DE2409650C3 - Verwendung wäßriger Lösung von menschlichem Serum-Haptoglobin bei der Bekämpfung von hämolytischen Nierenstörungen - Google Patents

Description

Haptoglobin ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 85 000 bis 400 000 und spielt im Stoffwechsel des im Blut freigesetzten Hämoglobins eine wichtige Rolle. Bei übermäßiger Hämolyse wird Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von etwa 67 000, das im Blut freigesetzt wird, durch das Glomerulum in den Urin ausgeschieden, wobei nicht nur der Eisengehali des Bluts gesenkt wird, sondern auch Störungen der Nierentubuli hervorgerufen werden.

Haptoglobin geht mit Hämoglobin eine selektive, feste Bindung ein, wobei ein Haptoglobin-Hämoglobinkomplex gebildet wird, der hauptsächlich von den Leberzellen aufgenommen wird. In den Leberzellen wird dieser Komplex anschließend abgebaut, so daß das Eisen wiedergewonnen wird und Nierenstörungen vermieden werden.

Die üblicherweise bei starker Hämolyse, d. h. Hämoglobinfreisetzung, auftretenden Nierenstörungen haben oft tödlichen Ausgang. Zur Zeit stellen hämolytische Nierenstörungen, die durch Transfusion fremder Blutarten, schwere Verbrennungen, Herzoperationen und hämolytische Krankheiten hervorgerufen werden, ein ernstes medizinisches Problem dar. Bisher wurden für solche Fälle nur symptomatische Behandlungen vorgeschlagen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine wäßrige Lösung von menschlichem Serum-Haptoglobin zur Verfugung zu stellen, aus der die hypotensiv wirkenden Substanzen und HB-Antigene entfernt wurden, mit der die vorgenannten Störungen kausal behandelt werden können. Durch diese Behandlung soll sich eine Normalisierung des Stoffwechsels und der Ausscheidung von Hämoglobin erreichen lassen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den im Patentanspruch bezeichneten Gegenstand.

Vorzugsweise weist die wäßrige Lösung eine Haptoglobinkonzentration von 5 bis 15% auf. Die Reinheit des Haptoglobins beträgt vorzugsweise mindestens 65%.

Um Hämoglobin, das im Blutstrom auf Grund von Hämolyseerscheindngen mit verschiedenen Ursachen freigesetzt worden ist, in einen Haptoglobin-Hämoglobin-Komplex überzuführen und Nierenstörungen zu verhindern oder zu behandeln, ist die Verabreichung einer großen Haptoglobinmenge erforderlich. Es ist deshalb wünschenswert, daß hoch gereinigtes Haptoglobin verabreicht wird. Außerdem enthalten Fraktionen von menschlichem Blutplasma nicht nur hypotensiv wirkende Substanzen, sondern sie können auch mit HB-Ag kontaminiert sein. Auch wenn die Untersuchung der Plasmafraktion auf HB-Ag negativ ausgefallen ist, kann die Gefahr einer Infektion nicht immer mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Dementsprechend ist die Entfernung der hypotensiv wirkenden Substanzen und die Inaktivierung von HB-Ag wichtig, wenn die genannten Fraktionen als Arzneimittel verwendet werden sollen.

Die Herstellung der wäßrigen Lösung von menschlichem Serum-Haptoglobin kann folgendermaßen durchgeführt werden: Eine wäßrige Lösung von α- und 0-Globulinfraktionen von menschlichem Blutplasma wird unter Verwendung von Ammoniumsulfat weiter fraktioniert Die bei 30- bis 40prozentiger Ammoniumsulfatsättigung ausgefällten Fraktionen werden gesammelt Diese Fraktionen werden in Wasser gelöst Die erhaltene Lösung wird zur Adsorption des Haptoglobins mit einem Anionenaustauscher behandelt Das Haptoglobin wird vom Anionenaustauscher selektiv eluiert und das erhaltene wäßrige Eluat eingeengt

Das Verfahren ist aus folgenden Gründen besonders wirtschaftlich und vorteilhaft:

Erstens können als Nebenprodukte erhaltene α- und jS-Globulinfraktionen verwendet werden. Diese Globulinfraktionen werden bei der Fraktionierung der hauptsächlichen Plasmaproteine, Fibrinogen, j»-Globulin und Albumin erhalten. Das Verfahren läßt sich bei Raumtemperatur durchführen.

Die im Verfahren verwendeten α- und |9-GIobuIinfraktionen entsprechen beispielsweise den Fraktionen IV, IV-I und IV-4 gemäß der Fraktionierung mit Alkohol bei niedrigen Temperaturen nach Cohn; vgl. E. J. C ο h η, L E. S t r ο η g, W. L. H u g h e s, D. J. Mulford, J. N. Ashworth, M. Melin und H. L. Taylor, Journal of the American Chemical Society, Bd. 68 (1946), S. 459. Nach einem anderen Verfahren lassen sich beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei 35- bis 50prozentiger Sättigung im wesentlichen die gleichen α- und jS-Globulinfraktionen erhalten. Die vorgenannten α- und J3-Globulinfraktionen werden im 3- bis lOfachen Volumen einer Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 9, vorzugsweise etwa 8, gelöst, wobei eine wäßrige Lösung entsteht, die in den meisten Fällen trüb ist. Diese wäßrige Lösung wird entweder direkt oder nach Klärung durch Zentrifugieren von restlichem Äthanol befreit, indem sie gegen eine Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 9 dialysiert wird.

Anschließend wird diese Lösung mit einer solchen Menge einer wäßrigen Lösung von Äthacridin-lactatmonohydrat versetzt, daß ihre Konzentration 0,2 bis 0,6,

vorzugsweise 0,4 Gewichtsprozent Äthylacridin-lactatmonohydrat, bezogen auf das Volumen der Lösung, beträgt. Dabei entsteht ein Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und das in der wäßrigen Lösung verbleiben-

de Äthylacridin-lactat wird beispielsweise durch Dialysieren gegen eine Pufferlösung oder durch Adsorption an Bentonit, Kaolin oder Aktivkohle entfernt. Die Äthylacridin-lactat-Behandlung ist zur Klärung der wäßrigen Lösung wichtig. Durch die Behandlung wird erreicht, daß die anschließenden Verfahrensschritte glatt ablaufen.

Die so geklärte wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise 7,0, eingestellt. Sodann wird eine wäßrige, konzentrierte Ammoniumsulfatlösung zugegeben. Der Niederschlag, der sich bei 30prozent,ger Ammoniumsulfatsättigung gebildet hat. wird entfernt. Anschließend wird der Überstand mit weiterer Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der bei einer 40prozentigen Ammoniumsulfatsättigung gebildete Niederschlag wird gesammelt, d. h. man erhält den Niederschlag, der zwischen 30- bis 40prozentiger Ammoniumsulfatsättigung entsteht.
Durch die fraktionierte Ammoniumsulfatfällung wer-

den Transferrin, Albumin und andere unerwünschte in den α- und /ί-GIobulinfraktionen enthaltene Proteine entfernt

Die vorstehend beschriebene Klärung von wäßrigen Lösungen von α- und /J-Globulinfraktionen mit Äthylacridin-lactat ist auch auf wieder hergestellte Lösungen der genannten, mit Ammoniumsulfat ausgefällten Niederschläge anwendbar. Die durch Ammoniumsulfat ausgefällten Fraktionen werden im 3- bis lOfachen Volumen Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5 bis 8,5, vorzugsweise 5,5, und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,08, beispielsweise einem 0,05 m Acetatpuffer, gelöst Die erhaltene Lösung wird in Kontakt mit einem starken Anionenaustauscher gebracht, der vorher mit der vorgenannten Pufferlösung äquilibriert worden ist Als Anionenaustauscher wird vorzugsweise mit Epichlorhydrin vernetztes Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-ar_fiinoäthyldextran oder Aminoäthylcelluiose verwendet Der Anionenaustauscher, an dem das Haptoglobin adsorbiert ist, wird gegebenenfalls mit einer geringen Menge der vorgenannten Pufferlösung von einer geringen Ionenstärke gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit einer Pufferlösung, die eine Ionenstärke von 0,25 bis 0,35 und einen pH-Wert von 4,5 bis 8,5, vorzugsweise 5,5 hat, eluiert. Beispielsweise wird ein 0,05 m Acetalpuffer, der durch Zusatz von Natriumchlorid auf die vorgenannte Ionenstärke gebracht worden ist, verwendet Auf diese Weise erhält man ein wäßriges Haptoglobineluat.

Bei dieser Stufe werden größere Mengen von jhypotensiv wirkenden Substanzen, die in der wäßrigen Lösung enthalten sind, und unstabile Substanzen, die eine Trübung oder Ausfällung während der Lagerung des Endproduktes hervorrufen, abgetrennt

Das erhaltene, Haploglobin enthaltende Eluat wird anschließend eingeengt, beispielsweise durch Ausfällung aller Bestandteile in der Lösung mit Ammoniumsulfat und Auflösen des Niederschlags in der entsprecherden Menge eines Lösungsmittels, vorzugsweise einer physiologisch verträglichen wäßrigen Lösung, wie einer isotonischen Kochsalzlösung. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die wäßrige Lösung durch Dialyse unter vermindertem Druck einzuengen. Wird unter vermindertem Druck gegen eine physiologisch verträgliche, wäßrige Lösung dialysiert, so w.rd in einer Stufe aus dem das Haptoglobin enthaltenden Eluat eine physiologisch verträgliche Lösung gebildet.

Die nach dem Verfahren erhaltene wäßrige Haptoglobinlösung läßt sich in beliebiger Konzentration erhalten. Wird die wäßrige Lösung zur intravenösen Injektion zur Verhinderung oder Behandlung von durch übermäßige Hämolyse hervorgerufenen Nierenstörungen verwendet, so wird eine Haptoglobinkonzentration von 5 bis 15 Prozent im allgemeinen bevorzugt. Die Reinheit des Haptoglobins in der wäßrigen Lösung beträgt mindestens 65 Prozent und die Ausbeute mindestens 30 Prozent der Theorie. Die Mengen an hypotensiv wirkenden Substanzen und unstabilen Substanzen, die in der wäßrigen Lösung enthalten sind, ist bei weitem geringer als in der wäßrigen Lösung vor der Behandlung mit dem Anionenaustauscher. Selbslverständlich wird die wäßrige Lösung vor der klinischen Anwendung steril filtriert oder einer ähnlichen Behandlung unterworfen, um ein keimfreies Arzneimittel zu erhalten. fc5

Wäßrige Haptoglobinlösungen sind nicht in ausreichendem Maße wärmestabil und verlieren im wesentlichen ihre Aktivität, wenn sie zur Inaktivierung von HB-Ag erwärmt werden, was bei der Albuminherstellung durchgeführt wird. Es wurde festgestellt daß die Haptoglobinaktivität in wäßriger Lösung bei einer lOstündigen Erwärmung auf 60⁰C, wie sie im allgemeinen zur Inaktivierung von HB-Ag vorgenommen wird, verschwindet

2s wurde nun festgestellt daß bei Zusatz von bestimmten Stabilisatoren zu den wäßrigen Haptoglobinlösungen das Haptoglobin gegen Erwärmen stabil wird. Beispiele für solche Stabilisatoren sind neutrale Aminosäuren, Monosaccharide, Disaccharide oder Zukkeralkohole. Nach Zusatz dieser Stabilisatoren behalten die wäßrigen Haptoglobinlösungen ihre Aktivität auch nach einer lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰C. Die vorgenannten Stabilisatoren können entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr dieser Verbindungen verwendet weiden.

Die vorgenannte Erwännungs- und Stabilisierungsbehandlung kann in einem beliebigen Stadium der Herstellung der Haptoglobinlösungen vorgenommen werden. Folgende Lösungen können mit dem vorgenannten Stabilisator versetzt und anschließend der Wärmebehandlung zur Inaktivierung von HB-Ag unterzogen werden: die wäßrige Ausgangslösung der a- und j3-GlobuIinfraktionen, die mit Äthylacridin-lactat geklärte wäßrige Lösung, die von Äthylacridin-lactat freie wäßrige Lösung, die nach Auflösen der Ammoniumsulfatfällungen wieder hergestellte wäßrige Lösung, das nach E'.ution des Anionenaustauschers erhaltene wäßrige Eluat und die eingeengte wäßrige Lösung.

Spezielle Beispiele für Stabilisatoren sind neutrale Aminosäuren (Monoamino-monocarbonsäuren) wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, Monosaccharide, wie Glucose, Mannose, Galactose und Fructose, Disaccharide, wie Saccharose, Maltose und Lactose, sowie Zuckeralkohole, wie Mannit, Sorbit und Xylit. Die Menge des zugesetzten Stabilisators beträgt mindestens 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise 15 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der Lösung.

Die Wärmebehandlung zur Inaktivierung von HB-Ag wird nach einem üblichen Verfahren durchgeführt. Bei einer üblichen lOstündigen Behandlung bei 60°C behält die wäßrige Lösung 95 Prozent ihrer Haptoglobinaktivität.

Der in der wäßrigen Lösung verbleibende Stabilisator wird anschließend durch Dialyse, durch Dialyse unter vermindertem Druck oder durch die zur Einengung der wäßrigen Lösung angewendete Ammoniumsulfatfällung entfernt.

Das Verfahren zur Stabilisierung von wäßrigen Haptoglobinlösungen kann auch auf wäßrige Haptoglobinlösungen angewendet werden, die nach anderen Verfahren erhalten worden sind. Beispielsweise sei das Verfahren von B e t r a c h und M c M i 11 a n genannt; Anal. Biochem., Bd. 49 (1972), S. 103 bis 108.

Die Toxizität der nach dem Verfahren hergestellten wäßrigen Haptoglobinlösungen ist äußerst gering. Bei Injektionen von großen Mengen an Mäuse oder Ratten, sowie auch an Menschen, werden keine ungünstigen Nebenwirkungen hervorgerufen. So ergeben sich beispielsweise bei intravenöser Infusion einer 5prozentigen Haptoglobinlösung in isotonischer Kochsalzlösung an Erwachsene keine ungünstigen Nebenwirkungen.

Wie bereits erwähnt, sind die wäßrigen Haptoglobinlösutigen wertvoll zur Bekämpfung von hämolytischen Nierenstörungen.

Die Figur zeigt den klinischen Fortschritt eines

Patienten mit Beckenbruch, Harnröhrenriß und Blutungsschock, dem eine wäßrige Lösung von menschlichem Serurn-Haptoglobin verabreich« wurde.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die in den Beispielen genannte Hämoglobin-Bindekapazität ist folgendermaßen definiert:

Höchstmenge an Hämoglobin, die einer definierten Menge Haptogiobin zugesetzt werden kann, ohne daß freies Hämoglobin auftritt. Das erhaltene Gemisch wird durch Dünnschichtelektrophorese an Polyacrylamidgel entwickelt Anschließend wird mit einem Benzidinreagens angefärbt; vgl. The Society of the Electrophoresis: Experimental Methods by Electrophoresis, Herausgeber Bunkodo, S. 247.

Die Gesamtmenge an Haptogiobin wird nach dem eindimensionalen Immunodiffusionsverfahren von G. Mancini, A. O. Carbonara und J. F. Heremans, Immunochem., Bd.2 (196"5), S.235, unter Verwendung von Kaninchen-Antihaptoglobinseren (Behringwerke) gemessen. Die Reinheit des Haptoglobins wird als der Haptoglobinanteil im Gesamtprotein des Präparats angegeben. Die Proteinmenge wurde dabei als Stickstoff nach K j e 1 d a h 1 bestimmt, wobei mit dem Faktor 6,25 multipliziert wurde.

Die akute Toxizität (LD50) wurde durch intravenöse Injektion von wäßrigen Haptoglobinlösungen an Mäuse und Ratten bestimmt. Zur Bestimmung der hypotensiven Aktivität wurden die Haptoglobinlösungen an erwachsene Hunde verabfolgt. Die hypotensive Aktivität wird als Verhältnis des arteriellen Blutdruck! vor der Verabreichung zum Blutdruck nach der Verabreichung angegeben. Eine hypotensive Aktivität von weniger als 10% wird als negativ gewertet. Die Messung von HB-Ag wurde nach dem Radioimmuntest gemäß der japanischen Patentveröffentlichung 49 919/73 unter Verwendung des Ausria-125-Bestecks bestimmt.

Beispiel 1

30 kg der Fraktion IV, die durch Fraktionierung von menschlichem Blutplasma nach der Cohn'schen Äthanolfraktion ierung bei niedriger Temperatur erhalten wurden, werden in 145 Liter 0,05 m Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 8,2 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit 120 Litern einer lprozentigen wäßrigen Lösung von Äthylacridin-lactat-monohydrat vermischt, 3 Stunden gerührt und anschließend 2 Stunden zum Absetzen des Niederschlags stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand mit 8 kg Bentonit vermischt, 2 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Man erhält eine klare Lösung. Nach dem Einstellen des pH-Wertes des Filtrats auf 7,0 durch Zugabe von 1 η Essigsäure wird Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer 30prozentigen Sättigung zugesetzt Der gebildete Niederschlag wird durch Abzentrifugieren entfernt Anschließend wird weiteres Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung zugesetzt und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert Dieser Niederschlag wird sodann in 10 Litern einer 0,05 m Natriumacetatlösung gelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert Die erhallene Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20 Prozent (Gewicht/Volumen) mit Glycin versetzt Der pH-Wert wird auf 8 eingestellt Sodann wird 10 Stunden im Wasserbad auf 6O⁰C erwärmt Die so wärmebehandelte Lösung wird gegen eine 0,05 m Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 dialysiert und anschließend mit 200 g QAE-Sephadex-A-50, das mit der vorgenannten Pufferlösung äquilibriert worden ist, vermischt, um das Haptogiobin zu adsorbieren. Anschließend wird das QAE-Sephadex-A-50 mit einer Pufferlösung der Ionenstärke 0,05 (Zusammensetzung: 0,05 m CH₃COOH +0,05 m CH₃COONa-3 H₂O) gewaschen. Anschließend wird das Haptogiobin mit einer Pufferlösung der Ionenstärke 0,3 (Zusammensetzung: 0,05 m CH₃COOH, 0,05 m CH₃COONa-3 H₂O-I-NaCl) eluiert Sodann wird Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 50 Prozent zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in 1,5 Liter einer isotonischen Kochsalzlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird dialysiert und anschließend durch eine 0,2 μ Filter-Membran (Spezialfilter für sterile Filtration) filtriert. Man erhält eine sterile wäßrige Lösung von Haptogiobin. Die Haptoglobinkonzentration dieser wäßrigen Lösung beträgt 4,8% und die Haptoglobinausbeute 42%. Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle I zusammengestellt:

35

Tabelle I	75%
Reinheit des Haptoglobins	0,62 mg Hämo
JO Hämoglobinbindekapazität	globin/mg
	Haptogiobin
LD50	mindestens 11,7 g/kg
45 Mäuse	mindestens 10,5 g/kg
Ratten	9,5%
Hypotensive Aktivität	negativ
HB-Ag

50

Um die Wirkung der Ionenaustauscherbehandlung zu zeigen, werden die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität der Haptoglobinlösungen vor und nach dieser Behandlung miteinander verglichen.

Tabelle II

Hypotensive
Aktivität

Lagerstabilität

dreimonatige Lagerung bei 4 C

dreimonatige Lagerung bei
Raumtemperatur

Vor der Behandlung mit 18
Ionenaustauscher

Nach der Behandlung 9,5

mit Ionenaustauscher

Auftreten von feinen suspendierten Partikeln

unverändert klar

Auftreten von feinen
suspendierten Partikeln

unverändert klar

Beispiel 2

3 kg der Fraktion IV, die gemäß der Cohn'schen Äthanolfraktionierung aus menschlichem Blutplasma erhalten wurden, werden in 15 Litern Acetatpuffer vom pH-Wert 7 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird gegen Acetatpuffer dialysiert und anschließend zentrifugiert, um das Äthanol bzw. die unlöslichen Bestandteile zu entfernen. Der Überstand wird bis zu 33prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfal versetzt, und der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt. Anschließend wird weiteres Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in 10 Litern Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 8 Litern einer 0,5prozentigen Lösung von Äthylacridin-Iactat-monohydrat versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,5 eingestellt. Anschließend wird die Lösung zur Entfernung der Niederschläge zentrifugiert. Der Überstand wird zur Entfernung des Äthylacridin-Iactats gegen Acetatpuffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20% (Gewicht/Volumen) mit Mannit versetzt und anschließend 10 Stunden auf 6O⁰C erwärmt. Die wärmebehandelte Lösung wird zur Entfernung des Manniis gegen 0,05 m Aceiatpuffer vom pH-Wert 6,5 dialysiert. Man erhält 1,2 Liter einer 3prozentigen wäßrigen Haptoglobinlösung. Diese Haptoglobinlösung wird mit 30 g Aminoäthylcelluiose, die mit dem vorgenannten Puffer äquilibriert worden ist, vermischt. Anschließend wird die Aminoäthylcelluiose mit einer wäßrigen Lösung der Ionenstärke 0,08 (Zusammensetzung: 0,08 m CH₃COOH + 0,08 m

Tabelle IV

CH₃COONa · 3 H₂O) gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit einer wäßrigen Lösung der Ionenstärke 0,25 (Zusammensetzung: 0,08 m CH₃COOH + 0,08 m CH₃COONa · 3 H₂O + NaCl) eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, eingeengt und sodann durch eine 0,2 μ Filtermembran filtriert. Man erhält eine sterile wäßrige Haptoglobinlösung. Die Proteinkonzentralion dieser Lösung beträgt 10 Prozent

ίο und die Haptoglobinausbeute 40 Prozent. Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle III zusammengestellt.

Um die Wirkung der Behandlung mit dem Ionenaustauscher zu zeigen, werden in Tabelle IV die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität der Haptoglobinlösungen vor und nach dieser Behandlung miteinander verglichen.

Tabelle III

Reinheit des Haptoglobin

71%

Hämoglobinbindekapazität

LD_5?
Mäuse
Ratten

Hypotensive Aktivität
Hb-Ag

0,68 mg Hämo-

giobin/mg

Haptoglobin

mindestens 12 g/kg
mindestens 10 g/kg

6,0%
negativ

Hypotensive Aktivität

Lagerstabilität

dreimonatige Lagerung bei 4 C

dreimonatige Lagerung bei
Raumtemperatur

Vor der Behandlung mit 12,0 dem Ionenaustauscher

Nach der Behandlung 6,0

mit dem Ionenaustauscher

feiner Niederschlag unverändert klar

leicht trüb
unverändert klar

Beispiel 3

10 Liter frisches Blutplasma werden zur Ausfällung der α.- und J3-Globulinfraktionen mit Ammoniumsulfat versetzt. Diese Fraktionen werden in 10 Litern Aiiimoniumacetaipuffer vorn pH-Wert 8 suspendiert Die Suspension wird mit 7 Litern einer lprozentigen wäßrigen Lösung von Äthylacridin-lactat-monohydrat vermischt und anschließend 2 Stunden stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und der Überstand mit 0,6 kg Kaolin versetzt, 2 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Man erhält eine klare Lösung. Nach dem Einstellen des pH-Wertes des Filtrats auf 7,0 durch Zusatz von 1 η Essigsäure wird Ammoniumsulfat bis zu 30prozentiger Sättigung zugegeben. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt Der Überstand wird mit weiterem Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung versetzt Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und in Wasser gelöst Die erhaltene Lösung wird gegen 0,05 m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,5 dialysiert Die dialysierte Lösung wird der Säulenchromatographie an einer mit QAE-Sephadex-A-50 beschickten Säule der Abmessungen 4 χ 30 cm unterworfen. Die "Säule wird mit Acetatpuffer der Ionenstärke 0,12 gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit Acetatpuffer der Ionenstärke 0,3 eluiert Das eluierte Haptoglobin wird mit Hilfe von Poiyäthyiengiykoi ais wasserabsorbierendes Mittel eingeengt Die eingeengte Flüssigkeit wird mit 15 Prozent (Gewicht/Volumen) Glycin versetzt und anschließend 10 Stunden auf 60° C erwärmt Die wärmebehandelte Lösung wird zur Entfernung des Glycins gegen eine isotonische Natriumchloridlösung dialysiert und anschließend durch eine 0,2 μ Filtermembran filtriert Man erhält eine sterile Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung. Die Proteinkonzentration dieser Lösung beträgt 8,2 Prozent und die Haptoglobinausbeute 38 Prozent Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle V zusammengestellt

Um die Wirkung der Behandlung mit dem Ionenaustauscher zu zeigen, werden in Tabelle VI die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität von Haptoglobinlösungen vor und nach dieser Behandlung verglichen.

ίο

Tabelle V

Reinheit des Haptoglobins

Hämoglobinbindekapazität

₅O

Mäuse
Ratten

Hypotensive Aktivität
HB-Ag 0,88 mg Hämoglobin/mg
Haptoglobin

mindestens 12 g/kg
mindestens 10 g/kg

7,0%
negativ

Tabelle VI

Hypotensive
Aktivität Lagerstabilität

dreimonatige Lagerung
bei 4' C

dreimonatige Lagerung bei Raumtemperatur

Vor der Behandlung mit 24,0

dem Ionenaustauscher
Nach der Behandlung mit 7,0

dem Ionenaustauscher

Beispiel 4

feiner Niederschlag
unverändert klar

leicht trüb

unverändert klar

Stabilisator
Art

Alanin

Wenn die Wärmebehandlung zur Inaktivierung von gegebenenfalls in der Haptoglobinlösung vorhandenem HB-Ag in Abwesenheit eines Stabilisators durchgeführt wird, so verliert das Haptoglobin seine Hämoglobinbindende Wirkung.

In diesem Beispiel werden der Einfluß der Katalysatormenge und die stabilisierende Wirkung verschiedener Stabilisatoren durch Messung der verbleibenden Mannit Hämoglobinbindekapazität des Haptoglobins nach der Wärmebehandlung untersucht.

Dabei wird die gemäß Beispiel 1 erhaltene, noch nicht wärmebehandelte Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung verwendet. Als Stabilisatoren Glucose werden die neutralen Aminosäuren Glycin und Alanin und die Saccharide Mannit und Glucose verwendet. Die Stabilisatoren werden jeweils in den in Tabelle VII angegebenen Mengen in der Haptoglobinlösung gelöst, welche dann 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt wird. Anschließend werden die Hämoglobinbindekapazität der Haptoglobinlösung und das Verhältnis der entsprechenden Werte vor und nach der Wärmebehandlung bestimmt

Zum Vergleich wird eine nicht mit Stabilisator versetzte Haptoglobinlösung der gleichen Wärmebehandlung unterzogen, wonach ebenfalls die Hämoglobi i Di Ebi id

Menge

Restliche Hämoglobinbindekapazitäl des Haptoglobins nach der Wärmebehandlung

20
15

20

15

10

20
15

75 50

85 80 55 40

60 45

Ohne Stabilisator

Beispiel 5

Beispiel 4 wird mit der Abänderung wiederholt, daß als Haploglobinlösung die noch nicht wärmebehandelte dialysierte Lösung von Beispiel 3 verwendet wird und als zusätzliche Stabilisatoren Sorbit und Saccharose eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt

Lmiuuiucjiapauiai gemessen wu in Tabelle VII zusammengestellt.	Menge	Restliche Hämoglobin	Tabelle VIII	60	Glycin	Menge	Restliche Hämoglobin
Tabelle VII		bindekapazität des	Stabilisator		Alanin		bindekapazität des
	°	Haptoglobins nach der		Mannit		Haptoglobins nach der
Stabilisator		Wärmebehandlung	Art	65 Glucose	20	Wärmebehandlung
Art	20		Sorbit	20
	15	95	Saccharose	20 ·	92
	10	95	Ohne Stabilisator	20	83
	5	70		20	85
Glycin	2.25	35		20	72
		20			76
			68
		0

Beispiel 6

Die gemäß Beispiel I hergestellte Haptoglobinlösung wird zu In-vivo-Experimenten an Kaninchen eingesetzt, um die Wirkung der Haptoglobinbehandlung nach einer Verabreichung von Hämoglobin festzustellen.

30 erwachsene Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,3 bis 2,9 kg werden in drei Gruppen von jeweils 10 Tieren eingeteilt. Diesen Tieren wird kontinuierlich Haptoglobin und/oder Hämoglobin verabfolgt, wobei die Überlebensrate der Kaninchen festgestellt wird. Nach beendeter Versuchsdauer werden die überlebenden Tiere seziert und die einzelnen Organe einer histopathologischen Untersuchung unterworfen.

Der ersten Gruppe wird Haptoglobin verabfolgt:

Eine 5prozentige Lösung von Haptoglobin in isoionischer Kochsalzlösung wird nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt und einmal tätlich durch intravenöse Dauerfusion in einer Dosis von 0,8 g/kg Körpergewicht verabfolgt.

Der zweiten Gruppe wird Hämoglobin verabfolgt:

Eine lOprozentige Lösung von Hämoglobin (aus roten Blutkörperchen von Kaninchen isoliert) in isotonischer Kochsalzlösung wird hergestellt und einmal täglich in einer Dosis von 0,4 g/kg Körpergewicht durch intravenöse Dauerfusion verabfolgt.

Der dritten Gruppe werden Haptoglobin und Hämoglobin verabfolgt:

Hämoglobin und anschließend Haptoglobin werden auf die gleiche Weise und in den gleichen Dosen wie in Gruppe 1 und Gruppe 2 verabfolgt.

Am 4. Tag nach der Verabfolgung wird die Anzahl der überlebenden Kaninchen pro Gruppe festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt:

Tabelle IX

Anzahl der Anzahl der AnzaW

Testtiere überleben- der toten

den Tiere Tiere

Gruppe 1:

Verabfolgung von 10

Haptoglobin
Gruppe 2:

Verabfolgung von 10

Hämoglobin
Gruppe 3:

Verabfolgung von 10

Haptoglobin und

Hämoglobin

10

25

30

35

40

45

50

Die histopathologische Untersuchung ergibt folgendes:

Gruppe 1

Bei Kaninchen, denen bis zu 14 Tagen kontinuierlich Haptoglobin verabfolgt wurde, zeigen sich an Nieren, Milz und Lunge keine Veränderungen. Lediglich eine geringe Verengung des Sinusoids und eine Eisenablagerung in der Leber werden beobachtet

Gruppe 2

Bei Kaninchen, denen kontinuierlich 6 Tage Hämoglobin verabfolgt wurde, lassen sich eine deutliche Eisenablagerung vom proximalen Tubulus zum Sammelrohr der Niere, eine Verdünnung der renalen Epithelzellen, eine Vermehrung der retikulären Zellen in der Milz, eine deutliche Verengung des Sinusoids und eine Eisenablagerung in der Leber feststellen.

Gruppe 3

Bei Kaninchen, denen kontinuierlich Hämoglobin und Haptoglobin verabfolgt wurde, läßt sich eine Eisenablagerung nur im proximalen Tubulus der Niere feststellen. Das Sammelrohr ist im wesentlichen normal. Es tritt keine Verdünnung der Epithelzellen auf. Ferner läßt sich eine leichte Infiltration von Zellen in der Milz feststellen. Ferner werden eine geringere Eisenablagerung und viel Gallenpigment in der Leber beobachtet.

Aus den vorstehenden Versuchen ergibt sich, daß die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Haptoglobinlösung im wesentlichen keine schädlichen Nebenwirkungen aufweist und sich zur Bekämpfung von durch Hämoglobin verursachten Nierenstörungen eignet.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird die klinische Wirkung der nach Beispiel 2 hergestellten Haptoglobinlösung erläutert. Bei einem männlichen Patienten von 53 Jahren, der bei einem Arbeitsunfall durch einen Holzbalken verletzt wurde und sofort ins Krankenhaus kam, wird ein Beckenbruch, ein Harnröhrenriß und ein Blutungsschock diagnostiziert. Unmittelbar nach der Einlieferung wird der Patient zur Wiederherstellung des Harntraktes operiert. Während der Operation beträgt der gesamte Blutverlust 7500 ml. Die Menge des übertragenen Blutes beträgt insgesamt 4200 ml und die Menge des Blutersatzes ebenfalls 4200 ml. Während dieser Zeit werden zwei Ampullen verabfolgt, wobei jede Ampuiie 2 ml einer Lösung mit 20 mg 4-ChIor-N-furfuryl-5-sulfamoylanthranilsäure enthält Ferner werden 200 ml einer 20prozentigen Mannitlösung verabfolgt, wobei die gewünschte Wirkung im Urin nicht eintritt Der klinische Fortschritt des Patienten nach der Operation ist aus der Figur ersichtlich. Das Symbol »J« im oberen Teil der Figur gibt den Zeitpunkt der Zugabe der einzelnen Stoffe und das Symbol »f«im untersn Teil der Figur gibt den Zeitpunkt der Operation und der klinischen Befunde an. Auf der Abszisse sind die Tage nach dem Unfall angegeben. Nach 20 Stunden beträgt die Urinmenge lediglich 120 ml. Im Urin ist eine

Hpntlirhp Μρησρ an Rlutniampntpn f*»ct"7nctiiH<»Ti In

diesem Stadium werden dem Patienten durch intravenöse Infusion 250 ml einer 5prozentigen Lösung von ih

se Infusion 250 ml einer 5prozentigen Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung verabfolgt, die nach dem Verfahren gemäß Beispiel 2 hergestellt wurde. Die roten Blutpigmente verschwinden innerhalb einiger Stunden nach der Haptoglobingabe aus dem Urin. Außerdem steigt die Urinmenge, und die allgemeinen Symptome des Patienten bessern sich allmählich. Auch 6 Monate später ergeben sich durch die Verabfolgung von Haptoglobin keine nachteiligen Nebenwirkungen.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung von wäßriger Lösung von menschlichem Serum-Haptofilobin, woraus die hypotensiv wirkenden Substanzen und die HB-Antigene entfernt wurden, bei der Bekämpfung von hämolytischen Nierenstörungen.