PL245254B1

PL245254B1 - Przeciwwirusowe zastosowanie preparatu

Info

Publication number: PL245254B1
Application number: PL439058A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof Lemke; Paulina Kowalczyk; Barbara KHAIDAKOV; Barbara Khaidakov; Mariusz Banach; Wojciech Cyplik
Original assignee: Aronpharma Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Aronpharma Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2024-06-10
Also published as: PL439058A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2 : 1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10 - 30% oraz polifenole 15 - 50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego, korzystnie przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat zawierający ekstrakty z owoców aronii (Aronia melanocarpa) oraz czarnego bzu (Sambucus nigra) do leczenia przeciwwirusowego, w szczególności przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.

Sambucus nigra jest rośliną bogatą w składniki o dużej aktywności biologicznej, przede wszystkim zawiera polifenole, takie jak flawonole, kwasy fenolowe, proantocyjanidyny i antocyjany, których obecność w dużej mierze odpowiada za działanie przeciwwirusowe owoców jagodowych (Anton et al., 2013; Sekizawa et al., 2013). Dotychczasowe dane przedkliniczne wskazują na istotne działanie przeciwwirusowe ekstraktu z czarnego bzu (Sambucus nigra L.). Efekt ten wykazano względem różnych szczepów wirusa grypy typu A (H3N2, H1N1, H3N2, H1N1, H5N1) i wirusa grypy typu B (Krawitz et al., 2011; Roschek et al., 2009; Zakay-Rones et al., 1995). Zawarte w jagodach S. nigra L. flawonoidy wiążą się z wirionami H1N1 poprzez wiązanie się do hemaglutyniny i po związaniu blokują zdolność wirusów do infekowania komórek gospodarza. Zidentyfikowano dwa związki odpowiedzialne za ten efekt: 5,7,3',4'-tetra-O-metylokwercetynę i 5,7-dihydroksy-4-okso-2-(3,4,5-trihydroksyfenylo)chroman-3-yl-3,4,5-trihydroksycykloheksanokarboksylan (Roschek et al., 2009). Również lektyny z bzu czarnego wiążą się do kwasów sialowych występujących na błonie komórkowej gospodarza zapobiegając tym samym przyłączeniu się wirusa do komórki (Zakay-Rones et al., 1995). Jednak dokładny mechanizm przeciwwirusowego działania owoców czarnego bzu oraz jego wyekstrahowanych związków aktywnych jest nadal przedmiotem badań. Sugeruje się, że działanie to może wynikać także z neutralizującego efektu względem neuraminidazy (Macdonald 2004; Swaminathan et al., 2013), umożliwiającej nowo namnożonym wirusom uwolnienie z komórki. Inny proponowany mechanizm to stymulacja układu odpornościowego (Barak et al., 2001). Na uwagę zasługuje fakt, że w zależności od frakcji możemy spodziewać się różnych efektów działania. W badaniach na myszach stwierdzono, że największy efekt przeciwwirusowy daje frakcja wysokocząsteczkowa, w skład której wchodzą polisacharydy. Podanie tej frakcji myszom zainfekowanym wirusem H1N1 powodowało obniżenie wiremii oraz podwyższenie poziomu przeciwciał neutralizujących w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i płucnych (Kinoshita et al., 2012). Działanie przeciwwirusowe bzu czarnego nie ogranicza się tylko do wirusów powodujących infekcję górnych dróg oddechowych. Udowodniono również, że czarny bez wykazuje silną aktywność przeciwko kociemu wirusowi niedoboru odporności (FIV), ponieważ hamuje tworzenie syncytiów, a poziom zahamowania zależy od stężenia ekstraktu (Uncini Manganelli et al., 2005). Wykazano także, że ekstrakt z czarnego bzu hamuje całkowicie replikację czterech szczepów wirusa HSV-1, w tym szczepów opornych na acyklowir. Działanie to jest niezależne od tego czy ekstrakt podawany był przed, w trakcie czy po adsorpcji wirusa do komórek (Morag A et al., 1997). Dalej stwierdzono również efekt przeciwko ptasiemu koronawirusowi. Postuluje się, że mechanizm tego działania związany jest z wiązaniem się lektyn czarnego bzu bezpośrednio do wirusa (Chen et al., 2014).

Badania kliniczne, również wykazały bezpieczny i terapeutyczny efekt ekstraktu z czarnego bzu w leczeniu grypy A i B, w porównaniu do grupy placebo (Zakay-Rones et al., 1995, 2004). Niezależne badania kliniczne potwierdziły pozytywny wpływ ekstraktu z czarnego bzu na przebieg infekcji wirusowej grypy typu A i B (Kong, 2009). W innym randomizowanym, podwójnie zaślepionym badaniu klinicznym ekstrakt z czarnego bzu znacząco zmniejszył objawy przeziębienia, czas trwania i nasilenie przeziębienia u osób podróżujących drogą powietrzną (Tiralongo et al., 2016). Wyniki tych badań zostały podsumowane w metaanalizie, gdzie stwierdzono, że standaryzowany ekstrakt z bzu czarnego skutecznie skraca całkowity czasu trwania i nasilenie objawów ze strony górnych dróg oddechowych w porównaniu z grupą placebo. Efekt suplementacji czarnego bzu jest większy w przypadku infekcji wirusem grypy niż zwykłego przeziębienia, ale suplementacja skutecznie zmniejsza objawy niezależnie od przyczyny (Hawkins, 2019).

Efekt immunomodulującego działania czarnego bzu jest szeroko dyskutowany w piśmiennictwie. Badania wskazują działanie immunostymulujące, poprzez zwiększenie produkcji w monocytach ludzkich cytokin takich jak IL-1 β, TNF-α, IL-6 oraz IL-8 w porównaniu do komórek stymulowanych LPS (Barak et al., 2001). Zwiększone wydzielanie TNF-α, IL-6, IL-8 zaobserwowano również w komórkach linii A-549 (komórki nabłonka pęcherzykowego płuc) w porównaniu do komórek stymulowanych LPS. Efekt immunostymulujący był niezawiązany z obecnością cyjanidyno-3-glukozydu, związku z grupy antocyjanów który jest uważany za główny składnik aktywny bzu czarnego (Torabian et al., 2019). W kolejnych badaniach wykazano również, że ekstrakt z czarnego bzu łagodzi reakcję zapalną w makrofagach aktywowanych LPS (linia RAW 264.7) poprzez zmniejszenie ekspresji genów prozapalnych (TNF-α, IL-6,

COX-2, iNOS) i hamowanie wzmożonej produkcji mediatorów zapalnych (TNF-α, IL-6, PGE2, NO) (Zielinska-Wasielica et al., 2019). Ekstrakt z bzu czarnego wykazał także dobrą skuteczność w usuwaniu wolnych rodników i zmniejszał tworzenie reaktywnych form tlenu zależnie od dawki w keratynocytach linii HaCaT napromieniowanych UVB. Znacząco zmniejszał również wydzielanie cytokin zapalnych poprzez hamowanie kinaz białkowych aktywowanych mitogenami / białka aktywatora 1 (MAPK / AP-1) i szlaków sygnałowych czynnika jądrowego kB (NF-kB) (Lin et al., 2019).

W przypadku owoców aronii (Aronia melanocarpa) również istnieją doniesienia wskazujące na j ej działanie przeciwwirusowe. Dotychczas wykazano, że w modelach in vitro sok z aronii wykazuje działanie przeciw różnym szczepom wirusa grypy, w tym na szczepy oporne na oseltamiwir. Dawka 0,125 mg//ml hamowała rozwój badanych szczepów o >60%. Podanie ekstraktu z aronii, jak również wyekstrahowanego kwasu elagowego i mirecytyny, zainfekowanym rekombinowanym wirusem grypy myszom spowodowało znaczący spadek śmiertelności u tych zwierząt. Autorzy pracy sugerują, że efekt działania aronii częściowo można wyjaśnić inaktywującym działaniem względem hemaglutyniny (Park et al., 2013). Na działanie przeciwwirusowe może również wskazywać fakt, że produkt złożony Bioaron C zawierający aronię, również wykazywał działanie przeciwwirusowe w stosunku do szerokiego spektrum wirusów odpowiedzialnych za infekcje górnych dróg oddechowych (Glatthaar-Saalmuller et al., 2015).

Owoce aronii wykazują działanie prozdrowotne dzięki dużej zwartości polifenoli w tym antocyjanów i pochodnych kwasu kawowego. Podanie ekstraktu z aronii szczurom u których za pomocą LPS wyindukowano zapalenie naczyniówki oka powodowało obniżenie liczby komórek zapalnych i spadek poziomu NO, PGE2 i TNF-α w cieczy wodnistej oka. W badaniu tym wykazano również, że ekstrakt z aronii hamuje indukowaną LPS ekspresję iNOS i COX-2 w komórkach RAW 264.7 (Ohgami et al., 2005). Dalsze badania wskazują, że koncentrat z aronii hamuje produkcję TNF-α, IL-6 i IL-8 w ludzkich monocytach stymulowanych LPS. Wykazano również, że ekstrakt ten hamuje aktywację NF-kB w pobudzonych makrofagach linii RAW 264.7 (Apple et al., 2015). Dalej stwierdzono działanie hamujące aktywację drogi klasycznej układu dopełniacza, oraz obniżenie produkcji tlenku azotu w makrofagach RAW 264.7 indukowanych LPS (Ho et al., 2014). Badania przeciwzapalnego działania aronii z wykorzystaniem pierwotnych komórek mysich splenocytów wykazały także, że ekstrakt z aronii hamuje wydzielanie IL-6 z tych komórek po stymulacji LPS, oraz zwiększa wydzielanie IL-10 w komórkach niestymulowanych (Martin et al., 2014).

Preparaty zawierające S. nigra (czarny bez) mogą dawać efekty niepożądane, szczególnie związane z zawartością glikozydu cyjanogennego który może mieć potencjalnie toksyczne działanie. Dodatkowo preparaty te mogą powodować niepożądane objawy ze strony przewodu pokarmowego takie jak nudności, biegunki, ból brzucha (Ulbricht et al., 2014). W związku z tym konieczna jest wysoka standaryzacja ekstraktu z bzu czarnego oraz stosowanie możliwie najniższych dawek efektywnych. Pomoże to w uzyskaniu wyższej aktywności biologicznej i zminimalizuje działania niepożądane.

Dotychczas na rynku nie występuje preparat złożony zawierający standaryzowane ekstrakty z bzu czarnego i aronii, o udowodnionym działaniu immunomodulującym i przeciwwirusowym. Dlatego też zasadne są działania zmierzające do otrzymania kombinacji ekstraktów z aronii i czarnego bzu w odpowiedniej standaryzacji. Działania te umożliwią zastosowanie mniejszej porcji do spożycia przy jednoczesnym utrzymaniu optymalnego stężenia pożądanych związków aktywnych zawartych w tych owocach, co przełoży się na lepszy efekt przeciwwirusowy.

Z publikacji wynalazku WO2009059218 A1 znany jest sposób leczenia co najmniej jednego objawu zespołu metabolicznego (korzystnie cukrzyca) u osobnika oraz dedykowanej kompozycji zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość środka modyfikującego zespół metaboliczny pochodzącego z jagody zawierającej ekstrakt bogaty w antocyjany (korzystnie bez albo aronia albo porzeczka); i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Z innej publikacji WO2005110404 A2 znany jest sposób zwiększania aktywności cytotoksycznej środka chemioterapeutycznego przeciw zaburzeniu nieprawidłowej proliferacji komórek u pacjenta, obejmujący podawanie skutecznej ilości tego środka chemioterapeutycznego w połączeniu ze skuteczną zwiększającą cytotoksyczność ilością ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze, sposób zmniejszania toksyczności środka chemioterapeutycznego w normalnych komórkach pacjenta poddawanego chemioterapii, obejmujący podawanie ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze przed, z lub po środku chemioterapeutycznym, a także sposób zwiększania indeksu terapeutycznego środka chemioterapeutycznego podawanego do leczenia nieprawidłowo namnażających się komórek, obejmujący podawanie ekstraktu jagodowego bogatego w przeciwutleniacze przed, z lub po środku

PL 245254 Β1 chemioterapeutycznym. Korzystnie wspomnianą nieprawidłową proliferacją komórek jest rak jelita grubego a wspomnianym środkiem chemioterapeutycznym jest 5-fluorouracyl. Natomiast wspomniany ekstrakt z jagód jest wybrany spośród ekstraktu z aronii, maliny, borówki, jeżyny, żurawiny, borówki czarnej, czarnej porzeczki, wiśni, czarnego bzu, winogron, kiwi, truskawki lub dowolnej ich kombinacji.

Zgłaszany preparat do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów oparty jest na mieszaninie ekstraktu z owocu bzu czarnego i ekstraktu z aronii, zawiera unikalne proporcje i standaryzacje, przez co wykazuje działanie przeciwwirusowe. Proporcje poszczególnych składników są dobrane w taki sposób, że powodują synergiczne działanie kompozycji w porównaniu do działania pojedynczych ekstraktów. Preparat według wynalazku, którego kompozycja oparta jest na mieszaninie ekstraktu z owocu bzu czarnego i ekstraktu z aronii wykazuje nowość i poziom wynalazczy w porównaniu do istniejącego stanu techniki.

Znana jest publikacja ”Fenactive - w jaki sposób aronia i czarny bez wspierają naszą odporność?”.... (strona zarchiwizowana dnia 13.12.2020 r.) - jednak w publikacji tej nie ma szczegółowych danych i wyników badań dotyczących działania mieszaniny, w tym synergistycznego działania ekstraktów z aronii i czarnego bzu, które są przedmiotem niniejszego wynalazku. Brakuje również danych używanych stężeń oraz szczegółów dotyczących metodologii czy wyników. Natomiast zgłoszony do ochrony preparat wyróżnia się przede wszystkim nowymi proporcjami składników, gdzie stosunek ekstraktów z bzu czarnego i aronii wynosi 2:1. To specyficzne dostosowanie proporcji ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych efektów przeciwwirusowych. Dodatkowo, preparat zawiera standaryzowane ilości związków polifenolowych, szczególnie antocyjanów, co decyduje o jego nowości i potencjale terapeutycznym.

Z abstraktu publikacji Badescu, O. Badulescu, L. Badescu, M. Ciocoiu „Effects of Sambucus nigra and Aronia melanocarpa extracts on immune system disorders within diabetes mellitus” (Pharma Biol. 2015 Apr; 53(4):533-9, abstract), znane są badania dotyczące właściwości biologicznych polifenoli ekstrahowanych z owoców aronii i bzu czarnego oraz ich wpływu na układ odpornościowy. Publikacja ta koncentrowała się na badaniu ekstraktów z bzu czarnego i aronii oddzielnie, a nie w ich połączeniu. To oznacza, że wyniki tych badań nie odzwierciedlają synergicznego działania mieszaniny ekstraktów, jak to ma miejsce w przypadku zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego. Ponadto, choć cukrzyca i choroby wirusowe mogą mieć pewne wspólne aspekty immunologiczne, ich patomechanizm i skutki są zazwyczaj różne, co oznacza, że wnioski dotyczące wpływu ekstraktów na układ odpornościowy w kontekście cukrzycy niekoniecznie można generalizować na leczenie chorób wirusowych. Zatem, mimo że publikacja ta jest cennym źródłem informacji na temat biologicznych właściwości ekstraktów z bzu czarnego i aronii, to jednak nie odzwierciedla ona synergicznego działania ich mieszaniny w kontekście przeciwwirusowego preparatu, jak również nie przekłada bezpośrednio się na specyficzne proporcje i standaryzację, które są kluczowe dla zgłoszonego wynalazku.

Z publikacji „Czarny bez-czy wzmocni odporność?” (https://pantabletka.pl/czarny-bez-odpornoscopinia/, 01.02.2020 r.), znane jest działanie przeciwwirusowe oraz immunostymulujące odporność bzu czarnego oraz aronii i ich ekstraktów. Publikacja ta rzeczywiście omawia korzyści zdrowotne czarnego bzu oraz przeprowadzone badania nad jego działaniem immunostymulacyjnym i przeciwwirusowym. W szczególności podkreśla ona aktywację zdrowego układu odpornościowego poprzez zwiększenie produkcji cytokin zapalnych, takich jak IL-6 i TNF-alfa, przez ekstrakty z czarnego bzu. Jednakże, choć te informacje są cenne i potwierdzają część efektów zdrowotnych zgłoszonego preparatu, to jednakże nie odzwierciedlają one całkowicie istoty i nowości samego wynalazku. Zgłoszony preparat, oparty na synergicznym połączeniu ekstraktów z bzu czarnego i aronii, jest bardziej skoncentrowany na wykorzystaniu specyficznych proporcji i synergii między składnikami w celu uzyskania skutecznej terapii przeciwwirusowej. Publikacja ta nie przekłada się bezpośrednio na unikalne proporcje i standaryzację, które są kluczowe dla zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego.

Z innej publikacji „Syropy na odporność dla dzieci - analiza i opinie” (http://pantabletka.pl/syropna-odpornosc-dziecko/. 21.02.2019 r.), znane są preparaty dla dzieci na bazie bzu czarnego. Publikacja ta dotyczy preparatów dla dzieci opartych na bzie czarnym. Mimo że może dostarczać informacji na temat popularności i szerokiego zastosowania bzu czarnego w suplementacji dla dzieci, to jednak nie analizuje specyficznych proporcji ekstraktów ani synergicznego działania z aronią, jak to ma miejsce w przypadku zgłoszonego preparatu przeciwwirusowego.

Celem wynalazku jest przeciwwirusowe zastosowanie preparatu, który zawiera ekstrakty z owoców aronii (Aronia melanocarpa) oraz czarnego bzu (Sambucus nigra).

Przedmiotem wynalazku jest preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2:1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.

Korzystnie reparat stosuje się doustnie.

Korzystnie preparat stosuje się jako suplement diety.

Określenie stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, ma następujące znaczenie:

Ekstrakt - oznacza określenie tożsame/zamienne z wyrażeniem „wyciąg”.

Kompozycja - oznacza określenie tożsame/zamiennie z wyrażeniem „preparat”.

Kompozycja według wynalazku - oznacza kompozycję/preparat o następującym składzie:

- mieszaninę ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa,

- gdzie mieszanina ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa zawiera antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%,

- stosunek ekstraktów z bzu i aronii w kompozycji wynosi 2:1.do 1:2.

- kompozycja zawiera farmaceutyczną zaróbkę lub rozcieńczalnik lub nośnik.

Opis rysunków:

Fig. 1 - przedstawia wpływ ekstraktów z aronii (A), czarnego bzu (B), oraz kompozycji według wynalazku (C) na replikację wirusa HCoV-OC43 w dawce 100 TCID50 (mediana z trzech niezależnych doświadczeń z trzema powtórzeniami, przedział ufności 95%). Wyniki testu mikroskopowego pokrywają się z wynikami testu immunoperoksydazowego. Wyniki zostały zanalizowane testem t Welcha za pomocą GraphPad Prism 9.1.0.

Fig. 2 - przedstawia wpływ kompozycji według wynalazku na wiązanie rekombinowanego białka hACE2 z domeną wiążącą receptor białka S wirusa SARS-CoV2 S (RBD) w kompetycyjnym teście ELISA.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia .

Przykład 1:

AKTYWNOŚĆ EKSTRAKTÓW Z OWOCÓW BZU CZARNEGO, ARONII ORAZ KOMPOZYCJI WEDŁUG WYNALAZKU WOBEC BETAKORONAWIRUSA HCoV-OC43

METODYKA BADAŃ

Badane ekstrakty

Standaryzowany wyciąg z owocu bzu czarnego (Sambucus nigra), standaryzowany wyciąg z aronii (Aronia melanocarpa) oraz kompozycja według wynalazku zawierająca standaryzowany wyciąg z aronii oraz standaryzowany wyciąg z owocu bzu czarnego. Wyjściowe stężenie ekstraktów, 10 mg/ml przygotowywano w 50% DMSO na świeżo przed każdym eksperymentem. Następnie, ekstrakty rozcieńczano w medium hodowlanym do odpowiednich stężeń. Końcowe stężenie DMSO w komórkach wynosiło < 5% (stężenie nietoksyczne dla komórek).

Linie komórkowe

Linia komórkowa raka okrężnicy HCT-8 [HRT-8] (ATCC® CCL-244™). Komórki hodowano w medium RPMI-1640 z dodatkiem 10% horse serum.

Wirus testowy

Ludzki wirus HCoV-OC43 (ATCC® VR-1558™ - betacoronavirus 1).

Ocena cytotoksyczności badanych preparatów

Cytotoksyczność badanych preparatów oceniano traktując 24 godzinne hodowle komórek linii HCT-8 wybranymi dawkami, rozpuszczonymi w płynie hodowlanym RPMI-1640 bez dodatku FBS (ekstrakt z aronii: 7,8-250 μg/ml, ekstrakt z czarnego bzu: 62,5-1000 μg/ml, kompozycja według wynalazku: 15,63-1000 μg/ml). Następnie hodowle inkubowano w inkubatorze 37°C, 5% CO2. Po 96 godzinach inkubacji wykonano kontrolne odczyty mikroskopowe zmian w morfologii komórek, wskazujących na cytotoksyczność (CTE, cytotoxic effect), w skali: 0 - brak cytotoksyczności; 1 - do 25%; 2 - 50%; 3 - 75%; 4 - 100% cytotoksyczność. Do badań wpływu preparatów na replikację wirusów wybrano 3 dawki dla każdego z preparatów, przy której żywotność komórek nie spada poniżej 75%.

Określenie wpływu preparatów na replikację betakoronavirusa 1

Wpływ preparatów na replikację wirusa oceniano w dawce 100 TCIDso/ml po wniknięciu wirusa do komórek (preinkubacja komórek z wirusami i późniejsza hodowla z badanym preparatem). 24-godzinną hodowlę komórek linii HCT-8 inkubowano z wirusem w płynie hodowlanym RPMI-1640, w inkubatorze 33°C, 5% CO2, przez 90 minut. Następnie dokładnie opłukano hodowlę z wirusów, po czym naniesiono wybrane dawki preparatów z zakresu:

• Ekstrakt z aronii: 7,8-31,25 μg/ml • Ekstrakt z bzu czarnego: 62,5-250 μg/ml • Kompozycja według wynalazku: 15,63-125 μg/ml przygotowanych w płynie hodowlanym RPMI bez dodatku FBS i inkubowano 96 godzin w inkubatorze 33°C 5% CO2. Po tym czasie odczytano miano wirusów pod mikroskopem.

Dodatkowo, wykonano również test immunoperoksydazowy w celu potwierdzenia odczytów mikroskopowych CPE wywołanych przez wirusa HCoV-OC43. Test ten pozwala wykryć nawet bardzo niskie miano wirusa HCoV-OC43, gdy nie jest widoczny typowy efekt cytopatyczny (CPE). Po 96 godz. inkubacji hodowli traktowanych preparatami i wirusem HCoV-OC43 wykonano barwienie z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciwko wirusowi HCoV-OC43 (mouse anti-coronavirus monoclonal antibodies) i przeciwciał drugorzędowych - goat anti-mouse IgG HRP. Następnie przeprowadzono reakcję barwną z użyciem DAB/H2O2 i obserwowano pod mikroskopem wybarwione na brązowo komórki zawierające wirusa HCoV-OC43.

Efekt wybarwienia przyporządkowano do skali 0-4, gdzie:

- brak wybarwienia

- poniżej 25% wybarwionych komórek

- od 25 do 50% wybarwionych komórek

- powyżej 50 do 75% wybarwionych komórek

- powyżej 75 do 100% wybarwionych komórek

WYNIKI

Wyznaczenie nietoksycznych stężeń ekstraktów z aronii, bzu czarnego oraz kompozycji według wynalazku

Zarówno w przypadku ekstraktu z aronii, czarnego bzu, jak i kompozycji według wynalazku % żywych komórek HCT-8 zmniejszał się wraz ze wzrostem stężenia preparatów. Do badań wpływu preparatów na replikację wirusa HCoV-OC43 wybrano stężenia przy których ilość żywych komórek w hodowli wynosiła co najmniej 80%.

Wpływ badanych preparatów na replikację wirusa HCoV-OC43

Zarówno ekstrakt z aronii jak i czarnego bzu w badanym zakresie stężeń nie wykazały działania przeciwwirusowego wobec wirusa HCoV-OC43. Z kolei kompozycja według wynalazku wykazała działanie przeciwwirusowe w stosunku do wirusa HCoV-OC43, hamując jego replikację po wniknięciu do komórek o ok. 50% (przy stężeniu 125 μg/ml) (Fig. 1).

Przykład 2:

OCENA HAMUJĄCEGO DZIAŁANIA KOMPOZYCJI WEDŁUG WYNALAZKU NA WIĄZANIE ACE2 i SARS-CoV2 RBD in vitro

METODYKA BADAŃ

Ocenę hamowania wiązania SARS-CoV2 RBD (domena wiążąca receptor) i hACE2 (ludzki enzym konwertujący angiotensynę 2) przeprowadzono przy użyciu zestawu COVID-19 Spike-ACE2 (CoVSACE2-1, RayBiotech Inc, https://www.raybiotech.com/covid-19-spike-ace2-wiążący-zestaw-testowy) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Kompozycja według wynalazku przygotowana była w trzech stężeniach (100, 1000, 2000 μg/ml), a potencjał inhibicyjny dla każdego stężenia oceniano w dwóch powtórzeniach. Analizowane ekstrakty zmieszano z rekombinowanym białkiem hACE2, dodano do płytki ELISA pokrytej rekombinowaną RBD białka S SARS-CoV2 i inkubowano przez noc w 4°C. Niezwiązane ACE2 usunięto przez płukanie, a wiązanie oceniano na podstawie reakcji przeciwciała anty-ACE2 sprzężonego z HRP (peroksydazą chrzanową) z 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyną (TMB). Absorbancję przy 450 nm mierzono czytnikiem PerkinElmer.

WYNIKI

Analiza testu wiązania ACE2-SARS CoV2 RBD in vitro wykazała zależny od stężenia hamujący wpływ kompozycji według wynalazku (Fig. 2).

Literatura:

Aksoy, B.A., Aksoy, P., Wyatt, M., Paulos, C.M., & Hammerbacher, J. (2018). PBMC isolation from buffy coat or whole blood PBMC cryopreservation. Protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/proto- cols.io.qu2dwye.

Anton, A.M., Pintea, A.M., Rugina, D.O., Scon(a, Z.M., Hanganu, D., Vlase, L., & Benedec, D. (2013). Preliminary studies on the chemical characterization and antioxidant capacity of polyphenols from Sambucus SP. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 8(3): 973-980.

Appel, K., Meiser, P., Millan, E., Collado, J.A., Rose, T., Gras, C.C., Carle, R., Munoz, E. (2015). Chokeberry (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot) concentrate inhibits NF-kB and synergizes with selenium to inhibit the release of pro-inflammatory mediators in macrophages. Fitoterapia, 105: 73-82.

Barak, V., Halperin, T., & Kalickman, I. (2001). The effect of Sambucol, a black elderberry-based natural product, on the production of human cytokines: I. Inflammatory cytokines. European Cytokine Network, 12(2): 290-296.

Bonarska-Kujawa, D., Pruchnik, H., Oszmiański, J., Sarapuk, J., & Kleszczyńska, H. (2011). Changes Caused by Fruit Extracts in the Lipid Phase of Biological and Model Membranes. Food Biophysics, 6(1): 58-67.

Chen, C., Zuckerman, D.M., Brantley, S., Sharpe, M., Childress, K., Hoiczyk, E., & Pendleton, A. R. (2014). Sambucus nigra extracts inhibit infectious bronchitis virus at an early point during replication. BMC Veterinary Research, 10(24).

Glatthaar-Saalmuller, B., Fal, A.M., Schonknecht, K., Conrad, F., Sievers, H., & Saalmuller, A. (2015). Antiviral activity of an aqueous extract derived from Aloe arborescens Mill, against a broad panel of viruses causing infections of the upper respiratory tract. Phytomedicine, 22(10): 911-920.

Hawkins, J., Baker, C., Cherry, L., Dunne, E. (2019). Black elderberry (Sambucus nigra) supplementation effectively treats upper respiratory symptoms: A metaanalysis of randomized, controlled clinical trials. Complement Ther Med., 42: 361-365.

Ho, G.T.T., Braunlich, M., Austarheim, I., Wangensteen, H., Malterud, K.E., Slimestad, R., & Barsett, H. (2014). Immunomodulating activity of Aronia melanocarpa polyphenols. Int J Mol Sci., 15(7): 11626-11636.

Kinoshita, E., Hayashi, K., Katayama, H., Hayashi, T., Obata, A. (2012). Anti-influenza virus effects of elderberry juice and its fractions. Biosci Biotechnol Biochem, 76(9): 1633-8.

Kong, F. (2009). Pilot clinical study on a proprietary elderberry extract: efcacy in addressing infuenza symptoms. J Pharmacol Pharmacokinet., 5: 32-43.

Krawitz, C., Mraheil, M.A., Stein, M., Imirzalioglu, C., Domann, E., Pleschka, S., & Hain, T. (2011). Inhibitory activity of a standardized elderberry liquid extract against clinically-relevant human respiratory bacterial pathogens and influenza A and B viruses. BMC Complement Altern Med., 11(1), 16.

doi.10.1186/1472-6882-11-16.

Lin, P., Hwang, E., Ngo, H.T.T., Seo, S.A., Yi, T.H. (2019). Sambucus nigra L. ameliorates UVBinduced photoaging and inflammatory response in human skin keratinocytes. Cytotechnology, 71(5): 1003-1017.

Macdonald, S.J., Watson, K.G., Cameron, R., Chalmers, D.K., Demaine, D.A., Fenton, R.J., Gower, D., Hamblin, J.N., Hamilton, S., Hart, G.J., Inglis, G.G., Jin, B., Jones, H.T., McConnell, D.B., Mason, A.M., Nguyen, V., Owens, I.J., Parry, N., Reece, P.A., Shanahan, S.E., Smith, D., Wu, W.Y., Tucker, S.P., (2004). Potent and long-acting dimeric inhibitors of influenza virus neuraminidase are effective at a onceweekly dosing regimen. Antimicrob. Agents Chemother., 48: 4542-4549.

Martin, D.A., Taheri, R., Brand, M.H., Draghi, A., Sylvester, F.A., Bolling, B.W. (2014). Anti-inflammatory activity of aronia berry extracts in murine splenocytes. J. Funct. Foods, 8: 68-75.

Morag, A., Mumeuoglu, M., Baybikov, T., Schelsinger, M., Zakay-Rones, Z. (1997) Inhibition of sensitive and acyclovir-resistant HSV-1 strains by an elderberry extract in vitro. J Z Phytother., 25: 97-98.

Ohgami, K., Ilieva, I., Shiratori, K., Koyama, Y., Jin, XH., Yoshida, K., Kase, S., Kitaichi, N., Suzuki, Y., Tanaka, T., Ohno, S. (2005). Anti-inflammatory effects of aronia extract on rat endotoxin-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci., 46(1): 275-281.

Park, S., Kim, J. I., Lee, I., Lee, S., Hwang, M.W., Bae, J.Y., Heo, J., Kim, D., Han, S.Z., & Park, M.S. (2013). Aronia melanocarpa and its components demonstrate antiviral activity against influenza viruses. Biochem Biophys Res Commun., 440(1): 14-19.

Roschek, B., Fink, R.C., McMichael, M.D., Li, D., & Alberte, R.S. (2009). Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro. Phytochemistry, 70(10): 1255-1261.

Sekizawa, H., Ikuta, K., Mizuta, K., Takechi, S., & Suzutani, T. (2013). Relationship between polyphenol content and anti-influenza viral effects of berries. J Sci Food Agric., 93(9): 2239-2241.

Swaminathan, K., Dyason, J.C., Maggioni, A., von Itzstein, M., Downard, K.M. (2013). Binding of a natural anthocyanin inhibitor to influenza neuraminidase by mass spectrometry. Anal Bioanal Chem., 405(20): 6563-6572.

Tiralongo, E., Wee, S.S., & Lea, R.A. (2016). Elderberry supplementation reduces cold duration and symptoms in air-travellers: A randomized, double-blind placebocontrolled clinical trial. Nutrients, 8(4), 182. doi.10.3390/nu8040182.

Torabian, G., Valtchev, P., Adil, Q., & Dehghani, F. (2019). Anti-influenza activity of elderberry (Sambucus nigra). Journal of Functional Foods, 54: 353-360.

Ulbricht, C., Basch, E., Cheung, L., Goldberg, H., Hammerness, P., Isaac, R., Khalsa, K.P.S., Romm, A., Rychlik, I., Varghese, M., Weissner, W., Windsor, R.C., & Wortley, J. (2014). An evidencebased systematic review of elderberry and elderflower (Sambucus nigra) by the natural standard research collaboration. J Diet Suppl., 11(1): 80-120.

Uncini M., R.E., Zaccaro, L., & Tomei, P.E. (2005). Antiviral activity in vitro of Urtica dioica L., Parietaria diffusa M. et K. and Sambucus nigra L. J Ethnopharmacol., 98(3): 323-327.

Zakay-Rones Z., Varsano, N., Zlotnik. M., Manor, O., Regev, L., Schlesinger, M., & Mumcuoglu, M. (1995). Inhibition of Several Strains of Influenza Virus in Vitro and Reduction of Symptoms by an Elderberry Extract (Sambucus nigra L.) during an Outbreak of Influenza B Panama. J Altern Complement Med., (4): 361-369.

Claims

1. Preparat stanowiący mieszaninę w stosunku 2:1 ekstraktu z owocu bzu czarnego Sambucus nigra oraz ekstraktu z aronii Aronia melanocarpa, zawierający antocyjany 10-30% oraz polifenole 15-50%, do zastosowania do leczenia przeciwwirusowego przeciw ludzkiemu wirusowi z grupy koronawirusów.

2. Preparat do zastosowania według zastrz. 1, znamiennym tym, że preparat stosuje się doustnie.

3. Preparat do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jako suplement diety.