DE69631528T2

DE69631528T2 - Serumzusammensetzungen zur hemmung von retroviren und tumorwachstum

Info

Publication number: DE69631528T2
Application number: DE69631528T
Authority: DE
Inventors: E. Mark HOWARD
Original assignee: VIRO TECH SEDR LP; VIRO TECH SEDRO-WOOLLEY LP
Current assignee: VIRO TECH SEDR LP; VIRO TECH SEDRO-WOOLLEY LP
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2016-05-04
Also published as: ATE259240T1; DE69631528D1; EP0835124A1; KR19990008226A; WO1996034616A1; EP0835124A4; CA2219899A1; JPH11504636A; AU5852996A; EP0835124B1; AU696602B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erkrankung Erworbenes-Immunschwächesyndrom, oder AIDS, bleibt im wesentlichen unempfindlich gegenüber einer Behandlung. Trotz intensiver Bemühungen, Verbindungen zu entwickeln, die das Virus, HIV, inhibieren, das die Erkrankung verursacht, schreitet die Infektion fast gleichmäßig voran, und das Immunsystem des Individuums wird dysfunktionell gemacht. Infizierte Patienten werden extrem empfindlich gegenüber Sekundärerkrankungen, wie zum Beispiel Pneumonie und Kaposi's-Sarkom, die oft lebensbedrohlich sind. Während Wirkstoffe, wie zum Beispiel 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT), 2',3'-Didesoxyinosin (ddI) und 2',3'-Didesoxycytosin (ddC) zur Verwendung in infizierten Individuen zugelassen wurden, sind profunde Toxizitäten und das Entstehen von Wirkstoff-resistenten viralen Stämmen mit deren Verwendung assoziiert. Es verbleibt ein kritischer Bedarf, neue antiretrovirale Mittel allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln zu identifizieren.
Eine effektive anti-retrovirale Therapie hängt von der Identifizierung von antiviralen Mitteln ab, denen eine signifikante Toxizität fehlt und die, wenn in der Therapie verwendet, nicht leicht zu der Entstehung von Wirkstoff-resistenten viralen Isolaten führen. Potentiell brauchbare Verbindungen bei der Inhibierung von HIV und anderen retroviralen Infektionen werden in einer Zahl von Systemen gescreent. Anfänglich wird das Screening in in vitro-Modellen von empfindlichen Zellinien durchgeführt. Dann werden Tiermodelle verwendet, um diejenigen Verbindungen mit anti-retroviraler Aktivität in vivo zu identifizieren, die außerdem akzeptable Spiegel von Wirtstoxizität besitzen. Die Modelle untersuchen bevorzugterweise die Aktivität gegen retrovirale Virämie sowie die Fähigkeit, retroviral-induzierte Erkrankung zu unterdrücken, wie zum Beispiel im Fall von HIV die Zerstörung des Immunsystems und Erkrankung des zentralen Nervensystems.
Ein Modell, von dem gefunden wurde, das es als ein Modell von retroviraler Infektion, einschließlich HIV-Infektion, besonders brauchbar ist, ist die Rauscher-Leukämievirus (RLV)-Infektion von Mäusen. RLV ist in erwachsenen Mäusen infektiös und pathogen und ist erythrotropisch, was eine Splenomegalie verursacht, die mit dem viralen Titer proportional ist.
Chirigos, Cancer Res. 24: 1035–1041 (1964). Kurz nach der Inokulation werden abnormale Milzkolonien gebildet, deren Zahlen die viralen Titer widerspiegeln. Jede Kolonie ist das Ergebnis eines erfolgreichen viralen "Treffers" und die Kolonie fährt fort, sich zu vergrößern, während neue Zielzellen kontinuierlich während der Virämie transformiert werden. RLV induziert auch B-Zell-Neoplasmen. Daher führt die RLV-Infektion zu einer massiven Splenomegalie und Erythroleukämie, die infizierte Tiere innerhalb von 4–5 Wochen nach der Inokulation tötet. Weiss, Teich, Varmus, et al., RNA Tumor Viruses, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 78–79, Cold Spring Harbor, NY (1984). Von der RLV-Infektion in Mäusen wurde auch gezeigt, daß sie bestimmte immunologische Aspekte der HIV-Infektion in Menschen reproduziert. Siehe, z. B. Gabrilovich et al., Immunology 82: 82–87 (1994) und Gabrilovich et al., Eur. J. Immunol. 23: 2932–2938 (1993).
Die Verwendung des RLV-Modells, um anti-HIV-Mittel zu identifizieren und zu evaluieren, hat sich weit verbreitet. Zum Beispiel wurde RLV als ein Modell der HIV-Infektion zur Evaluierung von AZT (Ruprecht et al., Nature 323: 467–469 (1986); Ruprecht, Intervirol. 30 (S1) 2–11 (1989)), neuen lipophilen Derivaten von AZT (Schendener et al., Antiviral Res. 24: 79–93 (1994)), Derivaten von Tetrahydroimidazol [4,5,1-jk] [1,4]-Benzodiazepin-2 (1H)-thion (Buckheit et al., AIDS Res. Human Retrovir. 9: 1097–1106 (1993), biologischen Antwortmodifikatoren, einschließlich Tests, die durch die US Food and Drug Administration durchgeführt wurden, wie z. B. für Poly[I, C]-LC, MVE-2 und CL 246, 738 berichtet (Black et al., Annl. N. Y. Acad. Sci. 685: 467–470 (1993)) und Kombinations-anti-HIV-Therapien (z. B. Ruprecht, supra, Buchkeit et al., supra, und Black et al., supra) berichtet. Und da RLV Leukämien in infizierten Tieren induziert, wird das RLV-Modell auch extensiv als ein Modell für die Behandlung von verschiedenen Typen von Krebs, insbesondere Leukämien, verwendet. Sydow und Wunderlich, Cancer Lett. 82: 89–94 (1994)).
Neue therapeutische Weisen werden dringend benötigt, um effektivere Behandlungen zur Inhibierung von retroviraler Infektion zur Verfügung zu stellen. Auch werden effektive Mittel gebraucht, um die Entwicklung von Krebs zu inhibieren, wie zum Beispiel Leukämien oder anderen Neoplasmen. Für diese Zwecke brauchbare Zusammensetzungen sollten relativ einfach herzustellen und zu verabreichen sein, relativ nicht-toxisch sein und effektive Inhibitoren von retroviraler Infektion oder besonderen Neoplasmen darstellen. Relativ überraschend richtet sich die vorliegende Erfindung auf diese und andere damit zusammenhängende Bedürfnisse.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Verfahren zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen Erkrankungen in einer empfindlichen Säugerzelle nützlich ist zur Verfügung. Im allgemeinen wird das Haifischserum durch eine Ethanol-Haiblut-Mischung, gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen der Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren, hergestellt. Das Serum wird dann von jeglichem Niederschlag getrennt und direkt verwendet oder dazu verwendet, Zusammensetzungen zu bilden, einschließlich pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen Erkrankungen nützlich sind. Alternativ kann die aktive Fraktion durch Ethylacetat oder ähnliche Fraktionierung von Haiblut hergestellt werden.
In einem ersten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen in einem Säuger nützlich ist, zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) Zugeben von Ethanol zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten Blutkörperchen und Serum zu bewirken, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird;
(b) Erwärmen der Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren; und
(c) Trennen der Mischung in Niederschlag und Haiserumkonzentrat; und
(d) wenigstens 3-maliges Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit dem Haiserumkonzentrat.

In einem zweiten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen in einem Säuger nützlich ist, zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) Zugeben von Ethanol zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten Blutkörperchen und Serum zu bewirken bei einer Temperatur von ungefähr 10°C, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird;
(b) Trennen der Mischung in Niederschlag und einen Überstand, der das Haiserumkonzentrat umfaßt; und
(c) Zugeben von ausreichend Ethanol zum Überstand von Schritt (b), um eine Endkonzentration von etwa 60% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag zu bilden;
(d) Abtrennen des Niederschlags von Schritt (c);
(e) Zugeben eines ausreichenden Volumens NaCl, um den Niederschlag aus Schritt (d) löslich zu machen und einen Niederschlag zu bilden, der Haiserum-Immunglobulin umfaßt;
(f) Abtrennen des Niederschlags aus Schritt (e) von der Lösung;
(g) Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol zum Filtrat aus Schritt (f), um eine Endkonzentration von etwa 40% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag und einen Überstand zu bilden;
(h) Zugeben einer ausreichenden Menge NaCl zum Niederschlag aus Schritt (g), um den Niederschlag löslich zu machen, Einstellen des pHs der Lösung auf etwa 7,4 und Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol, um eine Endkonzentration von etwa 25% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag zu bilden, der Hai-Immunglobulin umfaßt;
(i) Abtrennen des Niederschlags, der Hai-Immunglobulin umfaßt, aus Schritt (h) von der Lösung.

In einem dritten Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen in Säugern nützlich ist, zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) Zugeben eines gleichen Volumens von destilliertem Wasser und Ethylacetat zu einem Volumen Haiblut;
(b) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
(c) Abtrennen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
(d) Zugeben des Volumens von Ethylacetat aus Schritt (a) und Vermischen mit der Wasser-Phase von Schritt (c);
(e) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
(f) Abtrennen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase;
(g) Wiederholen der Schritte (d) bis (f);
(h) Entfernen des Wassers aus den Ethylacetat-Phasen;
(i) Zugeben von Aceton zur Ethylacetat-Phase aus Schritt (h), um das Hai-Immunglobulin auszufällen; und
(j) Abtrennen des gereinigten Hai-Immunglobulins von der Ethylacetat-Phase.

In einem vierten Aspekt der vorliegende Erfindung wird eine Zusammensetzung, erhältlich durch eines der Verfahren der vorliegenden Erfindung, zur Hemmung von Rauscher-Mäuseleukämie-virus-Proliferation oder Tumorzell-Proliferation in einem Säuger zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Verfahren zur Herstellung von Hai-Serumkonzentrat, das zur Hemmung einer retroviralen und neoplastischen Erkrankungen in einer empfindlichen Säugerzelle nützlich ist zur Verfügung. Im allgemeinen wird das Haifischserum durch eine Ethanol-Haiblut-Mischung, gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen der Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren, hergestellt. Das Serum wird dann von jeglichem Niederschlag getrennt und direkt verwendet oder dazu verwendet, Zusammensetzungen zu bilden, einschließlich pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Hemmung von retroviralen und neoplastischen Erkrankungen nützlich sind. Alternativ kann die aktive Fraktion durch Ethylacetat oder ähnliche Fraktionierung von Haiblut hergestellt werden.
Daher wird in einem Verfahren zur Herstellung von Serumextrakten Ethanol zu Haiblut in einer ausreichenden Menge hinzugefügt, um die Trennung von roten Blutkörperchen und Serum zu bewirken, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird. Typischerweise wird das Haiblut gefroren erhalten und wird vor dem Zugeben des Ethanols auf, z. B. Raumtemperatur aufgetaut. Ethanol kann in einer Menge von 20 bis 35% Vol./Vol., weiter gewöhnlich ungefähr 25% Vol. zugegeben werden. Die Ethanol-Haiblut-Mischung wird auf eine Temperatur, z. B. etwa 21°C bis etwa 30°C (70–85°F) und eine Zeitdauer erwärmt, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber typischerweise nicht ausreichend sind, um das Serumkomplement zu inaktivieren. Das Gemisch wird dann durch Zentrifugation, Filtration oder ähnliches in Niederschlag und Hai-Serumkonzentrat getrennt. Das Verfahren kann bis zu dreimal oder mehr mit dem Serum durchgeführt werden, um eine weitere Klärung und Konzentration der Immunglobuline, einschließlich IgM und/oder jeglichen IgG-ähnlichen Molekülen zu erreichen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, einschließlich einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Verfügung, die Hai-Serum umfaßt, wobei das Serum durch eine Verfahren von Mischen von Ethanol mit Haiblut, gefolgt von einem Entfernen des Ethanols, typischerweise durch Erwärmen aber wobei das Serumkomplement nicht inaktiviert wird, und Abtrennen des Serums von jeglichen sich ergebenden Partikeln hergestellt wurde. Alternativ kann die Zusammensetzung durch Ethylacetat-Extraktion hergestellt werden. Die Zusammensetzung kann in Mengen formuliert werden, die ausreichend sind, um die retrovirale Replikation in empfindlichen Zellen zu inhibieren oder in Mengen, die für die Behandlung von neoplastischer Erkrankung geeignet sind und weiter einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Stabilisator, wie zum Beispiel Maltose oder ähnliches umfassen. Die Zusammensetzungen von Haiserum IgM und/oder IgG-ähnlichen Molekülen kann mit Haimarkpräparationen für eine synergistische anti-retrovirale Wirkung kombiniert werden. Die Haiserumzusammensetzung und Immunglobuline darin können auch lyophilisiert sein.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Hemmung einer retroviralen Infektion von empfindlichen Säugerzellen zur Verfügung. Eine Menge von Haiserum, gereinigtem IgM- und/oder IgG-ähnlichen Molekülen oder sogar Gesamtblut, die ausreichend ist, die retrovirale Infektion zu inhibieren oder ihr vorzubeugen, soll an die infizierten oder Infektions-empfindlichen Zellen verabreicht werden und dadurch in Kontakt gebracht werden. Der für eine Inhibierung empfindliche Retrovirus schließt den Maus-Rauscher-Leukämie-Virus (RLV) ein. Das Haiserumkonzentrat, gereinigte IgM- und/oder IgG-ähnliche Fraktionen, einzeln oder mit Markpräparation kombiniert, sollen auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich intravenös, topisch, intramuskulär oder oral.
In einem weiteren Aspekt beschreibt die Erfindung Zusammensetzungen zur Inhibierung von Tumorzellen. Wie hier beschriebenes Haiserumkonzentrat soll für eine Verabreichung an die Tumorzellen in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum des Tumors zu inhibieren, vorgesehen sein. Die inhibierten Tumorzellen können in einer Kultur, z. B. in vitro, in einem betroffenen Säuger vorliegen oder für eine ex vivo-Behandlung aus dem Säuger entfernt werden. Die für die Inhibierung empfindlichen Tumore schließen eine Vielzahl von Sarkomen und Leukämien ein und schließen weiter diejenigen ein, die durch ein retrovirales Gen induziert werden.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung beschreibt Zusammensetzungen, die für die Inhibierung oder Reversion von retroviral-vermittelter Erkrankung in einem infizierten Säuger nützlich sind. Es wurde als Teil der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß Präparationen von Haiserum und daraus gereinigte Immunglobuline, IgM- und/oder IgG-ähnliche Moleküle, Manifestationen von retroviraler Erkrankung in einem infizierten Säuger inhibieren. Das Haiserum und die Immunglobulinpräparationen sind in der Lage, den retroviralen Titer und den damit assoziierte Symptome zu inhibieren und entweder die zellulären Funktionen wiederherzustellen oder deren weitere Störung vorzubeugen. In anderen Aspekten der Erfindung werden die Haiserumpräparationen und Immunglobuline dazu verwendet, um die Entwicklung von neoplastischer Erkrankung, wie zum Beispiel Sarkomen oder Lymphomen, in betroffenen Säugern, zu inhibieren.
Als Teil der vorliegenden Erfindungen wurde gezeigt, daß Haiblut, Serum und Immunglobulin-enthaltende Fraktionen hergestellt werden können, die signifikante anti-retrovirale und anti-neoplastische Aktivität besitzen. Das Haiserumkonzentrat und die Immunglobulinfraktion(en), wenn an Tier verabreicht, die mit dem Rauscher-Maus-Leukämie-Virus infiziert sind, inhibiert oder beugt der Entwicklung von Splenomegalie in den Tieren auf eine Dosisabhängige Weise vor, wohingegen unbehandelte Tiere schwere Splenomegalie entwickeln. Der Rauscher-Leukämie-Virus ist ein weit als ein in vivo-Modell der HIV-Retrovirusinfektion verwendeter Retrovirus. Ein Standardmaß der Wirkstoffeffektivität in dem Rauscher-Modell war die Fähigkeit, die Splenomegalie in infizierten Tieren zu inhibieren. In den hier beschriebenen Experimenten beugen das Haiserumkonzentrat, Haifischblut, Serum-Immunglobulinfraktionen und Ethylacetatfraktionen von Haiblut im wesentlichen und in einigen Fällen vollständig der in Rauscher-infizierten Kontrolltieren beobachteten Splenomegalie vor. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Symptome einer retroviralen Erkrankung, inhibiert oder vollständig verhindert werden können, wodurch es dem Immunsystem des infizierten Individuums ermöglicht wird, weiter geeignet auf andere Antigene zu antworten, für die eine Antwort des Individuums schwer unterdrückt wurde, wodurch die Lebensdauer des Individuums verlängert wird.
Die Präparationen des hier beschriebenen Haiserumkonzentrats können dazu verwendet werden, um pathologische Zustände zu behandeln, die mit der retroviralen Infektion auf dem zellulären Niveau assoziiert sind, wie zum Beispiel RLV-induzierte neurologische Schädigung, retroviral-induzierte neoplastische Erkrankungen, programmierter Zelltod und ähnliches. Retroviren, die durch die Serumzusammensetzungen behandelt werden können, schließen Rauscher-Maus-Leukämie-Virus ein. Eine für die Behandlung oder Inhibierung durch das Haiserum oder Immunglobulin (IgM- und/oder IgG-ähnliches Molekül) und eine Fraktionen) davon geeignete Erkrankung wird unter der Verwendung von z. B. Säugerzellen oder Tieren von denen vermutet wird, daß sie eine Erkrankung durchlaufen, z. B. Sarkoma-Zellen, identifiziert, die als empfindlich gegenüber dem Verfahren bestätigt werden, z. B. im Fall der Sarkoma-Zellen tumorigen. Um zu bestimmen, daß das Haiserum oder eine andere Präparation das Fortschreiten der Erkrankung inhibiert, werden die Zellen mit dem Haiserum oder spezifischer Immunglobulinpräparation behandelt und die Ergebnisse mit einer unbehandelten Zellprobe verglichen. In beeinträchtigten Zellen, die behandelt wurden und die eine Inhibierung oder Reversion einer bequem überwachten funktionellen Eigenschaft/Eigenschaften zeigen, wie zum Beispiel die neoplastische Zellteilungsfähigkeit, wird das Verfahren als empfindlich gegenüber der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt. Die vorliegenden Verfahren können auch bei der Behandlung von Autoimmun- oder Autoimmun-assoziierten Erkrankungen verwendet werden, insbesondere denjenigen, die mit Immunschwächen assoziiert sind, wie sie mit der RLV-Infektion oder ähnlichen assoziiert sein können.
In einer Ausführungsform wird eine Haiserumpräparation der vorliegenden Erfindung durch sorgfältige Abtrennung von Blutkomponenten, wie zum Beispiel Hämoglobin und Zellen von Serumkomponenten hergestellt. In einer hier bevorzugten Ausführungsform wird das Blut anfänglich von einem Zulieferer gefroren erhalten. Haiblut wird durch eine Vielzahl von verschiedenen Mitteln geerntet. Da das Haiblut direkt nach der Tötung anfängt zu verklumpen, muß das Bluten so früh wie möglich beginnen. In einem Verfahren wird der Kopf des Haifisches angehoben und der Schwanz entfernt und es dem Blut ermöglicht, in einen geeigneten Behälter abzulaufen. Das Blut kann auch ohne ein Töten des Haifisches erhalten werden, wie zum Beispiel durch die Anwendung von Venipunktur eines betäubten oder immobilisierten Haifisches, jedoch werden kleinere Mengen erhalten. Bevorzugterweise wird das geerntete Blut sofort eingefroren, um eine Zersetzung zu verhindern. Das Blut kann aus einer Zahl von verschiedenen Haifischen verwendet werden, wie z. B. dem Mako-, Thresher-, Schwarzspitzen- oder gewöhnlicher Riffhai, jedoch sind andere Spezies auch ausreichend, z. B. der Großrücken-Flossenhai oder Ammenhaie. Die Titer der antiretroviralen und anti-Tumorserumaktivität können durch in vitro-Tests wie hier beschrieben für eine bestimmte Spezies oder Quelle bestimmt werden. Serum oder isolierte und gereinigte Immunglobuline von verschiedenen Spezies können, falls gewünscht, vereinigt werden, um einen bestimmten Aktivitätsspiegel zu erreichen. Verschiedene Immunglobuline können kombiniert werden, z. B. IgM- und/oder IgG-ähnliche Moleküle und verschiedene Kombinationen mit Haifischmark können auch zur effektiven Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren hergestellt werden.
Um das Serum von den zellulären Komponenten zu trennen, wird es dem gefrorenen Blut ermöglicht, aufzutauen, typischerweise auf Raumtemperatur oder ähnliches. In einem bevorzugten Abtrennungs- und Konzentrationsverfahren wird das getaute Blut mit Ethanol oder geeigneten alternativen, z. B. fluorierten Derivaten von Ethanol, in einem Verhältnis von ungefähr 15–60% Ethanol zu Blut (Volumen/Volumen), weiter bevorzugt ungefähr 20–35% Ethanol zu Blut, gemischt werden und am meisten bevorzugt wird in dem hier beschriebenen Beispiel ein 25% Ethanol zu Blutgemisch verwendet. Reines Ethanol (100%) wird bevorzugterweise in diesem Abtrennverfahren verwendet. Das Gemisch wird allmählich auf eine Temperatur von ungefähr 21°C–32°C (70°–90°F) unter sanften Mischen gebracht, weiter bevorzugt ungefähr 21°C–30°C (70°–85°F) und am meisten bevorzugt in einen Bereich von 21°C–26°C (70°C–75°C). Eine Heizplatte oder ähnliche Vorrichtung kann zu diesem Zweck verwendet werden. Das Mischen sollte ausreichend sein, um ein gründliches Mischen des Bluts und Alkohols zu bewirken und gleichzeitig ein Sieden der Präparation an der Heizoberfläche zu vermeiden. Das sanfte Mischen der erwärmten Präparation wird fortgeführt, bis der Alkohol im wesentlichen aus dem Gemisch verdampft wurde, im allgemeinen ungefähr 1 bis 1½ Stunden für eine 100 ml Präparation. Die erhaltene Präparation wird typischerweise einen Niederschlag enthalten und diese Fraktion wird von der Flüssigkeit (Serumkonzentrat) abgetrennt, typischerweise durch Zentrifugation, Filtration oder ähnliches. Das Konzentrationsverfahren kann gegebenenfalls mit dem Serumkonzentrat wiederholt werden, d. h. Wiederholen der Ethanolbehandlung, Erwärmen und Mischen und Abtrennen, bis das erhaltene Serumkonzentrat im wesentlichen klar ist und der Niederschlag im finalen Abtrennschritt im wesentlichen beseitigt ist. Typischerweise wird das Verfahren drei- oder viermal wiederholt, um das Endprodukt zu erreichen. Ein anschließender Test der finalen Präparation wird durch Mischen einer Probe davon mit Ethanol, Erhitzen und Mischen durchgeführt; das Fehlen von weiteren Niederschlag zeigt ein im wesentlichen reines Serumprodukt an.
Zur Herstellung einer pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzung wird das Haiserumkonzentrat und daraus erhaltene Fraktionen, z. B. gereinigtes IgM- und/oder IgG-ähnliche Moleküle, typischerweise auf eine dem Fachmann in der Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen Serumpräparationen gut bekannte Weise sterilisiert werden, z. B. durch Filtration, Bestrahlung, usw. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch akzeptablen Serumpräparationen sind in z. B. U.S.-Patent Nrn. 4,587,121; 3,903,262 und 4,186,192 beschrieben.
Die Haifischserum- oder Immunglobulinzusammensetzungen können an Personen oder Säuger verabreicht werden, die an retroviral-assoziierter Erkrankung oder Krebs leiden oder dafür empfänglich sind. Von dem Haiserum und dem Immunglobulin davon wird geglaubt, daß es die Funktionalität wieder herstellt, wie zum Beispiel die immunproliferative Fähigkeit. Daher wird nicht nur die Vermehrung oder Verbreitung des Virus durch die Behandlung verhindert, sondern der Säuger erlangt sein responsives Immunsystem wieder zurück oder behält dies bei und ist daher in der Lage, auf andere Antigenangriffe zu reagieren.
Die Zusammensetzungen finden auch Verwendung für die prä- oder post-Expositionsprophylaxe, im Anschluß an Verletzungen mit schmutzigen Nadeln für Pflegepersonal oder routinemäßig begleitend bei Bluttransfusionen oder für Personen, die in Gefahr sind, gegenüber infizierten Körper- oder Kulturflüssigkeiten ausgesetzt zu werden. Für die post-Expositionsprophylaxe wird die Verabreichung kurz nach der vermuteten Inokulation begonnen und für mindestens ungefähr 2 bis 4 Wochen danach fortgeführt, gefolgt von zusätzlichen Dosen oder lange Zeit aufrechterhaltenen Dosen, wie sie möglicherweise erforderlich sein können, um das Wachstum des Virus und die Erkrankung zu inhibieren und/oder eine Immunität dagegen aufrecht zu erhalten.
Die pharmazeutischen Serum- und Immunglobulin-Zusammensetzungen sind für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung vorgesehen. Bevorzugterweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen oral oder parenteral verabreicht, d. h. intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär. Daher stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die orale, topische oder parenterale Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung eines Haiserumkonzentrats, im wesentlichen gereinigten Immunglobulins und/oder Haifischmarks in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugterweise einem wäßrigen Träger, umfassen. Eine Vielzahl von wäßrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und ähnliches und kann andere Proteine für eine verbessertes Stabilität enthalten, wie zum Beispiel Albumin, Lipoprotein, Globulin usw., die milden chemischen Modifikationen oder ähnliches unterzogen werden. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch in eine Creme oder Salbe für die topische oder transdermale Verabreichung, z. B. bei einer 25%igen Konzentration, formuliert werden. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche gut bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die sich ergebenden Lösungen können zur Verwendung verpackt werden oder unter aseptischen Bedingungen filtriert werden und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Präparation mit einer sterilen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie für geeignete physiologische Bedingungen erforderlich, wie zum Beispiel ein pH einstellendes und pufferndes Mittel, die Tonizität einstellende Mittel und ähnliches, zum Beispiel, Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Stabilisatoren (z. B. Maltose (1–20%)), usw.
Die Konzentration des Haiserums, der Immunglobulinpräparation und/oder des Marks in diesen pharmazeutischen Formulierungen kann weit variieren, d. h. von weniger als ungefähr 10%, gewöhnlich bei oder mindestens ungefähr 25%, bis zu so viel wie 75 oder 90 Gew.-% und wird vorherrschend durch Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten, usw. in Übereinstimmung mit der bestimmten Verabreichungsart und der zu behandelnden Erkrankung ausgewählt. Aktuelle Verfahren zur Herstellung von oral, topisch und parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen werden dem Fachmann bekannt oder ersichtlich sein und sind im Detail in, zum Beispiel, Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) beschrieben.
Die Bestimmung einer effektiven Menge einer Zusammensetzung der Erfindung, um die retroviral-vermittelte Erkrankung oder den Krebs in einem Patienten zu inhibieren, kann durch empirische Standardverfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel kann eine Reversion der Beeinträchtigung der Immunfunktion, z. B. eine Wiederherstellung der lymphoproliferativen Antwort auf ein "Recall"-Antigen (z. B. Influenza), Alloantigene oder Mitogene, wie zum Beispiel PWM oder PHA, und so die Effizienz der betreffenden Zusammensetzungen mit einer Vielzahl von gut bekannten in vitro T-Zell Zellteilungs-Antwortverfahren überwacht werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sollen an einen Wirt verabreicht werden, der bereits an einer retroviralen Infektion oder Neoplasma, wie oben beschrieben, leidet, in einer Menge, die ausreichend ist, um die Entwicklung der darauf folgenden Immunschwächeerkrankung und ihrer Komplikationen oder dem empfindlichen Tumor vorzubeugen oder deren Entwicklung zumindest teilweise aufzuhalten, wie genauer unten beschrieben wird. Eine geeignete Menge, um dies zu erreichen, wird als eine "therapeutische effektive Dosis" definiert. Für diese Verwendung effektive Mengen werden beträchtlich variieren und von der Schwere der Infektion oder Erkrankung und dem Gewicht und generellen Zustand des Patienten, der behandelt wird, abhängen, jedoch im allgemeinen von ungefähr 5 mg/kg bis ungefähr 1.000 mg/kg Wirtskörpergewicht von Haiserumkonzentrat; Immunglobulin und/oder Mark pro Anwendung erreichen, wobei Dosen von ungefähr 10 mg/kg bis ungefähr 200 mg/kg pro Anwendung häufiger verwendet werden. Die Verabreichung ist täglich, wöchentlich oder weniger häufig, wie in Abhängigkeit von der Antwort auf die Erkrankung und der Toleranz des Patienten gegenüber der Therapie erforderlich. Aufrechterhaltende Dosierungen über eine andauernde Zeitdauer hinweg können erforderlich sein, und die Dosierungen können wie er forderlich eingestellt werden. Die Zeitdauer der Verabreichung wird im allgemeinen ausreichend sein, um das Immunsystem des Wirts wiederherzustellen, so daß effektive Immunantworten gegen eine Vielzahl von Antigenen aufgebaut werden können, am meisten wünschenswert dem RLV-Virus im Fall von mit RLV infizierten Säugern, oder um das Wachstum der Krebszellen zu beseitigen oder wesentlich zu inhibieren. Falls das wiederhergestellte Immunsystem eines Individuums nicht in der Lage ist, die Erkrankung zu beseitigen, können Aufrechterhaltungsdosierungen über eine verlängerte Zeitdauer hinweg erforderlich sein. Auch muß berücksichtigt werden, daß die Materialien der vorliegenden Erfindung in lebensbedrohenden oder potentiell lebensbedrohenden Situationen verwendet werden können. In solchen Fällen ist es möglich und kann es durch den behandelnden Arzt wünschenswert sein, wesentliche Überschüsse dieser Verbindungen zu verabreichen. Für veterinäre Verwendungen können höhere Spiegel als erforderlich verabreicht werden.
In prophylaktischen Anwendungen sollen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an einen Säuger verabreicht werden, der empfindlich gegenüber einer retroviral-vermittelten Erkrankung ist oder auf eine andere Weise einem Risiko einer retroviral-vermittelten Erkrankung unterliegt, um die eigenen immunologischen Fähigkeiten des Patienten zu verbessern. Solch eine Menge wird als eine "prophylaktisch-effektive Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung werden die genauen Mengen wiederum von dem Gesundheitszustand und dem Gewicht des Patienten abhängen, jedoch allgemein von ungefähr 1 mg/kg bis ungefähr 250 mg/kg Körpergewicht, weiter herkömmlich von ungefähr 10 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht reichen.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen werden durchgeführt, wobei die Dosisspiegel und -muster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen des Haiserumkonzentrats, der gereinigten Immunglobulinpräparation und/oder Mark eine Menge des Inhibitors zur Verfügung stellen, die ausreichend ist, um die retroviral-vermittelte Erkrankung oder den Tumor in dem behandelten Wirt effektiv zu inhibieren.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch für die ex vivo-Therapie verwendet werden. Mit ex vivo- oder extrakorporaler Therapie ist gemeint, daß therapeutische Manipulationen an Wirtszellen und Flüssigkeiten außerhalb des Körpers durchgeführt werden. Zum Beispiel können Lymphozyten oder andere Zielzellen aus einem Patienten entfernt werden und mit hohen Dosen der Zusammensetzung behandelt werden, wobei eine Konzentration von Inhibitor zu der Zelle weit im Überschuß von Spiegeln zur Verfügung gestellt wird, die von einem Patienten toleriert werden könnten oder in ihm erreicht werden könnten. Im Anschluß an die Behandlung werden die Zellen in den Wirt zurückgegeben, um die Erkrankung zu behandeln.
Eine Zusammensetzung der Erfindung kann mit einer oder mehreren anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Vielzahl von therapeutischen Verwendungen, z. B. einer verstärkten therapeutischen Aktivität gegen RLV-Retroviren oder Krebs, kombiniert werden. Zum Beispiel können bei der Behandlung von RLV-Infektion die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung allein oder als eine zusätzlich Therapie und Haiserumkonzentrat verabreicht werden. Die IgM-Fraktion kann auch mit der IgG-ähnlichen Fraktion kombiniert werden, um eine verstärkte Effizienz zu erreichen. Serum und/oder gereinigte Immunglobuline können auch mit Haimarkpräparationen kombiniert werden. Wenn als eine zusätzliche Therapie verabreicht, können die Präparationen in Verbindung mit den anderen Behandlungsmodalitäten oder getrennt zu verschiedenen Intervallen verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden auch Verwendung in vitro. Die Zusammensetzungen können dazu verwendet werden, um retroviral-induzierten Tod von kultivierten Zellen, wie zum Beispiel bestimmten Hybridom- oder anderen Lymphozytenlinien, die empfindlich gegenüber retroviraler Infektion sind, zu inhibieren. Die Präparationen der Erfindung können auch in Screeningverfahren, um effektive Spiegel von anti-retroviralen Verbindungen zu ermitteln, oder anderen Behandlungen, verwendet werden. Zusätzlich kann durch Bestimmen, ob eine Retrovirus-vermittelte Dysfunktion oder Tod der Zellen eines Patienten empfindlich gegenüber der Inhibierung oder der Reversion durch eine Zusammensetzung der Erfindung ist, eine geeignete Therapie leichter etabliert werden oder, alternativ, können die Effekte von anderen Behandlungsumständen, wie zum Beispiel anderer anti-RLV-Behandlungsschemata, bestimmt werden. Daher kann ein Diagnostikum zur Ermittlung der Effizienz von zum Beispiel anti-RLV-Therapie auch zur Verfügung gestellt werden. Der Nachweis von Veränderungen in vitro im Hinblick auf die Spiegel der HIV-Empfindlichkeit oder die Wiederherstellung der Immunfunktion, z. B. der Antwort auf Recall-Antigene, gegen Alloantigene oder gegen Mitogene, wie zum Beispiel PWM oder PHA stellt eine Indikation einer in vivo-Aktivität des Haiserums oder der Immunglobulinzusammensetzungen zur Ver fügung, die zur Behandlung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
Um Veränderungen im Spiegel der Immunfunktion in einer Zellpopulation zu überwachen, können Kontrollwerte der Immunfunktion aus Zellen der allgemeinen Population oder von dem Patienten vor dem Beginn der Therapie bestimmt werden. Da die Immunfunktion sich beträchtlich zwischen den Patienten unterscheiden kann, ist die Bestimmung der prä-Behandlungsimmunfunktion von jedem Patienten bevorzugt. Der Spiegel von Immunfunktion in Zellen, z. B. Lymphozyten im Fall von RLV infizierten Säugern, wird dann während der Therapie verfolgt. Dieser Spiegel wird mit dem Spiegel der Immunfunktion in Zellen verglichen, die nicht der Therapie ausgesetzt waren, und die Effektivität der Therapie wird durch einen erhöhten Spiegel in der gemessenen Immunfunktion während oder post-Therapie ermittelt.
Das Haiserumkonzentrat und gereinigtes IgM- und/oder IgG-ähnliches Immunglobulin der vorliegenden Erfindung kann auch als ein anti-neoplastisches Mittel verwendet werden. Unter den durch das Serumkonzentrat inhibierten neoplastischen Erkrankungen befinden sich Sarkome, Leukämien und Karzinome, einschließlich denjenigen, die durch ein retrovirales Gen induziert werden können. Die Bestimmung einer effektiven Menge von Haiserumkonzentrat der Erfindung, die ausreichend ist, um das Wachstum der neoplastischen Zellen zu inhibieren, kann zum Beispiel durch Verfolgen von metastatischen Stellen mit einer Vielzahl von Verfahren bestimmt werden, z. B. in vivo-Bildgebung oder ex vivo diagnostischen Techniken. Andere Krebsmarker können auch dazu verwendet werden um die Therapie mit dem Serumkonzentrat der Erfindung zu überwachen, z. B. der CEA-Test oder der PSA-Test für Prostatakarzinom, dieser Test ist käuflich erhältlich.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sollen an einen Patienten verabreicht werden, der bereits an einem Neoplasma leidet, z. B. Sarkom, Leukämie oder Karzinom, in einer Menge, die ausreichend ist, um die Erkrankung zu heilen oder zumindest teilweise aufzuhalten. Eine geeignete Menge um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch effektive Dosis" definiert. Für diese Verwendung effektive Mengen werden von der Schwere des Neoplasma und seiner Lokalisierung abhängen, insbesondere wenn eine metastatische Stelle beteiligt ist, und dem Gewicht und dem generellen Zustand des Patienten der behandelt wird, jedoch allgemein von ungefähr 10 mg/kg bis ungefähr 1.000 mg/kg Wirtskörpergewicht an Serumkonzentrat und/oder Immunglobulin pro Tag reichen, wobei Dosen von ungefähr 25 mg/kg bis ungefähr 125 mg/kg pro Tag häufiger verbreitet verwendet werden. Aufrechterhaltende Dosierungen über eine verlängerte Zeitdauer hinweg können wie erforderlich eingestellt werden. Da die Haiserumkonzentrate und Immunglobuline in fortgeschrittenen Erkrankungszuständen verwendet werden können, gemeint ist, lebensbedrohenden oder potentiell lebensbedrohenden neoplastischen Erkrankungen, ist es möglich und kann durch den behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden, wesentliche Überschüsse dieser Zusammensetzungen zu verabreichen.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können durchgeführt werden, wobei die Dosisspiegel und -muster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Menge an Zusammensetzungen der Erfindung zur Verfügung stellen, die ausreichend ist, um effektiv die neoplastische Erkrankung zu inhibieren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können allein oder als zusätzliche Therapie verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können mit zum Beispiel Taxol, Cis-Platin, Tamoxifen, Etoposidphosphat, Doxorubizin, Daunomycin, endokriner Therapie usw. verabreicht werden. Wenn als eine zusätzliche Therapie verabreicht, können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang mit den anderen Behandlungsmodalitäten verabreicht werden oder getrennt zu unterschiedlichen Intervallen.
Wie mit den hier beschriebenen Zusammensetzungen zur Inhibierung von retroviralvermittelter Erkrankung können das Haiserum und die Markpräparationen und das Immunglobulin der Erfindung auch in der ex vivo-Therapie von neoplastischer Erkrankung verwendet werden. Zum Beispiel werden Knochenmarks- oder andere Zielzellen oder Gewebe aus einem Patienten entfernt und mit hohen Dosen von Zusammensetzungen behandelt, die die Zusammensetzung der Erfindung umfassen, die gegebenenfalls an zytotoxische Mittel konjugiert werden können, wie zum Beispiel Toxine, Wirkstoffe, Marker, usw., wodurch eine therapeutische Konzentration der Zusammensetzungen weit im Überschuß von Spiegeln zur Verfügung gestellt wird, die in dem Patienten erreicht werden könnte oder durch ihn toleriert werden könnte. Im Anschluß an die Behandlung, um die neoplastischen Zellen in der Zielzellpopulation oder dem Gewebe zu beseitigen, werden die Zellen oder Gewebe in den Patienten zurückgegeben.
Die folgenden experimentellen Beispiele werden zur Verdeutlichung und nicht zur Begrenzung angeboten.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Serumkonzentraten aus Haifischblut.
Gesamt-Haiblut aus Mako-Haifisch wurde gefroren erhalten. Das Blut wurde von den Haifischen durch Abtrennen des Schwanzes und Anheben des Körpers erhalten, wobei es dem Blut ermöglicht wurde, in einen Behälter abzulaufen, der versiegelt wurde und in einem gekühlten Raum gefroren wurde. Das Blut wurde gefroren gehalten, bis es an das Labor geliefert wurde. Dem gefrorenen Blut wurde es erlaubt, auf Raumtemperatur aufzutauen.
In einer typischen Präparation wurden 100 ml des aufgetauten Haifischbluts mit 25% (im Volumen) reinem Alkohol bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wird dann auf eine Temperatur von ungefähr 21°C–26°C (70–75°F) gebracht, unter Mischen, das ausreichend war um ein gründliches Gemisch des Bluts und des Alkohols zu erreichen und so ein Sieden der Präparation an der Heizoberfläche zu verhindern. Das sanfte Mischen der gewärmten Präparation wurde fortgeführt, bis der Alkohol im wesentlichen aus dem Gemisch verdampft war, im allgemeinen ungefähr 1 bis 1½ Stunden für eine 100 ml Präparation. Die erhaltene Präparation enthielt einen Niederschlag, und dieser wurde durch Zentrifugation (Physician's Compact Centrifuge, Clay Adams, Inc.) bei 1.315 × g für 40–45 Minuten entfernt und der Niederschlag verworfen. Dieses Verfahren der Ethanolbehandlung, Erhitzen und Mischen, Zentrifugieren und Abgießen wurde drei- bis viermal wiederholt. Die erhaltene Flüssigkeit ist sehr klar und nur eine Spur an Niederschlag wird im finalen Zentrifugationsschritt erhalten. Ein anschließender Test der finalen Präparation durch Mischen mit Ethanol, Erhitzen und Mischen, gefolgt von Zentrifugation zeigt ein im wesentlichen reines Produkt mit keinem Niederschlag im Zentrifugationsgefäß an.
Das Ausgangs-Haifischblut wies eine Hämoglobinkonzentration von 16 g pro 100 ml und einen Gesamtproteingehalt von 6,6 g pro 100 ml auf. Das in den Rauscher-Virus-Inhibierungsbeispielen wie unten beschrieben verwendete Haiblutkonzentrat wies einen Hämoglobingehalt von 4,6 g pro 100 ml auf und einen Proteingehalt von 1,5 g pro 100 ml. Ein Testen von zwei Präparationen von Serumkonzentrat mit für menschliches IgM-spezifischen Reagenzien zeigte Konzentrationen von ungefähr 368 mg/dl für das Erste und 155 mg/dl für das Zweite an und ein für menschliches IgG-spezifisches Reagenz zeigte Konzentrationen von ungefähr 139 mg/dl für das Erste und 52 mg/dl für das Zweite an.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Serumpräparation, um Manifestationen von Retrovirus-Infektion in einem Säuger zu inhibieren.
Die Effizienz der Haiserumpräparation als ein anti-retrovirales Mittel wurde unter der Verwendung des Rauscher-Virus-Erkrankungsmodells bestimmt. Rauscher ist ein pathogener Maus-Retrovirus in Mäusen, der typischerweise Erythroidkolonien in der Milz von Mäusen verursacht, die zu einer schweren Splenomegalie führen, und verursacht auch eine Erythroleukämie. In dieser Untersuchung wurden BALB/c-Mäuse, die mit der Haiserumpräparation behandelt wurden und unbehandelte Kontrollen mit Viruspräparationen infiziert.
BALB/c-Mäuse, die jeweils 12–15 Gramm wogen, wurden als Testtiere verwendet. Die Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, erhalten und wurden für eine minimale Zeit von fünf Tagen in Quarantäne gehalten, bevor sie für die Versuche verwendet wurden. Die Mäuse wurden bei stabiler Temperatur gehalten und täglich auf Anzeichen von Erkrankung, Streß, Verletzung und externen Parasiten beobachtet.
Der Test wurde wie folgt durchgeführt. Die Tiere wurden in fünf Gruppen geteilt. Gruppe 1, die aus zwölf Tieren bestand, diente als eine Kontrolle, in der Mäuse nicht mit Rauscher-Virus konfrontiert wurden, wurde jedoch IP mit 0,2 ml an physiologischer Kochsalzlösung täglich für fünf Tage injiziert. Zwölf Tiere der Gruppe 2 wurden mit dem Rauscher-Virus an Tag 1 der Untersuchung konfrontiert und erhielten Injektion IP von physiologischer Kochsalzlösung täglich für fünf Tage. Gruppe 3A bestand aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag 0 konfrontiert wurden und erhielten 0,5 ml Haiserumpräparation durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Gruppe 3B bestand aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag 0 konfrontiert wurden und erhielten 0,25 ml Haiserumpräparation durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Gruppe 3C bestand aus sechs Tieren, die mit Rauscher-Virus an Tag 0 konfrontiert wurden und erhielten 0,1 ml Haiserumpräparation durch intraperitoneale Injektion jeden Tag für fünf Tage. Jede Maus wurde intraperitoneal mit 0,1 ml Rauscher-Leukämie Virus-infizierten Zellen (06-000-000; Advanced Biotechnologies, Inc., MD) injiziert. Unmittelbar im Anschluß an die Virusinjektion an Tag 0 erhielten die Tiere die erste Injektion an Kochsalzlösung oder der Haiserumpräparation. Die Tiere wurden täglich für 21 Tage beobachtet und das Experiment wurde an Tag 21 beendet, wobei die Gewichte aller Überlebenden vor der Tötung aufgezeichnet wurden. Die Milzen wurden von allen Tieren unmittelbar im Anschluß an die Tötung entfernt, gewogen und aufgezeichnet.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 gesehen werden können, zeigen, daß Gruppe 1-Tiere, die nur Kochsalzlösung erhielten, ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 120 mg aufwiesen. Gruppe 2-Tiere, die mit Rauscher-Virus konfrontiert wurden, die jedoch nur Kochsalzlösungsbehandlung erhielten, wiesen massive Milzen auf, mit einem mittleren Milzgewicht pro Maus von 3.800 mg. Diese Kontrollgruppen zeigten die Etablierung der retroviralen Infektion und die fortschreitende Erkrankung in infizierten Tieren. Im Unterschied zu den Kochsalzbehandelten Tieren wiesen die Tiere, die 0,5 ml, 0,25 ml oder 0,1 ml an Haiserumpräparationen erhielten, dramatisch kleinere Milzen auf, mit mittleren Milzgewichten pro Maus von jeweils 110 mg, 398 mg und 872 mg.
TABELLE I
Die Ergebnisse bestätigen, daß die Haiserumpräparation signifikante anti-retrovirale Aktivität enthielt und im Fall der 0,5 ml-Behandlung das normale Fortschreiten der retroviralen Erkrankung in den infizierten Tieren effektiv verhinderte oder im Fall der niedrigen Dosierungen inhibierte.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Verbindung von fraktionierten Haiserumpräparationen, um Manifestationen von Retrovirus-Infektion in Mäusen zu inhibieren, unter der Verwendung des Rauscher-Virus-Erkrankungsmodells.
Hai-Gesamtblut wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Das Blutserum wurde präpariert und zum Testen in dem Rauscher-Test wie folgt fraktioniert. Zu 100 ml Blut wurden 800 ml an destilliertem Wasser und 300 ml Ethanol hinzugefügt, gefolgt durch Mischen für 10 Minuten bei 10°C und Zentrifugation bei 1.600 × g für 10 Minuten bei 10°C. Der Niederschlag (als "Ppt. I" bezeichnet) wurde für die Tests aufgehoben (als eine Resuspension in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) und der Überstand (als "Sup. I" bezeichnet), 750 ml, wurde mit Ethanol kombiniert, um eine finale Konzentration von 60% Ethanol zu erreichen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Das Gemisch wurde bei 22.000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert, wobei der Überstand davon als "Sup. II" bezeichnet wurde. Der Niederschlag "Ppt. II" wurde mit 30 mM NaCl (750 ml) kombiniert und filtriert. Der erhaltene Niederschlag ("Ppt. III") wurde verworfen und das Filtrat mit Ethanol auf eine finale Konzentration von 30% Ethanol behandelt. Dies wurde bei 22.000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand ("Sup. III") aufgehoben. Der Niederschlag ("Ppt. IV") wurde mit 30 mM NaCl (100 ml) behandelt (ein Teil an Ppt. IV wurde auch zum Testen in PBS resuspendiert), der pH auf 7,4 mit 0,5 M Na₂HPO₄ eingestellt und dann mit Ethanol gemischt, um eine finale Konzentration von 25% Ethanol zu erreichen. Die Lösung wurde bei 22.000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Niederschlag ("Ppt. V"), umfassend eine gereinigte Immunglobulinfraktion einschließlich eines IgG-ähnlichen Moleküls, wurde geerntet.
Getrennt davon wurde eine Präparation von Haifischblut mit Ethylacetat extrahiert. Zu 500 ml Blut wurden 500 ml dH₂O hinzugefügt und drei Extraktionen mit 500 ml-Teilen an Ethylacetat wurden durchgeführt. Die sich ergebenden 1.400 ml an Ethylacetat wurden über wasserfreiem Natriumcarbonat getrocknet und dann auf ein 50 ml Volumen eingedampft. Ein Niederschlag wurde dann nach der Zugabe von 300 ml Aceton gebildet. Der Niederschlag wurde zentrifugiert und luftgetrocknet. Ungefähr 2 g eines braun- bis cremefarbigen Pulvers ergab sich und wird als die Ethylacetat-Fraktion bezeichnet. Ungefähr 0,5 g des Pulvers wurden zum Testen in 50 ml PBS resuspendiert.
BALB/c-Mäuse, die jeweils 12–15 Gramm wogen, wurden als Testtiere verwendet. Die Mäuse wurden von Simonsen Laboratories, Gilroy, CA, erhalten und wurden für mindestens fünf Tage in Quarantäne gehalten, bevor sie zum Testen verwendet wurden. Die Mäuse wurden bei stabiler Temperatur gehalten und täglich wie oben beschrieben beobachtet.
Die Tests wurden wie folgt durchgeführt. Zur Konfrontation mit Virus wurden Rauscher-Leukämie Virus-infizierte Zellen (06-000-000) von Advanced Biotechnologies, Inc., MD erhalten und der Virus aus Passage-Mäusen weitergegben. Für das Konfrontationsverfahren wurden alle Gruppen, die für die Konfrontation mit dem Rauscher-Virus vorgesehen waren, an Tag 0 konfrontiert und jede Maus wurde intraperitoneal (IP) mit 0,25 ml Virus injiziert. Für das Behandlungsverfahren wurde jede für die Behandlung vorgesehene Maus IP mit 0,5 ml Haiblut oder der angegebenen Fraktion für eine Dauer von fünf Tagen, von Tag 1 bis Tag 5, injiziert. Die Mortalitätszahlen wurden täglich für alle Gruppen aufgezeichnet. Die Studie wurde an Tag 28 beendet. Die Milzen wurden unmittelbar von den Tieren im Anschluß an die Tötung entfernt und gewogen.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 2 gesehen werden können, zeigen, daß Gruppe 1-Tiere die nur Kochsalzlösung erhielten, ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 98 mg aufwiesen. Gruppe 2-Tiere, die mit Rauscher-Virus konfrontiert wurden, die jedoch nur Kochsalzlösungsbehandlung erhielten, wiesen ein mittleres Milzgewicht pro Maus von 3.620 mg auf. Diese Kontrollgruppen zeigen die Etablierung der retroviralen Infektion und die fortschreitende Erkrankung in infizierten Tieren.
Im Unterschied zu den Kochsalz-behandelten Tieren wiesen Tiere, die 0,5 ml Gesamtblut (Gruppe 3), Ppt. V (Gruppe 11) oder Ethylacetatkonzentrat (Gruppe 12) erhielten, dramatisch kleinere Milzen auf, mit mittleren Milzgewichten pro Maus von jeweils 226 mg, 148 mg und 96 mg.
TABELLE 2
Die Ergebnisse bestätigen, daß das Haiblut und die Serum-Immunglobulinpräparationen, die eine IgG-ähnliche Fraktion einschließen, eine signifikante anti-retrovirale Aktivität enthielten und effektiv dem Fortschreiten von retroviraler Erkrankung in der Milz von infizierten Tieren vorbeugten oder dies inhibierten.
Eine getrennte Untersuchung wurde mit einer verschiedenen Präparation von gereinigtem Haifisch-Immunglobulin in dem Rauscher-Modell und einer Fraktion ("Fr. 2"), die während des Reinigungsverfahrens erhalten wurde, durchgeführt. Die Untersuchung wurde im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, und ist im folgenden zusammengefaßt:
TABELLE 3
Diese Untersuchung bestätigt die anti-retrovirale Effizienz der Haifisch-Immunglobulinenthaltenden Fraktion, die in der in Tabelle 2 berichteten Untersuchung beobachtet wurde.
Beispiel 4
Diese Beispiel zeigt eine signifikante anti-Tumoraktivität der Haifischserumpräparation, die in Beispiel 1 beschrieben ist.
Der in dieser Untersuchung verwendete Tumor war Sarkom 180, erhalten von der American Type Culture Collection und in wöchentlichen Intervallen als Aszites in nicht-behandelten weiblichen Swiss-Webster-Mäusen passiert. Um das Inokulum von Tumorzellen für die vorliegende Studie zu präparieren, wurde Aszites-Flüssigkeit aus einer Maus mit einer 7–10 Tag Aszites mit steriler Technik aspiriert. Die Tumorzellen wurden unter der Verwendung von Trypan-blau Färbung auf ihre Lebensfähigkeit hin überprüft. Eine Tumorzellzahl wurde dann bestimmt und die Zellen mit normaler Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verdünnt, um eine finale Konzentration von 1–2 × 10⁶ Zellen/mm³ zu erhalten. Diese Suspension wird für die Injektion in Mäusen verwendet. Die finale Verdünnung wird auf Tryptikase-Soja-Agar plattiert, um zu bestimmen, das sie frei von bakterieller Kontamination ist.
Für die Injektion in Tiere werden 0,1 ml der Tumorzellsuspension in den linken hinteren Beinmuskel jeder Maus inokuliert. Inokulierte Mäuse wurden dann in einen großen Käfig plaziert und zufällig in Gruppen von zehn Mäusen aufgeteilt und dann unter Routinebedingungen gehalten. Die Mäuse wurden am Tag der Beimpfung, Tag 7 und Tag 14 zum Zeitpunkt der Tötung gewogen.
Die Behandlung der Mäuse wurde gewöhnlicherweise einen Tag nach der Injektion des Tumors begonnen und wurde täglich für fünf Tage fortgeführt. In einer Gruppe wurde die Behandlung nicht bis Tag 7 begonnen, zu der Zeit war der sich entwickelnde Tumor fühlbar. In diesem Fall wurde die Behandlung für 5–7 Tage vor der Tötung fortgeführt. Am Ende der 14-tägigen Beobachtungszeitdauer wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation oder Ether-Betäubung getötet. Die Haut über dem linken hinteren Bein wurde entfernt, um den Tumor freizulegen und das Bein mit Tumor wurde am Hüftgelenk entfernt. Jegliche restliche Haut wurde entfernt und das Bein/Tumor wurde gewogen. Der Mittelwert des normalen Beins wurde von dem Gewicht des Beins mit dem Tumor abgezogen, um eine Abschätzung des ak tuellen Tumorgewichts zur Verfügung zu stellen. Prozent-Tumorinhibierung wurde wie folgt bestimmt:
Es gab zehn Mäuse pro Gruppe. Die Testmäuse wurden an Tag 1 behandelt (dem Tag nach der Tumorimplantierung) und für fünf Tage fortgeführt. Die Tumorgewichte wurden an Tag 14 bestimmt. Zehn Mäuse dienten als Kontrolle und wurden mit 0,5 ml Kochsalzlösung behandelt, zehn Mäuse erhielten 0,25 ml Haiserumpräparation und zehn Mäuse erhielten 0,5 ml Haiserumpräparation. Alle Behandlungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht.
Die Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 4, zeigten an, daß die Haiserumpräparation eine signifikante anti-Tumoraktivität, mit mittlerer Tumorinhibierung von 57,7% und 98,4% für jeweils die 0,25 ml und 0,5 ml Haiserumpräparationsbehandlungen, wenn mit Tumoren der Kochsalzbehandelten Kontrolltiere verglichen.
TABELLE 4

Claims

Verfahren zur Herstellung von Haiserumkonzentrat, das zur Hemmung von Erkrankungen in einem Säuger nützlich ist, welches umfaßt: (a) Zugeben von Ethanol zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten Blutkörperchen und Serum zu bewirken, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird; (b) Erwärmen der Ethanol-Haiblut-Mischung auf eine Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um das Ethanol zu verdampfen, aber nicht ausreichend, um das Serumkomplement zu inaktivieren; und (c) Trennen der Mischung in Niederschlag und Haiserumkonzentrat; und (d) wenigstens 3-maliges Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit dem Haiserumkonzentrat.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Haiblut gefroren erhalten wird und vor dem Zugeben des Ethanols von Schritt (a) aufgetaut wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ethanol von Schritt (a) zu Haiblut in einer Menge von 20 bis 35 Vol.-% zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ethanol-Haiblut-Mischung von Schritt (b) unter Mischen auf eine Temperatur von etwa 21°C bis etwa 30°C erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ethanol-Haiblut-Mischung bei besagter Temperatur unter Mischen für wenigstens etwa eine Stunde gehalten wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung von Schritt (c) durch Zentrifugation oder Filtration durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Hai-Immunglobulin, das zur Hemmung von Erkrankungen in einem Säuger nützlich ist, welches umfaßt: a) Zugeben von Ethanol zu Haiblut in einer ausreichenden Menge, um die Trennung von roten Blutkörperchen und Serum zu bewirken, bei einer Temperatur von etwa 10°C, wodurch eine Ethanol-Haiblut-Mischung gebildet wird; b) Trennen der Mischung in Niederschlag und einen Überstand, der Haiserumkonzentrat umfaßt; c) Zugeben von ausreichend Ethanol zum Überstand von Schritt (b), um eine Endkonzentration von etwa 60% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag zu bilden; d) Abtrennen des Niederschlags von Schritt (c); e) Zugeben eines ausreichenden Volumens NaCl, um den Niederschlag aus Schritt (d) löslich zu machen und einen Niederschlag zu bilden, der Haiserum-Immunglobulin umfaßt; f) Abtrennen des Niederschlags aus Schritt (e) von der Lösung; g) Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol zum Filtrat aus Schritt (f), um eine Endkonzentration von etwa 40% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag und einen Überstand zu bilden; h) Zugeben einer ausreichenden Menge NaCl zum Niederschlag aus Schritt (g), um den Niederschlag löslich zu machen, Einstellen des pHs der Lösung auf etwa 7,4 und Zugeben eines ausreichenden Volumens Ethanol, um eine Endkonzentration von etwa 25% Ethanol zu erreichen, um einen Niederschlag zu bilden, der Hai-Immunglobulin umfaßt; i) Abtrennen des Niederschlags, der Hai-Immunglobulin umfaßt, aus Schritt (h) von der Lösung.
Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Hai-Immunglobulins, das zur Hemmung von Erkrankungen in Säugern nützlich ist, welches umfaßt: a) Zugeben eines gleichen Volumens von destilliertem Wasser und Ethylacetat zu einem Volumen Haiblut; b) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase; c) Abtrennen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase; d) Zugeben des Volumens von Ethylacetat aus Schritt (a) und Vermischen mit der Wasser-Phase von Schritt (c); e) Trennenlassen der Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase; f) Abtrennender Ethylacetat-Phase von der Wasser-Phase; g) Wiederholen der Schritte (d) bis (f); h) Entfernen des Wassers aus den Ethylacetat-Phasen; i) Zugeben von Aceton zur Ethylacetat-Phase aus Schritt (h), um das Hai-Immunglobulin auszufällen; und j) Abtrennen des gereinigten Hai-Immunglobulins von der Ethylacetat-Phase.
Zusammensetzung, erhältlich mit dem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, zur Verwendung bei der Hemmung von Rauscher-Mäuseleukämie-virus-Proliferation oder Tumorzell-Proliferation in einem Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung intravenös oder intramuskulär verabreicht werden soll.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Tumor ein Sarkom oder Leukämie ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter ein pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder Stabilisator umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der pharmazeutisch annehmbare Stabilisator Maltose ist.