SE455163B - Uropepsin for anvendning som terapeutikum mot allergiska sjukdomar, immunkomplexsjukdomar och tumorer - Google Patents

Description

455 165 (4) Allergi av typ IV (cellförmedlad eller fördröjd typ), där lymfocyter (T-celler) från tymus med specifika receptorer stimuleras av antigener och frigör mediatorer. Vid avstötning av vävnad omvandlas dessa lymfocyter och dödar vissa celler med ympmaterialets histokompatibilitetsantigen.

Bland dessa allergiska reaktioner deltager reaktionerna av typerna I, III och IV t ex i bronkialastma, och var och en av dessa reaktioner anses oberoende eller i kombinationer för- orsaka dessa sjukdomar. Mekanismen för framkallande av aller- giska sjukdomar anses vara följande. Ett antigen som tränger in i en organism behandlas av makrofager, och den immunologiska informationen överföres till T-cell-B-cell-systemet. De B- -celler som har mottagit informationen producerar antikroppar (IgE-antikroppar produceras huvudsakligen vid allergi av typ I och IgG-antikroppar vid allergi av typ II eller typ III). IgE- -antikroppar bíndes till basofila celler i cirkulation eller till mastceller i vävnaderna, varigenom det sensibiliserande tillståndet upprättas. När samma antigen senare tränger in i den sensibiliserande organismen, bíndes antigenet till anti- kropparna på dessa celler och frigör kemiska mediatorer, såsom histamin, eller långsamt reagerande anafylaxisubstanser H¶ß De sålunda frigjorda kemiska mediatorerna framkallar aller- giska symptom, såsom erytem, ödem eller ökning av körtel- sekretíonen förorsakad av sammandragning av glatta muskler och ökning av kapillärpermeabiliteten. IgG-antikroppar á andra sidan bindes till polymorfonukleära leukocyter för uppnàende av sensibilisering, och det antages att SRS-A frigöres såsom kemisk mediator.

Medel för behandling av allergiska sjukdomar kan uppnå sin terapeutiska verkan genom att hämma vilket steg som helst i de ovan nämnda processerna. För terapeutisk behandling av bronkialastma användes t ex xantinderivat, B-adrenergiska sti- muleringsmedel (B-stimulatorer) eller kortikosteroider. Ogynn- samma biverkningar har emellertid ofta observerats vid använd- ning av dessa läkemedel. För patienter som fått mottaga xantin- derivat och ß-stimulatorer har man t ex angivit förekomst av hjärtklappning och takykardi. Kortikosteroider ger också bi- verkningar, såsom magsår och komplikationer vid bakterieinfek- ru' 455 163. tioner. Antihistaminer är icke effektiva vid behandling av bronkialastma. Dessa medel gör ibland astman ännu värre genom att de gör det svårt att hosta upp sekret från luftstrupen.

Immunkomplex-sjukdomar, såsom reumatoid artrit, syste- misk lupus erytematosus (SLE) och lupus nefritis, är såsom namnet antyder sjukdomar som framkallas av komplex bildade av antigener och antikroppar, dvs immunkomplex, och dessa sjuk- domar hör till allergier av typ III. Även om mekanismen för uppträdande av dessa sjukdomar är komplicerad och innehåller många punkter som fortfarande är oklara, antages det vanligen att förloppet är följande.

När bakterie- eller virusinfektioner skadar vävnader, produceras antikroppar mot nybildade autoantigener eller virus- infekterade celler under bildning av immunkomplex. Eftersom dessa immunkomplex aktiverar komplementsystemet och blodplät- tarna, frigöres kärlaktiva substanser, såsom histamin och sero- tonin, och blodkärlens permeabilitet ökas. Immunkomplexen i cirkulation kommer in i blodkärlen och avsätter sig längs bas- membranet hos den kärlvägg, vars permeabilitet har ökats. När immunkomplexen har avsatt sig, samlas polymorfonukleära leuko- cyter genom inverkan av kemotaktiska leukocytfaktorer, vilka har bildats genom komplementets inverkan på de avsatta immun- komplexen¿ De polymorfonukleära leukocyterna reagerar med immunkomplexen och frigör olika substanser som skadar vävna- derna, såsom katepsinerna D och E, kollagenas, elastas och permeabilitetsfaktorer, och dessa substanser skadar slutligen vävnaden. Hos patienter med immunkomplexsjukdomar, såsom SLE, är komplementhalten i serum vanligen låg, och försämringen av sjukdomstillståndet har nära samband med minskningen av komple- menthalten. Denna minskning antages bero på kraftig förbrukning av komplementet pà de ställen där reaktionen mellan antigener och antikroppar äger rum, såsom njurar och blodkärl. Immun- komplexen står också i ett visst förhållande till blodkoagu- leringssystemen, och det antages att immunkomplexen fram- kallar allvarliga symptom genom olika mekanismer, t ex genom 'acceleration av fibrinoidavsättning på de skadade vävnaderna. 455 163 Det finns i dag flera typer av medel för behandling av immunkomplexsjukdomar, nämligen immunsuppressiva medel, såsom steroider som hämmar aktivering av immunsystemet, antiinflamma- toriska medel som minskar lokala inflammationer och smärtor, samt antikoagulationsmedel och medel mot blodplättar, som för- bättrar abnormiteterna hos blodkärlens koagulations-fibrinolys- -system. Dessa. medel uppvisar emellertid icke en tillfreds- ställande verkan, och de ger kraftiga biverkningar. Utveckling av en medicin som är säker och mycket effektiv vid behandling av dessa sjukdomar är sålunda mycket önskvärd.

Många medel har utvecklats för behandling av nmligna tumörer.

Antitumärmedlen kan grovt indelas i två typer. Den första typen omfattar s k cytotoxiska läkemedel, vilka direkt hämmar tumörernas tillväxt. Den andra typen omfattar läkemedel som indirekt reglerar tumörtillväxten genom aktivering av immunologíska skyddsfunktioner hos individen. Den förstnämnda typen av läkemedel uppvisar emellertid icke tillräckligt selektiv cytotoxicitet mot tumörcellerna, utan dessa medel är giftiga även mot de normala cellerna, varigenom den användbara totalmängden av medlet begränsas avsevärt. Den sistnämnda typen av läkemedel, dvs immunopotentiatorer, kan å andra sidan vanligen användas med säkerhet och ger mindre ofta ogynnsamma biverkningar än .den förstnämnda. typen av läkemedel. Tumörer härrör emellertid från patientens normala celler, vilket inne- bär att tumören icke i tillräcklig utsträckning kan igen- kännas såsom en främmande substans. Några immunopotentiatorer uppvisar därför icke en tillräcklig antitumörverkan.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstad- komma ett terapeutiskt medel för allergiska sjukdomar, immun- komplexsjukdomar och tumörer, vilket medel icke uppvisar några biverkningar.

Uppfinningen avser sålunda uropepsin för användning som terapeutíkum mot allergiska sjukdomar, immunkomplexsjukdomar och tumörer, vilket uropepsin har följande egenskaper: 455 163t 5 (a) molekylvikt inom intervallet 32 000-38 000, bestämd ge- nom gelkromatografi; (b) isoelektrisk punkt inom pH-intervallet 1-3, bestämd genom isoelektrisk fokusering; (c) maximal absorption vid 278 nm; (d) utmärkt hydrolytisk aktivitet inom det sura pH-omrâdet (pH lägre än 7), när hemoglobin användes såsom substrat; (e) positiv reaktion för ninhydrin; (f) löslígt i vatten och olösligt i eter och kloroform; (g) hämmas av pepstatin; (h) stabilt inom det sura pH-området (pH lägre än 7) och instabilt inom det alkaliska pH-området (pH högre än 8).

På basis av den ovan angivna teknikens ståndpunkt har uppfinnarna intensivt undersökt möjligheterna att utveckla ett effektivt terapeutiskt medel för behandling av allergiska sjukdomar, immunkomplexsjukdomar och tumörer. Såsom resultat av dessa undersökningar har man funnit att ett surt proteas från humanurin (uropepsin) uppvisar en kraftig antiallergisk verkan, i anmärkningsvärd grad hämmar olika immunkomplexsjuk- domar och dessutom uppvisar utmärkt antitumörverkan. Före- liggande uppfinning har baserats pà dessa' upptäckter.

Det enligt föreliggande uppfinning använda uropepsinet är ett känt enzym (Mireky et ei, J ciin Invest, 27, B18, 1948), vilket aldrig har använts sásom terapeutiskt medel för aller- giska sjukdomar, immunkomplexsjukdomar och tumörer. Uropepsinet kan erhållas från humanurin genom att man på lämpligt sätt kombinerar vanliga metoder för isolering av proteiner, såsom utsaltning, adsorptionskromatografi på oorganiska adsorptions- medel, jonbytarkromatografi på jonbytare eller gelkromatografi med användning av molekylsilar.

Humanurin kan t ex ledas genom en DEAE-cellulosakolonn som har bragts i jämvikt med 0,1 M acetatbuffertlösning (pH 5,3) enligt den metod som har beskrivits av Seijffers et al (American Journal of Physiology, 206, 1106, 1964), varvid uro- pepsinet adsorberas på kolonnen. Uropepsinet elueras därefter med samma buffertlösning innehållande 0,3 M natriumklorid. 455 163 Eluatet koncentreras och renas sedan xtterligare genom gelkro- matografi med användning av Sephadex Qy G-100, varpå en syra- behandling genomföres. Syrabehandlingen kan t ex genomföras genom att eluatets pH-värde inställes på ett värde lägre än 5 med saltsyra, varefter lösningen inkuberas på lämpligt sätt under lämplig tid. Pà detta sätt erhålles uropepsinet enligt uppfinningen.

Det uropepsin som erhålles enligt den ovan beskrivna metoden har en molekylvikt av 32 000-38 000, bestämd genom gel- gå G-100 (tvärbunden dextran från kromatografi på Sephadex Pharmacia AB). Den isoelektriska. Epnkten bestämd genom iso- elektrisk fokusering pà Ampholine g)(blandning av alifatiska polyaminokarboxylsyror från LKB-Produkter AB) ligger inom pH- -intervallet 1-3. Uropepsinet uppvisar en maximal absorption vid 278 nm, uppvisar en positiv reaktion för ninhydrin samt är lättlösligt i vatten och olösligt i eter och kloroform. Uro- pepsinet uppvisar utmärkt hydrolytisk aktivitet inom det sura pH-området (pH lägre än 7), när hemoglobin användes såsom substrat, och det hämmas av pepstatin. Uropepsínets aktivitet förblir stabil inom det sura pH-området (pH lägre än 7), medan det förlorar sin aktivitet inom det alkaliska pH-området (pH högre än 8).

I nedanstående experiment visas det sura proteasets (uropepsinets) farmakologiska egenskaper och giftighet.

På den bifogade ritningen visar fig 1 resultaten av experiment 1; fig 2 och 3 visar resultaten av experiment 7; och fig 4 visar resultaten av mätningarna av proteínhalten i urinen enligt experiment 8. Proteinhalten i urinen bestämdes enligt en skala från 0 till. 4 med hjälp av färgningen av kommersiellt tillgängligt proteintestpapper, och den genomsnittliga protein- halten för varje grupp beräknades.

Experiment 1. Hämmande verkan på produktionen av anti- -ovalbumin-IgE-antikroppar.

Man använde en grupp om 10 Wistar-hanràttor med en vikt av 180-200 g. 0,1 mg ovalbumin och 20 mg aluminiumhydroxídgel injicerades intraperitonealt. Med början från efterföljande dag injicerades surt proteas (uropepsin) intravenöst en gång per dygn under 14 dygn. Sera uppsamlades 7, 10 och 14 dygn 455 155 efter injiceringen av ovalbumin, och halten antí-ovalbumin-IgE- -antikroppar i serumet bestämdes genom homolog PCA-reaktion hos _ ráttorna. (H Maruyma et al, Folio Pharmacologíca Japonica, 74, 179, 1978). De erhàllna resultaten visas grafiskt i fig 1.

Av försöksresultaten framgår att produktionen av anti- -ovalbumin-IgE-antikroppar hämmades signifikant.

Experiment 2. Hämmande verkan på bronkialastma.

Man använde en grupp om 10 Wistar-hanràttor med en vikt av 180-200 g. 0,1 mg ovalbumin och 20 mg aluminiumhydroxidgel injicerades intraperitonealt. Med början frán efterföljande dag injicerades surt proteas (uropepsin) intravenöst en gång per dygn under 14 dygn. På det 14:e dygnet injicerades ovalbumin intravenöst i en dos av 25 mg/kg för framkallande av bronkial- astma. Den sålunda framkallade trakealkontraktionen mättes enligt den metod som har beskrivits av Konzett och Rössler (Arch Exptl Path Pharmacol 195, 71, 1940). Man beräknade tra- kealkontraktionen i procent av trakealkontraktionen hos en kontrollgrupp, för vilken värdet 100% anges. De erhållna resul- taten är sammanställda i nedanstående tabell 1.

Tabell 1 Trakealkontraktion (%) Kontroll 100 Surt proteas (uropepsín), 0,05 mg/kg 72 Surt proteas (uropepsin), 47 0,5 mg/kg Surt proteas (uropepsín), 24 5 mg/kg Av resultaten framgår, att trakealkontraktionen hämma- des signifikant genom administrering av det sura proteaset.

Experiment 3. Hydrolys av immunkomplex. 15 mg av ett lösligt immunkomplex [human~IgG-kanin- -antí-human-IgG-antikropp] och 3 mg av antingen surt proteas (uropepsin), trypsin, a~chymotrypsín eller plasmin löstes i .-.-_-nn. 455 165 1 ml fosfatbuffertlösning (0,06 M; pH 6,0), och den erhållna lösningen inkuberades vid 37°C under 60 min. Reaktionen av- bröts genom tillsättning av 1 ml av en 20-procentig vatten- lösning av perklorsyra. Man mätte den överstàende vätskans absorption vid 280 nm för beräkning av hydrolysgraden. Samma procedur upprepades med användning av human-IgG i stället för immunkomplexet. Man beräknade förhållandet mellan den erhållna hydrolysgraden för immunkomplexet och hydrolysgraden för human-IgG. Resultaten är sammanställda L nedanstående tabell 2.

I jämförelse med de andra proteaserna så hydrolyserade det sura proteaset (uropepsinet) det lösliga immunkomplexet mera selektivt än normalt humant IgG.

Tabell 2 Relativ hydrolysgrad Hydrolysförhållande Human-IgG Immunkomplex (immunkomplex/ human-IgG) Surt proteas (uro- pepsin) 100 380 3,8 Trypsin 130 169 1,3 a-chymotrypsin 22 26 1,2 Plasmin 26 29 1,1 Experiment 4. Hydrolys av immunkomplex. 15 mg av ett lösligt immunkomplex [human-IgG-kanin- -anti-human-IgG-antikropp] och 0,3 mg surt proteas (uropepsin) eller trypsin löstes i 1 ml fosfatbuffertlösning (0,06 M; pH 6,0), och 250 pl av antingen råttserum eller samma fosfat- buffertlösning sattes till blandningen. Blandningen inkuberades därefter vid 37°C under 60 min. Efter avslutad reaktion mättes kvarvarande human-IgG enligt den enkla radialimmunodiffusions- metoden med användning av kanin-anti-human-IgG-serum för bestämning av förhållandet mellan hydrolyserat immunkomplex och ursprungligen inkuberat immunkomplex. Resultaten är samman- ställda i nedanstående tabell 3. 455 163_ Av resultaten framgår, att det sura proteasets (uro- pepsinets) hydrolytiska aktivitet gentemot immunkomplexet icke påverkas genom tillsättning av serum. Den hydrolytiska aktivi- teten av trypsin minskades däremot kraftigt genom tillsätt- ningen av serum.

Tabell 3 Hydrolysförhàllande (%) Frånvaro av Närvaro av serum serum Surt proteas (uropepsin) 35 35 Trypsin 19 2 Experiment 5. Hämmande verkan pá tyroidit.

Det sura proteasets (uropepsínets) hämmande verkan pà tyroidit undersöktes enligt den metod som har beskrivits av Kotani et al (Clinical Immunology, 9, 635, 1977). En grupp om tio hanråttor BFU/HDK (ålder sex veckor) underkastades tymektomi och exponerades för fyra upprepade röntgenbestràl- ningar om vardera 200 rad varannan' vecka. T4 veckor efter tymektomin avlivades råttorna. Sköldkörteln avlägsnades från varje råtta och inbäddades i ett paraffinblock. Efter färgning med hematoxylin-eosin eller med azan undersöktes graden av infiltration av mononukleära celler, förstöring av endoplasma- retikulum och glandulär fibros för uppskattning av allvarlig- hten av tyroiditen enligt en skala från 0 till 4. Det sura proteaset (uropepsinet) administrerades intravenöst en gång per dygn. Såsom kontroll administrerades ett inaktiverat surt pro- teas. Resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 4.

I jämförelse med kontrollvärdena visade sig det sura proteaset minska både uppträdandet och allvarligheten av tyroidit på ett dosberoende sätt. 'hz 455 163 10 Tabell 4 Uppträdande (%) Allvarlighet Kontroll 90 3,4 1 0,3 Surt proteas (uropepsin). 1 mg/kg 80 2,8 1 0,4 3 mg/kg 60 2,0 i 0,1* 10 mg/kg 40* 1,3 i 0,1** * p < 0,05, ** p < 0,01 Experiment 6. Hämmande verkan på immunkomplex-nefrit.

Man använde en grupp om 10 hanmöss C57BL. Dessa möss ínjícerades intravenöst tre gånger per dygn med 8 h mellanrum under totalt 3 dygn med human-IgG-kanin-anti-human-IgG-anti- kropp-komplex i en dos av 200 mg/kg. Under det fjärde dygnet avlivades djuren och njurarna avlägsnades. Avsättning av immun- komplexet i glomeruli observerades enligt metoden med fluorescerande antikroppar, varvid man använde get-anti-kanin- -IgG-antikroppar märkta med fluoresceinisotiocyanat. Vidare mättes halten immunkomplex i serumet enligt CLq-bindnings- metoden. Proteinhalten i urinen mättes medelst kommersiellt testpapper för de 34 möss, från vilka urin hade uppsamlats före avlivandet. Det sura proteaset (uropepsínet) administrerades intravenöst tre gånger per dygn med början omedelbart efter injiceríngen av immunkomplexet. Såsom kontroll gavs inaktiverat surt proteas. Resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 5.

Av försöksresultaten framgår, att halten ímmunkomplex i serum minskades, att förekomsten av proteinuri minskades och att avsättningen av immunkomplex i glomeruli minskades genom administreringen av det sura proteaset. 11 455 165 Tabell 5 Halt immun- Proteinuri (antal Avsättning av immun- komplex i positiva möss +/ komplex på glomerulus serum totala antalet (antal positiva möss/ (ug/ml) testade möss) totala antalet använ- da möss) Kontroll 156 1 18 7/ 8 10/10 Surt proteas (uropepsin) 0,3 mg/kg 128 1 9 5/ 7 8/10 1,0 mg/kg 88 1 12* 4/10 5/10* 3,0 mg/kg 53 1 7** 3/ 9* 2/10** T ; Möss med proteinuri av 3-e eller 4-e graden * ; p < 0,05, ** ; p < 0,01 Experiment 7. Hämmande verkan på Masugi-nefrit.

Enligt den metod som har beskrivits av Suzuki et al (Folia Pharmacologica Japonica, 68, 572 (1972) administrerades kanin~anti-råttnjureserum intravenöst till en grupp om 10 hanråttor av Wistar-stam i en dos av 5 ml/kg. Det sura protea- set (uropepsinet) administrerades intravenöst en gång per dygn efter administreringen av anti-njurserumet. Immunkomplexhalten i serumet och proteinhalten i urinen mättes varje vecka. Såsom kontroll gavs inaktiverat surt proteas. Resultaten visas i fig 2 och 3.

Hos de råttor som hade behandlats med det sura pro- teaset iakttogs en minskning av proteinhalten i urinen och en minskning av halten immunkomplex i serum.

Experiment B. Hämmande verkan på spontan lupus nefritis hos möss.

Man använde den metod som har beskrivits av Abe et al (The Ryumachi, 14, 43, 1974).

Man använde 16 honmöss (NZB x NZW)F1 med en ålder av 16 veckor såsom försöksdjur. Det sura proteaset (uropepsinet) injicerades intravenöst en gång per dygn i en dos av 10 mg/kg.

Såsom kontroll gavs inaktiverat surt proteas. Var fjärde vecka bestämdes proteínhalten i urinen medelst kommersiellt test- w 455 163 12 papper, varvid resultaten angavs enligt en skala från 0 till 4.

De erhållna resultaten visas i fig 4.

Sex möss ur varje grupp avlivades vid en ålder av 32 veckor, och man iakttog cellínfiltrationen i njurglomerulí.

Administrationen av det sura proteaset fortsattes till de kvarvarande mössen i varje grupp för bestämning av över- levnadsgraden vid en ålder av 50 veckor. Resultaten är samman- ställda i nedanstående tabell 6.

Tabell 6 Kontrollgrupp Grupp behandlad med surt proteas (uropepsin) Cellinfíltration Kraftig infiltration av små lymfocyter och plasmaceller Svag infiltration runt kärlväggen Överlevnadsgrad 20% 80%* * p < 0,05 Experiment 9. Hämmande verkan på kronisk aktiv hepatit.

I enlighet med den metod som har beskrivits av Mayer et al (British Journal of Experimental Pathology, 55, 498, 1974) injicerades humanlever-LSP (leverspecifikt membranlipoproteín) upprepade gånger tillsammans med Freunds fullständiga adjuvant till en grupp om 10 kaniner för framkallande av kronisk aktiv hepatit. Det sura proteaset (uropepsinet) administrerades intravenöst till kaninerna en gång per dygn under två veckor.

Två veckor efter framkallandet av hepatiten mättes GOT- och GPT~aktiviteterna i serum. Såsom kontroll gavs inaktiverat surt proteas. Resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 7.

Av försöksresultaten framgår, att det sura proteaset hämmade ökningen av GOT-aktiviteten och GPT-aktiviteten i serum pá ett dosberoende sätt. 455 163 13 Tabell 7 GOT-aktivitet GPT-aktivitet (enheter/ml) (enheter/ml) Kontroll 337,5 1 34,5 395,1 i 40,5 Surt proteas (uropepsin) 1 mg/kg 311,5 i 27,4 351,2 i 37,8 3 mg/kg 256,2 i 41,1 301,5 i 29,7 10 mg/kg 193,3 i 36,3** 245,7 1 31,4** ** p < 0,01 Experiment 10. Hämmande verkan pà artrit.

Man använde den försöksmetod som har beskrivits av Tsukada et al (The Ryumachi, 16, 255, 1976). Härvid injicerades 4 nd. av ett lösligt oxserumalbumin-(BSA)-kanin-anti-BSA-anti- kropp-komplex innehållande 2 mg antikropp-kväve i båda knä- lederna hos kaniner (10 djur per grupp) en gång per dygn under 6 dygn för framkallande av allergisk artrit. Det sura proteaset (uropepsinet) administrerades intraartikulärt en gång per dygn från och med första dagen av administreringen av BAS~anti-BAS- -antikropp-komplexet. Tio dygn efter den första administrerin- gen av komplexet avlivades kaninerna. Knälederna fixerades med formalin, färgades med hematoxylín-eosin och undersöktes mikroskopiskt. Såsom kontroll gavs inaktiverat surt proteas.

Försöksresultaten är sammanställda i nedanstående tabell 8.

I kontrollgruppen observerades hyperplasi av celler på knäleden, pannusbildning och cellinfiltration av lymfolid- follikler som är fria från germinalcentra. I den med surt proteas behandlade gruppen minskades däremot signifikant pan- nusbildning och cellinfiltration av lymfoidfollikler. 455 165 14 Tabell 8 Patohistologiska observationer Hyperplasi av Pannus- Cellinfiltration av celler på bildning lymfoidfollikler knäleden Kontroll 10/10 9/10 8/10 Surt proteas (uropepsin) 1 mg/kg 10/10 5/10 4/10 3 mg/kg 10/10 4/10* 2/10* 10 mg/kg 10/10 3/10** 2/10* Försöksvärdena anger antalet positiva djur/antalet använda djur * p < 0,05, ** p < 0,01 Experiment 11. Hydrolys av humanimmunkomplex.

Sera uppsamlades från patienter med reumatoid artrit, systemisk lupus erythematosus (SLE) och hepatit förorsakad av immunkomplex. 1 ml av varje serum inkuberades med 10, 30 eller 100 pg surt proteas (uropepsín) vid 37OC under 60 min. Halten av immunkomplex bestämdes därefter genom hemolytisk reaktion av röda blodceller från får med användning av komplement från marsvin med användning av aggregerat human-IgG såsom standard, varvid man tillämpade den metod som har beskrivits av Füst et al (Atherosclerosis, 29, 181, 1978). I sera från patienter med reumatoid artrit bestämdes dessutom reumatoidfaktorn (RA-fak- torn) genom hemagglutineringsreaktion (RAHA-test) enligt den metod som har beskrivits av Azuma et al (The Ryumachi, 12, 330, 1972). De erhållna resultaten är sammanställda i tabellerna 9 och 10.

Det sura proteaset minskade halten immunkomplex i dessa patienters serum på ett dosberoende sätt. Det sura proteaset minskade också halten RA-faktor hos patienterna med reumatoid artrit. 455 163. 15 Tabell 9 gygrolys av humant immunkomplex Sjukdom Serum Mängd tillsatt Immunkomplexhalt nr surt proteas (ng/ml) (uropepsin) (ng/ml) Reumatoid 1 0 75 artrit 10 63 30 52 100 <5O 2 0 234 10 180 30 151 100 120 3 0 103 10 84 30 63 100 <5O Systemisk 1 0 426 lupus 10 384 erythematosus 30 203 100 150 2 0 120 10 74 30 56 100 <5O 3 0 153 10 108 30 63 100 50 Hepatit 1 O 63 10 59 30 <5O 100 <5O 2 0 72 10 68 30 59 ; : 100 52 455 165 16 Tabell 10 Inverkan pà RA-faktorn Serum Mängd tillsatt surt Maximal utspädning för påvisande ' nr proteas (uropepsin) av positiv RAHA-reaktion (ng/ml) 1 0 2048 10 1024 30 256 100 32 2 0 512 10 128 30 64 100 64 3 0 1024 10 512 30 - 128 100 64 4 0 256 10 128 30 64 100 16 Experiment 12. Inverkan på tillväxten av odlade human- bröstkancerceller MX-1 och musleukemiceller L1210.

Humanbröstkancerceller MX-1 och musleukemiceller L121O suspenderades i en koncentration av vardera 105 celler per ml i Eagles medium innehållande 10% kalvserum samt provsubstans.

Cellerna odlades vid 37°C under 48 h och under en atmosfär innehållande 5% C02. Antalet livsduglíga celler räknades sedan efter färgning med tripan-blått. Graden av tillväxthämníng be- räknades enligt följande formel, och resultaten är samman- ställda i nedanstående tabell 11. antalet livsdugliga celler i behandlat prov Tillväxthämníng (%) = (1 - ) -100 antalet livsdugliga celler i kontrollprov 455 1es_ 17 Tabell 11 Provsubstans Koncentration (ng/ml) Tíllväxthämning (%) MX-1 L1210 Surt proteas (uropepsin) 30 15 8 100 33 21 300 55 30 Mitomycin C 100 47 62 Av resultaten framgår att det sura proteaset hämmade tumörcellerna tillväxt även vid låg koncentration.

I Exgeriment 13. Verkan på nakna möss bärande human- bröstcancerceller MX-1.

Ett kvadratiskt stycke med sidan 2 mm av humanbröst- kancer MX-1 transplanterades subkutant till en grupp om 5 nakna möss (BALB/C, nu/nu). Två veckor efter transplantationen inji- cerades surt proteas (uropepsín) intravenöst två gånger per dygn under 18 dygn. Tumören vägdes 32 dygn efter transplanta- tionen. Resultaten visas i nedanstående tabell 12. ' Tabell 12 Dos (mg/kg) Tumörvikt (g) Kontroll 1,32 1 0,09 Surt proteas (uropepsin) 0,3 0,79 1 0,2* 3,0 0,65 1 0,15* * p < 0,05 Det sura proteaset uppvisade således en signifikant antitumörverkan. 455 163 1 18 Experiment 14. Verkan på möss bärande leukemiceller P388. 105 leukemiceller P388 transplanterades intraperíto- nealt till en grupp om 5 hanmöss BDF1.

Surt proteas (uropepsin) injicerades intravenöst till mössen två gånger per dygn med början från dagen efter trans- plantationen. Injiceringen av det sura proteaset fortsattes till dess att djuren dog. Den genomsnittliga överlevnadstiden bestämdes och uttrycktes i procent av den genomsnittliga över- levnadstiden för djuren i kontrollgruppen. De erhållna resul- taten är sammanställda i nedanstående tabell 13. genomsnittlig överlevnadstid i dygn för djuren i den behand- lade gruppen Genomsnittlig överlevnadstid (%) = - 100 genomsnittlig överlevnadstid i dygn för djuren i kontroll- gruppen ß: Tabell 13 Dos (mg/kg) Genomsnittlig överlevnadstid (%) Kontroll 100 i 5 Surt proteas (uropepsin) 0,3 110 i 5 1,0 121 1 9 3,0 123 1 9* Mitomycin C 0,5 136 117 * p < 0,05 Av resultaten framgår att det sura proteaset klart ökade den genomsnittliga överlevnadstiden. 455 165. 19 Experiment 15. Akut giftighet.

Surt proteas (uropepsin) löst i fysiologisk saltlösning administrerades intravenöst eller intraperitonealt till en grupp om 10 hanmöss ddY med en vikt av 20 1 1 g i en dos av 2 g/kg. Mössen hölls under daglig observation i en vecka för pávisande av eventuella toxikologiska symptom. Inga tecken på giftighet observerades under denna tidsperiod.

Det enligt föreliggande uppfinning använda uropepsinet undertrycker produktionen av IgE-antikroppar och uppvisar en klar terapeutisk verkan gentemot bronkialastma, sàsom framgår av ovanstående försöksresultat. Vidare hämmar uropepsinet tyd- ligt uppkomsten och utvecklingen av' ett antal sjukdomar som antages framkallas av immunkomplex, t ex tyroidit och nefrít.

Dessutom uppvisar uropepsinet en kraftig antitumörverkan.

Den mängd uropepsin som erfordras för att erhålla dessa verkningar ligger inom ett tillräckligt säkert område sàsom framgår av resultatet av undersökningen av den akuta giftig- heten. Eftersom uropepsinet är ett protein av humant ursprung, är sannolikheten för att det skulle framkalla allvarliga biverkningar, sàsom anafylaktisk chock pá grund av antigeni- citet, ytterst liten. Uropepsinet antages därför utgöra ett mycket användbart terapeutiskt medel för behandling av aller- giska sjukdomar, sàsom bronkialastma, urtikaria, hösnuva, kontaktdermatit, livsmedelsallergi, läkemedelsallergi, aller- gisk rinit, överkänslighetspneumoni; olika immunkomplexsjuk- domar, såsom systemisk lupus erythematosus, glomerulonefrit med immunkomplex, periarteritis nodosa, reumatoid artrit, immun- komplexhepatit, tyroidit, serumsjuka, myasthenia gravis; och olika tumörsjukdomar, sàsom magkancer, lungkancer, lever- kancer, kolonkancer, bröstkancer, prostatakancer, livmoder- kancer, kancer i urinblåsan, leukemi, kancer i matstrupen, lymfom. Även om uropepsinet vanligen användes i form av en lösning för intravenös, subkutan, intramuskulär eller intra- artikulär injicering, kan det även användas i en form lämpad för oral administrering, i en form lämpad för inhalering eller i form av suppositorier för rektal administrering. Även om dygnsdosen av uropepsinet för en vuxen människa ligger inom intervallet 1-1 000 mg, företrädesvis 50-500 mg, kan denna dos 455 165 20 på lämpligt sätt ökas eller minskas beroende på symptomen och på administreringssättet.

Preparat avsedda för injicering kan vara lyofiliserade preparat, vilka löses omedelbart före administreringen, samt flytande preparat. Preparat för oral administrering kan vara kapslar, tabletter, granuler och pulver samt flytande orala preparat. Ett inhalationsläkemedel kan innefatta ett lyofili- serat preparat. För rektal administrering användes lämpligen suppositorier.

Av uropepsinet enligt föreliggande uppfinning kan man bereda ett terapeutiskt medel med användning av farmaceutiskt godtagbara bärare eller utdrygningsmedel enligt vilken som helst konventionell metod. Såsom exempel på lämpligen använda fasta bärare och utdrygníngsmedel kan man nämna vanliga ut- drygningsmedel, såsom laktos, mannitol, majsstärkelse och po- tatisstärkelse; bindemedel, såsom kristallin cellulosa, cellu- losaderivat, gummi arabikum, majsstärkelse och gelatin; desin- tegreringsmedel, såsom majsstärkelse, potatisstärkelse och kal- ciumkarbohydroximetylcellulosa; och smörjmedel, såsom talk och magnesiumstearat. Såsom exempel på lämpligen använda flytande bärare kan man nämna destillerat vatten för injektionsändamål, fysiologisk saltlösning, vegetabiliska oljor för injektions- ändamål och glykoler, såsom propylenglykol och polyetylen- glykol. ' Nedan anges exempel på typiska kompositioner inne- hållande uropepsin.

Komposition 1. 100 mg uropepsin löstes i 10 ml fysiologisk saltlös- ning. Den erhållna lösningen steriliserades genom filtrering genom ett membranfilter. 1 ml av fíltratet infördes i en i förväg steriliserad glasbehållare och lyofiliserades därefter.

Behållaren förseglades sedan, varvid man erhöll ett lyofili- serat pulverpreparat.

Komposition 2. 100 g lyofiliserat surt proteas (uropepsin), 97 g lak- tos och 3 g magnesíumstearat uppvägdes och blandades så att man erhöll en homogen blandning. 200 mg av den resulterande bland- ningen infördes i en gelatinkapsel nr 2, och kapseln belades med en enteral beläggning så att man erhöll en enteral kapsel. 455 165 21 Nedan anges ett icke begränsande exempel pá förfarandet för isolering och rening av det sura proteaset (uropepsinet).

Exemgel. 100 l humanurin koncentrerades till ca 1/1 000 av den ursprungliga volymen med användning av ett tryck-ultrafiltre- ríngsinstrument (Pe1licon(gí Millipore Co, och Diaflo(š, Amicon Co), varvid membranets cut-off-värde var 10 000 dalton. 100 ml av den koncentrerade urinen anbragtes på en kolonn (2,5 x 20 cm) av DEAE-cellulosa (Whatman Co), som hade bragts i jämvikt med 0,1 M acetatbuffert (pH 6,0). Man eluerade sedan med samma buffert innehållande 0,3 M natriumklorid. Eluatet koncentrera- des till en volym av ca 100 ml genom ultrafiltrering och under- kastades dialys. Den dialyserade lösnin en anbragtes på en ko- lonn (2,5 az 20 cm) av DEAE-Sepharose Q (Pharmacia Co), varpå man eluerade under samma betingelser som ovan har angivits. Den eluerade fraktionen koncentrerades till en volym av ca 10 ml, och koncentratet anbragtes à en gelfíltreringskolonn (2,5 x 90 cm) innehållande SephadexEš)G-100 för ytterligare rening och samtidigt avlägsnande av pyrogener. Ca 80 ml av den härvid erhållna lösningen surgjordes till pH 2 med saltsyra, varpå lösningen inkuberades vid 370C under 10 min. Därefter lyo- filiserades lösningen, varvid man erhöll ca 20 mg surt proteas (uropepsin).

Claims (5)

455 165 22 - P a t e n t k r a v

1. Uropepsin för användning som terapeutikum mot aller- giska sjukdomar, immunkomplexsjukdomar och tumörer, vilket uropepsin har följande egenskaper: (a) molekylvikt inom intervallet 32 000-38 000, bestämd genom gelkromatografi; (b) isoelektrisk punkt inom pH-intervallet 1-3, bestämd genom ísoelektrisk fokusering; (c) maximal absorption vid 278 nm; (d) utmärkt hydrolytisk aktivitet inom det sura pH-omrâdet (pH lägre än 7), när hemoglobin användes såsom substrat; (e) positiv reaktion för ninhydrin; (f) lösligt i vatten och olösligt i eter och kloroform; (g) hämmas av pepstatin; (h) stabilt inom det sura pH-området (pH lägre än 7) och instabilt inom det alkaliska pH-området (PH högre än 8).

2. Uropepsin enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det föreligger i form av en lösning avsedd för injicering.

3. _ Uropepsin enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det föreligger i form av ett preparat för oral admi- nistrering.

4. Uropepsín enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v atti det föreligger i form av ett supposítorium för rektal administrering.

5. Uropepsin enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det föreligger i form av ett ínhalationspreparat.