestimmten Hybridom- oder anderen Lymphozytenlinien, die empfindlich
gegenüber
retroviraler Infektion sind, zu inhibieren. Die Präparationen
der Erfindung können
auch in Screeningverfahren, um effektive Spiegel von anti-retroviralen
Verbindungen zu ermitteln, oder anderen Behandlungen, verwendet
werden. Zusätzlich
kann durch Bestimmen, ob eine Retrovirus-vermittelte Dysfunktion
oder Tod der Zellen eines Patienten empfindlich gegenüber der
Inhibierung oder der Reversion durch eine Zusammensetzung der Erfindung
ist, eine geeignete Therapie leichter etabliert werden oder, alternativ,
können
die Effekte von anderen Behandlungsumständen, wie zum Beispiel anderer
anti-RLV-Behandlungsschemata,
bestimmt werden. Daher kann ein Diagnostikum zur Ermittlung der
Effizienz von zum Beispiel anti-RLV-Therapie auch zur Verfügung gestellt werden.
Der Nachweis von Veränderungen
in vitro im Hinblick auf die Spiegel der HIV-Empfindlichkeit oder
die Wiederherstellung der Immunfunktion, z. B. der Antwort auf Recall-Antigene,
gegen Alloantigene oder gegen Mitogene, wie zum Beispiel PWM oder
PHA stellt eine Indikation einer in vivo-Aktivität des Haiserums oder der Immunglobulinzusammensetzungen
zur Ver fügung,
die zur Behandlung in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
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Um
Veränderungen
im Spiegel der Immunfunktion in einer Zellpopulation zu überwachen,
können Kontrollwerte
der Immunfunktion aus Zellen der allgemeinen Population oder von
dem Patienten vor dem Beginn der Therapie bestimmt werden. Da die
Immunfunktion sich beträchtlich
zwischen den Patienten unterscheiden kann, ist die Bestimmung der
prä-Behandlungsimmunfunktion
von jedem Patienten bevorzugt. Der Spiegel von Immunfunktion in
Zellen, z. B. Lymphozyten im Fall von RLV infizierten Säugern, wird
dann während
der Therapie verfolgt. Dieser Spiegel wird mit dem Spiegel der Immunfunktion
in Zellen verglichen, die nicht der Therapie ausgesetzt waren, und
die Effektivität
der Therapie wird durch einen erhöhten Spiegel in der gemessenen
Immunfunktion während
oder post-Therapie ermittelt.
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Das
Haiserumkonzentrat und gereinigtes IgM- und/oder IgG-ähnliches
Immunglobulin der vorliegenden Erfindung kann auch als ein anti-neoplastisches
Mittel verwendet werden. Unter den durch das Serumkonzentrat inhibierten
neoplastischen Erkrankungen befinden sich Sarkome, Leukämien und
Karzinome, einschließlich
denjenigen, die durch ein retrovirales Gen induziert werden können. Die
Bestimmung einer effektiven Menge von Haiserumkonzentrat der Erfindung,
die ausreichend ist, um das Wachstum der neoplastischen Zellen zu
inhibieren, kann zum Beispiel durch Verfolgen von metastatischen
Stellen mit einer Vielzahl von Verfahren bestimmt werden, z. B.
in vivo-Bildgebung oder ex vivo diagnostischen Techniken. Andere
Krebsmarker können
auch dazu verwendet werden um die Therapie mit dem Serumkonzentrat
der Erfindung zu überwachen,
z. B. der CEA-Test oder der PSA-Test für Prostatakarzinom, dieser
Test ist käuflich
erhältlich.
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Die
therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sollen an einen
Patienten verabreicht werden, der bereits an einem Neoplasma leidet,
z. B. Sarkom, Leukämie
oder Karzinom, in einer Menge, die ausreichend ist, um die Erkrankung
zu heilen oder zumindest teilweise aufzuhalten. Eine geeignete Menge
um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch
effektive Dosis" definiert.
Für diese
Verwendung effektive Mengen werden von der Schwere des Neoplasma
und seiner Lokalisierung abhängen,
insbesondere wenn eine metastatische Stelle beteiligt ist, und dem
Gewicht und dem generellen Zustand des Patienten der behandelt wird, jedoch
allgemein von ungefähr
10 mg/kg bis ungefähr
1.000 mg/kg Wirtskörpergewicht
an Serumkonzentrat und/oder Immunglobulin pro Tag reichen, wobei
Dosen von ungefähr
25 mg/kg bis ungefähr
125 mg/kg pro Tag häufiger
verbreitet verwendet werden. Aufrechterhaltende Dosierungen über eine
verlängerte
Zeitdauer hinweg können
wie erforderlich eingestellt werden. Da die Haiserumkonzentrate
und Immunglobuline in fortgeschrittenen Erkrankungszuständen verwendet
werden können,
gemeint ist, lebensbedrohenden oder potentiell lebensbedrohenden
neoplastischen Erkrankungen, ist es möglich und kann durch den behandelnden
Arzt als wünschenswert
empfunden werden, wesentliche Überschüsse dieser
Zusammensetzungen zu verabreichen.
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Einzelne
oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können durchgeführt werden, wobei
die Dosisspiegel und -muster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden.
In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine
Menge an Zusammensetzungen der Erfindung zur Verfügung stellen,
die ausreichend ist, um effektiv die neoplastische Erkrankung zu
inhibieren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung können
allein oder als zusätzliche
Therapie verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können mit
zum Beispiel Taxol, Cis-Platin, Tamoxifen, Etoposidphosphat, Doxorubizin,
Daunomycin, endokriner Therapie usw. verabreicht werden. Wenn als
eine zusätzliche
Therapie verabreicht, können
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang
mit den anderen Behandlungsmodalitäten verabreicht werden oder
getrennt zu unterschiedlichen Intervallen.
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Wie
mit den hier beschriebenen Zusammensetzungen zur Inhibierung von
retroviralvermittelter Erkrankung können das Haiserum und die Markpräparationen
und das Immunglobulin der Erfindung auch in der ex vivo-Therapie
von neoplastischer Erkrankung verwendet werden. Zum Beispiel werden
Knochenmarks- oder andere Zielzellen oder Gewebe aus einem Patienten
entfernt und mit hohen Dosen von Zusammensetzungen behandelt, die
die Zusammensetzung der Erfindung umfassen, die gegebenenfalls an
zytotoxische Mittel konjugiert werden können, wie zum Beispiel Toxine,
Wirkstoffe, Marker, usw., wodurch eine therapeutische Konzentration
der Zusammensetzungen weit im Überschuß von Spiegeln
zur Verfügung
gestellt wird, die in dem Patienten erreicht werden könnte oder
durch ihn toleriert werden könnte.
Im Anschluß an
die Behandlung, um die neoplastischen Zellen in der Zielzellpopulation
oder dem Gewebe zu beseitigen, werden die Zellen oder Gewebe in
den Patienten zurückgegeben.
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Die
folgenden experimentellen Beispiele werden zur Verdeutlichung und
nicht zur Begrenzung angeboten.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung von Serumkonzentraten aus Haifischblut.
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Gesamt-Haiblut
aus Mako-Haifisch wurde gefroren erhalten. Das Blut wurde von den
Haifischen durch Abtrennen des Schwanzes und Anheben des Körpers erhalten,
wobei es dem Blut ermöglicht
wurde, in einen Behälter
abzulaufen, der versiegelt wurde und in einem gekühlten Raum
gefroren wurde. Das Blut wurde gefroren gehalten, bis es an das
Labor geliefert wurde. Dem gefrorenen Blut wurde es erlaubt, auf
Raumtemperatur aufzutauen.
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In
einer typischen Präparation
wurden 100 ml des aufgetauten Haifischbluts mit 25% (im Volumen)
reinem Alkohol bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wird dann
auf eine Temperatur von ungefähr 21°C–26°C (70–75°F) gebracht,
unter Mischen, das ausreichend war um ein gründliches Gemisch des Bluts und
des Alkohols zu erreichen und so ein Sieden der Präparation
an der Heizoberfläche
zu verhindern. Das sanfte Mischen der gewärmten Präparation wurde fortgeführt, bis
der Alkohol im wesentlichen aus dem Gemisch verdampft war, im allgemeinen
ungefähr
1 bis 1½ Stunden
für eine
100 ml Präparation.
Die erhaltene Präparation
enthielt einen Niederschlag, und dieser wurde durch Zentrifugation
(Physician's Compact
Centrifuge, Clay Adams, Inc.) bei 1.315 × g für 40–45 Minuten entfernt und der
Niederschlag verworfen. Dieses Verfahren der Ethanolbehandlung,
Erhitzen und Mischen, Zentrifugieren und Abgießen wurde drei- bis viermal wiederholt.
Die erhaltene Flüssigkeit
ist sehr klar und nur eine Spur an Niederschlag wird im finalen
Zentrifugationsschritt erhalten. Ein anschließender Test der finalen Präparation
durch Mischen mit Ethanol, Erhitzen und Mischen, gefolgt von Zentrifugation
zeigt ein im wesentlichen reines Produkt mit keinem Niederschlag
im Zentrifugationsgefäß an.
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Das
Ausgangs-Haifischblut wies eine Hämoglobinkonzentration von 16
g pro 100 ml und einen Gesamtproteingehalt von 6,6 g pro 100 ml
auf. Das in den Rauscher-Virus-Inhibierungsbeispielen
wie unten beschrieben verwendete Haiblutkonzentrat wies einen Hämoglobingehalt
von 4,6 g pro 100 ml auf und einen Proteingehalt von 1,5 g pro 100
ml. Ein Testen von zwei Präparationen
von Serumkonzentrat mit für
menschliches IgM-spezifischen Reagenzien zeigte Konzentrationen
von ungefähr
368 mg/dl für
das Erste und 155 mg/dl für das
Zweite an und ein für
menschliches IgG-spezifisches Reagenz zeigte Konzentrationen von
ungefähr
139 mg/dl für
das Erste und 52 mg/dl für
das Zweite an.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen
Serumpräparation,
um Manifestationen von Retrovirus-Infektion in einem Säuger zu
inhibieren.
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Die
Effizienz der Haiserumpräparation
als ein anti-retrovirales Mittel wurde unter der Verwendung des Rauscher-Virus-Erkrankungsmodells
bestimmt. Rauscher ist ein pathogener Maus-Retrovirus in Mäusen, der typischerweise
Erythroidkolonien in der Milz von Mäusen verursacht, die zu einer
schweren Splenomegalie führen,
und verursacht auch eine Erythroleukämie. In dieser Untersuchung
wurden BALB/c-Mäuse,
die mit der Haiserumpräparation
behandelt wurden und unbehandelte Kontrollen mit Viruspräparationen
infiziert.
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BALB/c-Mäuse, die
jeweils 12–15
Gramm wogen, wurden als Testtiere verwendet. Die Mäuse wurden von
Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, erhalten und wurden für eine minimale
Zeit von fünf
Tagen in Quarantäne
gehalten, bevor sie für
die Versuche verwendet wurden. Die Mäuse wurden bei stabiler Temperatur
gehalten und täglich
auf Anzeichen von Erkrankung, Streß, Verletzung und externen
Parasiten beobachtet.
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Der
Test wurde wie folgt durchgeführt.
Die Tiere wurden in fünf
Gruppen geteilt. Gruppe 1, die aus zwölf Tieren bestand, diente als
eine Kontrolle, in der Mäuse
nicht mit Rauscher-Virus
konfrontiert wurden, wurde jedoch IP mit 0,2 ml an physiologischer
Kochsalzlösung
täglich
für fünf Tage
injiziert. Zwölf
Tiere der Gruppe 2 wurden mit dem Rauscher-Virus an Tag 1 der Untersuchung
konfrontiert und erhielten Injektion IP von physiologischer Kochsalzlösung täglich für fünf Tage.
Gruppe 3A bestand aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag
0 konfrontiert wurden und erhielten 0,5 ml Haiserumpräparation
durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Gruppe 3B bestand
aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag 0 konfrontiert wurden und
erhielten 0,25 ml Haiserumpräparation
durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Gruppe 3C bestand
aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag 0 konfrontiert wurden
und erhielten 0,1 ml Haiserumpräparation
durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Jede Maus wurde intraperitoneal
mit 0,1 ml Rauscher-Leukämie
Virus-infizierten Zellen (06-000-000; Advanced Biotechnologies,
Inc., MD) injiziert. Unmittelbar im Anschluß an die Virusinjektion an
Tag 0 erhielten die Tiere die erste Injektion an Kochsalzlösung oder
der Haiserumpräparation.
Die Tiere wurden täglich
für 21
Tage beobachtet und das Experiment wurde an Tag 21 beendet, wobei
die Gewichte aller Überlebenden
vor der Tötung
aufgezeichnet wurden. Die Milzen wurden von allen Tieren unmittelbar
im Anschluß an
die Tötung
entfernt, gewogen und aufgezeichnet.
-
Die
Ergebnisse, die in Tabelle 1 gesehen werden können, zeigen, daß Gruppe
1-Tiere, die nur Kochsalzlösung
erhielten, ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 120 mg aufwiesen.
Gruppe 2-Tiere, die mit Rauscher-Virus konfrontiert wurden, die
jedoch nur Kochsalzlösungsbehandlung
erhielten, wiesen massive Milzen auf, mit einem mittleren Milzgewicht
pro Maus von 3.800 mg. Diese Kontrollgruppen zeigten die Etablierung der
retroviralen Infektion und die fortschreitende Erkrankung in infizierten
Tieren. Im Unterschied zu den Kochsalzbehandelten Tieren wiesen
die Tiere, die 0,5 ml, 0,25 ml oder 0,1 ml an Haiserumpräparationen
erhielten, dramatisch kleinere Milzen auf, mit mittleren Milzgewichten
pro Maus von jeweils 110 mg, 398 mg und 872 mg.
-
-
Die
Ergebnisse bestätigen,
daß die
Haiserumpräparation
signifikante anti-retrovirale Aktivität enthielt und im Fall der
0,5 ml-Behandlung das normale Fortschreiten der retroviralen Erkrankung
in den infizierten Tieren effektiv verhinderte oder im Fall der
niedrigen Dosierungen inhibierte.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel beschreibt die Verbindung von fraktionierten Haiserumpräparationen,
um Manifestationen von Retrovirus-Infektion in Mäusen zu inhibieren, unter der
Verwendung des Rauscher-Virus-Erkrankungsmodells.
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Hai-Gesamtblut
wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Das Blutserum wurde
präpariert
und zum Testen in dem Rauscher-Test wie folgt fraktioniert. Zu 100
ml Blut wurden 800 ml an destilliertem Wasser und 300 ml Ethanol
hinzugefügt,
gefolgt durch Mischen für
10 Minuten bei 10°C
und Zentrifugation bei 1.600 × g
für 10
Minuten bei 10°C.
Der Niederschlag (als "Ppt.
I" bezeichnet) wurde
für die
Tests aufgehoben (als eine Resuspension in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung,
PBS) und der Überstand
(als "Sup. I" bezeichnet), 750
ml, wurde mit Ethanol kombiniert, um eine finale Konzentration von
60% Ethanol zu erreichen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Das
Gemisch wurde bei 22.000 × g
für 20
Minuten bei 4°C
zentrifugiert, wobei der Überstand
davon als "Sup.
II" bezeichnet wurde.
Der Niederschlag "Ppt.
II" wurde mit 30
mM NaCl (750 ml) kombiniert und filtriert. Der erhaltene Niederschlag
("Ppt. III") wurde verworfen
und das Filtrat mit Ethanol auf eine finale Konzentration von 30%
Ethanol behandelt. Dies wurde bei 22.000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert
und der Überstand
("Sup. III") aufgehoben. Der
Niederschlag ("Ppt.
IV") wurde mit 30
mM NaCl (100 ml) behandelt (ein Teil an Ppt. IV wurde auch zum Testen
in PBS resuspendiert), der pH auf 7,4 mit 0,5 M Na2HPO4 eingestellt und dann mit Ethanol gemischt,
um eine finale Konzentration von 25% Ethanol zu erreichen. Die Lösung wurde
bei 22.000 × g
für 20
Minuten bei 4°C
zentrifugiert und der Niederschlag ("Ppt. V"), umfassend eine gereinigte Immunglobulinfraktion
einschließlich
eines IgG-ähnlichen
Moleküls,
wurde geerntet.
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Getrennt
davon wurde eine Präparation
von Haifischblut mit Ethylacetat extrahiert. Zu 500 ml Blut wurden
500 ml dH2O hinzugefügt und drei Extraktionen mit
500 ml-Teilen an Ethylacetat wurden durchgeführt. Die sich ergebenden 1.400
ml an Ethylacetat wurden über
wasserfreiem Natriumcarbonat getrocknet und dann auf ein 50 ml Volumen
eingedampft. Ein Niederschlag wurde dann nach der Zugabe von 300
ml Aceton gebildet. Der Niederschlag wurde zentrifugiert und luftgetrocknet.
Ungefähr
2 g eines braun- bis cremefarbigen Pulvers ergab sich und wird als
die Ethylacetat-Fraktion bezeichnet. Ungefähr 0,5 g des Pulvers wurden
zum Testen in 50 ml PBS resuspendiert.
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BALB/c-Mäuse, die
jeweils 12–15
Gramm wogen, wurden als Testtiere verwendet. Die Mäuse wurden von
Simonsen Laboratories, Gilroy, CA, erhalten und wurden für mindestens
fünf Tage
in Quarantäne
gehalten, bevor sie zum Testen verwendet wurden. Die Mäuse wurden
bei stabiler Temperatur gehalten und täglich wie oben beschrieben
beobachtet.
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Die
Tests wurden wie folgt durchgeführt.
Zur Konfrontation mit Virus wurden Rauscher-Leukämie
Virus-infizierte Zellen (06-000-000) von Advanced Biotechnologies,
Inc., MD erhalten und der Virus aus Passage-Mäusen weitergegben. Für das Konfrontationsverfahren
wurden alle Gruppen, die für
die Konfrontation mit dem Rauscher-Virus vorgesehen waren, an Tag
0 konfrontiert und jede Maus wurde intraperitoneal (IP) mit 0,25
ml Virus injiziert. Für
das Behandlungsverfahren wurde jede für die Behandlung vorgesehene
Maus IP mit 0,5 ml Haiblut oder der angegebenen Fraktion für eine Dauer
von fünf
Tagen, von Tag 1 bis Tag 5, injiziert. Die Mortalitätszahlen
wurden täglich
für alle
Gruppen aufgezeichnet. Die Studie wurde an Tag 28 beendet. Die Milzen
wurden unmittelbar von den Tieren im Anschluß an die Tötung entfernt und gewogen.
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Die
Ergebnisse, die in Tabelle 2 gesehen werden können, zeigen, daß Gruppe
1-Tiere die nur Kochsalzlösung
erhielten, ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 98 mg aufwiesen.
Gruppe 2-Tiere, die mit Rauscher-Virus konfrontiert wurden, die
jedoch nur Kochsalzlösungsbehandlung
erhielten, wiesen ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 3.620 mg
auf. Diese Kontrollgruppen zeigen die Etablierung der retroviralen
Infektion und die fortschreitende Erkrankung in infizierten Tieren.
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Im
Unterschied zu den Kochsalz-behandelten Tieren wiesen Tiere, die
0,5 ml Gesamtblut (Gruppe 3), Ppt. V (Gruppe 11) oder Ethylacetatkonzentrat
(Gruppe 12) erhielten, dramatisch kleinere Milzen auf, mit mittleren
Milzgewichten pro Maus von jeweils 226 mg, 148 mg und 96 mg.
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Die
Ergebnisse bestätigen,
daß das
Haiblut und die Serum-Immunglobulinpräparationen, die eine IgG-ähnliche
Fraktion einschließen,
eine signifikante anti-retrovirale Aktivität enthielten und effektiv dem
Fortschreiten von retroviraler Erkrankung in der Milz von infizierten
Tieren vorbeugten oder dies inhibierten.
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Eine
getrennte Untersuchung wurde mit einer verschiedenen Präparation
von gereinigtem Haifisch-Immunglobulin in dem Rauscher-Modell und
einer Fraktion ("Fr.
2"), die während des
Reinigungsverfahrens erhalten wurde, durchgeführt. Die Untersuchung wurde
im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, und ist im folgenden zusammengefaßt:
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Diese
Untersuchung bestätigt
die anti-retrovirale Effizienz der Haifisch-Immunglobulinenthaltenden Fraktion,
die in der in Tabelle 2 berichteten Untersuchung beobachtet wurde.
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Beispiel 4
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Diese
Beispiel zeigt eine signifikante anti-Tumoraktivität der Haifischserumpräparation,
die in Beispiel 1 beschrieben ist.
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Der
in dieser Untersuchung verwendete Tumor war Sarkom 180, erhalten
von der American Type Culture Collection und in wöchentlichen
Intervallen als Aszites in nicht-behandelten weiblichen Swiss-Webster-Mäusen passiert.
Um das Inokulum von Tumorzellen für die vorliegende Studie zu
präparieren,
wurde Aszites-Flüssigkeit
aus einer Maus mit einer 7–10
Tag Aszites mit steriler Technik aspiriert. Die Tumorzellen wurden
unter der Verwendung von Trypan-blau Färbung auf ihre Lebensfähigkeit
hin überprüft. Eine
Tumorzellzahl wurde dann bestimmt und die Zellen mit normaler Kochsalzlösung oder
Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verdünnt, um
eine finale Konzentration von 1–2 × 106 Zellen/mm3 zu erhalten.
Diese Suspension wird für
die Injektion in Mäusen
verwendet. Die finale Verdünnung
wird auf Tryptikase-Soja-Agar plattiert, um zu bestimmen, das sie
frei von bakterieller Kontamination ist.
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Für die Injektion
in Tiere werden 0,1 ml der Tumorzellsuspension in den linken hinteren
Beinmuskel jeder Maus inokuliert. Inokulierte Mäuse wurden dann in einen großen Käfig plaziert
und zufällig
in Gruppen von zehn Mäusen
aufgeteilt und dann unter Routinebedingungen gehalten. Die Mäuse wurden
am Tag der Beimpfung, Tag 7 und Tag 14 zum Zeitpunkt der Tötung gewogen.
-
Die
Behandlung der Mäuse
wurde gewöhnlicherweise
einen Tag nach der Injektion des Tumors begonnen und wurde täglich für fünf Tage
fortgeführt.
In einer Gruppe wurde die Behandlung nicht bis Tag 7 begonnen, zu
der Zeit war der sich entwickelnde Tumor fühlbar. In diesem Fall wurde
die Behandlung für
5–7 Tage
vor der Tötung
fortgeführt.
Am Ende der 14-tägigen Beobachtungszeitdauer
wurden die Mäuse
durch zervikale Dislokation oder Ether-Betäubung
getötet.
Die Haut über
dem linken hinteren Bein wurde entfernt, um den Tumor freizulegen
und das Bein mit Tumor wurde am Hüftgelenk entfernt. Jegliche
restliche Haut wurde entfernt und das Bein/Tumor wurde gewogen.
Der Mittelwert des normalen Beins wurde von dem Gewicht des Beins
mit dem Tumor abgezogen, um eine Abschätzung des ak tuellen Tumorgewichts
zur Verfügung
zu stellen. Prozent-Tumorinhibierung wurde wie folgt bestimmt:
-
-
Es
gab zehn Mäuse
pro Gruppe. Die Testmäuse
wurden an Tag 1 behandelt (dem Tag nach der Tumorimplantierung)
und für
fünf Tage
fortgeführt.
Die Tumorgewichte wurden an Tag 14 bestimmt. Zehn Mäuse dienten
als Kontrolle und wurden mit 0,5 ml Kochsalzlösung behandelt, zehn Mäuse erhielten
0,25 ml Haiserumpräparation
und zehn Mäuse
erhielten 0,5 ml Haiserumpräparation.
Alle Behandlungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht.
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Die
Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 4, zeigten an, daß die Haiserumpräparation
eine signifikante anti-Tumoraktivität, mit mittlerer Tumorinhibierung
von 57,7% und 98,4% für
jeweils die 0,25 ml und 0,5 ml Haiserumpräparationsbehandlungen, wenn
mit Tumoren der Kochsalzbehandelten Kontrolltiere verglichen.
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