BRPI0808418A2 - Predição de resposta a um inibidor de her - Google Patents

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BRPI0808418A2
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Merrill Birkner
Chin-Yu Lin
Joachim Moecks
Andreas Strauss
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREDIÇÃO DE RESPOSTA A UM INIBIDOR DE HER".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao uso de HER3 baixo como um critério de seleção para tratar pacientes com câncer, tais como pacientes com câncer ovariano, com um inibidor de HER1 tal como pertuzumab.
A invenção refere-se também ao uso de uma proporção elevada entre HER2:HER3 como um critério de seleção para tratar pacientes com câncer, tais como pacientes com câncer ovariano, com um inibidor de HER, tal como pertuzumab.
Além disso, a invenção refere-se ao uso de HER3 elevado como um critério de seleção para tratar pacientes com câncer com um agente quimioterápico, por exemplo, gencitabina.
Antecedentes da Invenção
Receptores de HER e Anticorpos Contra Receptores de HER
A família HER de receptores de tirosina quinases são mediadores importantes de crescimento, diferenciação e sobrevivência celulares. A família de receptores inclui quatro membros distintos, incluindo o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbBI ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185"eu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2).
EGFR, codificado pelo gene enbB1, tem sido implicado como causador de malignidade humana. Em particular, a expressão aumentada de EGFR tem sido observada em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago assim como em glioblastomas. A expressão aumentada do receptor de EGFR está geralmente associada com a produção aumentada do Iigante de EGFR, que transforma o fator de crescimento alfa (TGFa), pelas mesmas células tumorais que resultam na ativação do receptor por uma via estimulatória autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Anticorpos monoclonais dirigidos contra EGFR ou seus ligantes, TGF-α e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignídades. Vide, por exemplo, Baselga and Mendelsohn, supra; Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984): e Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995).
O segundo membro da família HER, p185neu, foi identificado originalmente como o produto do gene transformado de neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. A forma ativa do proto-oncogene neu resulta 5 de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na região transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada nos cânceres de mama e ovário e correlaciona-se com um diagnóstico sombrio (Slamon et al, Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al, Science, 244:707-712 (1989); e Patente US N0 4.968.603). Até agora, ne10 nhuma mutação pontual como aquela do proto-oncogene neu foi descrita em tumores humanos. A superexpressão de HER2 (frequentemente mas não uniformemente devida à amplificação do gene) também foi obseivada em outros carcinomas, incluindo carcinomas de estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, colon, tireoide, pâncreas e bexiga. Vide, entre ou15 tros, King et al, Science, 229:974 (1985); Yokota et al, Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige et al, Mol Cell BioL, 6:955-958 (1986); Guerin et al, Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al, Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al. , Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al, GynecoL Oncol., 38:364
(1990); Weiner et al, Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al, Cancer 20 Res., 50:5184 (1990); Park et al, Caneer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al, Mol. Carcinog, 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); e McCann et al, Câncer, 65:88-92 (1990). HER2 pode estar superexpresso no câncer de próstata. (Gu et al. Caneer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al. Hum. PathoL 28:827- 25 33 (1997); Ross et al. Cancer 79:2162-70 (1997); e Sadasivan et al. J. Urol. 150:126-31 (1993)).
Anticorpos dirigidos contra p185neu de rato e produtos da proteína HER2 humana foram descritos.
Drebin e colaboradores construíram anticorpos contra o produto do gene neu de rato, p185neiJ. Vide, por exemplo, Drebin et al., Cell 41:695- 706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); e W094/22478. Drebin et al., Oncoqene 2:273-277 (1988) relataram que misturas de anticorpos reativos com duas regiões distintas de ρΐβδ0®0 resultam em efeitos antitumor sinérgicos sobre células NIH-3T3 transformadas com neu implantadas em camundongos nus. Vide também a Patente U.S. 5.824.311, emitida em 20 de outubro de 1998.
Hudziak et al., Moi Cell. Bioi 9(3):1165-1172(1989) descrevem
a geração de um painel de anticorpos contra HER2 que foram caracterizados usando a linhagem SK-BR-3 de tumor de mama humano. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 após a exposição aos anticorpos foi determinada pela coloração com cristal violeta das monocamadas após 72 ho10 ras. Usando esse ensaio, a inibição máxima foi obtida com o anticorpo chamado de 4D5, que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação em uma extensão menor nesse ensaio. O anticorpo 4D5 foi observado ainda sensibilizar as linhagens celulares de tumor de mama que superexpressam HER2 aos efeitos citotóxicos de TNF-a. 15 Vide também a Patente U.S. N0 5.677.171, emitida em 14 de outubro de 1997. Os anticorpos contra HER2 discutidos por Hudziak et al. foram posteriormente caracterizados por Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558
(1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation
1 :72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11 (3): 117-127 (1991); Ku
mar et al. Moi Cell. BioL 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al J. Bioi Chem. 269(20):14661- 14665 (1994); Scott et al J. Bioi Chem. 266:14300-5
(1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci 91 :7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); e Schaefer et al. Oncogene
15:1385-1394 (1997).
Uma versão recombinante humanizada do anticorpo 4D5 de HER2 de murino (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab ou HERCEPTIN®; Patente U.S. N0 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientes com cânceres de mama metastáticos que superexpressam HER2 que receberam intensa terapia anticâncer anterior (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744
(1996)). Trastuzumab recebeu aprovação para comercialização da Food and Drug Administration em 25 de setembro de 1998, para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores superexpressam a proteína HER2.
Outros anticorpos contra HER2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al Int. J.
Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Caneer Res. 51 :5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695
(1991); Bacus et al. Caneer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research
52:2771-2776 (1992);Hancock et al. Cancer Res. 51 :4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167
(1992); Patente U.S. N0 5.783.186; e Klapper et al Oneogene 14:2099-2109 (1997).
O rastreamento de homologia resultou na identificação de outros membros da família do receptor HER: HER3 (Patentes US N°s 5.183.884 e 5.480.968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193- 9197 (1989)) e HER4 (Pedido de Patente EP N0 599.274; Plowman et al, Proe. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al, Nature, 366:473-475
(1993)). Ambos os receptores exibem expressão aumentada em pelo menos algumas linhagens de câncer de mama.
Os receptores de HER são geralmente encontrados nas células em várias combinações e a heterodimerização é considerada aumentar a 25 diversidade de respostas celulares a uma variedade de Iigantes de HER (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). EGFR está ligado a seis Iigantes diferentes: fator de crescimento epidérmico (EGF), fator alfa de transformação do crescimento (TGF-α), anfirregulina. fator de crescimento epidérmico que se liga à heparina (HB-EGF), beta30 celulina e epiregulina (Groenen et ai, Growth Factors 11:235-257 (1994)). Uma família de proteínas heregulinas, que resultam do splícing alternativo de um único qene, é Iiqante de HER3 e HER4. A família herequlina inclui alfa. beta e gama heregulinas (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Patente U.S. N0 5.641.869; e Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)); fatores de diferenciação de neu (NDFs), fatores de crescimento da glia (GGFs); indutor da atividade do receptor de acetilcolina (ARIA); e fator 5 derivado do neurônio sensitivo e motor (SMDF). Para uma revisão, vide Groenen et al. Growth Factors 11 :235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) e Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recentemente, três Iigantes adicionais de HER foram identificados: neuregulina-2 (NRG-2) que foi descrito se ligar tanto a HER3 quanto a HER4 (Chang 10 et al., Nature 387:509-512 (1997); e Carraway et al., Nature 387:512-516
(1997)); neuregulina-3 que se liga a HER4 (Zhang et al., PNAS (USA)94(18):9562-7 (1997)); e neuregulina-4 que se liga a HER4 (Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)). HB-EGF, beta-celulina e epiregulina também se ligam a HER4.
Embora EGF e TGFa não se liguem a HER2, EGF estimula EG
FR e HER2 a formar um heterodímero, que ativa EGFR e resulta na transfosforilação de HER2 no heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parecem ativar a tirosina quinase HER2. Vide Earp et al., supra. Igualmente, quando HER3 é coexpressa com HER2, um complexo de sinalização ativa é 20 formado e os anticorpos dirigidos contra HER2 são capazes de romper esse complexo (Sliwkowski et al., J.Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). Além disso, a afinidade de HER3 por heregulina (HRG) é aumentada para um estado de maior afinidade quando coexpressa com HER2. Vide também Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., 25 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al, Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) com relação ao complexo de proteína de HER2-HER3. HER4, como HER3, forma um complexo ativo de sinalização com HER2 (Carraway e Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).
As publicações de patentes relacionadas com anticorpos HER incluem: US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 5.725.856, US 5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063, US2002/019221 1A1. US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603. US 5,821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US2004/0236078A1, US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US 6.821.515, W098/17797, US 6.127.526, US 6.333.398, US 6.797.814, US 6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, W099/31140, US2003/0147884A1, 5 US2003/0170234Α1, US2005/0002928A1, US 6.573.043, US2003/0152987Α1, W099/48527, US2002/0141993A1, W001/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, W000/69460, W001 /00238, W001/15730, US 6.627.196Β1, US6.632.979B1, W001/00244, US2002/0090662A1, W001/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, 10 WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, W003/087131, US2003/0228663, W02004/008099A2, US2004/0106161, W02004/048525, US2004/0258685A1, US 5.985.553, US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401.638, US 5.604.107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412.116 Β1, EP 494.135 BI, US 5.824.311, EP 444.181 BI, EP 1.006.194 15 Α2, US 2002/0155527Α1, WO 91/02062, US 5.571.894, US 5.939.531, EP 502.812 Β1, WO 93/03741, EP 554.441 BI, EP 656.367 Al, US 5.288,477, US 5.514.554, US 5.587.458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486, US 6.028.059, WO 96/07321, US 5.804.396, US 5.846.749, EP 711.565, WO 20 96/16673, US 5.783.404, US 5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271, US 6.270.765, US 6.395.272, US 5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186, US 6.458.356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6.214.388, US 5.925.519, WO 98/02463, US 5.922.845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 BI, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 25 01/20033, US 2002/0076695 Al, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, W002/05791, WO 02/11677, US 6.582.919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530Α1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6.602.670 Β2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 30 02/087619, WO 03/006509, W003/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5.705.157, US 6.123.939. EP 616.812 BI. US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 BI, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6.333.348 BI, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al, US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al, WO 01/87334, 5 W002/05791 ,W002/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 e WO 03/86467.
Diagnóstico
Pacientes tratados com o anticorpo HER2 trastuzumab são selecionados para a terapia baseado na superexpressão/amplificação. Vide, por 10 exemplo, W099/31140 (Paton et al), US2003/0170234A1 (Hellmann, S.), e US2003/0147884 (Paton et al.)] assim como W001/89566, US2002/0064785, e US2003/0134344 (Mass et al). Vide também US2003/0152987, Cohen et al, em relação à imuno-histoquímica (IHC) e hibridização por fluorescência in situ (FISH) para detectar a superexpressão 15 e amplificação de HER2.
W02004/053497 e US2004/024815A1 (Bacus et al), assim como US 2003/0190689 (Crosby e Smith), referem-se à resposta determinada ou predita à terapia por trastuzumab. US2004/013297A1 (Bacus et al.) refere-se à resposta determinada ou predita à terapia com o anticorpo ABX0303 EG20 FR. W02004/000094 (Bacus et al.) está direcionada a resposta determinada a GW572016, uma molécula pequena, inibidor da tirosina quinase EGFRHER2. W02004/063709, Amler et al, refere-se a biomarcadores e métodos para determinar a sensibilidade ao inibidor de EGFR, erlotinib HCI. US2004/0209290, Cobleigh et al., refere-se a marcadores de expressão de 25 gene para o prognóstico de câncer de mama.
Pacientes tratados com pertuzumab podem ser selecionados para a terapia baseado na ativação ou dimerização de HER2. Publicações de Patente que referem-se à pertuzumab e a seleção de pacientes para terapia com o mesmo incluem: W001/00245 (Adams et al); US2003/0086924 30 (Sliwkowski, M.); US2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.); assim como W02004/008099A2, e US2004/0106161 (Bossenmaier et al).
Cronin et al., Am. J. Path. 164:( 1 ):35-42 (2004) descrevem a medida da expressão de gene em tecidos arquivados embebidos em parafl· na. Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004) descrevem a definição do perfil de gene para microarranjos de oligonucleotídeo de gene usando RNA isolado de seções de tecido de tumor retiradas de biópsias primárias arquivadas.
5 Pertuzumab (também conhecido como anticorpo monoclonal
humano recombinante 2C4; OMNITARG®, Genentech1 Inc., South San Francisco) representa o primeiro de uma nova classe de agentes conhecida como inibidores da dimerização de HER (HDI) e funciona inibindo a habilidade de HER2 de formar heterodímeros ativos com outros receptores de HER 10 (tais como EGFR/HER1, HER3 e HER4) e é ativo independentemente dos níveis de expressão de HER2. Vide, por exemplo, Harari e Yarden, Oncogene 19:6102-14 (2000; Yarden e Sliwkowski Nat Rev Mol Cell Biol, 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Streut Biol 10:158-9 (2003); Cho, et al., Nature 421 :756-60 (2003); e Malik, et ai Pro Am Soe Caneer Res 44:176-7 (2003).
O bloqueio por pertuzumab da formação de heterodímeros de
HER2-HER3 em células tumorais foi demonstrado inibir a sinalização celular crítica, o que resulta em proliferação tumoral reduzida e sobrevivência (Agus et ai, Caneer Cell 2:127-37 (2002)).
Pertuzumab foi submetido a testes como agente único na clínica com um teste fase Ia em pacientes com cânceres avançados e testes fase Il em pacientes com câncer ovariano e câncer de mama assim como câncer de pulmão e próstata. No estudo da Fase I, pacientes com tumores sólidos incuráveis, localmente avançados, recorrentes ou metastáticos que progrediram durante ou após a terapia padronizada, foram tratados com pertuzumab administrado intravenosamente a cada 3 semanas. Pertuzumab foi geralmente bem tolerado. A regressão do tumor foi obtida em 3 dos 20 pacientes avaliáveis para a resposta. Dois pacientes tiveram respostas parciais confirmadas. Doença estável com duração de mais do que 2,5 meses foi observada em 6 de 21 pacientes (Agus et al., Pro. Am. Soe. Clin. Oneoi 22:192 (2003)). Em doses de 2,0 a 15 mg/kg, a farmacocinética de pertuzumab foi linear e a depuração média variou entre 2,69 a 3,74 ml/dia/kg e a meia-vída média da eliminação final variou entre 15,3 a 27,6 dias. Anticorpos para pertuzumab não foram detectados (Allison et al., Pro. Am. Soe. Clin. OncoL 22:197 (2003)).
Sergina et al., relataram que o marcador biológico com o qual avalia-se a eficácia dos inibidores de HER tirosina quinase (TKIs) poderia 5 ser a transfosforilação ao invés da autofosforilação de HER3. Sergina et al., Nature 445(7126):437-441 (2007).
Jazaeri et al., avaliaram os perfis de expressão de gene associados com a resposta à quimioterapia em cânceres do epitélio ovariano. Jazaeri et al., Clin. Cancer Res. 11(17):6300-6310 (2005).
Tanner et al. relatam que HER3 prediz a sobrevivência no cân
cer ovariano. Tanner et al. J. Clin. Oncol. 24(26):4317-4323 (2006).
Sumário da Invenção
Esse pedido refere-se, pelo menos em parte, à surpreendente observação de que pacientes com câncer (por exemplo, pacientes com cân15 cer ovariano), cujo câncer expressa HER3 em um nível baixo, respondem melhor a testes clínicos em seres humanos a um inibidor da dimerização de HER do que aqueles pacientes cujo câncer expressa HER3 em um nível elevado. Geralmente, tais pacientes têm uma proporção de HER2:HER3 elevada (devida ao baixo nível de HER3),avaliando assim que os níveis relati20 vos de ambas, HER2 e HER3, fornecem um meio adicional ou alternativo para selecionar pacientes para a terapia com um inibidor da dimerização de HER.
Assim, a invenção refere-se, em um primeiro aspecto, a um método para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de respon25 der a um inibidor de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de HER ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível mais baixo do que o nível mediano de expressão de HER3 nesse tipo de câncer. Exemplos de inibidores de HER contemplados incluem anticorpos para HER ou inibidores de moléculas pe30 quenas; anticorpos para HER ou inibidores de molécula pequena; inibidores de tirosina quinase que incluem mas não se limitam a lapatinibe, Tykerb, etc. O mais preferivelmente, o inibidor de HER é um inibidor da dimerização de HER. Consequentemente, a invenção fornece um método para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da dimerização de HER ao paciente, em que 5 o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER no câncer.
De acordo com essa modalidade, preferivelmente, o câncer do paciente expressa HER3 em um nível que é menor do que o 25° percentil da expressão de HER3 no tipo de câncer. Opcionalmente, tal câncer do pacien10 te expressa HER2.HER3 em um nível maior do que o 25° percentil, preferivelmente maior do que o nível mediano e o mais preferivelmente maior do que o 75° percentil da expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer. O ensaio preferido para medir a expressão de HER3 (e HER2) compreende a reação em cadeia de polimerase (PCR), mais preferivelmente a reação em 15 cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
Preferivelmente, o inibidor da dimerização de HER é um anticorpo, mais preferivelmente um anticorpo HER2, tal como pertuzumab.
Preferivelmente, o tipo de câncer a ser tratado ou diagnosticado aqui é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer peri20 toneal, câncer da trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal. Mais preferivelmente, o tipo de câncer tratado ou diagnosticado aqui é o câncer ovariano, câncer peritoneal ou câncer da trompa falopiana. O tipo de câncer pode ser resistente à quimioterapia, resistente a pla25 tina, avançado, refratário e/ou recorrente. O método pode prolongar a sobrevida, incluindo a sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS) do paciente.
O inibidor de HER pode ser administrado como um único agente antitumor ou pode ser combinado com uma ou mais outras terapias. Em uma modalidade, o inibidor de HER é administrado com um ou mais agentes quimioterápicos, tais como gencitabina, carboplatina, paclitaxel, topotecano e doxorrubicina Iipossomal e preferivelmente um antimetabólito. tal como gencitabina. O inibidor de HER também pode ser combinado com trastuzumab, erlotinib ou bevacizumab.
Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pertuzumab ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa de Falópio.
A invenção refere-se ainda a um método para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER (por exemplo, um inibidor da dimerização de HER) compreendendo determinar a expressão de HER em uma amostra do câncer do paciente e selecionar um inibidor de HER (por exemplo, um inibidor da dimerização de HER) como terapia se a amostra do câncer expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
Além disso, a invenção fornece um artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica que compreende um inibidor da dimerização de HER em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o inibidor ou composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a fabricação de um inibidor da dimerização de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo compreendendo a combinação, em uma embalagem, do inibidor ou composição farmacêutica e um selo indicando que o inibidor ou composição farmacêutica é indicado(a) para o tratamento de um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível inferior ao nível médio de expressão HER3 no tipo de câncer. Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para anunciar um inibidor da dimerização de HER ou uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo oferecer, para um públicoalvo, o uso do inibidor de dimerização de HER ou uma composição farma5 cêutica do mesmo para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer, onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
À parte das invenções acima, dados clínicos humanos fornecidos aqui demonstraram que pacientes com câncer (por exemplo, pacientes com câncer ovariano) cujo câncer expressa HER3 em um nível elevado, tem uma resposta clínica melhor a um agente terapêutico, tal como gencitabina, do que aqueles pacientes cujo câncer expressa HER3 em um nível baixo.
Com relação a esse aspecto adicional da invenção, a invenção fornece um método para selecionar uma terapia para um paciente com um 15 tipo de câncer que é capaz de responder a um agente quimioterápico compreendendo determinar a expressão de HER3 na amostra do câncer do paciente e selecionar um agente quimioterápico como a terapia, se a amostra do câncer expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer. Preferivelmente, o tipo de câncer é 20 ovariano, peritoneal ou câncer da trompa falopiana, incluindo câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana resistente à platina, assim como câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente. Preferivelmente, o agente quimioterápico selecionado é um antimetabólito, tal como gencitabina.
A invenção também diz respeito a um método para tratar um pa25 ciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um agente quimioterápico, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer. Preferivelmente, o câncer do paciente expressa 30 HER3 em um nível maior do que o 25° percentil da expressão de HER3 no tipo de câncer. O ensaio preferido para medir a expressão de HER3 compreende a reação em cadeia de polimerase (PCR), mais preferivelmente a reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
Preferivelmente, o agente quimioterápico é um antimetabóIito1 mais preferivelmente gencitabina.
Preferivelmente, o tipo de câncer a ser tratado ou diagnosticado 5 de acordo com esse aspecto adicional da invenção é o câncer ovariano, câncer peritoneal ou câncer da trompa falopiana. O tipo de câncer pode ser resistente à quimioterapia, resistente à platina, avançado, refratário e/ou recorrente. O método pode prolongar a sobrevivência, incluindo a sobrevida livre de progressão (PFS) e a sobrevida global (OS) do paciente.
Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método
para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de gencitabina ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
A invenção também fornece um artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica que compreende um agente quimioterápico (tal como gencitabina) em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o agente quimioterápico 20 ou composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente com um tipo de câncer, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
Em ainda um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para produzir um agente quimioterápico (tal como gencitabina) ou uma 25 composição farmacêutica do mesmo compreendendo combinar em uma embalagem o agente quimioterápico ou composição farmacêutica e um selo determinando que o agente quimioterápico ou composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente com um tipo de câncer, no qual o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da 30 expressão de HER3 no tipo de câncer.
Em outra modalidade ainda, a invenção fornece um método para anunciar um agente quimioterápico ou sua composição farmaceuticamente aceitável, compreendendo promover, para um público-alvo, o uso do agente quimioterápico ou da sua composição farmacêutica para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer, onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
O presente pedido fornece dados clínicos de seres humanos demonstrando que pacientes com expressão alta de HER2:HER3 respondem mais favoravelmente a um inibidor de HER, tal como pertuzumab. Assim, a invenção fornece, em outro aspecto, um meio para selecionar pacien10 tes pela avaliação dos níveis de expressão de HER2 e HER3 e para excluir da terapia aqueles pacientes cujo câncer expressa HER2:HER3 em um nível baixo.
Assim, a invenção também refere-se a um método para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor 15 de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de HER a um paciente, em que o câncer do paciente expressa HER2.HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer. Preferivelmente, o câncer do paciente expressa HER2.HER3 em um nível que é maior do que a média e, o 20 mais preferivelmente, maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
Além disso, é fornecido um método para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, cujo método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pertuzumab ao 25 paciente, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, compreendendo determinar a expressão de HER2 e HER3 na amostra do câncer do paciente e selecionar um inibidor de HER como terapia, se a amostra do câncer expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
A invenção refere-se também a um artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica que 5 compreende um inibidor de HER em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o inibidor ou composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 25° percentil da expressão de 10 HER2:HER3 no tipo de câncer.
Além disso, a invenção fornece um método para fabricar um inibidor de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo, compreendendo combinar em uma embalagem o inibidor ou a composição farmacêutica e um selo que determina que o inibidor ou a composição farmacêutica são indica15 dos para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder ao inibidor de HER, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer.
Além disso, a invenção refere-se um método para anunciar um 20 inibidor de HER ou sua composição farmaceuticamente aceitável, compreendendo promover, para um público-alvo, o uso do inibidor de HER ou da sua composição farmacêutica para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer, onde o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de 25 câncer.
Descrição Resumida das Figuras
Figura 1 fornece um esquema da estrutura da proteína HER2 e as seqüências de aminoácidos para os Domínios I-IV (SEQ ID N0 19-22, respectivamente) do domínio extracelular dessa.
Figura 2A e 2B descrevem os alinhamentos das seqüências de
aminoácidos dos domínios variável leve (Vl) (Figura 2A) e variável pesado (Vh) (Fiqura 2B) de anticorpo monoclonal de murino 2C4 (SEQ ID N0 1 e 2, respectivamente); domínios Vl e Vh da variante 574/pertuzumab (SEQ ID N0 3 e 4, respectivamente) e regiões estruturais consenso de Vl e vH humanas (hum k1, subgrupo I de kappa leve; humlll, subgrupo Ill pesado) (SEQ ID N0 5 e 6, respectivamente). Asteriscos identificam as diferenças entre os domí5 nios variáveis de pertuzumab e o anticorpo monoclonal de murino 2C4 ou entre os domínios variáveis de pertuzumab e a região estrutural humana. As Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) estão entre parênteses.
Figura 3A e 3B mostram as seqüências de aminoácidos da ca10 deia leve (Figura 3A; SEQ ID N0 13) e da cadeia pesada (Figura 3B; SEQ ID N0 14) de pertuzumab. As CDRs são mostradas em negrito. A massa molecular calculada da cadeia leve e da cadeia pesada são 23,526.22 Da e 49,216.56 DA (cisteínas em forma reduzida). A porção carboidrato está acoplada a Asn 299 da cadeia pesada.
Figura 4 descreve, esquematicamente, a ligação de 2C4 ao sítio
de ligação heterodimérica de HER2, prevenindo dessa maneira a heterodimerização com EGFR ativado ou HER3.
Figura 5 descreve o acoplamento de HER2/HER3 as vias de MAPK e Akt.
Figura 6 compara as várias atividades de trastuzumab e pertu
zumab.
Figura 7A e 7B mostram as seqüências de aminoácidos da cadeia leve (Figura 7A; SEQ ID N0 15) e da cadeia pesada (Figura 7B; SEQ ID N0 16) de trastuzumab, respectivamente.
Figura 8A e 8B descrevem uma variante da seqüência da cadeia
leve de pertuzumab (Figura 8A; SEQ ID N0 17) e uma variante da cadeia pesada de pertuzumab (Figura 8B; SEQ ID N0 18), respectivamente.
Figura 9 descreve o planejamento/esquema para o teste clínico no Exemplo 1 envolvendo pacientes com carcinoma ovariano resistente à platina, peritoneal primário ou da trompa falopiana tratados tanto com gencitabina e placebo quanto com gencitabina e pertuzumab.
Fiqura 10A descreve a sobrevida livre de progressão (PFS) para todos os pacientes do estudo do Exemplo 1.
Figura 10B é uma versão atualizada da Figura 10A. PFS foi estimada usando o modelo de Cox estratificado e o teste log-rank estratificado por fatores de estratificação por aleatorização (ECOG PS, número de regimes anteriores para doença resistente à platina e mensurabilidade da doença).
Figura 11A representa PFS pela situação predita de pHER2.
Figura 11B é uma versão atualizada da Figura 11 A.
Fig, 12A representa PFS pelos pontos de corte de qRT-PCR de EGFR (HER1).
Figura 12B é outra representação dos pontos de corte de wRTPCR de EGFR (HER1), também indicando o número de indivíduos nos grupos de HER1 (Alto) e HER1 (Baixo) em vários valores de ponto de corte de EGFR.
Figura 13 A representa PFS por pontos de corte de qRT-PCR de
HER2.
Figura 13 B é outra representação de PFS pelos pontos de corte de qRT-PCR de HER2, também indicando o número de indivíduos nos grupos de HER1 (Alto) e HER1 (Baixo) em vários valores de ponto de corte de HER2.
Figura 14A representa PFS pelos pontos de corte de qRT-PCR
de HER3.
Figura 14B é outra representação de PFS pelos pontos de corte de qRT-PCR de HER3, também indicando o número de indivíduos nos grupos de HER3 (Alto) e HER3 (Baixo) em vários valores de ponto de corte de HER3.
Figura 15A mostra PFS para subgrupos de HER3. A atividade de pertuzumab é muito maior em pacientes com tumores que expressam Her3 baixo e tende a aumentar conforme o nível de expressão do gene de HER3 diminui.
Figura 15B é outra representação de PFS pelos níveis de qRTPCR de HER3. Figura 16A demonstra PFS por subgrupos de HER3. Os dados mostram que pode haver uma interação negativa entre pertuzumab e gencitabina em pacientes com tumores que expressam Her3 alto.
Figura 16B é outra representação de PFS pelos níveis de qRTPCR de HER3. Os dados confirmam ainda que pode haver uma interação negativa entre pertuzumab e gencitabina em pacientes com tumores que expressam Her3 alto.
Figura 17A resume PFS para subgrupos de HER3; subgrupo com expressão alta de HER3 e subgrupo com expressão baixa de HER3.
Figura 17B é uma versão atualizada de PFS pelos níveis de
qRT-PCR de HER3 mostrados na Figura 17A.
Figura 18A demonstra ainda PFS para subgrupos de HER3.
Figura 18B é uma versão atualizada da análise de PFS pelos quartis de expressão de HER3, mostrados na Figura 18A.
Figura 19A mostra PFS por qRT-PCR de HER3 com um split de
50/50; com baixa expressão de HER3 em menos do que o 50° percentil e alta expressão de HER3 em mais do que ou igual o 50° percentil.
Figura 19B é uma versão atualizada de PFS por qRT-PCR de HER3 com um split de 50/50, mostrada na Figurai9A.
Figura 20A mostra PFS por qRT-PCR de HER3 com um split de
25/75; com baixa expressão de HER3 em menos do que o 25° percentil e alta expressão de HER3 em mais do que ou igual ao 25° percentil.
Figura 20B é uma versão atualizada de PFS por qRT-PCR de HER3 com um split de 25/75, mostrada na Figura20A.
Figura 21A mostra os dados preliminares da sobrevida global
(OS) em todos os pacientes. Dados baseados em 46/130 eventos.
Figura 21B é um gráfico atualizado de dados de OS, modelo de Cox estratificado estimado e teste log-rank estratificado por fatores de estratificação por aleatorização (ECOG PS, número de regimes anteriores para
doença resistente à platina e mensurabilidade da doença).
Figura 22A ilustra os dados preliminares par OS por qRT-PCR de HER3. Dados baseados em 43/119 eventos. Figura 22B é um gráfico atualizado de dados de OS por qRTPCR de HER3 com um split de 50/50, com baixa expressão de HER3 em menos do que o 50° percentil e alta expressão de HER3 em mais do que ou igual ao 25° percentil.
Figura 23A demonstra PFS por qRT-PCR de HER3 comparando
as taxas de risco altas contra baixas (HR).
Figura 23B é um gráfico atualizado de PFS por qRT-PCR de HER3 comparando as taxas de risco altas contra baixas (HR).
Figura 24A mostra o grupo completo de dados para pertuzumab do câncer ovariano resistente à platina no Exemplo 1, com PFS por qRTPCR de HER3. Nota: Os valores de p de HR e de Log-rank não foram ajustados para comparação múltipla.
Figura 24B é outro grupo de dados para pertuzumab do câncer ovariano resistente à platina, com PFS por qRT-PCR de HER3. Como na Figura 24A, Os valores de p de HR e de Log-rank não foram ajustados para comparação múltipla.
Figura 25 mostra PFS e OS por qRT-PCR de HER3 para pacientes tratados como no Exemplo 2 com pertuzumab como agente único. Pacientes com Her3 alto eram aqueles com mais do que ou igual ao 75° percen20 til; pacientes com Her3 baixo eram aqueles com menos do que o 75° percentil. A sobrevivência média para pacientes com baixa expressão foi de 1,31 anos (Cl de 95%, 1,93-4,69); a sobrevivência média para pacientes que expressam Her3 alto foi de 1,80 anos (Cl de 95%, 0,83 a 2,78).
Figura 26A mostra a proporção normalizada calibrada de HER3; a faixa de expressão é de cerca de 20 a 80 vezes. CPs estão entre 23 e 30 para a maioria das amostras.
Figura 26B é outra figura que mostra a proporção normalizada calibrada de HER3; a faixa de expressão é de cerca de 20 a 80 vezes. CPs estão entre 23 e 30 para a maioria das amostras.
Figura 27 mostra a seqüência de processos do ensaio de diag
nóstico in vitro (IVD) por qRT-PCR de pertuzumab em LIGHTCYCLER® 2.0.
Fiqura 28 mostra a análise e a seqüência de processos do ensaio IVD de pertuzumab com um marcador e referência.
Figura 29A fornece PFS pelos percentis de HER2.HER3 para pacientes tratados no Exemplo 1.
Figura 29B é outra figura que mostra PFS pelos percentis de HER2.HER3 para pacientes tratados no Exemplo 1. Nota: Os valores de p de HRs e de Log-rank não foram ajustados para comparação múltipla.
Figura 30A avalia PFS pela proporção de HER2:HER3 para o Exemplo 1 usando gráficos de Kaplan Meyer especificamente para pacientes com proporções de HER2 para HER3 maiores do que a média ou maiores do que o 75° percentil.
Figura 30B é uma atualização que mostra PFS para a proporção de HER2:HER3 para o Exemplo 1 usando gráficos de Kaplan Meyer especificamente para pacientes com proporções de HER2 para HER3 maiores do que a média ou maiores do que o 75° percentil.
Figura 31A avalia PFS para os subgrupos de quartil da propor
ção de HER2.HER3, novamente do Exemplo 1.
Figura 31B é outro sumário da análise de PFS pelos quartis de HER2:HER3 de câncer ovariano recorrente.
Figura 32 mostra gráficos de Kaplan-Meier para PFS de indivíduos com câncer ovariano que têm níveis de HER3 menores do que a média e igual ou maiores do que a média, respectivamente, tratados como descrito no Exemplo 3.
Figura 33 mostra um gráfico de Kaplan-Meier pra PFS de indivíduos com câncer ovariano, tratados com quimioterapia ou pertuzumab em um grupo de pacientes com níveis de HER3 menores do que a média ou iguais ou maiores do que a média, respectivamente.
Figura 34 mostra gráficos de Kaplan-Meier para indivíduos com câncer ovariano, tratados com pertuzumab e quimioterapia ou só com pertuzumab, com proporções de HER2.HER3 abaixo da média e iguais ou maiores do que a média, respectivamente.
Figura 35 mostra um gráfico de Kaplan-Meier para indivíduos com câncer ovariano, tratados com quimioterapia ou pertuzumab, com proporções de HER2:HER3 abaixo da média e iguais ou maiores do que a média, respectivamente.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas I. Definições
5 Um "receptor de HER" é um receptor da proteína tirosina quina
se que pertence à família do receptor de HER e inclui os receptores de EGFR1 HER2, HER3 e HER4. O receptor de HER geralmente compreenderá um domínio extracelular, que pode se ligar a um Iigante de HER e/ou dimerizar com outra molécula de receptor de HER; um domínio transmembrana 10 lipofílico; um domínio conservado intracelular de tirosina quinase; e um domínio de sinalização de carboxila terminal abrigando vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor de HER pode ser uma "seqüência nativa" de receptor de HER ou uma "seqüência de aminoácidos variante" dessa. Preferivelmente, o receptor de HER é uma seqüência nativa do re15 ceptor de HER humano.
As expressões ”ErbB1”, "HER1", "receptor do fator de crescimento epidérmico" e "EGFR" são usadas aqui intercambiavelmente e referem-se à EGFR como descrito, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluindo formas mutantes que ocorrem natu20 ralmente do mesmo (por exemplo, uma EGFR mutante por deleção, como em Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). enbB1 refere-se ao gene que codifica o produto de proteína de EGFR.
As expressões "ErbB2" e "HER2" são usadas aqui intercambiavelmente e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em 25 Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (número de acesso no Genebank X03363). O termo "er<fc>B2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humana e "neu" refere-se ao gene que codifica p185neu de rato. A HER2 preferida é a seqüência nativa de HER2 humana.
"Domínio extracelular de HER2" ou "HER2 ECD" referem-se aqui
a um domínio de HER2 que está fora de uma célula, tanto ancorado a um membrana celular quanto em circulação, incluindo seus fragmentos. Em uma modalidade, o domínio extracelular de HER2 pode compreender quatro domínios: "Domínio I" (resíduos de aminoácidos entre cerca de 1 a 195; SEQ ID N°19), "Domínio II" (resíduos de aminoácidos entre cerca de 320 a 488; SEQ ID N°20), "Domínio III" (resíduos de aminoácidos entre cerca de 1 a 5 195; SEQ ID N°21) e "Domínio IV" (resíduos de aminoácidos entre cerca de 489 a 630; SEQ ID N°22) (numeração de resíduo sem peptídeo de sinal). Vide Garrett et al. Mol. Cell. 11 : 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421 : 756- 760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), e Plowman et al Proc. NatL Acad. Sci 90:1746-1750 (1993) assim como a Figura 1.
"ErbB3" e "HER3" referem-se ao polipeptídeo receptor como
descrito, por exemplo, nas Patentes US N0S 5.183.884 e 5.480.968 assim como Kraus et ai PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989).
As expressões "ErbB4" e "HER4" referem-se aqui ao polipeptídeo receptor como descrito, por exemplo, no Pedido de Patente N0 EP 599.274; Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al, Nature, 366:473-475 (1993), incluindo suas isoformas, por exemplo, como descrito em W099/19488, publicada em 22 de abril de 1999.
Por "ligante de HER" entende-se um polipeptídeo que se ligue e/ou ative um receptor de HER. O ligante de HER de interesse particular aqui é uma seqüência nativa de ligante de HER humana tal como o fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al, J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); fator alfa de transformação do crescimento (TGF-α) (Marquardt et al, Science 223:1079-1082 (1984)); anfirregulina também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino de queratinócito (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al Nature 348:257-260 (1990); e Cook et al Mol Cell. Biol 11 :2547-2557 (1991)); beta-celulina (Shing et al, Science 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico que se liga à heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al, Science 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al, J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al Oncogene 15:2841-2848 (1997)); uma heregulina (vide abaixo); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al, Nature 387:512-516 (1997)): neurequlina-3 (NRG-3) (Zhang et al, Proc. Nati Acad. Sci 94:9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al Oncogene 18:2681-89 (1999)); e cripto (CR-I) (Kannan etalJ. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Ligantes de HER que se ligam a EGFR incluem EGF1 TGF-α anfirregulina, beta-celulina, HB-EGF 5 e epiregulina. Ligantes de HER que se ligam a HER3 incluem heregulinas. Ligantes de HER capazes de se ligar a HER4 incluem beta-celulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e heregulinas.
"Heregulina" (HRG) quando usada aqui refere-se a um polipeptídeo codificado pelo produto de gene de heregulina como descrito na Patente 10 U.S. N°5.641.869, ou Marchionni et al, Nature, 362:312-318 (1993). Exemplos de heregulinas incluem heregulina-a, heregulina-βΐ, heregulina^2 e heregulina-p3 (Holmes et al, Science, 256: 1205-1210 (1992); e Patente U.S. No. 5.641.869); fator de diferenciação de neu (NDF) (Peles et al Cell 69: 205-216 (1992)); indutor de atividade de receptor de acetilcolina (ARIA) (Fal15 Is et al Cell 72:801-815 (1993)); fatores de crescimento da glia (GGFs) (Marchionni et al, Nature, 362:312-318 (1993)); fatores derivados de neurônio sensitivo e motor (SMDF) (Ho et al J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)).
Um "dímero de HER" é um dímero não covalentemente associa20 do compreendendo pelo menos dois receptores de HER. Tais complexos podem se formar quando uma célula que expressa dois ou mais receptores de HER é exposta a um ligante de HER e podem ser isolados por imunoprecipitação e analisados por SDS-PAGE como descrito em Sliwkowski et al, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo. Outras proteínas, 25 tais como uma subunidade de receptor de citoquina (por exemplo, gp130) podem estar associadas ao dímero. Preferivelmente, o dímero de HER compreende HER2.
Um "heterodímero de HER" é um heterodímero não covalentemente associado compreendendo pelo menos dois receptores de HER diferentes, tais como os heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 ou HER2- HER4.
Um "inibidor de HER” é um agente que interfere com a ativação ou função de HER. Exemplos de inibidores de HER incluem anticorpos antiHER (por exemplo, anticorpos para EGFR, HER2, HER3 ou HER4); fármacos direcionados para EGFR; antagonistas de HER de molécula pequena; inibidores de tirosina quinase HER; inibidores duplos de tirosina quinase 5 HER2 e EGFR tal como lapatinib/GW572016; moléculas antissenso (vide, por exemplo, W02004/87207); e/ou agentes que se ligam, interferem com a função de moléculas de sinalização a jusante, tais como MAPK ou Akt (vide Figura 5). Preferivelmente, o inibidor de HER é um anticorpo ou molécula pequena que se ligam ao receptor de HER.
Um "inibidor da dimerização de HER" é um agente que inibe a
formação de um dímero de HER ou de um heterodímero de HER. Preferivelmente, o inibidor da dimerização de HER é um inibidor da dimerização de HER2 e/ou inibidor da heterodimerização de HER. Preferivelmente, o inibidor da dimerização de HER é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo que se 15 ligue a HER2 no seu sítio de ligação heterodimérica. O inibidor da dimerização de HER mais preferido é pertuzumab ou Mab 2C4. A ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérica de HER2 está ilustrada na Figura 4. Outros exemplos de inibidores da dimerização de HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem sua dimerização com um ou mais outros receptores 20 de HER (por exemplo, anticorpo monoclonal 806 anti-EGFR, Mab806, que se liga a EGFR ativada ou "não ligada"; vide Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); anticorpos que se ligam a HER3 e inibem sua dimerização com um ou mais outros receptores de HER; anticorpos que se ligam a HER4 e inibem sua dimerização com um ou mais outros receptores 25 de HER; inibidores de dimerização de peptídeo (Patente U.S. N0 6.417.168); inibidores da dimerização antissenso, etc.
Um "inibidor da dimerização de HER2" é um agente que inibe a formação de um dímero ou heterodímero que compreende HER2.
Um "anticorpo HER" é um anticorpo que se liga a um receptor de HER. Opcionalmente, o anticorpo HER interfere ainda com a ativação ou função de HER. Preferivelmente, o anticorpo HER se liga ao receptor de HER2. Um anticorpo HER2 de interesse particular aaui é pertuzumab. Outro exemplo de um anticorpo HER2 é trastuzumab. Exemplos de anticorpos para EGFR incluem cetuximabe e ABX0303.
"Ativação de HER" refere-se à ativação ou à fosforilação de qualquer um ou mais receptores de HER. Geralmente, a ativação de HER resulta em transdução de sinal (por exemplo, aquela causada por um domínio quinase intracelular de um receptor de HER que fosforila resíduos de tirosina no receptor de HER ou um substrato de polipeptídeo). A ativação de HER pode ser mediada por um ligante de HER que se liga a um dímero de HER que compreende o receptor de HER de interesse. O ligante de HER que se liga a um dímero de HER pode ativar um domínio quinase de um ou mais dos receptores de HER no dímero e dessa maneira resultar na fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores de HER e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipeptídeos de substrato adicionais, tais como as quinases intracelulares Akt ou MAPK, por exemplo; vide Figura 5.
"Fosforilação" refere-se à adição de um ou mais grupos fosfato a uma proteína, tal como um receptor de HER ou seu substrato.
Um anticorpo que "inibe a dimerização de HER" é um anticorpo que inibe ou interfere na formação de um dímero de HER. Preferivelmente, tal anticorpo se liga a HER2 no seu sítio de ligação heterodimérica. O anticorpo que inibe a dimerização mais preferido aqui é pertuzumab ou Mab 2C4.
A ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérica de HER2 está ilustrada na Figura 4. Outros exemplos de anticorpos que inibem a dimerização de 25 HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem sua dimerização com um ou mais outros receptores de HER (por exemplo, anticorpo monoclonal 806 para EGFR, Mab 806, que se liga à EGFR ativada ou "não ligada", vide Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); anticorpos que se ligam a HER3 e inibem sua dimerização com um ou mais outros 30 receptores de HER; anticorpos que se ligam a HER4 e inibem sua dimerização com um ou mais outros receptores de HER.
Um anticorpo que "bloqueia a ativação do Iiqante de um receptor de HER mais eficientemente do que trastuzumab" é aquele que reduz ou elimina a ativação do ligante de HER dos receptores de HER ou de dímero(s) de HER mais eficientemente (por exemplo, pelo menos cerca de 2 vezes mais eficientemente) do que trastuzumab. Preferivelmente, tal anticorpo 5 bloqueia a ativação do ligante de HER de um receptor de HER pelo menos tão eficientemente como o anticorpo monoclonal 2C4 de murino ou seu fragmento Fab, ou como pertuzumab ou seu fragmento Fab. Pode-se avaliar a habilidade de um anticorpo em bloquear a ativação de um ligante de um receptor de HER pelo estudo dos dímeros de HER diretamente ou pela ava10 liação da ativação de HER ou da sinalização a jusante que resulta da dimerização de HER e/ou pela avaliação do sítio de ligação anticorpo-HER2, etc. Ensaios para o rastreamento de anticorpos com a habilidade para inibir a ativação do ligante de um receptor de HER mais eficientemente do que trastuzumab estão descritos em Agus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002) e 15 W001/00245 (Adams et al.). Apenas como exemplo, pode-se ensaiar para: inibição da formação de dímero de HER (vide, por exemplo, Figura IA-B de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002); e W001/00245); redução na ativação de ligante de HER em células que expressam dímeros de HER (W001/00245 e Figura 2A-B de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), 20 por exemplo); bloqueando ligante de HER que se liga a células que expressam dímeros de HER (WO 01/00245, e Figura 2E de Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição de crescimento celular de células cancerosas (por exemplo, MCF7, MDA-MD- 134, ZR-75-1, MD-MB- 175, células T-47D) que expressam dímeros de HER na presença (ou na ausência) 25 de ligante de HER (W001/00245 e Figuras 3A-D de Agus et al. Caneer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição de sinalização a jusante (por exemplo, inibição de fosforilação de AKT dependente de HRG ou inibição de fosforilação de MAPK dependente de HRG ou TGF-α) (vide, W001/00245, e Figura 2C-D de Agus et al. Caneer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo). 30 Pode-se avaliar também se o anticorpo inibe a dimerização de HER pelo estudo do sítio de ligação do anticorpo-HER2, por exemplo, pela avaliação de uma estrutura ou modelo, tal como uma estrutura cristalina, do anticorpo ligado a HER2 (Vide, por exemplo, Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
Um "sítio de ligação heterodimérica" sobre HER2 refere-se a uma região no domínio extracelular de HER2 que contata ou se conecta por 5 meio de uma interface com uma região no domínio extracelular de EGFR, HER3 ou HER4 após a formação de um dímero com eles. A região é encontrada no Domínio Il de HER2. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004).
O anticorpo HER2 pode "inibir a fosforilação de AKT dependente de HRG" e/ou "inibir a fosforilação de MAPK dependente de TGF-α ou HRG" mais eficientemente (por exemplo, pelo menos 2 vezes mais eficientemente) do que trastuzumab (vide Agus et al. Caneer Cell 2: 127-137 (2002) e W001/00245, por exemplo).
O anticorpo HER2 pode ser aquele que, como pertuzumab, "não inibe a clivagem do ectodomínio de HER2" (Molina et al. Caneer Res. 61:4744-4749 (2001)). Trastuzumab, por outro lado, pode inibir a clivagem do ectodomínio de HER2.
Um anticorpo HER que "se liga a um sítio de ligação heterodimérica" de HER2, se liga a resíduos no domínio Il (e opcionalmente também se liga a resíduos em outro dos domínios do domínio extracelular de HER2, tal 20 como domínios I e III) e pode impedir estericamente, pelo menos em algum nível, a formação de um heterodímero de HER2-EGFR, HER2-HER3 ou HER2-HER4. Franklin et al. Caneer Cell 5:317-328 (2004) caracterizaram a estrutura cristalina de HER2-pertuzumab, depositada no RCSB Protein Data Bank (Código de ID IS78), ilustrando um anticorpo exemplar que se liga ao 25 sítio de ligação heterodimérica de HER2.
Um anticorpo que "se liga ao domínio II" de HER2, se liga a resíduos no domínio Il e opcionalmente a resíduos de outro(s) domínio(s) de HER2, tais como domínios I e III. Preferivelmente, o anticorpo que se liga ao domínio Il se liga na junção entre os domínios I, Il e Ill de HER2.
"Expressão" de proteína refere-se à conversão da informação
codificada em um gene no RNA mensageiro (mRNA) e então para a proteína. Uma amostra ou célula que "expressa" uma proteína de interesse (tal como HER3 e/ou HER2) é aquela na qual o mRNA que codifica a proteína, ou a proteína, incluindo seus fragmentos, é determinada estar presente na amostra ou célula.
5 Uma amostra, célula, tumor ou câncer que "expressa HER3 em
um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3" em um tipo de câncer é aquela no qual o nível de expressão de HER3 é considerado um "nível baixo de HER3" para uma pessoa experiente naquele tipo de câncer. Geralmente, tal nível estará na faixa entre cerca de O a menos do que 50%, 10 em relação aos níveis de HER3 em uma população de amostras, células, tumores ou cânceres do mesmo tipo de câncer. Por exemplo, a população que é usada para se chegar ao nível mediano de expressão pode ser de amostras de câncer ovariano, geralmente, ou seus subgrupos, tais como câncer ovariano resistente a quimioterapia, câncer ovariano resistente à pla15 tina, assim como câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente. Os exemplos demonstram aqui como o nível de expressão média é determinado. Isso pode constituir um valor absoluto de expressão. Assim, com referência a Figura 17 do mesmo, o ponto de corte de pacientes com câncer ovariano resistente à platina considerado para expressar HER3 em um nível baixo 20 pode ser cerca de 2,8 ou menos (menos do que o 60° percentil); cerca de 2,41 ou menos (menos do que o 55° percentil); cerca de 2,28 ou menos (menos do que o 50° percentil); cerca de 1,88 ou menos (menos do que o 45° percentil); cerca de 1,71 ou menos (menos do que o 40° percentil); cerca de 1,57 ou menos (menos do que o 35° percentil); cerca de 1,4 ou menos 25 (menos do que o 30° percentil); cerca de 1,19 ou menos (menos do que o 25° percentil); cerca de 0,99 ou menos (menos do que o 20° percentil), etc. Tais valores absolutos serão quantificados em um ensaio sob condições de ensaio específicas, tais como qRT-PCR aqui descrito e, mais preferivelmente, o ensaio qRT-PCR como no Exemplo 1. Preferivelmente, o nível de ex30 pressão de HER3 é menor do que o 50° percentil e mais preferivelmente menor do que o 30° ou 25° percentil.
As expressões "HER2:HER3" ou "HER2 para HER3" referem-se aqui ao nível de expressão de HER2 em relação ao nível de expressão de HER3 em uma amostra, célula, tumor ou câncer. Tal nível de expressão pode ser quantificado usando uma variedade de técnicas diferentes tais como aquelas aqui descritas. Embora isso possa ser calculado como uma propor5 ção da expressão de HER2 para a expressão de HER3, a presente invenção contempla várias outras maneiras de avaliar os níveis de HER2 e HER3 a fim de selecionar um paciente para terapia, incluindo, mas não-limitado ao uso de uma árvore de decisão onde os pacientes são selecionados se suas expressões de HER2 e/ou HER3 estão acima ou abaixo de certos pontos de 10 corte, etc. Tais vários outros meios para comparar HER2 a HER3 são abrangidos pelas frases "HER2:HER3" ou "Her2 para HER3".
Uma amostra, célula, tumor ou câncer que "expresse HER2.HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3" em um tipo de câncer, é aquela na qual a proporção da ex15 pressão de HER2 em relação à expressão de HER3 não é "um nível baixo de HER2:HER3" para aquele tipo de câncer. Preferivelmente, tal nível estará na faixa entre maior do que cerca de 25% a cerca de 100%, em relação aos níveis de HER2:HER3 em uma população de amostras, células, tumores ou cânceres do mesmo tipo de câncer. Por exemplo, a população que é usada 20 para se chegar a tais níveis de expressão pode ser de amostras de câncer ovariano, geralmente, ou seus subgrupos, tais como câncer ovariano resistente a quimioterapia, câncer ovariano resistente à platina, assim como câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente. Os exemplos demonstram, aqui como o percentil dos níveis de expressão pode ser determinado. Em 25 uma modalidade, o nível de HER2:HER3 constitui um valor absoluto de expressão. Assim, com referência a Figura 29, o ponto de corte para pacientes com câncer ovariano resistente à platina que expressam HER2:HER3 nesse nível pode ser cerca de 0,82 ou mais (maior do que 25° percentil); cerca de 0,90 ou mais (maior do que 30° percentil); cerca de 1,06 ou mais (maior do 30 que 35° percentil); cerca de 1,13 ou mais (maior do que 40° percentil); cerca de 1,26 ou mais (maior do que 45° percentil); cerca de 1,53 ou mais (maior do que 50° percentil): cerca de 1,70 ou mais (maior do que 55° percentil); cerca de 1,86 ou mais (maior do que 60° percentil); cerca de 2,15 ou mais (maior do que 65° percentil); cerca de 2,49 ou mais (maior do que 70° percentil); cerca de 2,62 ou mais (maior do que 75° percentil); cerca de 2,92 ou mais (maior do que 80° percentil), etc. Tais valores absolutos poderão ser 5 quantificados em um ensaio sob condições de ensaio especificadas, tais como qRT-PCR aqui descrita e o mais preferivelmente, o ensaio qRT-PCR como no Exemplo 1. Em uma modalidade, o nível de expressão de HER2:HER3 é maior do que o 50° percentil, preferivelmente maior do que o 70° percentil e o mais preferivelmente maior do que o 75° percentil. Pacien10 tes cujo câncer expressa HER2:HER3 em níveis como aqui descritos podem, ou não podem, superexpressar HER2.
A técnica da "reação em cadeia de polimerase" ou "PCR" como usada aqui geralmente refere-se a um procedimento em que quantidades mínimas de um pedaço específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são 15 amplificadas como descrito na Patente U.S. N0 4.683.195 emitida em 28 de julho de 1987. Geralmente, a informação da seqüência das extremidades da região de interesse ou além, necessita ser avaliada, tal que iniciadores de oligonucleotídeos podem ser designados; esses iniciadores serão idênticos ou similares em seqüência às fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os 20 nucleotídeos 5' terminais dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usada para amplificar seqüências específicas de RNA, seqüências específicas de DNA de DNA genômico total e cDNA transcrito a partir de RNA celular total, bacteriófago ou seqüências de plasmídeo, etc. Vide, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. 25 Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY1 1989). Como usada aqui, PCR é considerada ser um, mas não o único exemplo de um método de reação em cadeia de polimerase de ácido nucleico para amplificação de uma amostra de teste de ácido nucleico, que compreende o uso de um ácido nucleico conhecido (DNA ou RNA) como um ini30 ciador e que utiliza uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar um pedaço específico de um ácido nucleico ou para amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico que é complementar a um ácido nucleico particular.
"Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real" ou "qRT-PCR" refere-se a uma forma de PCR em que a quantidade de produto de PCR é medida em cada etapa em uma reação de PCR. Essa técnica 5 tem sido descrita em várias publicações incluindo Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); e Ma et ai, Cancer Cell 5:607-616 (2004).
A expressão "microarranjo" refere-se a um arranjo ordenado de elementos de arranjo hibridizáveís, preferivelmente sondas de polinucleotídeo, sobre um substrato.
A expressão "polinucleotídeo", quando usada no singular ou no
plural, geralmente refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificados ou RNA ou DNA modificados. Assim por exemplo, polinucleotídeos como definidos aqui incluem, sem limitação, DNA de fita simples e dupla, DNA que inclui regiões de 15 fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou incluir regiões de fita simples e dupla, Além disso, a expressão "polinucleotídeo" como usada aqui refere-se a regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. As fitas em tais regiões podem ser da mesma molé20 cuia ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir tudo de uma ou mais das moléculas, mas mais tipicamente envolvem apenas uma região de algumas das moléculas. Uma das moléculas de uma região de hélice tripla geralmente é um oligonucleotídeo. A expressão "polinucleotídeo" inclui especificamente cDNAs. A expressão inclui DNAs (incluindo cDNAs) e RNAs 25 que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, DNAs ou RNAs com arcabouços modificados quanto à estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" conforme essa expressão é aqui designada. Além disso, DNAs e RNAs que compreendem bases incomuns, tal como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiadas, estão incluídos na expressão 30 "polinucleotídeos” como aqui definida. Em geral, a expressão "polinucleotídeo" abrange todas as formas modificadas quimicamente, enzimaticamente e/ou metabolicamente de polinucleotídeos não modificados, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo células simples e complexas.
A expressão "oligonucleotídeo" refere-se a um polinucleotídeo relativamente curto, incluindo, sem limitação, desoxirribonucleotídeos de fita 5 simples, ribonucleotídeos de fita simples ou dupla, híbridos de RNA:DNA e DNAs de fita dupla. Oligonucleotídeos, tais como sonda de oligonucleotídeos de DNA de fita simples, são geralmente sintetizados por métodos químicos, por exemplo, usando sintetizadores de oligonucleotídeo automatizados que estão comercialmente disponíveis. Entretanto, oligonucleotídeos podem ser 10 feitos por uma variedade de outros métodos, incluindo técnicas mediadas por DNA recombinante in vítro e por expressão de DNAs em células e organismos.
A frase "amplificação de gene" refere-se a um processo pelo qual múltiplas cópias de um gene ou de um fragmento de gene são forma15 das em uma célula ou linhagem celular em particular. A região duplicada (uma fita de DNA amplificado) é geralmente referida como "amplicon". Geralmente, a quantidade do RNA mensageiro (mRNA) produzida também aumenta na proporção do número de cópias feitas de um gene expresso em particular.
A "estringência" de reações de hibridização é rapidamente de
terminável por aquele versado na técnica e geralmente é um cálculo empírico dependente da extensão da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais extensas requerem temperaturas mais elevadas para o anelamento apropriado, enquanto que sondas mais curtas 25 necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende da habilidade do DNA desnaturado em reanelar quando as fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de suas temperaturas de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda e a seqüência hibridizável, maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como 30 resultado, observa-se que temperaturas relativas mais elevadas tenderão fazer as condições de reação mais estringentes, enquanto que temperaturas mais baixas tenderão fazer as condições de reação menos estringentes. Para detalhes e explicações adicionais de estringência de reações de hibridização, vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", como definidas aqui, tipicamente: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015M/citrato de sódio a 0,0015M/dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) empregam um agente desnaturante durante a hibridização, tal como formamida, por exemplo formamida a 50% (v/v) com albumina sérica bovina a 0,1 %/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM em pH 6.5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio a 0,075M), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 mg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguida por uma lavagem de alta estringência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C.
"Condições moderadamente estringentes" podem ser identificadas como descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de uma solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica e % de SDS) menos estringentes do que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é a incubação durante a noite a 37°C em uma solução que compreende: formamida a 20%, x SSC (NaCI 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7.6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e DNA de esperma de salmão desnaturado a 20 mg/ml, seguida pela lavagem dos filtros em 1 x SSC em cerca de 37 a 50°C. O técnico experiente reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc., como necessário para acomodar fatores tais como extensão da sonda e similares.
Um polipeptídeo com "seqüência nativa" é aquele que tem a mesma seqüência de aminoácidos como o polipeptídeo (por exemplo, receptor de HER ou ligante de HER) derivado da natureza, incluindo o que ocorre naturalmente ou variantes alélicas. Tais polipeptídeos de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recom5 binantes ou sintéticos. Assim um polipeptídeo com seqüência nativa pode ter a mesma seqüência de aminoácidos do polipeptídeo humano, polipeptídeo de murino ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamífero que ocorrem naturalmente.
A expressão "anticorpo" é usada aqui no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados por, pelo menos, dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo desde que eles exibam a atividade biológica desejada.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu meio ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu meio ambiente natural são materiais que podem interferir com a pesquisa, usos diagnóstico ou terapêutico do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos e não-proteináceos. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado (1) a mais do que 95% em peso de anticorpo como determinado, por exemplo, pelo método de Lowry e, em algumas modalidades, a mais do que 99% em peso; (2) a um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos da seqüência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de, por exemplo, um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usando, por exemplo, corantes Coomassie azul ou prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do meio ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Comumente, entretanto, um anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
"Anticorpos nativos" são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, embora o número de ligações dissulfeto varie entre as cadeias pesadas de isotipos diferentes de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (Vh) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante na outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Resíduos de aminoácidos particulares são considerados formar uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e pesada.
A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo referese aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm sítios de ligação ao antígeno.
A expressão "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem amplamente em seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular por seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não está igualmente distribuída através dos domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados de regiões hipervariáveis (HVRs) em ambos os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões estruturais (FR). Cada domínio variável das cadeias pesada e leve nativas compreendem quatro regiões FR, que adotam amplamente uma configuração de fita beta, conectadas por três HVRs, que formam alças que conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura de fita beta. As HVRs de cada cadeia estão organizadas em íntima proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo com um antígeno, mas exibem várias funções efeto5 ras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser determinadas por um de dois tipos claramente distintos, chamados de kappa (κ) e Iambda (λ), baseado na seqüência de aminoácidos de seus domínios constantes.
Dependendo das seqüências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser divididos em diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM1 e várias dessas podem ser divididas ainda em 15 subclasses (isotipos), por exmplo, IgG1, IgG2, lgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas e configurações tridimensionais da subunidade de diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas e descritas, geralmente em, 20 por exemplo Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a Ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma grande molécula de fusão, formada por associação covalente e não covalente do anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos.
As expressões "anticorpo de extensão completa", "anticorpo intacto" e "anticorpo completo" como usadas aqui, intercambiavelmente, referem-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, não a fragmentos de anticorpo como definidos abaixo. As expressões referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região Fe.
Um "anticorpo nu" para os propósitos do mesmo, é um anticorpo que não está conjugado com uma porção citotóxica ou radiomarcador.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo a sua porção de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e FGV; dicorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpo.
5 A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos
de ligação ao antígeno idênticos, chamados de fragmentos "Fab", cada um com um sítio único de ligação ao antígeno e um fragmento residual "Fe", cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina rende um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação ao antígeno e ainda é capaz de se interligar com o antígeno.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio de ligação ao antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero do domínio variável de uma cadeia leve e uma cadeia pesada em estreita associação, não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem estar covalentemente ligados por um ligante peptídico flexível tal que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquela da espécie de Fv de duas cadeias. É nessa configuração que as três HVRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação ao antígeno do anticorpo. Entretanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a habilidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma afinidade menor do que a do sítio de ligação inteiro.
O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carboxi do 30 domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação para Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes abriga(m) um grupo tiol livre. Fragmentos F(ab')2 de anticorpo foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que têm dobradiças de cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" com5 preendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia única de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo de scFv compreende ainda um Iigante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita a scFv formar a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão sobre scFv, vide , por exemplo, Pluckthun, em The 10 Pharmacology of Monoclonal Aníibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer- Verlag, New York, 1994), pp. 269-315. Os fragmentos scFv incluem especificamente "imuno-farmacêuticos moduladores pequenos" (SMIPs), tais como descritos em US2005/0180970 A1 e US2005/0186216 A1 designadas para Trubion.
A expressão "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo
com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Com o uso de Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios 20 sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161 ; Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sci 25 USA 90: 6444- 6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
A expressão "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população 30 são idênticos , exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em certas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que compreende uma seqüência de polipeptídeos que se liga a um alvo, em que a seqüência de polipeptídeos que se liga ao alvo foi obtida por um processo que inclui a se5 leção de uma única seqüência de polipeptídeos que se liga ao alvo de uma pluralidade de seqüências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único a partir de uma pluralidade de clones, tal como um pool de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ficar entendido que uma seqüência que se liga 10 ao alvo selecionada pode ser alterada, posteriormente, por exemplo, para melhorar a afinidade com o alvo, para humanizar a seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a seqüência de ligação ao alvo alterada também 15 é um anticorpo monoclonal dessa invenção. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre um antígeno. Além de sua especificidade, prepara20 ções de anticorpo monoclonal são vantajosas já que, tipicamente, elas não são contaminadas por outras imunoglobulinas.
O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por 25 qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método do hibridoma (por exemplo, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Ma30 nual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567), tecnologias de apresentação em fago (vide, por exemplo, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Moi Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al. , J. Moi Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci 5 USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et ai, J. Immunoi Methods 284(1-2): 119-132(2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos e similares a humanos em animais que têm partes ou todos os Ioci das imunoglobulinas humanas ou genes que codificam sequencias de imunoglobulinas humanas (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 10 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856- 15 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Os anticorpos monoclonais incluem aqui, especificamente, anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é 20 idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertence a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (vide, por exemplo, Patente U.S. N0 4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 25 (1984)). Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos PRIMATIZED® nos quais a região de ligação com o antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, pela imunização de macacos com o antígeno de interesse.
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exempio, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência mínima derivada de uma imunogiobulina não-humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunogiobulina humana (anticorpo receptor), na qual resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de HVR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano, que tem a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos de FR da imu5 noglobulina humana são substituídos pelos resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmen10 te todos ou pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunogiobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunogiobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá opcionalmente pelo menos uma por15 ção de uma região constante de uma imunogiobulina (Fe), tipicamente aquela de uma imunogiobulina humana. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323- 329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vide também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immu20 nol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e Patentes U.S. Nos. 6.982.321 e 7.087.409.
Anticorpos para HER2 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, hu25 MAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou trastuzumab (HERCEPTIN®) como descrito na Tabela 3 da Patente U.S. 5.821.337, expressamente incorporada aqui por referência; 520C9 humanizado (W093/21319); e anticorpos 2C4 humanizados tais como pertuzumab como aqui descrito.
Para os propósitos do mesmo, "trastuzumab"," HERCEPTIN®" e "huMab4D5-8" referem-se a um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidos da cadeia leve e pesada das SEQ ID N0 15 e 16, respectivamente. "Pertuzumab" e "OMNITARG®" referem-se a um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidos da cadeia leve e pesada das SEQ ID N013 e 14, respectivamente.
As diferenças entre as funções de trastuzumab e pertuzumab 5 estão ilustradas na Figura 6.
Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que tenha sido feito usando qualquer uma das técnicas para fazer anticorpos humanos como aqui descritas. Essa definição de um anti10 corpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos que se ligam a antígeno não-humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas, incluindo bibliotecas de apresentação em fago. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et ai, J. Moi Bioi, 222:581 (1991). Os métodos des15 critos em Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy1 Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et ai, J. Immunol, 147(l):86-95 (1991) também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos. Vide também van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do 20 antígeno a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um estímulo antigênico, mas cujos Ioci endógenos tenham sido desabilitados, por exemplo, xeno-camundongos imunizados (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.075.181 e 6.150.584 com relação à tecnologia XENOMOUSE®). Vide também, por exemplo, Li et al, Proc. 25 Natl. Acad. Sci USA, 103:3557-3562 (2006) com relação a anticorpos humanos gerados através da tecnologia de hibridoma de célula B humana.
Resíduos "estruturais" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável diferentes de resíduos de HVR como aqui definidos.
A expressão "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração da posição de aminoácido como em Kabat" e suas variações, referem-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos de Kabat et al.,supra. Usando esse sistema de numeração, a seqüência de aminoácidos linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais que correspondem ao encurtamento ou a inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de ca5 deia pesada pode incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR da cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homolo10 gia de seqüência do anticorpo com uma seqüência de Kabat numerada "padronizada".
Ao longo do presente pedido e das reivindicações, o sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se referir a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1 a 107 da cadeia leve e resí15 duos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)).
O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente usado quando se referir a um resíduo em uma região constante de uma cadeia 20 pesada de imunogiobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et ai, Sequenees of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), incorporado aqui expressamente por referência). A menos que determinado aqui de outra maneira, as referências aos números dos resíduos no domínio variável do anticorpo sig25 nificam numeração de resíduo pelo sistema de numeração de Kabat. A menos que determinado aqui de outra maneira, as referências aos números dos resíduos no domínio constante do anticorpo significam numeração de resíduo pelo sistema de numeração EU (por exemplo, vide Pedido Provisório US N0 60/640.323, Números para numeração EU).
Um anticorpo "maturado por afinidade" é aquele com uma ou
mais alterações em uma ou mais de suas HVRs que resultam em uma melhora da afinidade do anticorpo pelo antígeno, comparada com um anticorpo parente que não possui aquela(s) alteração(ções). Em uma modalidade, um anticorpo maturado por afinidade tem afinidades nanomolares ou até picomolares pelo antígeno-alvo. Anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos usando certos procedimentos conhecidos na técnica. Por exem5 pio, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade pelo embaralhamento de domínio VH e VL. A mutagênese aleatória de HVR e/ou de resíduos estruturais está descrita em, por exemplo, Barbas et al., Proc Nat. Acad Sei. USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); 10 Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. MoL Biol. 226:889-896 (1992).
"Funções efetoras" de anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc da seqüência nativa ou uma região Fc variante da seqüência de aminoácidos) de um anticorpo e 15 variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a C1q e citoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor de Fe; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B. 20 A expressão "região Fe" é usada aqui para definir uma região C
terminal de uma cadeia pesada de imunogiobulina, incluindo as regiões Fc da seqüência nativa e regiões Fc variantes. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de imunogiobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida se estender de um re25 síduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até a terminação carboxila dessa. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fe pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo ou por manipulação recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequente30 mente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem remoção de resíduos K447 e populações de anticorpo que têm uma mistura de anticorpos com e sem resíduos K447.
A menos que indicado de outra maneira, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada de imunogiobulina é aquela do índice EU como em Kabat et i, supra. O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração 5 de resíduo do anticorpo IgGI EU humano.
Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc da seqüência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação a C1q; ligação ao receptor de Fe; ADCC; fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), 10 etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios como descritos, por exemplo, nas definições.
Uma "região Fc da seqüência nativa" compreende uma sequên15 cia de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc da seqüência nativa humana incluem uma região Fc da seqüência nativa de IgGI humana (alótipos não A e A); região Fc da seqüência nativa de lgG2 humana; região Fc da seqüência nativa de lgG3 humana; e região Fc da seqüência nativa de lgG4 humana, as20 sim como suas variantes que ocorrem naturalmente.
Um "região Fc variante" compreende uma seqüência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc da seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituições de aminoácidos. Preferivelmente, a região Fc variante 25 tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com uma região Fc da seqüência nativa ou a região Fc de um polipeptídeo parente, por exemplo, entre cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferivelmente, entre cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc da seqüência nativa ou na região Fc do polipep30 tídeo parente. A região Fc variante preferivelmente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia com a região Fc da seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parente e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com elas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com elas.
"Receptor de Fe" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRI 11, incluindo variantes alélicas e formas entrelaçadas alternativamente daqueles receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor inibitório"), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem primariamente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em imunorreceptor de tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor inibitório FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em imunorreceptor de tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático (vide, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203- 234 (1997)). FcRs estão revisadas em, por exemplo, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330- 41 (1995). Outras FcRs, incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, estão abrangidas aqui pela expressão "FcR".
A expressão "receptor de FcR" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117-587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e pela regulação da homeostase de imunoglobulinas. 25 Métodos para medir a ligação a FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie and Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie etal, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton etal).
A ligação a FcRn humano in vivo e a meia-vida sérica de polipeptídeos que se ligam com alta afinidade a FcRn humano podem ser ensaiadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens celulares humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas para os quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída a FcRs. Vide também por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
5 "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um
ou mais FcRns e desempenham funções efetoras. Em certas modalidades, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham funções efetoras de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células "natural killer" 10 (NK). monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.
"Citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citoxicidade na qual IG secretada ligada sobre receptores Fe (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por e15 xemplo, células NK1 neutrófilos e macrófagos) possibilitam que essas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula-alvo que abriga um antígeno e subsequentemente matem a célula-alvo com citotoxinas. As células primárias que mediam ADCC, células NK1 expressam apenas FcyRIII apenas, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A ex20 pressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetech e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente U.S. N0 5.500.362 ou 5.821.337 ou Patente U.S. N°6.737.056 (Presta) pode ser realizado. Células 25 efetoras úteis para tais ensaios incluem PBMC e células NK. Alternativamente, ou além disso, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes etal., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Citoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à Iise de uma célula-alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada), que estão ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em GazzanoSantoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado. Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácidos alteradas na região Fc 5 (polipeptídeos com uma região Fc variante) e capacidade aumentada ou diminuída de ligação a C1q estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. N0 6.194.551 BI e WO 1999/51642. Vide também, por exemplo, Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)
A expressão "anticorpo compreendendo uma região Fe" refere10 se a um anticorpo que compreende uma região Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou por manipulação recombinante do ácido nucleico que codifica o anticorpo. Consequentemente, uma composição que compreende um anticorpo que tem uma região 15 Fc de acordo com essa invenção pode compreender um anticorpo com K447, com todos K447 removidos ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
A expressão "espécie principal de anticorpo" refere-se aqui à estrutura do anticorpo em uma composição que é a molécula do anticorpo 20 quantitativamente predominante na composição. Em uma modalidade, a espécie principal de anticorpo é um anticorpo HER2, tal como um anticorpo que se liga ao Domínio Il de HER2, anticorpo que inibe a dimerização de HER mais eficientemente do que trastuzumab e/ou um anticorpo que se liga a um sítio de ligação heterodimérica de HER2. Aqui, a modalidade preferida 25 da espécie principal de anticorpo é aquela que compreende as seqüências de aminoácidos da variável leve e da variável pesada nas SEQ ID N0 3 e 4, e mais preferivelmente que compreende as seqüências de aminoácidos da cadeia leve e da cadeia pesada nas SEQ ID N0 13 e 14 (pertuzumab).
Um anticorpo com "seqüência de aminoácidos variantes" é um anticorpo com uma seqüência de aminoácidos que difere de uma espécie principal de anticorpo. Comumente, variantes de seqüência de aminoácidos possuirão pelo menos cerca de 70% de homologia com a espécie principal de anticorpo, e preferivelmente, elas serão pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% homólogas com a espécie principal de anticorpo. As seqüências de aminoácidos variantes possuem substituições, deleções e/ou adições em certas posições dentro ou adjacentes à sequência de aminoácidos da espécie principal de anticorpo. Exemplos de seqüências de aminoácidos variantes incluem uma variante ácida (por exemplo, anticorpo variante deamidado), uma variante básica, um anticorpo com uma extensão líder amino-terminal (por exemplo VHS-) sobre uma ou duas cadeias leves do mesmo, um anticorpo com um resíduo de Iisina C-terminal sobre uma ou duas cadeias pesadas do mesmo, etc., e inclui combinações de variações de seqüências de aminoácidos das cadeias pesada e/ou leve. Aqui, a variante de anticorpo de interesse particular é o anticorpo que compreende uma extensão líder amino-terminal sobre uma ou duas cadeias leves, compreendendo ainda, opcionalmente, outra seqüência de aminoácidos e/ou diferenças de glicosilação em relação à espécie principal de anticorpo.
Um anticorpo "variante de glicosilação" aqui é um anticorpo com uma ou mais porções de carboidrato acopladas a ele que diferem de uma ou mais porções de carboidrato acopladas à espécie principal de anticorpo. Exemplos de variantes de glicosilação aqui incluem um anticorpo com estrutu20 ra de oligossacarídeo G1 ou G2, ao invés de estrutura de oligossacarídeo GO, acoplada a uma região Fc do mesmo, anticorpo com uma ou mais porções de carboidrato acopladas a uma ou duas cadeias leves do mesmo, anticorpo sem carboidrato acoplado a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, etc., e combinações de alterações de glicosilação.
Onde o anticorpo tem uma região Fe, uma estrutura de oligossa
carídeo pode ser acoplada a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, por exemplo, no resíduo 299 (298, numeração de resíduos Eu). Para pertuzumab, GO foi a estrutura de oligossacarídeo predominante, com outras estruturas de oligossacarídeo, tais como G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1- 30 6), G1(1-3) e G2 sendo encontradas em menores quantidades na composição de pertuzumab.
A menos que indicado de outra maneira, uma "estrutura de oligossacarídeo G1" inclui as estruturas G-1, G1-1, G1(1-6) e G1(1-3).
Uma "extensão líder amino-terminal" refere-se aqui a um ou mais resíduos de aminoácidos da seqüência Iider amino-terminal que estão presentes na terminação amino de qualquer uma ou mais cadeias pesada ou 5 leve de um anticorpo. Uma extensão líder amino-terminal exemplar compreende ou consiste em três resíduos de aminoácidos, VHS, presentes sobre uma ou ambas as cadeias leves de uma variante de anticorpo.
Um anticorpo "deamidado" é aquele no qual um ou mais de seus resíduos de asparagina tenham sido derivatizados, por exemplo, para um ácido aspártico, uma succinimida ou um ácido isoaspártico.
As expressões "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Um "tipo de câncer" refere-se aqui a uma categoria particular ou indicação de câncer. Exemplos de tais tipos de cân15 cer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo Iipossarcoma e sarcoma de célula sinovial), tumores neuroendócrinos (incluindo tumores carcinoides, gastrinoma e câncer de célula de ilhota), mesotelioma, schwannoma (incluindo neurinoma do acústico), meningioma, adenocarcinoma, me20 lanoma, e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa (por exemplo, câncer de célula escamosa epitelial), câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de célula pequena (SCLC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cân25 cer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama (incluindo câncer de mama metastático), câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de 30 glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano. câncer testicular, câncer esofaqeano, tumores do trato biliar, assim como câncer de cabeça e pescoço, assim como subtipos de qualquer um de tais cânceres, incluindo, mas não-limitado a, tipos resistentes a quimioterapia, resistentes a platina, avançados, refratários e/ou recorrentes dos mesmos.
Um "tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER" é aquele que quando tratado com um inibidor de HER, tal como um anticorpo HER2 ou um inibidor de molécula pequena, mostra um benefício terapeuticamente eficaz no paciente de acordo com qualquer um dos critérios para eficácia terapêutica conhecidos pelo oncologista experiente, incluindo aqueles elaborados aqui, mas particularmente em termos de sobrevida, incluindo sobrevida livre de progressão (PFS) e/ou sobrevida global (OS). Preferivelmente, tal câncer é selecionado entre câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer da trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal. Mais preferivelmente, o câncer é ovariano, peritoneal ou câncer da trompa falopiana, incluindo formas resistentes a platina de tais cânceres, assim como câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
Um "tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER" é aquele que quando tratado com um inibidor da dimerização de HER, tal como pertuzumab, mostra um benefício terapeuticamen20 te eficaz no paciente de acordo com qualquer um dos critérios para eficácia terapêutica conhecidos pelo oncologista experiente, incluindo aqueles elaborados aqui, mas particularmente em termos de sobrevida, incluindo sobrevida livre de progressão (PFS) e/ou sobrevida global (OS). Preferivelmente, tal câncer é selecionado entre câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer da 25 trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal. Mais preferivelmente, o câncer é ovariano, peritoneal ou câncer da trompa falopiana, incluindo formas resistentes a platina de tais cânceres, assim como câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
Uma "resposta eficaz" e palavras similares referem-se a uma
resposta ao inibidor da dimerização de HER, inibidor de HER ou agente quimioterápico que é significativamente maior do que a resposta de um paciente que não expressa HER3 no nível designado.
Um câncer "avançado" é aquele que se espalhou pra fora do local ou do órgão de origem, tanto por invasão local quanto por metástases.
Um câncer "refratário" é aquele que progride mesmo quando um 5 agente antitumor, tal como um agente quimioterápico, está sendo administrado ao paciente com câncer. Um exemplo de um câncer refratário é aquele que é refratário a platina.
Um câncer "recorrente" é aquele que recidiva, tanto no local inicial quanto em um local a uma distância após uma resposta à terapia inicial. 10 Aqui, um "paciente" é um paciente humano. O paciente pode ser
um "paciente com câncer", isto é, aquele que sofre ou está em risco de sofrer de um ou mais sintomas de câncer.
Uma "amostra de tumor" aqui é uma amostra derivada de, ou que compreende células de, um tumor do paciente. Exemplos de amostras 15 de tumor incluem, mas não são limitadas a, biópsias de tumor, células circulantes de tumor, proteínas plasmáticas circulantes, fluido ascítico, culturas de células primárias ou linhagens celulares derivadas de tumor ou que exibem propriedades similares a tumor, assim como amostras de tumor preservadas, tais como amostras de tumor fixadas em formalina, amostras de tu20 mor embebidas em parafina ou amostras de tumor congeladas.
Uma amostra de tumor "fixada" é aquela que foi preservada histologicamente usando um fixador.
Uma amostra de tumor "fixada em formalina" é aquela que foi preservada usando formaldeído como o fixador.
Uma amostra de tumor "embebida" é aquela que é circundada
por um meio firme, geralmente duro, tal como parafina, cera, celoidina ou uma resina. A embebição toma possível o corte de seções finas para exame microscópico ou para geração de microarranjos de tecidos (TMAs).
Uma amostra de tumor "embebida em parafina" é aquela que é 30 circundada por uma mistura purificada de hidrocarbonetos sólidos derivados de petróleo.
"Congelada" refere-se aaui a uma amostra de tumor que é ou foi congelada.
Um câncer ou amostra biológica que "exibe expressão, amplificação ou ativação de HER” é aquele que, em um teste diagnóstico, expressa (incluindo superexpressa) um receptor de HER, tem um gene de HER 5 amplificado e/ou demonstra de outra maneira a ativação ou fosforilação de um receptor de HER.
Uma célula de câncer com "superexpressão ou amplificação de receptor de HER" é aquela que tem níveis significativamente altos de proteína ou gene de receptor de HER comparada com uma célula não-cancerosa 10 do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada pela amplificação ou pela transcrição ou tradução aumentadas do gene. A superexpressão ou amplificação de receptor de HER pode ser determinada em um ensaio diagnóstico ou prognóstico pela avaliação dos níveis elevados da proteína HER presente na superfície de uma célula (por exemplo, através de 15 um ensaio ímuno-histoquímico; IHC). Alternativamente, ou além disso, podese medir os níveis de ácido nucleico que codifica HER na célula, por exemplo, através de hibridização fluorescente in situ (FISH; vide W098/45479 publicada em Outubro de 1998), técnicas de Southern blot ou reação em cadeia da polimerase (PCR)1 tal como PCR quantitativa em tempo real (qRT20 PCR). Pode-se estudar a superexpressão ou amplificação do receptor de HER pela medida da dispersão do antígeno (por exemplo, domínio extraceIular de HER) em um fluido biológico tal como soro (vide, por exemplo, Patente U.S. N0 4.933.294 publicada em 12 de Junho de 1990; W091/05264 publicada em 18 de Abril de 1991; Patente U.S. 5.401.638 publicada em 28 25 de Março de 1995; e Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Junto com os ensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis para o versado experiente. Por exemplo, pode-se expor as células dentro do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo com 30 as células do paciente pode ser avaliada, por exemplo, por rastreamento externo da radioatividade ou pela análise de uma biópsia retirada de um paciente previamente exposto ao anticorpo. Ao contrário, um câncer que "não superexpressa ou amplifica um receptor de HER" é aquele que não tem níveis maiores do que os níveis normais de proteína ou gene de receptor de HER comparada com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Anticorpos que inibem a dimeri5 zação de HER, tal como pertuzumab, podem ser usados para tratar câncer que não superexpressa ou amplifica o receptor de HER2.
Um "agente antitumor" refere-se aqui a um fármaco usado para tratar o câncer. Exemplos não-limitantes de agentes antitumor incluem aqui agentes quimioterápicos, inibidores de HER, inibidores da dimerização de 10 HER, anticorpos para HER, anticorpos dirigidos contra antígenos associados a tumor, compostos anti-hormonais, citocinas, fármacos dirigidos a EGFR, agentes antiangiogênicos, inibidores da tirosina quinase, agentes e anticorpos inibitórios do crescimento, agentes citotóxicos, anticorpos que induzem apoptose, inibidores de COX, inibidores de farnesil transferase, anticorpos 15 que se ligam a proteína oncofetal CA 125, vacinas para HER2, inibidores de Raf ou ras, doxorrubícina lipossomal, topotecan, taxane, inibidores duplos de tirosina quinase, TLK286, EMD-7200, pertuzumab, trastuzumab, erlotinib e bevacizumab.
Um "agente antitumor aprovado" é um fármaco usado para tratar câncer ao qual foi concedida aprovação para comercialização por uma autoridade reguladora tal como Food and Drug Administration (FDA) ou seu equivalente estrangeiro.
Onde um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER é administrado como um "único agente antitumor", ele é o único agente antitumor administrado para tratar o câncer, isto é, ele não é administrado em combinação com outro agente antitumor, tal como quimioterapia.
Por "tratamento-padrão" é proposto aqui o agente ou agentes antitumor que são rotineiramente usados para tratar uma forma particular de câncer. Por exemplo, para um câncer ovariano resistente à platina, o tratamento-padrão é topotecan ou doxorrubícina lipossomal.
Um "agente inibitório do crescimento" quando usado aqui referese a um composto ou composição que inibe o crescimento da célula, especialmente uma célula cancerosa que expressa HER in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibitório do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a percentagem de células que expressam HER na fase S. Exemplos de agentes inibitórios do crescimento incluem aqueles que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um lugar diferente da fase S), tais como agentes que induzem a parada na fase G1 e a parada na fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de topo II, tais como doxorrubícina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G1 também interferem na parada da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexate, 5-fluorouracila e ara-C. Mais informações podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, Eds., Capítulo 1, com o título de "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs" por Murakami etal. (WB Saunders, Filadélfia, 1995), especialmente a p. 13.
Exemplos de anticorpos "inibidores do crescimento" são aqueles que se ligam a HER2 e inibem o crescimento de células cancerosas que superexpressam HER2. Anticorpos inibidores do crescimento de HER2 preferidos inibem o crescimento de células de tumor de mama SK-BR-3 em cultura 20 celular em mais do que 20% e, preferivelmente, em mais do que 50% (por exemplo, entre cerca de 50% a cerca de 100%) em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 Mg/ml, onde a inibição do crescimento é determinada seis dias após a exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (vide a Patente U.S. N0 5.677.171 publicada em 14 de Outubro de 1997). O 25 ensaio de inibição de crescimento de célula SK-BR-3 é descrito em mais detalhes naquela patente e aqui abaixo. O anticorpo inibitório de crescimento preferido é uma variante humanizada do anticorpo monoclonal de murino 4D5, por exemplo, trastuzumab.
Um anticorpo que "induz apoptose" é aquele que induz a morte celular programada como determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas de membrana (chamadas de corpos apoptóticos). A célula é aquela que geralmente superexpressa o receptor de HER2. Preferivelmente, a célula é uma célula de tumor, por exemplo, uma célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireoide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode 5 ser uma célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Vários métodos estão disponíveis para a avaliação dos eventos celulares associados com a apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida pela ligação a anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada através do encadeamento de DNA; e condensação nucle10 ar/cromatina junto com a fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento de células hipodiploides. Preferivelmente, o anticorpo que induz a apoptose é aquele que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 50 vezes e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, a indução da ligação a anexina em relação a uma célula não-tratada em um 15 ensaio de ligação a anexina usando células BT474 (vide abaixo). Exemplos de anticorpos para HER2 que induzem apoptose são 7C2 e 7F3.
O "epitopo 2C4" é a região no domínio extracelular de HER2 ao qual o anticorpo 2C4 se liga. A fim de rastrear os anticorpos que se ligam ao epitopo 2C4, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele des20 crito em Antibodies, A Laboratorial Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) pode ser realizado. Preferivelmente, o anticorpo bloqueia a ligação de 2C4 a HER2 em cerca de 50% ou mais. Alternativamente, o mapeamento de epitopo pode ser realizado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 2C4 de HER2. O epitopo 2C4 compreende resí25 duos do Domínio Il no domínio extracelular de HER2. 2C4 e pertuzumab se ligam ao domínio extracelular de HER2 na junção dos domínios I, Il e III. Franklin etal. Cancer Cell 5:317-328 (2004).
O "epitopo 4D5" é a região no domínio extracelular de HER2 ao qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e trastuzumab se ligam. Esse epitopo está perto do domínio transmembrana de HER2 e dentro do Domínio IV de HER2. Para rastrear anticorpos que se ligam ao epitopo 4D5, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aouele descrito em Antibodies, A Laboratorial Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) pode ser realizado. Alternativamente, o mapeamento de epitopo pode ser realizado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 4D5 de HER2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região entre o resíduo 5 529 a cerca do resíduo 625, incluindo ECD de HER2, numeração de resíduo incluindo peptídeo de sinal).
O "epitopo 7C2/7F3" é a região na terminação N, dentro do Domínio I, do domínio extracelular de HER2 a qual os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada qual depositado com a ATCC, vide abaixo) se ligam. Para rastrear an10 ticorpos que se ligam ao epitopo 7C2/7F3, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratorial Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) pode ser realizado. Alternativamente, o mapeamento de epitopo pode ser realizado para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 7C2/7F3 de HER2 (por exem15 pio, qualquer um ou mais resíduos na região entre o resíduo 22 a cerca do resíduo 53 de ECD de HER2, numeração de resíduo incluindo peptídeo de sinal).
"Tratamento" refere-se a ambos os tratamentos terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento 20 incluem aqueles que já têm câncer assim como aqueles nos quais o câncer deve ser prevenido. Portanto, o paciente a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticado como tendo câncer ou pode estar predisposto ou suscetível ao câncer.
As expressões "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quanti25 dade eficaz" referem-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar câncer em um paciente. A quantidade eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, desacelerar em alguma extensão e preferivelmente parar) a infiltração de célula cancerosa em órgãos periféricos; inibir (isto é, desacelerar em alguma ex30 tensão e preferivelmente parar) as metástases do tumor; inibir, em alguma extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com câncer. Na medida em que o fármaco previna o crescimento e/ou mate as células cancerosas existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica. A quantidade eficaz pode prolongar a sobrevida (por exemplo, como medida pelos Critérios de Avaliação de Resposta para Tumores Sólidos, RECIST, ou alterações em CA-125), resultando em 5 uma resposta objetiva (incluindo uma resposta parcial, PR, ou resposta completa, CR), melhorara sobrevida (incluindo a sobrevida global e a sobrevida livre de progressão) e/ou melhorar um ou mais sintomas de câncer (por exemplo, como avaliado por FOSI). Mais preferivelmente, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco é eficaz para melhorar a sobrevida livre de 10 progressão (PFS) e/ou a sobrevida global (OS).
"Sobrevida" refere-se ao paciente que permanece vivo e inclui a sobrevida global assim como a sobrevida livre de progressão.
"Sobrevida global" refere-se ao paciente que permanece vivo por um período de tempo definido, tal como 1 ano, 5 anos, etc. a partir do momento do diagnóstico ou do tratamento.
"Sobrevida livre de progressão" refere-se ao paciente que permanece vivo, sem progressão do câncer ou piorando.
Por "sobrevida prolongada" entende-se o aumento global ou a sobrevida livre de progressão em um paciente tratado com relação a um pa20 ciente não-tratado (isto é, com relação ao paciente não-tratado com inibidor de HER, inibidor da dimerização de HER, tal como pertuzumab) ou com relação a um paciente que não expresse HER3 ou HER2:HER3 no nível designado, e/ou com relação ao paciente tratado com um agente antitumor aprovado (tal como topotecan ou doxorrubícina lipossomal, onde o câncer é 25 câncer ovariano).
Uma "resposta objetiva" refere-se a uma resposta mensurável, que inclui a resposta completa (CR) ou uma resposta parcial (PR).
Por "resposta completa" ou "CR" é pretendido o desaparecimento de todos os sinais de câncer em resposta ao tratamento. Isso nem sempre significa que o câncer tenha sido curado.
"Resposta parcial" ou "PR" refere-se a uma diminuição do tamanho de um ou mais tumores ou lesões ou da extensão do câncer no corpo. em resposta ao tratamento.
A expressão "agente citotóxico" como usada aqui refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou que causa a destruição das células. A expressão pretende incluir isótopos radioativos 5 (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou de animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra
tamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquila tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquone, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilame15 Iaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietiIenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin e bullatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, 20 CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9- aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposideo; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); 25 eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostarda de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrossureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, 30 nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina omeqa 11 (vide, por exemplo, Nicolaou et al. Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, um inibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como neocarzinostatina cromofora e antibióticos cromóforos relacionados com a cromoproteína enediina), aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azasserina, 5 bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, doxorrubícina (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, injeção de doxorrubicina HCI lipossomal (DOXIL®), doxorrubícina TLC D-99 lipossomal (MYO10 CET®), doxorrubícina lipossomal peguilada (CAEL YX®), e deoxidoxorrubicina), epirrubicína, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mítomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocína, tubercidina, ubenimex, zínostatina, zorrubicina; antimeta15 bólitos tais como metotrexato, gencitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), um epotilona, e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6- 20 azauridína, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridína, enocitabina, floxuridina; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila: bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquone; elfornitina; a25 cetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; Ionidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazone; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2- etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSKcf (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rizoxina; sizofirano: 30 espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina. tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina): uretano; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulação de nanoparticula de paclitaxel manipulada em albumina (ABRAXANE®), e docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucila; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexate; agentes de platina tais como cis5 platina, oxaliplatina, e carboplatina; vincas, que previnem a polimerização de tubulina para formar microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINA®), FILDESIN®), e vinorelbina (NAVELBINA®); etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovovin; novantrona; edatrexate; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor da 10 topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinóico, incluindo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledronico/zoledronato (ZOMET A®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedrona15 to (ACTONEL®); troxacitabina (um análogo 1,3-dioxolano do nucleosídeo citosina); oligonucleotídeos antissenso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas em proliferação celular aberrante, tais como. por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e 20 vacinas para terapia com gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosina, inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib ou etoricoxib), inibidor de proteosoma (por exemplo, PS341); bortezo25 mibe (VELC ADE®); CCI-779; tipifarnibe (RI 1577); orafenibe, ABT510; inibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inibidores de EGFR (vide definição abaixo); inibidores de tirosina quinase (vide definição abaixo); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos 30 acima tal como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubícina, vincristina e prednisolona e FOLFOX, uma abreviação de um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN®) combinada com 5-FU e leucovovina.
Agentes quimioterápicos incluem, aqui, "agentes anti-hormonais" ou "terapêuticos endócrinos" que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento de câncer.
5 Eles podem ser os próprios hormônios, incluindo, mas não-limitado a, antiestrogênios com perfil misto de agonista/antagonista, incluindo tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, queoxifeno e moduladores seletivos de receptor de estrogênio (SERMs) tal como SERM3; antiestrogênios 10 puros sem propriedades agonistas, tais como fulvestrant (FASLODEX®) e EM800 (tais agentes podem bloquear a dimerização do receptor de estrogênio (ER), inibir a ligação de DNA, aumentar o turnover de ER e/ou suprimir os níveis de ER); inibidores da aromatase, incluindo inibidores da aromatase esteroidais tais como formestano e exemestano (AROMASIN®) e inibidores 15 da aromatase não esteroidais tais como anastrazol (ARIMIDEX®), Ietrozol (FEMARA®) e aminoglutetimida e outros inibidores da aromatase incluem vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®) fadrozol, e 4(5)imidazois; agonistas de hormônio que liberam hormônio luteinizante, incluindo Ieuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), goserelina, buserelina e tripterelina; 20 esteroides sexuais, incluindo progestinas tais como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrogênios tais como dietilestilbestrol e premarina, e androgênios/retinoides tais como fluoximesterona, ácido transretionico e fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores negativos de receptor de estrogênio (ERDs); anti-androgênios tais como flutamida, 25 nilutamida e bicalutamida; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima.
Um "agente quimioterápico antimetabólito" é um agente que é estruturalmente similar a um metabólito, mas não pode ser usado pelo corpo de uma maneira produtiva. Vários agentes quimioterápicos antimetabólitos interferem com a produção de ácidos nucleicos, RNA e DNA. Exemplos de agentes guimioterápicos antimetabólitos incluem gencitabina (GEMZAR®), 5-fluorouracila (5-FU), capecitabina (XELOD A®), 6-mercaptopurina, metotrexato, 6-tioguanina, pemetrexed, raltitrexed, arabinosilcitosina ARA-C citarabina (CYTOSAR-U®), dacarbazina (DTIC-DOME®), azocitosina, deoxicitosina, piridmideno, fludarabina (FLUDARA®), cladrabina, 2-deoxi-D-glicose etc. O agente quimioterápico antimetabólito preferido é gencitabina.
"Gencitabina" ou "mono-cloridrato de 2'-deóxi-2',2'difluorocitidina (isômero b) é um análogo de nucleosídeo que exibe atividade antitumor. A fórmula empírica para gemtabicina HCI é C9H11F2N304 HCI. Gencitabina HCI é vendido por Eli Lilly sob a marca registrada GEMZAR®.
Um "agente quimioterápico baseado em platina" compreende um
composto orgânico que contém platina como parte integrante da molécula. Exemplos de agentes quimioterápicos baseados em platina incluem carboplatina, cisplatina e oxaliplatina.
Por "quimioterapia baseada em platina" pretende-se uma terapia com um ou mais agentes quimioterápicos baseados em platina, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos.
Por "câncer resistente à quimioterapia" entende-se que o câncer do paciente progrediu apesar de receber um regime quimioterápico (isto é, o paciente é "refratário à quimioterapia") ou o paciente progrediu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) depois de completado o regime de quimioterapia.
Por câncer "resistente à platina" entende-se que o câncer do paciente progrediu apesar de receber uma quimioterapia baseada em platina (isto é, o paciente é "refratário à platina") ou o paciente progrediu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) depois de completado o regime de quimioterapia baseada em platina.
Um "agente antiangiogênico" refere-se a um composto que bloqueia ou interfere em algum grau com o desenvolvimento de vasos sanguíneos. O fator antiangiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena 30 ou um anticorpo que se ligue a um fator de crescimento ou receptor de fator do crescimento envolvido na promoção da angiogênese. O fator antiangioaênico preferido aqui é um anticorpo que se Iiqa ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal como bevacizumab (AVASTIN®).
A expressão "citoquina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celular que atua sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfoquinas, monoquinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão o hormônio do crescimento tal como hormônio do crescimento humano, Nmetionil hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireoidiano; tiroxina; insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios glicoprotéicos tais como hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH) e hormônio Iuteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; Iactogênio placentário; fator α e β de necrose do tumor; substância inibitória mulleriana; peptídeo associado gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nervo tais como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento transformantes (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator I e Il de crescimento similar à insulina; eritropoietina (EPO); fatores ósteo-indutivos; interferons tais como interferon-α, β e γ; fatores que estimulam colônia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócitomacrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); ínterleuquinas (ILs) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; fator de necrose do tumor tais como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e o Iigante kit (KL). Como usada aqui, a expressão citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citoquinas de seqüências nativas.
Como usada aqui, a expressão fármaco dirigido para EGFR” refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e 30 moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507). MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide, Patente US No. 4.943.533, Mendelsohn et al.) e suas variantes, tais como 225 quimérico (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225 humano transformado (H225) (vide, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, um anticorpo dirigido para EGFR totalmente humano, anticorpo dirigido para 5 EGFR (Imclone); anticorpos que se ligam a EGFR mutante tipo Il (Patente US No. 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que se ligam a EGFR como descrito em Patente US No. 5.891.996; e anticorpos humanos que se ligam a EGFR, tais como ABX-EGF (vide W098/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto etal. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 10 (matuzumabe) um anticorpo humanizado para EGFR dirigido contra EGFR que compete com ambos EGF e TGF-alfa pela ligação a EGFR; e mAb 806 ou mAb 806 humanizado (Johns et al, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, gerando assim um imunoconjugado (vide, por exemplo, EP659.439 A2, 15 Merck Patent GmbH). Exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZDI839 ou Gefitinib (IRESSA®; Astra Zeneca); CP-358774 ou Erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200.
Um "inibidor de tirosina quinase" é uma molécula que inibe a atividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase tal como um receptor de HER. Exemplos de tais inibidores incluem fármacos dirigidos para EGFR relacionados no parágrafo anterior; inibidor de tirosina quinase de HER2 de molécula pequena tal como TAK165 disponibilizado por Takeda; CP724.714, um inibidor oral seletivo de tirosina quinase do receptor ErbB2 (Pfizer e OSI); inibidores duplos de HER tal como EKB-569 (disponibilizado por Wyeth) que se liga preferencialmente a EGFR, mas inibe células que superexpressam ambos HER2 e EGFR; Gw572016 (disponibilizado por Glaxo), um inibidor oral de tirosina quinase de HER2 e EGFR; PKI- 166 (disponibilizado por Novartis); pan-inibidores de HER tal como canertinibe (CI-1033; Pharmacia); inibidores de Raf-1 tal como o agente antissenso ISIS-5132 disponibilizado por ISIS Pharmaceuticals que inibe a sinalização de Raf-1; inibidores de TK não dirigidos para HER tais como mesilato de Imatinibe (Gleevac®) disponibilizado por Glaxo; inibidor CI-1040 de quinase I extracelular regulado por MAPK (disponibilizado por Pharmacia); quinazolinas, tais como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706;
5 pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); trifostinas contendo porções de nitrotiofeno; PD-OI 83805 (Warner-Lamber); moléculas antissenso (por exemplo, aquelas que se ligam ao ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (Patente US No. 5.804.396); trifostinas (Patente US No. 10 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); paninibidores de HER tal como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatínibe (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKIine); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK- 787 (Novartis/Schering AG); INC-ICI 1 (Imclo15 ne); ou como descritos em qualquer um dos seguintes pedidos de patente: Patente US No. 5.804.396; W099/09016 (American Cyanimid); W098/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warner Lambert); W099/06378 (Warner Lambert); W099/06396 (Warner Lambert); W096/30347 (Pfizer, Inc); W096/33978 (Zeneca); W096/3397 (Zeneca); e W096/33980 (Zeneca).
Uma dose "fixa" ou "invariável" de um agente terapêutico refere
se a uma dose que é administrada a um paciente humano sem relação com peso (WT) ou área de superfície corporal (BSA) do paciente. A dose fixa ou invariável não é portanto fornecida como uma dose em mg/kg ou mg/m2, mas sim como uma quantidade absoluta do agente terapêutico.
Uma dose "de ataque” geralmente compreende uma dose inicial
de um agente terapêutico administrado a um paciente e é seguida por uma ou mais doses de manutenção do mesmo. Geralmente, uma dose de ataque única é administrada, mas doses de manutenção múltiplas são contempladas aqui. Geralmente, a(s) quantidade(s) da dose de ataque excede(m) a(s) 30 quantidade(s) da(s) dose(s) de manutenção administrada(s) e/ou a(s) doseis) de ataque é(são) administrada(s) mais frequentemente do que a(s) dose(s) de manutenção, de maneira a se obter a concentração invariável desejada do agente terapêutico mais cedo do que possa ser obtida com a(s) dose(s) de manutenção.
Uma dose de "manutenção" refere-se a uma ou mais doses de um agente terapêutico administrado a um paciente durante o período de tra5 tamento. Geralmente, as doses de manutenção são administradas em intervalos de tratamento espaçados, tais como aproximadamente a cada semana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas ou aproximadamente a cada 4 semanas.
Um "medicamento" é um fármaco ativo para tratar câncer, tal como um inibidor de HER, um inibidor da dimerização de HER (tal como pertuzumab) ou um agente quimioterápico (tal como gencitabina).
Uma "audiência-alvo" é um grupo de pessoas ou uma instituição para quem ou para qual um medicamento está sendo promovido ou pretendido ser promovido, como por comercialização ou propaganda, especialmen15 te para usos, tratamentos ou indicações particulares, tais como pacientes individuais, populações de pacientes, leitores de jornais, literatura médica, revistas, espectadores de televisão ou internet, ouvintes de rádio ou internet, médicos, indústrias farmacêuticas, etc.
Uma "bula" é usada para referir-se a instruções comumente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações a cerca das indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações, outros produtos combinados com o produto embalado, e/ou advertências com relação ao uso de tais produtos terapêuticos, etc.
II. Produção de Anticorpos Na modalidade preferida, como o inibidor de HER é um anticor
po, segue-se uma descrição das técnicas exemplares para a produção de anticorpos para HER usados de acordo com a presente invenção. O antígeno de HER a ser usado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de um receptor de HER ou 30 uma porção do mesmo, contendo o epitopo desejado. Alternativamente, as células que expressam HER em suas superfícies celulares (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas oara superexpressar HER2; ou uma linhagem celular de carcinoma tal como células SK-BR-3, vide Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) podem ser usadas para gerar anticorpos. Outras formas de receptores de HER úteis para gerar anticorpos ficarão evidentes para aqueles versados na técnica.
5 (i) Anticorpos policlonais
Anticorpos policlonais são preferivelmente originados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (se) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, 10 hemocianina de caramujo, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anídrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são 15 grupos alquila diferentes.
Animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados pela combinação, por exemplo, de 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em 20 múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto à titulação de anticorpo. Os animais são estimulados até o platô do título. Preferivelmente, o animal é estimulado com o conjugado, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de interligação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura 25 de célula recombinante como proteínas de fusão. Agentes agregantes tal como alúmem também podem ser adequadamente usados para intensificar a resposta imune.
(ii) Anticorpos monoclonais
Vários métodos para fazer anticorpos monoclonais estão disponíveis na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método do hibridoma, descrito primeiro por Kohler et ai, Nature 256:495 (1975), por métodos de DNA recombinante (Patente U.S. Nt 4.816.567).
No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como acima descrito para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos 5 que se ligam especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principie and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 10 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que contém, preferivelmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência de células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células parentais de 15 mieloma carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção em nível elevado estável de anticorpo pelas células que produzem anticorpo e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre essas, as linhagens celulares de mieloma preferidas são as linhagens de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores MOPC-21 e MPC-11 de camundongo, disponibilizadas pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, USA, e células SP-2 ou X63- Ag8-653, disponibilizadas por American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano também têm sido descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).
O meio de cultura no oual as células de hibridoma são cultivadas é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220(1980).
Após as células de hibridoma serem identificadas como aquelas 10 que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitante e cultivados por métodos padronizados (Goding, Monoclonal Antibodies: Principie and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para esse propósito incluem, por exemplo, meios D-MEM 15 ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia com hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especifica25 mente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como a fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que 30 não produzem anticorpos de outra maneira, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Em uma modalidade adicional, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson etal., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e seres humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos com alta afinidade (média nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, essas técnicas são alternativas viáveis para as técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da seqüência codificadora dos domínios constantes da cadeia pesada e da cadeia leve por seqüências homólogas de murino (Patente U.S. No. 20 4.816.567; e Morrison, etal, Proc. Natl Acad. Sci USA, 81 :6851 (1984)), ou pela ligação covalente à seqüência codificadora de imunogiobulina de toda ou parte da seqüência codificadora de um polipeptídeo não imunogiobulina.
Tipicamente, tais polipeptídeos não-imunoglobulinas são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou eles são substituídos 25 pelos domínios variáveis de um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que tem especificidade por um antígeno e outro sítio de combinação ao antígeno que tem especificidade por um antígeno diferente. Hii) Anticorpos humanizados 30 Métodos para humanização de anticorpos não-humanos têm
sido descritos na técnica. Preferivelmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é nãohumana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são geralmente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321 5 :522-525 (1986); Riechmann etal, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de seqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4.816.567),em que substancialmente menos 10 do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesa
do, a serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método "Best-fit", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de seqüências de domínio variável 20 humano conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima daquela do roedor é então aceita como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol., 151 :2296 (1993); Chothia et al, J. Mol Biol., 196:901 (1987)). Outro método usa uma região estrutural particular derivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um 25 subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol, 151 :2623 (1993)).
É importante ainda que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se atingir essa meta, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanos conceituais usando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulinas tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis das seqüências da imunogiobulina candidata selecionada estão disponíveis. A inspeção dessas apresentações permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência da imunogiobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a habilidade da imunogiobulina candidata de se ligar com seu antígeno. Dessa maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados do receptor e das seqüências importadas tal que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s)-alvo(s), seja obtida. Em geral, os resíduos de região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.
W001/00245 descreve a produção de anticorpos contra HER2 humanizados exemplares que se ligam e bloqueiam a ativação de um Iigante de um receptor de HER. O anticorpo humanizado de interesse particular aqui bloqueia essencialmente a ativação de MAPK mediada por EGF, TGF-a 20 e/ou HRG tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal 2C4 de murino (ou seu fragmento Fab) e/ou se liga a HER2 tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal 2C4 de murino (ou seu fragmento Fab). O anticorpo humanizado do mesmo pode, por exemplo, compreender resíduos de região hipervariável não-humana incorporados em um domínio variável pesado 25 humano e pode compreender ainda uma substituição na região estrutural (FR) em uma posição selecionada do grupo que consiste em 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração de domínio variável descrito por Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Em uma 30 modalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições em FR em duas ou em todas as posições 69H, 71H e 73H.
Um anticorpo humanizado exemplar de interesse aqui compreende resíduos determinantes de complementaridade de domínio pesado variável GFTFTDYTMX, onde X é preferivelmente D ou S (SEQ ID N°:7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID N°:8); e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID N°9), compreendendo, opcionalmente, modificações de aminoácidos daqueles 5 resíduos de CDR, por exemplo, onde as modificações mantêm ou melhoram essencialmente a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter entre cerca de uma a cerca de sete ou a cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR variáveis pesadas acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados por maturação por 10 afinidade, por exemplo, como descrito abaixo. O anticorpo humanizado mais preferido compreende a seqüência de aminoácidos do domínio pesado variável de SEQ ID N0 4.
O anticorpo humanizado pode compreender resíduos determinantes de complementaridade de domínio leve variável KASQDVSIGVA (SEQ ID N°10); SASYX1X2X3, onde X1 é preferivelmente R ou L, X2 é preferivelmente Y ou E, e X3 é preferivelmente T ou S (SEQ ID N0 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID N0 12), por exemplo, em adição àqueles resíduos de CDR de domínio pesado variável no parágrafo precedente. Tais anticorpos humanizados podem compreender opcionalmente modificações de aminoácidos nos resíduos de CDR acima, por exemplo, onde as modificações mantêm ou melhoram essencialmente a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter entre cerca de uma a cerca de sete ou a cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR variáveis leves acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados por maturação por afinidade, por exemplo, como descrito abaixo. O anticorpo humanizado mais preferido compreende a seqüência de aminoácidos do domínio leve variável de SEQ ID N0 3.
O presente pedido também contempla anticorpos maturados por afinidade que se ligam a HER2 e bloqueiam a ativação de um Iigante de receptor de HER. O anticorpo parental pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, um que compreenda as seqüências da região variável leve e/ou variável pesada de SEQ ID N0 3 e 4, respectivamente (isto é, compreendendo VL e/ou VH de pertuzumab). O anticorpo maturado por afinidade se liga, preferivelmente ao receptor de HER2 com uma afinidade superior àquela de 2C4 de murino ou pertuzumab (por exemplo, afinidade melhorada entre cerca de duas a cerca de quatro vezes, a cerca 5 de 100 vezes ou a cerca de 1000 vezes, por exemplo, como avaliado usando ELISA de um domínio extracelular (ECD) de HER2). Resíduos de CDR variável pesada exemplares para substituição incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete dos mesmos resíduos). Exemplos de resíduos de 10 CDR variável leve para alteração incluem L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois a três, quatro, cinco ou até cerca de dez dos mesmos resíduos).
Várias formas de anticorpo humanizado ou de anticorpo maturado por afinidade são contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado 15 ou o anticorpo maturado por afinidade podem ser um fragmento de anticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou o anticorpo maturado por afinidade pode ser um anticorpo inlacto, tal como um anticorpo IgGI intacto. O anticorpo IgGI intacto preferi20 do compreende a seqüência da cadeia leve de SEQ ID N0 13 e a seqüência da cadeia pesada de SEQ ID N0 14.
(iv) Anticorpos humanos
Como uma alternativa á humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgêni25 cos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunogiobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção (Jh) da cadeia pesada do anticorpo em camundongos quiméricos e da linhagem germinativa resulta em inibi30 çao completa da produção endógena de anticorpo. A transferência do arranjo de gene da imunogiobulina da linhagem germinativa humana em tal linhagem germinativa de camundongo mutante resultará na produção de anticorpos humanos após estimulação com antígeno. Vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Scí. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patente U.S. N0 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807. Alternativamente, pode 5 ser usada a tecnologia de apresentação em fago (McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene do domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores imunizados. De acordo com essa técnica, genes do domínio V do anticorpo são clonados em fase tanto com o gene da prote10 ína de revestimento principal quanto da secundária de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos funcionais de anticorpo sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia do DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resul15 tam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. A apresentação em fago pode ser realizada em uma variedade de formatos; para sua revisão vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de seg20 mentos de gene de V podem ser usadas para apresentação em fago. Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos antioxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser cons25 truído e anticorpos para um arranjo diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo, essencialmente, as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBOJ. 12:725-734 (1993). Vide também, Patente U.S. N0 5.565.332 e 5.573.905.
Como discutido acima, anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (vide Patentes U.S. N0 5.567.610 e 5.229.275).
Anticorpos humanos contra HER2 estão descritos na Patente U.S. N°5.772.997, emitida em 30 de junho de 1998 e WO 97/00271 publicada em 3 de janeiro de 1997.
(v) Fragmentos de anticorpo
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo que compreendem uma ou mais regiões de ligação ao antígeno. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados de anticorpos intactos através de digestão proteolítica (vide, por exemplo, Morimoto et al , Journal of Biochemical and Biophysieal Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan etal., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser produzidos agora diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fba-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão claras para o técnico experiente. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Vide, WO 93/16185; Patente U.S. N0 5.571.894; e Patente U.S. N0 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode ser também um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Patente U.S. N°5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser mono-específicos ou biespecíficos.
(vi) Anticorpos biespecíficos Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades
de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentes da proteína HER2. Outros de tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação de HER2 com sítio(s) de ligação para EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativamente, um bra30 ço de HER2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeante sobre um leucócito tal como uma molécula de receptor de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IqG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de maneira a focalizar os mecanismos de defesa celulares para a célula que expressa HER2. Anticorpos biespecíficos podem ser usados também para localizar agentes citotóxicos para células que expressam HER2. Esses anticorpos possuem um 5 braço de ligação a HER2 e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, cadeia A de ricina, metotrexate ou isótopo radioativo de hapteno). Anticorpos bi-específicos podem ser preparados como anticorpos de extensão completa ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab')2de anticorpos biespecíficos).
WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico para HER2/
FcyRIII e a Patente U.S. N0 5.837.234 descreve um anticorpo biespecífico para HER2/FcyRI IDMI (Osidem). Um anticorpo biespecífico para HER2/ Fca é mostrado em W098/02463. Patente U.S. N0 5.821.337 descreve um anticorpo biespecífico para HER2/CD3. MDX-210 é biespecifico para Ab HER2- FcyRIII.
Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de extensão completa é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunogiobulina, onde os dois pares têm especificidades diferen20 tes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido ao agrupamento aleatório das cadeias leve e pesada de imunogiobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é geralmente feita por etapas de cromato25 grafia por afinidade, é particularmente trabalhosa e o rendimento do produto é pequeno. Procedimentos similares estão descritos em WO 93/08829, e em Traunecker etal, EMBOJ., 10:3655-3659(1991).
De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios que combínam anticorpo-antígeno) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunogiobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunogiobulina, que compreende pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação a cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da 5 imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados para um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem rendimentos ótimos. Entretanto, é 10 possível inserir as seqüências codificadoras para duas ou todas três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em proporções iguais resulta em rendimentos altos ou quando as proporções não são de significância particular.
Em uma modalidade preferida dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve-pesada de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) em outro braço. Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, já que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Essa abordagem é descrita na WO 94/04690. Para mais detalhes de geração de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology, 121:210(1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N0 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende 30 pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, um ou mais aminoácidos pequenos das cadeias laterais da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídos por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias do mesmo tamanho ou similares as cadeias laterais maiores são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição de aminoácidos grandes das cadeias laterais por outros menores (por e5 xemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode 10 ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para direcionar células do sistema imune contra células indesejadas (Patente U.S. N0 4.676.980) e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando qualquer método de reticulação conveniente. Agen15 tes de reticulação adequados são bem-conhecidos na técnica e estão descritos na Patente U.S. N0 4.676.980, junto com várias técnicas de reticulação.
As técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também estão descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. 20 Brennan et ai, Science, 229:81 (1985) descreve um procedimento no qual anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2- Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente ditiol complexado com arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são en25 tão convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab1-TNB é então re-convertido para Fba'-tiol pela redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado de Fab’-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados para imobilização seletiva de enzimas.
O progresso recente tem facilitado a recuperação direta de
fragmentos Fab1-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et ai. J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente de E. coli e submetido ao acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado 5 foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor de HER2 e células T humanas normais, assim como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.
Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante também têm sido 10 descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et ai, J. Immunoi, 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar monôme15 ros e então re-oxidados para formar heterodímeros de anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "dicorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) tem fornecido um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos com20 preendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL)por um Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domínios complementares Vh e Vl de outro fragmento, formando 25 dessa maneira dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia simples também foi descrita. Vide Gruber et al., J. Immunoi, 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais do que duas valências são considerados. Por exemplo podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et ai J. Immunoi 147: 60 (1991).
(yü) Outras modificações de sequencia de aminoácidos Modificações de seqüência de aminoácidos dos anticorpos aqui descritos são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparados pela intro5 dução de alterações apropriadas de nucleotídeos no ácido nucleico do anticorpo ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para se chegar ao construto final, desde que o 10 construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-traducionais do anticorpo, tais como alterar o número ou posição de sítios de glicosilação.
Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são as localizações preferidas para mutagênese é chama15 do de "mutagênese por rastreamento de alanina" como descrito por Cunningham e Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou um grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, Iys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para 20 afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Aquelas localizações de aminoácidos que demonstram a sensibilidade funcional para substituições são então refinadas pela introdução adicional ou de outras variantes no ou para os sítios de substituição. Assim, apesar do sítio para introdução de uma variação de aminoácido ser predeterminado, a natureza da mutação per se 25 não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, o rastreamento de ala ou a mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpo expressas são rastreadas quanto a atividade desejada.
As inserções em seqüência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxi-terminais variando em extensão entre um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções íntra-sequência de um único ou de múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão na terminação N ou C do anticorpo de uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou de um po5 lipeptídeo que aumente a meia-vida sérica do anticorpo.
Outro tipo de variante é uma variante por substituição de aminoácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariá10 veis, mas alterações em FR também são consideradas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológica, então alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como descrito mais abaixo com relação a classes de 15 aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados.
Tabela 1
Resíduo ori¬ Substituições exemplares Substituições Pre¬ ginal feridas Ala (A) Vai. Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp GIy(G) Aa Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He(I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Vai; lie. Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala /ON
TUk
Illl Resíduo ori¬ Substituições exemplares Substituições Pre¬ ginal feridas Thr(T) Vai; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anti
corpo são obtidas pelas substituições seletivas que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção (a) da estrutura do arcabouço polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de fita ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) não-polares: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3)ácidos: Asp (D), Glu (E)
(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)
Alternativamente, os resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseado nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;
(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp1 Tyr, Phe.
Substituições não-conservativas envolverão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
Quaiquei iesiduu ut; ciàieíiict nãu tüivuiviuu na mãi iuit;i içãu ücj conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Inversamente, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente, 5 quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Um tipo preferido de variante por substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, as variantes resultantes, selecionadas para desenvolvimento posterior, terão 10 propriedades biológicas aperfeiçoadas em relação ao anticorpo parental a partir do qual elas foram geradas. Um modo conveniente para gerar tais variantes por substituição envolve a maturação por afinidade usando apresentação em fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de a15 minoácidos possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas em um aspecto monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões do produto M13 do gene Ill acondicionado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas em fago são então rastreadas quanto as suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de Ii20 gação) como aqui descrito. A fim de identificar sítios da região hipervariável candidatos a modificação, a mutagênese por rastreamento de alanina pode ser realizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antígeno. Alternativamente, ou adicionalmemente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo 25 antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e HER2 humana. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez que as variantes são geradas, o painel de variantes é submetido ao rastreamento como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em um ou 30 mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento posterior.
Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alterar, entende-se deletar uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.
A glicosilação de anticorpos é, tipicamente, tanto ligada a N quanto ligada a O. Ligada a N refere-se ao acoplamento da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para acoplamento enzimático da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de quaisquer dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O refere-se ao acoplamento de um dos açúcares Nacetilgalactosamina, galactose ou xilose à um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida pela alteração da seqüência de aminoácidos tal que ela contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeo acima descritas (para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina da seqüência original do anticorpo (para sítios de glicosilação ligados a O).
Onde o anticorpo compreende uma região Fe, o carboidrato acoplado a ela pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que carece de fucose acoplada a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente US N0 US2003/0157108 A1, Presta, L. Vide também US2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Anticorpos com uma N-acetilglicosamina dividida em dois (GIcNAc) no carboidrato acoplado a uma região Fc do anticorpo são citados em W003/011878, Jean-Marie et al. e Patente US N0 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo acoplado a uma região Fc são relatados em W097/30087, Patel et al. Vide também W098/58964 (Raju. S.) e W099/22764 (Raju, S.) com relação a anticorpos com carboidrato alterado acoplado à sua região Fe.
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relação a função efetora, por exemplo, de maneira a intensificar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou a citotoxicidade 5 dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode ser obtido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fe, permitindo dessa maneira a formação de ligação de dissulfeto entre as cadeias nessa região. O anticorpo homodi10 mérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Vide Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191- 1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunoi. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumor aumentada também podem ser pre15 parados usando reticuladores hetero-bifuncionais como descrito em Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que tem regiões Fc duplas pode ser manipulado e pode, dessa maneira, ter capacidades de Iise do complemento e ADCC aumentadas. Vide Stevenson et al·, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
WO00/42072 (Presta, L) descreve anticorpos com função ADCC
melhorada na presença de células efetoras humanas, onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácido na sua região Fe. Preferivelmente, o anticorpo com ADCC melhorada compreende substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos). Preferi25 velmente, a região Fc alterada é uma região Fe de IgGI humana que compreende ou consiste em substituições em uma, duas ou três dessas posições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com substituições com ligação aumentada a C1q e/ou CDC.
Anticorpos com ligação a C1q e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) alteradas estão descritos em W099/51642, Patente US N0 6.194.551 BI, Patente US N0 6.242.195BI, Patente US N0 6.528.624BI e Patente US N0 6.538.124 (Idusogie et al). Os anticorpos compreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 de sua região Fc (numeração EU de resíduos).
Para aumentar a meia vida sérica do anticorpo, pode-se incorpo5 rar um epitopo de ligação a receptor de resgate no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito, por exemplo, na Patente US N0 5.739.277. Como usada aqui, a expressão "epitopo de ligação a receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3 ou IgG^ que é responsável por aumentar a meia10 vida sérica da molécula de IgG in vivo.
Anticorpos com ligação aperfeiçoada ao receptor Fc neonatal (FcRn) e meias-vidas aumentadas estão descritos em W000/42072 (Presta, L.) e US2005/0014934A1 (Hinton et al). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesse lugar que aumentam a 15 ligação da região Fe a FcRn. Por exemplo, a região Fc pode ter substituições em uma ou mais das posições 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 ou 434 (numeração Eu de resíduos). A variante de anticorpo que compreende a região Fc preferida com ligação aumentada a FcRn, compreende substitui20 ções de aminoácidos em uma, duas ou três das posições 307, 380 e 434 da sua região Fc (numeração Eu de resíduos).
Anticorpos manipulados com três ou mais (preferivelmente quatro) sítios de ligação ao antígeno funcionais também são considerados (Pedido US N0 US2002/0004587 Al, Miller et al).
As moléculas de ácido nucleico que codificam as variantes de
seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não são limitados ao isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácidos que ocorrem naturalmente) ou pela preparação por 30 mutagênese mediada (ou direcionada ao sítio) por oligonucleotídeo, mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma versão preparada anteriormente ou uma não-variante de anticorpo. (viii) Rastreamento de anticorpos com as propriedades desejadas
As técnicas para gerar anticorpos foram descritas acima. Podese ainda selecionar aos anticorpos com certas características biológicas, como desejado.
5 Para identificar um anticorpo que bloqueie a ativação de um Ii
gante de um receptor de HER, a habilidade do anticorpo em bloquear a ligação do Iigante de HER em células que expressam o receptor de HER (por exemplo, em conjugação com outro receptor de HER com o qual o receptor de HER de interesse forma um hetero-oligômero de HER) pode ser determi10 nada. Por exemplo, células que expressam naturalmente ou transfectadas para expressar os receptores de HER do hetero-oligômero de Her podem ser incubadas com o anticorpo e então expostas ao Iigante de HER marcado. A habilidade do anticorpo em bloquear a ligação do Iigante ao receptor de HER no hetero-oligômero de HER pode, então, ser avaliada.
Por exemplo, a inibição do Iigante de HRG em linhagens celula
res MCF7 de tumor de mama pelos anticorpos para HER2 pode ser realizada usando culturas em monocamadas de MCF7 sobre gelo em um formato de placa de 24 poços, essencialmente como descrito em W001/00245. Anticorpos monoclonais para HER2 podem ser adicionados a cada poço e incu20 bados por 30 minutos. rHRGpi177.224 marcado com 125I (25 pm)pode então ser adicionado e a incubação pode ser continuada por 4 a 16 horas. As curvas de dose-resposta podem ser preparadas e um valor de IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma modalidade, o anticorpo que bloqueia a ativação do Iigante de um receptor de HER terá uma IC50 pa25 ra a inibição da ligação de HRG em células MCF7 nesse ensaio de cerca de 50 nM ou menos, mais preferivelmente 10 nM ou menos. Onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, a IC50 para a inibição da ligação de HRG em células MCF7 nesse ensaio pode, por exemplo, ser de cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.
Alternativamente ou além disso, a habilidade de um anticorpo
em bloquear a fosforilação de tirosina estimulada pelo Iigante de HER de um receptor de HER presente em um hetero-oligômero de HER pode ser avaliada. Por exemplo, células que expressam receptores de HER endogenamente ou transfectadas para expressá-los podem ser incubadas com o anticorpo e em seguida ensaiadas à atividade de fosforilação de tirosina dependente de Iigante de HER usando um anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina (que é 5 opcionalmente conjugado com um marcador detectável). O ensaio de ativação de receptor de quinase descrito na Patente U.S. N0 5.766.563 também está disponível para determinar a ativação do receptor de HER e o bloqueio desta atividade por um anticorpo.
Em uma modalidade, pode-se rastrear um anticorpo que inibe a estimulação por HRG da fosforilação de tirosina quinase p180 em células MCF7 essencialmente como descrito em W001/00245. Por exemplo, as células MCF7 podem ser plaqueadas em placas de 24 poços e anticorpos monoclonais para HER2 podem ser adicionados a cada poço e incubados por minutos em temperatura ambiente; então, rHRGpi 177.224 pode ser adicionado até uma concentração final de 0,2 nM e a incubação pode ser continuada por 8 minutos. O meio pode ser aspirado de cada poço e as reações podem ser paralisadas pela adição de 100 μΙ de tampão de amostra SDS (SDS a 5%, DTT a 25 mM e Tris-HCI a 25 mM, pH 6,8). Cada amostra (25 μΙ) pode ser submetida à eletroforese em um gel de gradiente de 4-12% (Novex) e então transferidas eletroforeticamente para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. "Imunoblots" de antifosfotirosina (1 μg/ml) podem ser desenvolvidos e a intensidade da banda em Mr~180.000 pode ser quantificada por densitometria de refletância. O anticorpo selecionado inibirá preferivelmente significativamente a estimulação por HRG da fosforilação de tirosina p180 para cerca de 0 a 35% do controle do mesmo ensaio. A curva de dose-resposta para a inibição da estimulação por HRG da fosforilação de tirosina p180 como determinada pela densitometria de refletância pode ser preparada e uma IC50 para o anticorpo de interesse pode ser calculada. Em uma modalidade, o anticorpo que bloqueia a ativação do Iigante de um receptor de HER terá uma IC50 para a inibição da estimulação por HRG da fosforilação de tirosina p180 nesse ensaio de cerca de 50 nM ou menos, mais preferivelmente 10 nM ou menos. Onde 0 anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, a IC50 para a inibição da estimulação por HRG da fosforilação de tirosina p180 nesse ensaio pode, por exemplo, ser de cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.
Pode-se avaliar os efeitos inibitórios do anticorpo sobre o crescimento de células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente como descrito por Schaefer et ai, Oncogene 15:1385-1394 (1997). De acordo com esse ensaio, células MDA-MB-175 podem ser tratadas com anticorpo monoclonal para HER2 (10 μ9/ηιΙ) por 4 dias e coradas com cristal violeta. A incubação com um anticorpo HER2 pode mostrar um efeito inibitório do crescimento sobre essa linhagem celular similar àquele apresentado pelo anticorpo monoclonal 2C4. Em uma modalidade adicional, HRG exógeno não reverterá significativamente essa inibição. Preferivelmente, o anticorpo será capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 em uma extensão maior do que o anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente, em uma extensão maior do que o anticorpo 7F3), tanto na presença quanto na ausência de HRG exógeno.
Em uma modalidade, o anticorpo HER2 de interesse pode bloquear a associação de HER2 com HER3 dependente de heregulina em ambas as células MCF7 e SK-BR-3 como determinado em um experimento de 20 coimunoprecipitação tal como aquele descrito em W001 /00245, substancialmente mais eficazmente do que o anticorpo monoclonal 4D5 e, substancialmente mais eficazmente do que o anticorpo monoclonal 7F3.
Para identificar anticorpos para HER2 inibitórios de crescimento, pode-se rastrear anticorpos que inibem o crescimento de células cancerosas 25 que superexpressam HER2. Em uma modalidade, o anticorpo inibitório de crescimento de escolha é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em uma cultura celular em cerca de 20 a 100% e preferivelmente em cerca de 50 a 100% em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μg/ml. Para identificar tais anticorpos, o ensaio de SK-BR-3 descrito na Pa30 tente U.S. N°5.677.171 pode ser realizado. De acordo com esse ensaio, as células SK-BR-3 são cultivadas em uma mistura 1:1 de F12 e meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%, Qlutamina1 penicilina e estreptomicina. As células SK-BR-3 são plaqueadas em 20.000 células em uma placa de cultura celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm). 0,5 a 30 μο/ιτιΙ de anticorpo HER2 são adicionados a cada placa. Após seis dias, o número de células, comparado com células não-tratadas, é contado usando um conta5 dor celular eletrônico COULTER®. Aqueles anticorpos que inibem o crescimento de células SK-BR-3 em cerca de 20 a 100% ou cerca de 50 a 100% podem ser selecionados como anticorpos inibitórios de crescimento. Vide Patente U.S. N°5.677.171 para ensaios de rastreamento de anticorpos inibitórios de crescimento, tais como 4D5 e 3E8.
A fim de selecionar anticorpos que induzem a apoptose, um en
saio de ligação à anexina usando células B1474 está disponível. As células BT474 são cultivadas e semeadas em placas como discutido no parágrafo precedente. O meio é então removido e substituído por meio fresco apenas ou meio contendo 10 μg/ml de anticorpo monoclonal. Depois de um período 15 de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são então centrifugadas, ressuspensas em tampão de ligação Ca2+ e aliquotadas em tubos como discutido acima, para o ensaio de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (por exemplo, anexina V-FTIC) (1 μg/ml). As amostras podem ser analisadas 20 usando um citômetro de fluxo FACSCAN® e o programa FACSCONVERT® CeIIQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação à anexina em relação ao controle, são selecionados como anticorpos indutores de apoptose. Além do ensaio de ligação à anexina, um ensaio de coloração de DNA usando células BT474 25 está disponível. A fim de realizar esse ensaio, as células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse como descrito nos dois parágrafos precedentes, são incubadas com 9 μg/ml de HOECHST 33342® por 2 h a 37°C, então analisadas em um citômetro de fluxo EPICS ELITE® (Coulter Corporation) usando o programa MODFIT LT® (Verity Software House). An30 ticorpos que induzem uma alteração na percentagem de células apoptóticas que é de 2 vezes ou mais (e preferivelmente de 3 vezes ou mais) do que as células não-tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionados como anticorpos pró-apoptóticos usando esse ensaio. Vide W098/17797 para ensaios de rastreamento de anticorpos que induzem apoptose, tais como 7C2 e 7F3.
Para rastrear anticorpos que se ligam a um epitopo sobre HER2 5 ligada por um anticorpo de interesse, um ensaio de rotina de bloqueio cruzado, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado para avaliar se o anticorpo bloqueia a ligação de um anticorpo, tal como 2C4 ou pertuzumab, a HER2. Alternativamente, ou além disso, o mape10 amento de epitopo pode ser realizado por métodos conhecidos na técnica e/ou pode-se estudar a estrutura de anticorpo-HER2 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004))para ver qual / quais domínio/domínios de HER2 é/são ligados pelo anticorpo.
(ix) Composições de pertuzumab Em uma modalidade de uma composição de anticorpo HER2, a
composição compreende uma mistura de uma espécie principal de pertuzumab e uma ou mais de suas variantes. A modalidade preferida aqui de uma espécie principal de anticorpo de pertuzumab é aquela que compreende as seqüências de aminoácidos variável leve e variável pesada nas SEQ ID N0 3 20 e 4 e, o mais preferivelmente, que compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve selecionada entre SEQ ID N0 13 e 17 e uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada entre SEQ ID N0 14 e 18 (incluindo variantes desamidadas e/ou oxidadas dessas seqüências). Em uma modalidade, a composição compreende uma mistura da espécie principal de 25 anticorpo pertuzumab e uma seqüência de aminoácidos variante do mesmo que compreende uma extensão líder amino-terminal. Preferivelmente, a extensão líder amino-terminal está em uma cadeia leve da variante de anticorpo (por exemplo, sobre uma ou duas cadeias leves da variante de anticorpo). A espécie principal de anticorpo HER2 ou o anticorpo variante podem 30 ser um anticorpo de extensão completa ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos Fab ou F(ab')2), mas preferivelmente ambos são anticorpos de extensão completa. A variante de anticorpo pode compreender uma extensão líder amino-terminal sobre qualquer uma ou mais das suas cadeias pesada ou leve. Preferivelmente, a extensão líder amino-terminal está em uma ou duas cadeias leves do anticorpo. A extensão líder aminoterminal preferivelmente compreende ou consiste em VHS. A presença da 5 extensão líder amino-terminal na composição pode ser detectada por várias técnicas analíticas incluindo, mas não-limítadas a análise da seqüência Nterminal, ensaio para heterogenicidade de carga (por exemplo, cromatografia por troca de cátion ou eletroforese de zona capilar), espectrometria de massa, etc. A quantidade da variante de anticorpo na composição geralmente 10 varia entre uma quantidade que constitui o limite de detecção de qualquer ensaio (preferivelmente a análise da seqüência N-terminal) usado para detectar a variante a uma quantidade menor do que a quantidade da espécie principal do anticorpo. Geralmente, cerca de 20% ou menos (por exemplo entre cerca de 1% a cerca de 15%, por exemplo, entre cerca de 5% a cerca 15 de 15%) das moléculas do anticorpo na composição compreendem extensão líder amino-terminal. Tais quantidades percentuais são preferivelmente determinadas usando uma análise quantitativa da seqüência N-terminal ou análise por troca de cátion (preferivelmente usando uma coluna de alta resolução, de troca de cátion fraco, tal como a coluna de troca de cátion PRO20 PAC WCX-10™). Ao lado da extensão líder amino-terminal variante, alterações adicionais da seqüência de aminoácidos da espécie principal do anticorpo e/ou variante são consideradas, incluindo mas não-limitadas a um anticorpo que compreende um resíduo de Iisina C-terminal em uma ou em ambas as cadeias pesadas, uma variante desamídada de anticorpo, etc.
Além disso, a espécie principal do anticorpo ou a variante podem
compreender ainda variações de glicosilação, exemplos não-limitantes dos quais incluem um anticorpo que compreende uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2 acoplada a sua região Fe, anticorpo que compreende uma porção de carboidrato acoplada a sua cadeia leve (por exemplo, uma ou du30 as porções de carboidrato, tais como glicose ou galactose, acopladas a uma ou duas cadeias leves do anticorpo, por exemplo acopladas a um ou mais resíduos de lisina), anticorpo que compreende uma ou duas cadeias pesadas não-glicosiladas ou anticorpo que compreende um oligossacarídeo sialidado acoplado a uma ou mais de suas cadeias pesadas, etc.
A composição pode ser recuperada a partir de uma linhagem celular manipulada geneticamente, por exemplo, uma linhagem celular de 5 ovário de hamster chinês (CHO) que expressa o anticorpo HER2 ou pode ser preparado por síntese de peptídeo.
(x) Imunoconiuqados
A invenção também refere-se a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente 10 quimioterápico, toxina (por exemplo, toxina de molécula pequena ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou de animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes) ou a um isótopo radioativo (isto é um radioconjugado).
Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como caliqueamina, maitansina (Patente U.S N0 5.208.020), um tricoteno e CC1065 também são considerados aqui.
Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo é conjugado com uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a 20 cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). Maitansina pode, por exemplo, ser convertida para May-SS-Me que pode ser reduzida para May-SH3 e reagida com anticorpo modificado (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado de maitansinoide-anticorpo.
Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo
conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina são capazes de produzir quebras em DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a γΛ Cx2', αβ1, N-acetil-γ-ι', PSAG e ΘΊ1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342
(1993) and Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Vide também, Patente US Nos. 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586; e 5.773.001 expressamente incorporadas aqui por referência.
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usadas incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não Iigantes de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), ca5 deia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 10 publicada em 28 de Outubro de 1993.
A presente invenção contempla ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como desoxiribonuclease; DNase).
Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a
produção de radioconjugados de anticorpos para HER2. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu.
Conjugados de anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeido), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolieno 2,6-di-isocianato), e compostos de flúor bisativos (tal como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com Carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide W094/11026. O Iiaante pode ser um "liqante clivável" que facilita a liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um Iigante ácido lábil, um Iigante sensível a peptidase: um Iigante de dimetil ou Iigante contendo dissulfeto (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) podem ser usados.
Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anti5 corpo e o agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo.
Outros imunoconjugados são considerados aqui. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros nãoproteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialqui10 Ienos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo pode ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de (metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas coloidais de liberação de fármaco (por 15 exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticuias e nanocápsulas) ou em outras macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
Os anticorpos aqui descritos podem ser também formulados co20 mo imunolipossomas. Lipossomas que contêm o anticorpo são preparados por métodos conhecidos ns técnica, tal como descrito em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82:3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 77:4030 (1980); Pat. U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e W097/38731 publicada em 23 de Outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação au25 mentado estão descritos na Pat. U.S. No 5.013.556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição Iipidica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e PEG-fosfatidiletanolamina derivatizada (PEG-PE). Lipossomas são expelidos através de filtros de tamanho de poro 30 definido para se obter lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab1 do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de intercâmbio de dissulfeto. Um agente quimioterápico está contido, opcionalmente, dentro do lipossoma. Vide, Gabizon et al. J. National Cancer /nsf.81(19)1484 (1989).
III. Métodos de Diagnóstico
Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer (por exemplo, câncer ovariano) que é capaz de responder a um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab), que compreende determinar a expressão de HER3 em uma amostra de câncer do paciente e selecionar um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER como a terapia se a amostra de câncer expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer e/ou se a amostra de câncer expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil (ou maior do que o nível mediano) da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
Em um segundo aspecto, a invenção fornece um método para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer (por exemplo, câncer ovariano) que é capaz de responder a um agente quimioterápico que compreende determinara expressão de HER3 em uma amostra de câncer de um paciente e selecionar um agente quimioterápico (por exemplo, gencitabina) como a terapia, se a amostra de câncer expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano de expressão de HER3 no tipo de câncer.
O nível mediano ou o percentil de expressão podem ser determinados essencialmente ao mesmo tempo em que a medida da expressão de HER3 (ou expressão de HER2 e HER3) ou podem ser determinados previamente.
Antes dos métodos terapêuticos descritos abaixo, o(s) nível/níveis de expressão de HER3 e, opcionalmente, o(s) nível/níveis de expressão de HER2, em um paciente com câncer, é/são avaliados. Geralmente, uma amostra biológica é obtida do paciente que necessita de terapia, cuia amostra é submetida a um ou mais ensaios diagnósticos, geralmente pelo menos um ensaio diagnóstico in vitro (IVD). Entretanto, outras formas para avaliar a expressão de HER3 e/ou de HER2, tal como o diagnóstico in vivo, são expressamente consideradas aqui. A amostra biológica é geralmente uma amostra de tumor, preferivelmente amostra de tumor de câncer ovaria5 no, câncer peritoneal, câncer da trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), câncer de próstata ou câncer colorretal.
A amostra biológica pode ser uma amostra fixada, por exemplo, uma amostra fixada em formalina, amostra embebida em parafina (FFPE) ou uma amostra congelada.
Vários métodos para determinar a expressão de mRNA ou de proteína incluem, mas não são limitados a definição do perfil de expressão de gene, reação em cadeia da polimerase (PCR) incluindo PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), análise de microarranjo, análise seriada de ex15 pressão de gene (SAGE), MassARRAY, Análise de Expressão de Gene por Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS), proteômicos, imunohistoquímica (IHC), etc. Preferivelmente o mRNA é quantificado. Tal análise de mRNA é preferivelmente realizada usando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por análise de microarranjo. Onde PCR é emprega20 da, uma forma preferida de PCR é PCR quantitativa em tempo real (qRTPCR). O ensaio de qRT-PCR preferido está descrito no Exemplo 1 abaixo.
As etapas de um protocolo representativo para a definição do perfil de expressão de gene usando tecidos fixados, embebidos em parafina como fonte de RNA, incluindo o isolamento, purificação, extensão de inicia25 dor e amplificação de mRNA são dadas em vários artigos publicados em jornais (por exemplo: Godfrey et al J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo inicia-se com o corte de seções espessas com cerca de 10 microgramas de amostras de tecido de tumor embebidas em parafina. 30 O RNA é então extraído e a proteína e o DNA são removidos. Após a análise da concentração de RNA, as etapas de reparo e/ou amplificação de RNA podem estar incluídas, se necessário, e o RNA é transcrito reversamente usando promotores específicos para o gene seguido por PCR. Finalmente, os dados são analisados para identificar a(s) melhor(es) opção/opções de tratamento disponível/disponíveis para o paciente com base no padrão de expressão característico do gene identificado na amostra de tumor examina5 da.
Vários métodos exemplares para determinar a expressão do gene serão descritos agora em mais detalhes.
(i) Definição do perfil de expressão de gene
Em geral, os métodos de definição de perfil de expressão de gene podem ser divididos em dois grandes grupos: métodos baseados na análise de hibridização de polinucleotídeos e métodos baseados no sequenciamento de polinucleotídeos. Os métodos mais comumente usados conhecidos na técnica para a quantificação da expressão de mRNA em uma amostra incluem northern blotting e hibridização in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensaios de proteção de RNAse (Hod, Biotechniques 13:852- 854 (1992)); e reação em cadeia da polimerase (PCR) (Weis et al, Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de DNA, dúplices de RNA e dúplices híbridos de DNA-RNA ou dúplices de proteína-DNA. Métodos representativos para análise de expressão de gene baseada no sequenciamento incluem a Análise Seriada de Expressão de gene (SAGE) e a análise de expressão de gene por Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS).
(ii) Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Das técnicas listadas acima, um método quantitativo sensível e
flexível é PCR, que pode ser usada para comparar níveis de mRNA em populações de amostras diferentes, em tecidos normais e de tumor, com ou sem tratamento com fármaco, para caracterizar padrões de expressão de gene, para discriminar entre mRNAs estreitamente correlacionados e para analisar a estrutura de RNA.
A primeira etapa é o isolamento de mRNA de uma amostra-alvo. O material inicial é tipicamente RNA total isolado de tumores humanos ou linhagens celulares de tumor e de tecidos e de linhagens celulares normais correspondentes, respectivamente. Assim, o RNA pode ser isolado de uma variedade de tumores primários, incluindo tumores de mama, pulmão, colon, próstata, cérebro, fígado, rim, pâncreas, baço, timo, testículo, ovário, útero, 5 etc., ou de linhagens celulares tumorais, com DNA agrupado de doadores saudáveis. Se a fonte de mRNA é um tumor primário, o mRNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ou arquivadas embebidas em parafina e fixadas (por exemplo, fixada em parafina). Métodos comuns para extração de mRNA são bem-conhecidos na técnica e são des10 critos em livros de texto padronizados de biologia molecular, incluindo Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Métodos para extração de RNA de tecidos embebidos em parafina são descritos, por exemplo em Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), e De Andres et al, BioTechniques 18:42044 (1995). Em particular, o isola15 mento de RNA pode ser realizado usando um kit de purificação, tampão pronto e protease de fabricantes comerciais, tais como Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA total de células em cultura pode ser isolado usando minicolunas Qiagen RNeasy. Outros kits para isolamento de RNA comercialmente disponíveis incluem MASTERPURE® 20 Complete DNA e RNA Purification Kit (EPICENTRE®, Madison, Wis.), e Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). RNA total de amostras de tecido pode ser isolado usando RNA Stat-60 (Tel-Test). RNA preparado a partir de um tumor pode ser isolado, por exemplo, por centrifugação com gradiente de densidade com cloreto de césio.
Como RNA não serve como um modelo para PCR, a primeira
etapa na definição do perfil de expressão de gene por PCR é a transcrição reversa do modelo de RNA em cDNA, seguida por sua amplificação exponencial em uma reação de PCR. As duas transcriptases reversas mais comumente usadas são a transcriptase reversa de vírus de mieloblastose aviá30 ria (AMV-RT) e a transcriptase reversa do vírus da leucemia de Moloney de murino (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa é tipicamente iniciada usando iniciadores específicos, hexâmeros aleatórios ou iniciadores de oligo-dT, dependendo das circunstâncias e da meta de definição de perfil de expressão. Por exemplo, o RNA extraído pode ser transcrito reversamente usando um kit GENEAMP® RNA PCR (Perkin Elmer, Califórnia, USA), seguindo as instruções do fabricante. O cDNA derivado pode então ser usado 5 como um modelo na reação de PCR subsequente. Embora a etapa de PCR possa usar uma variedade de polimerases de DNA dependentes de DNA termoestável, ela emprega tipicamente a Taq DNA polimerase que tem uma atividade de 5'-3' nuclease mas que carece da atividade 3-5' de correção de erros de endonuclease. Assim, TAQMAN® PCR utiliza tipicamente a ativida10 de 5'-nuclease de Taq ou Tth polimerase para hidrolisar uma sonda de hibridização ligada a seu amplicon-alvo, mas qualquer enzima com atividade 5' nuclease equivalente pode ser usada. Dois iniciadores de oligonucleotídeos são usados para gerar um amplicon típico de uma reação de PCR. Um terceiro oligonucleotídeo ou sonda é designado para detectar a seqüência de 15 nucleotídeos entre os dois iniciadores de PCR. A sonda não é extensível pela enzima Taq polimerase e é marcada com um corante fluorescente repórter e um corante fluorescente repressor. Qualquer emissão induzida por laser do corante repórter é reprimida pelo corante repressor quando os dois corantes estão localizados muito próximos como eles estão sobre a sonda. 20 Durante a reação de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase cliva a sonda de uma maneira dependente do modelo. Os fragmentos resultantes da sonda se dissociam em solução e o sinal do corante repórter liberado está livre do efeito repressor do segundo fluoróforo.Uma molécula do corante repórter é liberada para cada nova molécula sintetizada e a detecção do co25 rante repórter não reprimido fornece a base para a interpretação quantitativa dos dados.
TAQMAN®PCR pode ser realizado usando um equipamento comercialmente disponível, tal como, por exemplo, ABI PRISM 7700® Sequence Detection System® (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Cali30 fórnia, USA) ou Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). Em uma modalidade preferida, o procedimento com a 5'nuclease é corrido em um equipamento de PCR quantitativa em tempo real tal como o ABI PRISM 7700® Sequence Detection System. O sistema consiste em um termociclador, laser, dispositivo de carga acoplado (CCD), câmera e computador. O sistema amplifica amostras em um formato de 96 poços no termociclador. Durante a amplificação, o sinal fluorescente induzido por laser é cole5 tado em tempo real através de cabos de fibra óptica para todos os 96 poços e detectado no CCD. O sistema inclui um programa para ativar o instrumento e para análise de dados.
Os dados do ensaio com 5'-nuclease são expressos inicialmente como Ct ou o ciclolimiar.
Para minimizar erros e o efeito da variação de amostra para a
mostra, PCR é geralmente feita usando um padrão interno. O padrão interno ideal é expresso em um nível constante entre tecidos diferentes e não é afetado pelo tratamento experimental. RNAs mais frequentemente usados para normalizar padrões de expressão de gene são mRNAs para genes residentes de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e P-actina.
Uma variação mais recente da técnica de PCR é a PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), que mede a acumulação de produto de PCR através de uma sonda fluorescente duplamente marcada (isto é, sonda TAQMAN®). PCR em tempo real é compatível com ambas PCR quantitativa 20 competitiva, onde o competidor interno para cada sequência-alvo é usado para a normalização, e com PCR quantitativa comparativa usando um gene para normalização contido dentro da amostra ou um gene residente para PCR. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996).
As etapas de um protocolo representativo para definição do perfil
de expressão de gene usando tecidos fixados, embebidos em parafina como a fonte de RNA, incluindo o isolamento, purificação, extensão do iniciador e a amplificação de mRNA são dadas em vários artigos publicados em jornais (por exemplo, Godfrey et al., J. Molec. Diagnostics 2:84-91 (2000); Specht et 30 al., Am. J. Pathol. 158:419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo inicia-se com o corte de seções espessas com cerca de 10 microgramas de amostras de tecido de tumor embebidas em parafina. O RNA é então extraído e a proteína e o DNA são removidos. Após a análise da concentração de RNA, as etapas de reparo e/ou amplificação de RNA podem estar incluídas, se necessário, e o RNA é transcrito reversamente usando promotores específicos para o gene seguido por PCR.
5 De acordo com um aspecto da presente invenção, iniciadores e
sondas de PCR são designados baseado nas seqüências de íntron presentes no gene a ser amplificado. Nessa modalidade, a primeira etapa no planejamento do iniciador/sonda é a delineação das seqüências de intron dentro dos genes. Isso pode ser feito com um programa disponível publicamente, 10 tal como o programa DNA BLAT desenvolvido por Kent, W., Genome Res. 12(4):656-64 (2002) ou pelo programa BLAST incluindo suas variações. As etapas subsequentes seguem os métodos bem estabelecidos para o planejamento de iniciador e sonda de PCR.
A fim de evitar sinais não-específicos, é importante mascarar seqüências repetitivas dentro dos íntrons quando se planeja os iniciadores e sondas. Isso pode ser facilmente obtido pelo uso do programa Repeat Masker, disponível "on-line" através do Baylor College of Medicine, que rastreia seqüências de DNA contra uma biblioteca de elementos repetitivos e retorna com uma seqüência de consulta na qual os elementos repetitivos são mascarados. As seqüências mascaradas de íntrons podem então ser usadas para planejar as seqüências do iniciador e da sonda usando quaisquer pacotes de planejamento de iniciador/sonda disponíveis comercialmente ou publicamente de outra maneira, tais como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer 3 (Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 na internet para usuários comuns e para biólogos programadores. Em: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Bioiogy. Humana Press, Totowa, N.J., pp 365-386).
Fatores considerados no planejamento do iniciador de PCR incluem a extensão do iniciador, temperatura de fusão (Tm), e o conteúdo de G/C, especificidade, seqüências complementares de iniciador e seqüência 3'-terminal. Em qeral, iniciadores ótimos para PCR têm geralmente 17-30 bases de extensão e contém cerca de 20 a 80%, tal como, por exemplo, cerca de 50 a 60% de bases G+C. As Tm entre 50 e 80°C, por exemplo, cerca de 50 a 70°C são tipicamente preferidas.
Para instruções adicionais para o planejamento de iniciador e 5 sonda de PCR vide, por exemplo, Dieffenbach et al, "General Concepts for PCR Primer Design" em PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand1 Optimization of PCRs" em PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; e Plasterer, T. N. Primerselect: 10 Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520- 527 (1997), cujas descrições completas estão expressamente incorporadas por referência.
As condições preferidas, iniciadores, sondas e referência interna (G6PDH) são como descritas no Exemplo 1 abaixo.
(iii) Microarranios
A expressão diferencial de gene também pode ser identificada
ou confirmada usando a técnica do microarranjo. Assim, o perfil de expressão de genes associados ao câncer de mama pode ser medido tanto em tecido de tumor fresco quanto embebido em parafina, usando a técnica do microarranjo. Nesse método, seqüências de polinucleotídeos de interesse 20 (incluindo cDNAs e oligonucleotídeos) são plaqueadas ou arranjadas sobre um substrato de microchip. As seqüências arranjadas são então hibridizadas com sondas de DNA específicas para as células ou tecidos de interesse. Como no método de PCR, a fonte de mRNA é, tipicamente, RNA total isolado de tumores ou linhagens celulares de tumores e tecidos ou linhagens ce25 Iulares normais correspondentes. Se a fonte de mRNA é um tumor primário, o mRNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ou arquivadas embebidas em parafina e fixadas (por exemplo, fixada com formalina), que são preparadas e preservadas rotineiramente na prática clínica diária.
Em uma modalidade específica da técnica de microarranjo, in
sertos amplificados por PCR de clones de cDNA são aplicados a um substrato em um arranjo denso. Preferivelmente, pelo menos 10,000 seqüências de nucleotídeo são aplicadas ao substrato. Os genes microarranjados, imobilizados sobre o microchip em 10,000 elementos cada, são adequados para hibridização sob condições estringentes. Sondas de cDNA fluorescentemente marcadas podem ser geradas através da incorporação de nucleotídeos 5 fluorescentes pela transcrição reversa de RNA extraído dos tecidos de interesse. Sondas de cDNA marcadas aplicadas ao chip, hibridizam com especificidade a cada spot de DNA sobre o arranjo. Após a lavagem estringente para remover sondas não especificamente ligadas, o chip é rastreado por microscopia confocal a Iaserou por outro método de detecção, tal como uma 10 câmera CCD. A quantificação da hibridização de cada elemento arranjado permite a avaliação da abundância de mRNA correspondente. Com a fluorescência de duas cores, sondas de cDNA marcadas separadamente, geradas a partir de duas fontes de RNA, são hibridizadas em pares com o arranjo. A abundancia relativa dos transcritos das duas fontes que correspondem 15 a cada gene especificado é, assim, determinada simultaneamente. A escala miniaturizada da hibridização permite uma avaliação conveniente e rápida do padrão de expressão de um grande número de genes. Tais métodos mostraram ter a sensibilidade necessária para detectar transcritos raros, que são expressos em poucas cópias por célula, e para detectar, reprodutivamente, 20 pelo menos aproximadamente diferenças duplicadas nos níveis de expressão (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(2): 106-149 (1996)). A análise de microarranjo pode ser realizada com um equipamento disponível comercialmente, de acordo com os protocolos do fabricante, tal como pelo uso da tecnologia Affimetrix GENCHIP® ou a tecnologia de microarranjo Incyte.
O desenvolvimento de métodos de microarranjo para análise em
larga escala de expressão de gene torna possível pesquisar sistematicamente marcadores moleculares para a classificação de câncer e resulta na predição de uma variedade de tipos de tumor.
(M Análise Seriada da Expressão de Gene (SAGE)
A análise seriada da expressão de gene (SAGE) é um método
que permite a análise simultânea e quantitativa de um grande número de transcritos de qene, sem a necessidade de fornecer uma sonda de hibridização individual para cada transcrito. Primeiro, uma seqüência tag curta (cerca de 10 a 14 bp) é gerada contendo informação suficiente para identificar unicamente um transcrito, desde que o tag seja obtido a partir de um única posição dentro de cada transcrito. Então, vários transcritos são ligados juntos 5 para formar uma longa série de moléculas, que podem ser sequenciadas, revelando a identidade de múltiplos tags simultaneamente. O padrão de expressão de qualquer população de transcritos pode ser quantitativamente avaliado pela determinação da abundância de tags individuais e identificando o gene correspondente a cada tag. Para mais detalhes vide, por exemplo, 10 Velculescu et al, Science 270:484-487 (1995); e Velculescu et al, Ceil 88:243-51 (1997).
(v) Tecnologia MassARRAY
A tecnologia MassARRAY (Sequenom, San Diego, Califórnia) é um método automatizado, de alta eficiência de análise de expressão de ge15 ne usando a espectrometria de massa (MS) para detecção. De acordo com esse método, após o isolamento de RNA, transcrição reversa e amplificação por PCR, os cDNAs são submetidos a extensão de iniciador. Os produtos da extensão do iniciador derivado de cDNA são purificados e distribuídos sobre um chip de arranjo que é pré-carregado com os componentes necessários 20 para a preparação de amostra para MALTI-TOF MS. Os vários cDNAS presentes na reação são quantificados pela análise das áreas dos picos no espectro de massa obtido.
(vi) Análise da Expressão de Gene por Massively Parallel Siqnature Sequencing (MPSS)
Esse método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology
18:630-634 (2000), é uma abordagem de sequenciamento que combina um sequenciamento de assinatura não-baseado em gel com a clonagem in vitro de milhões de modelos sobre microesferas separadas com 5 microgramas de diâmetro. Primeiro, uma biblioteca de microesfera de modelos de DNA é 30 construída por clonagem in vitro. Isso é seguido pela reunião de um arranjo planar de microesferas que contêm o modelo em um fluxo celular de alta densidade (tipicamente maior do que 3 x 106 microesferas/cm2). As extremidades livres dos modelos clonados sobre cada microesfera são analisadas simultaneamente, usando um método de sequenciamento de assinatura baseada em fluorescência que não requer a separação de fragmento de DNA. Esse método mostrou fornecer simultaneamente e precisamente, em uma 5 única operação, centenas de milhares de seqüências de assinatura de gene a partir de uma biblioteca de cDNA de levedura.
(vii) Imuno-histoguímica
Métodos de imuno-histoquímica também são adequados para detectar níveis de expressão dos marcadores de prognóstico da presente invenção. Assim, anticorpos ou antissoros, preferivelmente antissoros policlonais e, mais preferivelmente, anticorpos monoclonais específicos para cada marcador são usados para detectar a expressão. Os anticorpos podem ser detectados pela marcação direta dos próprios anticorpos, por exemplo, com marcadores radioativos, marcadores fluorescentes, marcadores de haptenos tais como biotina ou uma enzima tal como peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina. Alternativamente, anticorpo primário não marcado é usado em conjunto com um anticorpo secundário marcado, compreendendo antissoros, antissoros policlonais ou anticorpo monoclonal específico para o anticorpo primário. Protocolos e kits de imuno-histoquímica são bem-conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis.
(viii) Proteômicos
A expressão "proteoma" é definida como a totalidade das proteínas presentes em uma amostra (por exemplo, tecido, organismo ou cultura celular) em um determinado momento. Proteômico incluem, entre outras coi25 sas, o estudo das alterações globais de expressão de proteína em uma amostra (também referido como "proteômico de expressão"). Proteômico inclui tipicamente as seguintes etapas: (1) separação de proteínas individuais em uma amostra por eletrofores em gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificação das proteínas individuais recuperadas do gel, por exemplo, por espectrome30 tria de massa ou sequenciamento N-terminal e (3) análise dos dados usando bioinformática. Métodos proteômicos são complementos valiosos para outros métodos de definição de perfil de expressão de gene e podem ser usados, sozinhos ou em combinação com outros métodos, para detectar os produtos dos marcadores de prognóstico da presente invenção.
(ix) Descrição Geral de Isolamento. Purificação e Amplificação de mRNA
As etapas de um protocolo representativo para definição do perfil de expressão de gene usando tecidos fixados, embebidos em parafina como a fonte de RNA, incluindo o isolamento, purificação, extensão do iniciador e a amplificação de mRNA são dadas em vários artigos publicados em jornais (por exemplo, Godfrey et al., J. Molec. Diagnostics 2:84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo inicia-se com o corte de seções espessas com cerca de 10 microgramas de amostras de tecido de tumor embebidas em parafina. O RNA é então extraído e a proteína e o DNA são removidos. Após a análise da concentração de RNA, as etapas de reparo e/ou amplificação de RNA podem estar incluídas, se necessário, e o RNA é transcrito reversamente usando promotores específicos para o gene seguido por PCR. Finalmente, os dados são analisados para identificar a(s) melhor(es) opção/opções de tratamento disponível/disponíveis para o paciente com base na definição do perfil de expressão gênica identificado na amostra de tumor examinada.
Em uma modalidade, o paciente tratado aqui, além de expressar 20 HER3 em um certo nível e/ou expressar HER2:HER3 em um certo nível, não superexpressa HER2. A superexpressão de HER2 pode ser analisada por IHC, por exemplo, usando HERCEPTEST® (Dako). Seções de tecido embebidas em parafina da biópsia do tumor podem ser submetidas ao ensaio de IHC e fornecer os critérios de intensidade de coloração da proteína HER2 25 como se segue:
Escore 0 - nenhuma coloração é observada ou a coloração da membrana é observada em menos do que 10% das células tumorais.
Escore 1+ - uma coloração fraca/dificilmente perceptível da membrana é detectada em mais do que 10% das células tumorais. As céluIas estão coradas apenas em parte de suas membranas.
Escore 2+ - uma coloração completa fraca a moderada da membrana é observada em mais do aue 10% das células tumorais. Escore 3+ - uma coloração completa moderada a forte da membrana é observada em mais do que 10% das células tumorais.
Aqueles tumores com escores 0 ou 1+ na avaliação da superexpressão de HER2 podem ser caracterizados como não superexpressando HER2, enquanto que aqueles tumores com escores 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando HER2.
Tumores que superexpressam HER2 podem ser avaliados pelos escores imuno-histoquímicos que correspondem ao número de cópias de moléculas de HER2 expressas por célula e podem ser determinados bioquimicamente:
O = Oa 10.000 cópias/célula,
1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula,
2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula,
3+ = pelo menos cerca de 2.000.000 cópias/célula.
A superexpressão de HER2 no nível 3+, que leva a ativação de
tirosina quinase independente do Iigante (Hudziak et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 84:7159-7163 (1987)), ocorre em aproximadamente 30% dos cãnceres de mama e, nesses pacientes, a sobrevida sem recidiva e a sobrevida global estão diminuídas (Slamon et al, Science, 244:707-712 (1989); Slamon 20 et ai, Science, 235:177-182 (1987)). Alternativamente ou além disso, ensaios FISH tal como INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido tumoral fixado em formalina, embebido em parafina para determinar a extensão (se houver) da amplificação de HER2 no tumor.
A expressão de HER3 e/ou de HER2 também pode ser avaliada
usando um ensaio diagnóstico in vivo, por exemplo, pela administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que se ligue a molécula a ser detectada e que é marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo) e rastreando externamente o paciente para a localização do marcador.
IV. Formulações Farmacêuticas
As formulações farmacêuticas do inibidor de HER, inibidor da dimerização de HER ou agente quimioterápico usado de acordo com a presente invenção são preparadas para o armazenamento pela mistura de um anticorpo que tem o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), geralmente na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Cristais de anticorpo também são considerados (vide Pedido de Patente US 2002/0136719). Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservadores (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônia; cloreto de hexametonio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sucrose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons que formam sais tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteina); e/ou surfactantes não iônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpo Iiofilizado estão descritas na WO 97/04801, expressamente incorporada aqui por referência.
A formulação preferida de pertuzumab para uso terapêutico compreende 30 mg/ml de pertuzumab em acetato de histidina 20 mM, sucrose 120 mM, polisorbato 20 0,02% em pH 6.0. Uma formulação alternativa de pertuzumab compreende 25 mg/ml de pertuzumab, tampão histidina-HCI 10 mM, sucrose 240 mM, polisorbato 20 0,02%, pH 6.0.
A formulação também pode conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular a ser tratada, preferívelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Vários fármacos que podem ser combinados com o inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER estão descritos na Seção de Tratamento abaixo. Tais moléculas estão adequadamente presentes em 5 quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos também podem encerrados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de 10 liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Preparações para liberação sustentada podem ser preparadas, exemplos adequados de preparações para liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão em forma de produtos formados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), ou poli(vinilalcool)), polilactatos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não-degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico tais como LUPRON DEPOT(TM) (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis, Isso é facilmente obtido por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Consequentemente, é fornecido um método para produzir um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER (tal como pertuzumab) ou uma composição farmacêutica dos mesmos, cujo método compreende combinar em uma embalagem o inibidor ou a composição farmacêutica e um selo indicando que o inibidor ou composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer (por exemplo, câncer ovariano) que é capaz de responder ao inibidor, em que o câncer do paciente expressa HER em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER 5 no tipo de câncer e/ou se a amostra de câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
Além disso, é fornecido um método para produzir um agente quimioterápico (tal como gencitabina) ou uma composição farmacêutica do 10 mesmo, em que o método compreende combinar em uma embalagem o agente quimioterápico ou composição farmacêutica e um selo indicando que o agente quimioterápico ou composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer (exemplificado por câncer ovariano), em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível me15 diano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
V. Tratamento com inibidores de HER
A invenção fornece um método para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER ou um inibidor da dimerização de HER, compreendendo administrar uma quantidade 20 terapeuticamente eficaz do inibidor ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível médio de expressão de HER3 no tipo de câncer e/ou se a amostra de câncer expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer e/ou expressa HER2:HER3 em um nível que 25 é maior do que o nível médio (mais preferivelmente maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3) no tipo de câncer.
Em uma modalidade particularmente preferida, a invenção fornece um método para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, compreendendo administrar uma quantidade terapeuti30 camente eficaz de pertuzumab ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível médio de expressão de HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana e/ou em que a amostra de câncer expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana. Nessa modalidade, preferivelmente o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o nível médio 5 (mais preferivelmente maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3) no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um agente quimioterápico, compreendendo determinar a ex10 pressão de hER3 em uma amostra de câncer do paciente e selecionar um agente quimioterápico como a terapia, se a amostra de câncer expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer. Nessa modalidade, preferivelmente o tipo de câncer é ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, incluindo câncer ovariano, peritoneal 15 ou da trompa falopiana resistente à platina, assim como câncer ovariano avançado, refratário e/ou recorrente. O agente quimioterápico é preferivelmente um antimetabólito, tal com gencitabina. Assim, nessa modalidade, HER3 elevado correlaciona-se com resposta melhorada à terapia com um agente quimioterápico, tal como gencitabina.
Exemplos de vários cânceres que podem ser tratados com um
inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER estão listados na seção de definições acima. Os tipos de câncer preferidos incluem câncer ovariano; câncer peritoneal; câncer da trompa falopiana; câncer de mama incluindo câncer de mama metastático (MBC); câncer de pulmão, incluindo câncer de 25 pulmão de célula não-pequena (NSCLC); câncer de próstata; e câncer colorretal. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é avançado, refratário, recorrente, resistente a quimioterapia e/ou resistente à platina.
A terapia com o inibidor de HER, inibidor da dimerização de HER e/ou agente quimioterápico preferivelmente prolonga a sobrevida, incluindo a sobrevida livre de progressão (PFS) e/ou a sobrevida global (OS). Em uma modalidade, a terapia com o inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER prolonga a sobrevida em pelo menos cerca de 20% a mais do que a sobrevida alcançada pela administração de um agente antitumor ou modelo de tratamento aprovados para o câncer a ser tratado.
Em uma modalidade preferida, o método envolve tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana. O paciente 5 pode ter câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana avançado, refratário, recorrente, resistente à quimioterapia e/ou resistente à platina. A administração de pertuzumab ao paciente pode, por exemplo, prolongar a sobrevida em pelo menos cerca de 20% a mais do que a sobrevida alcançada pela administração de topotecan ou doxorrubicina Iipossomal a tal paciente.
O inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER e/ou agen
te quimioterápico são administrados a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, em bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea,intra-articular, 15 intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. A via intravenosa para administração do anticorpo é preferida.
Para a prevenção ou tratamento de câncer, a dose de inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER e/ou agente quimioterápico dependerá do tipo de câncer a ser tratado, como definido acima, da severidade e 20 curso do câncer, se o anticorpo é administrado com propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao fármaco e do conhecimento do médico assistente.
Em uma modalidade, é administrada uma dose fixa de inibidor. A dose fixa pode ser adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou 25 durante uma série de tratamentos. Quando a dose fixa é administrada, preferivelmente ela está na faixa entre cerca de 20 mg a cerca de 2000 mg de inibidor. Por exemplo, a dose fixa pode ser de aproximadamente 420 mg, aproximadamente 525 mg, aproximadamente 840 mg ou aproximadamente 1050 mg do inibidor, tal como pertuzumab.
Onde uma série de doses são administradas, essas podem, por
exemplo ser administradas aproximadamente a cada semana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas ou aproximadamente a cada 4 semanas, mas preferivelmente aproximadamente a cada 3 semanas. As doses fixas podem continuar a ser administradas, por exemplo, até a progressão da doença, efeito adverso ou outro momento como determinado pelo médico. Por exemplo, entre cerca de duas, três ou quatro até cerca de 17 ou mais doses fixas podem ser administradas.
Em uma modalidade, uma ou mais doses de ataque do anticorpo são administradas, seguidas por uma ou mais doses de manutenção do anticorpo. Em outra modalidade, uma pluralidade das mesmas doses são administradas ao paciente.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, uma do
se fixa de inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) de aproximadamente 840 mg (dose de ataque) é administrada, seguida por uma ou mais doses de 420 mg (dose de manutenção) do anticorpo. As doses de manutenção são administradas preferivelmente a cada 3 semanas, para um total de pelo menos 2 doses até 17 ou mais doses.
De acordo com outra modalidade preferida, uma ou mais doses de 1050 mg de inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) são administradas, por exemplo, a cada 3 semanas. De acordo com essa modalidade, uma, duas ou mais das doses fixas são administradas, por exemplo, por até um ano (17 ciclos) ou mais se desejado.
Em outra modalidade preferida, uma dose fixa de aproximadamente 1050 mg de inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) é administrada como dose de ataque, seguida por uma ou mais doses de manutenção de aproximadamente 525 mg. Cerca de uma, duas ou mais 25 doses de manutenção podem ser administradas ao paciente a cada 3 semanas de acordo com essa modalidade.
Embora o inibidor de HER, inibidor da dimerização de HER ou agente quimioterápico possam ser administrados como um único agente antitumor, o paciente é opcionalmente tratado com uma combinação do inibidor (ou agente quimioterápico) e um ou mais agentes quimioterápicos (adicionais). Agentes quimioterápicos exemplares incluem: gencitabina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, topotecan e/ou doxorrubicina lipossomal. Preferivelmente, pelo menos um agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito tal como gencitabina. A administração combinada inclui a coadministração ou administração concorrente, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em 5 qualquer ordem, em que preferivelmente há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas. Assim, o agente quimioterápico antimetabólito pode ser administrado antes ou acompanhando a administração do inibidor. Nessa modalidade, o período entre pelo menos uma administração do agente quimio10 terápico antimetabólito e pelo menos uma administração do inibidor é, preferivelmente, de aproximadamente um mês ou menos e, mais preferivelmente, de aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterápico antimetabólito e o inibidor são administrados concorrentemente ao paciente, em uma única formulação ou em formulações separadas. O 15 tratamento com a combinação de agente quimioterápico (por exemplo, agente quimioterápico antimetabólito tal como gencitabina) e o inibidor (por exemplo, pertuzumab) pode resultar em um benefício terapêutico sinérgico, mais do que aditivo, para o paciente.
Agentes quimioterápicos particularmente desejados para combinação com o inibidor, por exemplo, para terapia de câncer ovariano, incluem: um agente quimioterápico antimetabólito tal como gencitabina; um composto de platina tal como carboplatina; um taxoide tal como paclitaxel ou docetaxel; topotecan; ou doxorrubicina lipossomal.
Um agente quimioterápico antimetabólito, se administrado, é ge25 ralmente administrado em suas dosagens conhecidas, ou opcionalmente diminuídas devido a ação combinada dos fármacos ou efeitos colaterais negativos atribuíveis a administração do agente quimioterápico antimetabólito. A preparação e regimes de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou como deter30 minadas empiricamente pelo médico experiente. Onde o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina, preferivelmente ele é administrado em uma dose entre cerca de 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (por exemplo, aproximadamente 1000 mg/m2), por exemplo, nos dias 1 e 8 de um ciclo de 3 semanas.
Além do inibidor e do agente quimioterápico antimetabólito, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com isto. Por exemplo, um 5 segundo (terceiro, quarto, etc.) agente quimioterápico pode ser administrado, em que o segundo agente quimioterápico é outro agente quimioterápico antimetabólito diferente ou um agente quimioterápico que não é antimetabólito. Por exemplo, o segundo agente quimioterápico pode ser um taxano (tal como paclitaxel ou docetaxel), capecitabina ou um agente quimioterápico ba10 seado em platina (tal como carboplatina, cisplatina ou oxaliplatina), antraciclina (tal como doxorrubicina, incluindo doxorrubicina lipossomal), topotecano, pemetrexed, alcalóide da vinca (tal como vinorelbina) e TLK 286. "Coquetéis" de agentes quimioterápicos diferentes podem ser administrados.
Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o inibidor e/ou agente quimioterápico incluem qualquer um ou mais de: um segundo inibidor de HER diferente, um inibidor da dimerização de HER (por exemplo, um anticorpo HER2 inibitório de crescimento, tal como trastuzumab ou um anticorpo HER2 que induz apoptose de uma célula que superexpressa HER2, tal como 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas); um anticorpo direcionado contra um antígeno diferente associado ao tumor, tal como EGFR, HER3, HER4; composto anti-hormonal, por exemplo, um composto antiestrogênio tal como tamoxifen ou um inibidor da aromatase; um cardioprotetor (para prevenir ou reduzir qualquer disfunção miocárdica associada com a terapia); uma citocina; um fármaco dirigido para EGFR (tal como TARCEVA®, IRESSA® ou cetuximabe); um agente antiangiogênico (especialmente bevacizumab vendido por Genentech sob o nome comercial de AVASTIN™); um inibidor da tirosina quinase; um inibidor de COX (por exemplo, um inibidor de COX-I ou COX-2); fármaco anti-inflamatório não esteroidal, celecoxib (CELEBREX®); inibidor de farnesil transferase (por exemplo, Tipifarnib/ZARNESTRA® RI15777 disponibilizado por Johnson and Johnson ou Lonafarnib SCH66336 disponibilizado por Schering-Plough); anticorpo que se liga a proteína oncofetal CA 125 tal como Oregovomab (MoAb B43.13); vacina para HER2 (tal como a vacina HER2 Auto Vac de Pharmexia, ou vacina de proteína APC8024 de Dendreon, ou vacina de peptídeo de HER2 de GSK/Corixa); outra terapia direcionada a HER (por exemplo, trastuzumab, cetuximabe, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CM 033, GW572016, IMC-11F8, TAK165, etc); inibidor de Raf e/ou ras (vide, por exemplo, WO 2003/86467); injeção de doxorrubicina HCI lipossomal (DOXIL(R)); inibidor de topoisomerase I tal como topotecan; taxano; inibidor duplo de tirosina quinase de HER2 e EGFR tal como lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA®); EMD-7200; um medicamento que trate náusea tal como um antagonista da serotonina, esteroide, ou benzodiazepínico; um medicamento que previna ou trate erupções cutâneas ou terapias padronizadas para acne, incluindo antibiótico tópico ou oral; um medicamento que previna ou trate diarréia; um medicamento que reduza a temperatura corporal tal como acetaminofen, difen-hidramina, ou meperidina; fator de crescimento hematopoiético, etc.
As dosagens adequadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são aquelas atualmente usadas e podem ser diminuídas devido a ação combinada (sinérgica) do agente e inibidor.
Em adição aos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido a remoção cirúrgica das células cancerosas e/ou terapia de radiação.
Onde o inibidor é um anticorpo, preferivelmente o anticorpo administrado é um anticorpo nu. Entretanto, o inibidor administrado pode ser conjugado com um agente citotóxico. Preferivelmente, o inibidor e/ou antíge25 no conjugados aos quais ele se liga é/são internalizados pela célula resultando em eficácia aumentada do conjugado terapêutico em matar a célula cancerosa a qual ele se liga. Em uma modalidade preferida, o agente citotóxico atinge ou interfere com o ácido nucleico na célula cancerosa. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem maitansinoides, caliqueamicinas, ribonu30 cleases e DNA endonucleases.
O presente pedido considera a administração do inibidor por terapia com gene. Vide, por exemplo, W096/07321. publicada em 14 de Março de 1996, relacionada ao uso de terapia com gene para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens principais para introduzir o ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente: in vivo 5 e ex vivo. Para liberação in vivo, os ácidos nucleicos são injetados diretamente no paciente, geralmente no local onde o anticorpo é necessário. Para o tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente tanto diretamente quanto, por exemplo, encapsuladas 10 dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, Patentes U.S. N0 4.892.538 e 5.283.187). Há uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técni15 cas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextran, método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumente usado para liberação ex vivo do gene é um retrovirus.
As técnicas para transferência de ácido nucleico in vivo atualmente preferidas incluem a transfecção com vetores virais (tais como adenovirus, vírus do Herpes simples I ou vírus associados a adeno) e sistemas baseados em lipídeos (lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo são DOTMA, DOPE e DC-CoI1 por exemplo). Em algumas situações é desejável fornecer a fonte de ácido nucleico com um agente que atinja as células-alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína da superfície da membrana celular ou a célula-alvo, um Iigante para um receptor sobre a célula-alvo, etc. Onde os lipossomas são empregados, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular associada com a endocitose podem ser usadas para direcionar e/ou facilitar a absorção, por exemplo, proteínas do capsídeo ou seus fragmentos trópicos para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclos e proteínas que atingem a localização intracelular e aumentam a meiavida intracelular. A técnica da endocítose mediada por receptor é descrita, por exemplo por Wu et ai, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner etal., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:3410-3414 (1990). Para uma revisão dos protocolos atualmente conhecidos de marcação de gene e terapia com gene 5 vide Anderson et ai, Science 256:808-813 (1992). Vide também WO 93/25673 e as referências citadas aqui.
VI. Produto de fabricação
Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de manufatura contendo materiais úteis para o tratamento das doenças ou condições descritas acima. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um selo ou bula inserido ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, vidros, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda ou contém uma composição que é eficaz para tratar a doença ou condição de escolha e pode ter um acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa para solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o inibidor da dimerização de HER, tal como pertuzumab ou o agente quimioterápico, tal como gencitabina.
O artigo de manufatura pode conter ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. O artigo de manufatura 25 pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Os kits e produtos manufaturados da presente invenção também incluem informações, por exemplo na forma de uma bula ou um selo, indicando que a composição é usada para tratar câncer onde o câncer do paci30 ente expressa HER3 e/ou HER2:HER3 em um nível definido dependendo do fármaco. A bula ou o selo podem ser de qualquer forma, tal como de papel ou um meio eletrônico, tal como um meio magneticamente gravado (por exemplo, disquete) ou um CD-ROM. O selo ou a bula também podem incluir outras informações relacionadas as composições farmacêuticas e formas de dosagem no kit ou no artigo de manufatura.
Geralmente, tais informações auxiliam, eficazmente e segura5 mente, os pacientes e os médicos no uso das composições farmacêuticas e formas de dosagem. Por exemplo, as seguintes informações com relação ao inibidor da dimerização de HER ou ao agente quimioterápico podem ser fornecidas na bula: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, cuidados, precau10 ções, reações adversas, superdosagem, dosagem apropriada e administração, como fornecer, condições de armazenamento apropriadas, referências e informações da patente.
Em uma modalidade específica da invenção, é fornecido um artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composi15 ção farmacêutica que compreende um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o inibidor ou a composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER, em que o câncer do pa20 ciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer e/ou se a amostra de câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer.
Em uma modalidade opcional do mesmo aspecto inventivo, o 25 artigo de manufatura pode compreender ainda um recipiente compreendendo um segundo medicamento, em que o inibidor de HER ou inibidor da dimerização de HER é o primeiro medicamento e cujo produto compreende ainda uma bula com instruções para tratar o paciente com o segundo medicamento, em uma quantidade eficaz. O segundo medicamento pode ser qualquer 30 um daqueles descritos acima, com um segundo medicamento exemplar sendo outro anticorpo HER2 ou um agente quimioterápico.
Em outro aspecto, é fornecido um artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica que compreende um agente quimioterápico (tal como gencitabina) em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o agente quimioterápico ou a composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente 5 com um tipo de câncer, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
A bula está sobre ou associada com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, vidros, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda ou contém uma composição que é eficaz para tratar o tipo de câncer e pode ter um acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa para solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o inibidor de HER, inibidor da dimerização de HER ou o agente quimioterápico. O selo ou a bula indicam que a composição é usada para tratar câncer em um indivíduo elegível para o tratamento com guias específicas com relação a quantidades de dosagem e intervalos do inibidor ou de qualquer outro medicamento a ser fornecido. O artigo de manufatura pode conter ainda um recipiente adicional compreendendo um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. O artigo de manufatura pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Vários métodos alternativos experimentais conhecidos na técnica podem ser substituídos com sucesso por aqueles aqui descritos na prática da invenção, como por exemplo descritos em manuais e livros texto excelentes disponíveis nas áreas de tecnologia relevante para essa invenção(por 30 exemplo, Using Antibodies1 A Laboratory Manual, editado por Harlow, E. e Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (por exemplo, ISBN 0- 87969-544-7); Roe B. A. et. ai. 1996, DNA Isoiation and Sequencinq (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons.(por exemplo, ISBN 0-471- 97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins, 2000, ed. J. Abelson, M. Simon1 S. Emr, J. Thomer. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3rd Edition, por Joseph Sambrook e Peter 5 MacCaIIum, (o antigo Maniatis Cloning manual) (por exemplo, ISBN 0- 87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et. al. John Wiley & Sons (por exemplo, ISBN 0-471- 50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (por exemplo, ISBN 0-471-11184-8); e Methods in Enzymology: Guide to protein 10 Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Academic Press, Inc. (por exemplo, ISBN 0-12-213585-7)), ou como descritos em websites universitários e comerciais voltados para a descrição de métodos experimentais em biologia molecular.
VII. Métodos de Propaganda A invenção também abrange um método para divulgar um inibi
dor de HER, um inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) ou uma composição farmaceuticamente aceitável dos mesmos que compreende promover para um público-alvo o uso do inibidor ou da sua composição farmacêutica para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer 20 (tal como câncer ovariano), onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer e/ou onde a amostra de câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer.
Em outra modalidade, a invenção fornece um método para di
vulgar um agente quimioterápico (tal como gencitabina) ou uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo que compreende promover para um público-alvo o uso do agente quimioterápico ou de uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo para tratar uma população de pacientes 30 com um tipo de câncer (tal como câncer ovariano), onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer. A propaganda é geralmente comunicação paga através de um meio não-pessoal no qual o responsável é identificado e a mensagem é controlada. Propaganda para os propósitos do mesmo inclui publicidade, relações públicas, colocação do produto, patrocínio, subscrição e promoções de 5 venda. Essa expressão inclui anúncios públicos informativos patrocinados que aparecem em quaisquer meios da imprensa escrita, designados para atrair uma audiência maciça para persuadir, informar, promover, motivar ou modificar de outra maneira o comportamento voltado para um padrão favorável de aquisição, suporte ou aprovação dessa invenção.
A propaganda e a promoção do método de diagnóstico do mes
mo pode ser obtida por quaisquer meios. Exemplos de meios de propaganda usados para veicular essas mensagens incluem televisão, rádio, cinemas, revistas, jornais, internet e cartazes, incluindo comerciais que são mensagens que aparecem nos meios de transmissão. Comerciais também incluem 15 aqueles em carrinhos de supermercados, nas paredes de corredores de um aeroporto e nas laterais de ônibus ou ouvidos em mensagens de espera telefônica ou em sistemas de armazenamento PA ou em qualquer lugar onde uma comunicação visual ou auditiva possa ser colocada.
Exemplos mais específicos de promoção ou de meios de propa20 ganda incluem a televisão, rádio, cinemas, a internet tal como vídeos e teleconferências, redes computadorizadas interativas com o objetivo de alcançar usuários simultâneos, cartazes fixos ou eletrônicos ou outras placas públicas, literatura tradicional ou eletrônica tais como revistas e jornais, apresentações ou contatos individuais por exemplo, por e-mail, telefone, mensagem 25 instantânea, postal, mensageiro, mala direta, visitas pessoais, etc.
O tipo de propaganda usado dependerá de vários fatores, por exemplo, da natureza da audiência-alvo a ser alcançada, por exemplo, hospitais, companhias de seguros, clínicas, médicos, enfermeiras e pacientes, assim como das considerações de custos e das leis e regulamentações ju30 risdicionais relevantes que governam a propaganda de medicamentos e diagnósticos. A propaganda pode ser individualizada ou personalizada baseada nas caracterizações do usuário definidas pela interação de serviço e/ou outros dados tais como localização demográfica e geográfica do usuário.
VIII. Depósito de Materiais
As seguintes linhagens celulares de hibridoma foram depositadas com a American Type Culture Collection1 10801 University Boulevard, Manassas1 VA 20110-2209, USA (ATCC):
Designação do Anticorpo N0 da ATCC Data de Depósito 7C2 ATCC HB-12215 17 de Outubro de 1996 7F3 ATCC HB-12216 17 de Outubro de 1996 4D5 ATCC CRL 10463 24 de Maio de 1990 2C4 ATCC HB-12697 8 de Abril de 1999 Detalhes adicionais da invenção estão ilustrados pelos seguintes exemplos não-limitantes. As descrições de todas as citações no pedido estão expressamente incorporadas aqui por referência.
EXEMPLO 1
Pertuzumab e qencitabina para terapia de câncer ovariano. carcinoma peritoneal primário ou carcinoma da trompa falopiana resistentes a platina
Esse exemplo fornece os resultados para a fase Ill de um teste clínico que avalia a segurança, tolerabilidade e eficácia de pertuzumab em combinação com gencitabina em pacientes com câncer ovariano, carcinoma 15 peritoneal primário ou carcinoma da trompa falopiana resistentes a platina. Pertuzumab representa uma nova classe de agentes direcionados chamados de inibidores da dimerização de HER (HDIs) que inibem a dimerização de HER2 com EGFR, HER3 e HER4 e que inibem a sinalização através de MAP e P13 quinase. Pertuzumab liga-se no sítio de interação dímero20 dímero, tem um efeito principal sobre o papel de HER2 como um correceptor, previne a dimerização de EGFR/HER2 e HER3/HER2 e inibe múltiplas vias de sinalização mediadas por HER.
O efeito de pertuzumab e gencitabina sobre a sobrevida livre de progressão (PFS) e a sobrevida global (OS), foi avaliado em todos os pacientes e no subgrupo de pacientes cujos tumores continham marcadores que indicavam a ativação de HER2. O planejamento/esquema do estudo é mostrado na Figura 9. Pacientes que tinham progredido enquanto recebiam, ou dentro de 6 meses de recebimento, um esquema de quimioterapia baseada em platina foram eleitos para esse estudo. Pacientes foram randomizados para receber tanto gemtacibina em combinação com pertuzumab quanto gemtacibi5 na em combinação com placebo. Os pacientes tratados aqui incluíram aqueles que não tinham recebido um tratamento prévio em regime de recuperação para doença resistente à platina antes de entrar no estudo e aqueles que receberam um regime anterior para doença resistente à platina.
Gencitabina foi administrada em 1000 mg/m2 nos dias 1 e 8 de 10 cada ciclo de 21 dias. Gencitabina foi infundida primeiro durante 30 minutos. As reduções da dose foram permitidas devido a toxicidade. Placebo ou pertuzumab foram administrados no dia 1 do ciclo de 21 dias. Os indivíduos randomizados para receber pertuzumab foram tratados com uma dose de ataque inicial de 840 mg (Ciclo 1) seguida por 420 mg nos Ciclos 2 e subse15 quentes. Indivíduos randomizados para receber placebo foram tratados com placebo no mesmo volume como administrado para o grupo de pertuzumab para o Ciclo 1, Ciclos 2 e subsequentes. Indivíduos sem doença progressiva receberam tratamento por até 17 ciclos ou 1 ano. Pacientes tiveram redução da dose padronizada de gencitabina e das doses de manutenção como re20 sultado de citopenias. Pertuzumab também foi mantido para quaisquer doses mantidas de gencitabina no Dia 1. As doses subsequentes foram as doses reduzidas e não foram aumentadas. Se a redução ou manutenção da dose fosse necessária em mais do que 4 ocasiões ou se as doses fossem mantidas por mais do que 3 semanas, então a gencitabina era descontinua25 da e, com a aprovação do médico assistente e do supervisor médico, um placebo foi continuado até a progressão da doença. Se as doses de gencitabina do Dia 8 fossem mantidas, então a dose do Dia 8 era omitida e o tratamento subsequente era iniciado com o próximo ciclo (Dia 22 do ciclo anterior)
Gencitabina foi mantida e a dose reduzida como recomendado
pela seguinte tabela: Contagem Absoluta de Contagem de Pla- % da dose total Granulócito (x 106/l) quetas (x 106/!) >1000 e >100.000 100 500-999 ou 50.000-99.000 75 <500 OU <50.000 Mantida As doses subsequentes para qualquer paciente que necessitasse de redução de dose foram as doses reduzidas. Se as doses fossem mantidas por mais do que 3 semanas como resultado de citopenias, os pacientes 5 eram supostos ter toxicidade inaceitável e a gencitabina era descontinuada. Se não houvesses outras toxicidades de grau Ill ou IV adicionais, a continuação do placebo era de responsabilidade do médico e do supervisor médico. A toxicidade hematológica de gencitabina foi relacionada com a velocidade de administração da dose. A gencitabina era dada durante 30 minutos sem 10 levar em consideração a dose total. O uso de agentes que estimulam colônias para citopenias de Grau 2 de NCI-CTC ficou a critério do médico assistente.
A opção de troca para o agente pertuzumab isolado foi oferecida. Uma dose de ataque de 840 mg foi administrada no ciclo seguinte apropriado com continuação de 420 mg nos ciclos subsequentes a cada 21 dias.
A resposta foi avaliada no final dos ciclos 2, 4, 6, 8, 12 e 17. A doença mensurável foi avaliada usando os Critérios de Avaliação de Resposta para Tumores Sólidos (RECIST), por avaliação clínica e CT scan ou equivalente. A resposta para indivíduos com doença avaliável foi estimada 20 de acordo com alterações para CA-125 e evidências clínica e radiológica de doença. As respostas foram confirmadas 4 a 8 semanas após a documentação inicial da resposta. As seguintes medidas de resultados foram avaliadas. Meta de Eficácia Primária
Sobrevida livre de progressão, como determinada pela avaliação do pesquisador usando RECIST ou alterações de CA-125, após o início do tratamento designado no estudo para todos os indivíduos em cada grupo.
Sobrevida livre de progressão, como determinada pela avaliação do pesquisador usando RECIST ou alterações de CA-125, após o início do tratamento designado no estudo em cada grupo nos seguintes subgrupos:
Indivíduos com marcadores detectáveis de ativação de HER2.
Indivíduos sem marcadores detectáveis de ativação de HER2.
Metas de Eficácia Secundária
Resposta objetiva (PR ou CR)
Duração da resposta Tempo de sobrevida Ausência de progressão em 4 meses
Essas metas foram avaliadas em todos os indivíduos em cada grupo e nos seguintes subgrupos:
Indivíduos com marcadores detectáveis de ativação de HER2. Indivíduos sem marcadores detectáveis de ativação de HER2.
Para prevenir ou tratar possíveis náuseas e vômito, o paciente
era pré-medicado com antagonistas da serotonina, esteroides e/ou benzodiazepínicos. Para prevenir ou tratar possíveis erupções, foram usados terapias convencionais para acne, incluindo antibióticos tópicos e/ou orais. Outras medicações concomitantes possíveis eram quaisquer medicações prescritas 20 ou preparações sem receita médica usadas por um indivíduo em um intervalo começando 7 dias antes do Dia 1 e continuando até o último dia do período de acompanhamento. Indivíduos que experimentaram elevações da temperatura para >38,5°C associadas a infusão ou outros sintomas associados a infusão foram tratados sintomaticamente com acetaminofen, difen25 hidramina ou meperidina. Fatores de crescimento hematopoiéticos nãoexperimentais foram administrados para citopenias Grau 2 de NCI-CTC.
Amostras de tecido fixadas em formalina, embebidas em parafina (FFPET) obtidas dos pacientes nesse estudo experimental foram analisadas para EGFR, HER2, HER3, dois Iigantes de HER (anfirregulina e beta30 celulina), e G6PDH (um gene residente) por qRT-PCR. O ensaio qRT-PCR foi realizado por TARGOS Molecular Pathology GmbH (Kassel, Alemanha) usando kits de laboratório Roche Diagnostic’s. O fluxo do trabalho e a análise para a realização do ensaio qRT-PCR nas amostras clínicas estão representados nas Figuras 27 e 28 do mesmo.
A análise de mRNA de EGFR, HER2, HER3, anfirregulina e beta-celulina foi realizada em duplicata. Para possibilitar a análise de dados 5 quantitativos, G6PHD também foi analisado como uma referência interna. Iniciadores e sondas foram planejados para amplificar apenas mRNA, nãoDNA. qRT-PCR foi conduzida separadamente para cada marcador e G6PDH como um procedimento em duas etapas.
Na primeira etapa, cDNA foi reversamente transcrito a partir de 5 μΙ de RNA total usando AMV transcriptase reversa e preparação específica para cada marcador e G6PDH. O perfil da temperatura era de 10 min/25°C para o anelamento, 60 min/42°C para transcrição reversa e 5 min/49°C para inativação enzimática.
Na segunda etapa, um fragmento de 100 a 120 bp de marcador 15 e mRNA de G6PDH foi amplificado a partir de 5 μΙ de cDNA, usando o instrumento LIGHTCYCLER® (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Os amplicons foram detectados por fluorescência usando pares específicos de sondas de hibridização marcadas (princípio da transferência de energia por ressonância fluorescente). Todos os reagentes usados para qRT-PCR 20 eram de Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha. O perfil da temperatura foi de 10 min/95°C para a desnaturação inicial e 45 ciclos de (10seg/62°C para o anelamento, 9seg/72°C para o alongamento, 10seg/95° para a desnaturação). Vide a tabela abaixo para iniciador/sonda usados.
Nome Seqüência Iniciador de cDNA de 5'-tgc gga tgt cag cca ctg tg-3'(SEQ ID N°23) G6PDH Iniciadorafrente de 5'-ggg tgc ate ggg tga cct g-3' (SEQ ID N°24) G6PDH Iniciador reverso de 5'-agc cac tgt gag gcg gga-3' (SEQ ID N°25) G6PDH Sonda Fluos. de G6PDH 5'-ggt gtt ttc ggg cag aag gcc ate c-Fluos-3'(SEQ ID N°26) Sonda LC Red de 5'-LCred 640-aac age cac cag atg gtg ggg tag G6PDH ate tt-3‘(SEQ ID Νύ27) Nome Sequência Iniciadorde cDNA de 5'-ccag tca atg tag tgg gca cac-3' (SEQ ID N°28) EGFR Iniciador a frente de EG- 5'-ggg tga gcc aag gga gtt tg-3' (SEQ ID N°29) FR Iniciador reverso de EG- 5'-gca cac tgg ata cag ttg tct ggt c-3' (SEQ ID FR N°30) Sonda LC Fluos. de EG- 5'-tgt gca ggt gat gtt cat ggc ctg agg-FluosFR 3'(SEQ ID N°31) Sonda LC Red de EGFR 5-LCred 640-cac tct ggg tgg cac tgt atg cac tc3’(SEQ ID N°32) Inieiador de cDNA de 5'-gga cct gcc tca ctt ggt tg-3' (SEQ ID N°33) HER2 Inieiador a frente de 5'-cag gtg gtg cag gga aac ct-3' (SEQ ID N°34) HER2 Inieiador reverso de 5'-ctg cct ttg gtt gtg agc-3' (SEQ ID N°35) HER2 Sonda Fluos. de HER2 5'-caa tgc cag cct gtc ctt cct gca g-Fluos-3'(SEQ ID N°36) Sonda LC Red de HER2 5-LCred 640-tat cca gga ggt gca ggg CTA CGT gc-3'(SEQ ID N°37) Inieiador de cDNA de 5'-gtg tcc tga caa age tta tcg-3' (SEQ ID N°38) HER3 Inieiador a frente de 5'-gat ggg aag ttt gcc ate ttc g-3' (SEQ ID N°39) HER3 Inieiador reverso de 5'-tct caa tat aaa cac ccc ctg aca g-3'(SEQ ID HER3 N°40) Sonda Fluos. de HER3 5'-aac acc aac tcc age cac gct ctg-Fluos-3'(SEQ ID N°41) Sonda LC Red de HER3 5'-LCred 640-agc tcc gct tga ctc age tca ccg3'(SEQ ID N°42) Inieiador de cDNA de 5'-ctt gtc gaa gtt tc-3' (SEQ ID N°43) anfirregulina Iniciador a frente de an- 5-cca tag ctg cct tta tgt ctg c-3‘ (SEQ ID N°44) Nome Seqüência firregulina Iniciador reverso de anfir- 5'-ctt tgc ttc ctc age ttc tcc ttc-3' (SEQ ID N°45) regulina Sonda Fluos de anfirre- 5'-tga tcc tca cag ctg ttg ctg tta-Fluos-3' (SEQ ID gulina N°46) Sonda LC Red de anfir- 5-LCred-tac agt cca cgt tag aag aça ata cgt cag regulina gaa-3'(SEQ ID N°47) Iniciador de cDNA de 5'-gtc aac tct ctc aca c-3'(SEQ ID N°48) beta-celulina Iniciador a frente de be¬ 5'-tct agg tgc ccc aag c-3' (SEQ ID N°49) ta-celulina Iniciador reverso de beta- 5'-tag cct tca tca cag aca cag-3' (SEQ ID N°50) celulina Sonda Fluos de beta- 5’-gca tta ctg cat caa agg gag atg ccg-Fluos-3' celulina (SEQ ID N°51) Sonda LC Red de beta- 5-LCred 640-tcg tgg tgg ccg age aga cg-3' celulina (SEQ ID N°52) Um calibrador de RNA (RNA purificado da linhagem celular HT29) foi incluído em cada corrida para permitir a quantificação relativa, controles positivo e negativo foram usados para controlar o fluxo de trabalho e os reagentes.
A análise dos dados foi conduzida usando o LIGHTCYCLER®
Relative Quantification Software (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O resultado foi uma "taxa normalizada do calibrador" de cada marcador para cada amostra do paciente.
Os valores de qRT-PCR foram acessíveis para 119/130 pacien
tes (92%). A média dinâmica foi: EGFR - cerca de 10 vezes, HER2 - cerca de 10 vezes, HER3 - cerca de 20 vezes. O princípio de "quantificação relativa" foi usado. A expressão de gene (nível de mRNA) de uma amostra foi relativamente quantificada referindo-se a expressão de um gene residente 15 da mesma amostra (referência = G6PDH). Essa expressão relativa de gene fc: então normalizada para a expressão relativa de gene no calibrador. Para cada marcador, uma "taxa normalizada do calibrador" é calculada como abaixo:
TAXA NORMALIZADA Concentração do alvo (amostra) Concentração de referência DO CALIBRADOR = Concentração do alvo (calibrador) Concentração de referência Alvo = gene de interesse Referência = gene residente (G6PDH)
5 Calibrador = RNA da linhagem celular HT29 de câncer colorretal
Os resultados da eficácia foram avaliados em média com 7,1 meses de acompanhamento (média de 1,3-20,3). Houveram 101 eventos de sobrevida livre de progressão (PFS) nesse momento. As Figuras 10A e B representam PFS em todos os pacientes tratados tanto com gencitabina e 10 placebo quanto com gencitabina e pertuzumab. Os valores de P foram estimados usando o modelo Cox estratificado e o teste log-rank estratificado pela randomização de fatores de estratificação (ECOG PS, número de regimes anteriores para doença resistente à platina e mensurabilidade da doença).
PFS pela situação predita de HER2 é mostrada nas Figuras 11A
e B, que compara PFS em pacientes preditos negativos para HER2 e aqueles preditos positivos para HER2. Um algoritmo preditivo foi desenvolvido usando 80 amostras de câncer ovariano obtidas comercialmente. Uma combinação de expressão de HER2, HER3 e anfirregulina prediz amostras 30% 20 mais elevadas de pHer com uma precisão de 80%. Os pacientes eram preditos positivos para HER2 se a anfirregulina, HER2 e HER3 eram maiores do que e iguais ao 70° percentil, outros foram considerados negativos para pHER2.
As Figuras 12A e B representam PFS baseada nos pontos de corte de qRT-PCR de EGFR; as Figuras 13A e B, PFS baseada nos pontos de corte de qRT-PCR de HER2; e as 14A e B, PFS por pontos de corte de qRT-PCR de HER3. Pacientes com Her3 baixo têm melhor resultado em termos de PFS. Esses dados são mostrados em mais detalhes nas Figuras 15A e B. Como mostrado naquelas figuras, a atividade de pertuzumab é maior em pacientes com tumores que expressam Her3 baixo e tende a aumentar conforme o nível de expressão de gene de HER3 diminui. Essas figu5 ras incluem o valor absoluto para a expressão de HER3 como quantificado no ensaio de qRT-PCR.
As Figuras 16A e B ilustram PFS para subgrupos de HER3. Esses dados mostram que pode haver uma interação negativa entre pertuzumab e gencitabina em pacientes com tumores que expressam Her3 alto.
As Figuras 17A e B são tabelas adicionais que resumem os da
dos de PFS para subgrupos de HER3 para ambas expressão alta de HER3 e expressão baixa de HER3. As Figuras 18A e B representam PFS para subgrupos de HER3 baseado em quatro percentis diferentes. Pacientes no percentil 0 a menos do que o 50°, e particularmente do 0 ao 25° percentil 15 para expressão de HER3 têm um tempo médio de recidiva (HR) melhorado para PFS. (HRs menores correlacionam-se com resultados melhorados como medido por PFS).
As Figuras 19A e B fornecem os dados que mostram PFS para qRT-PCR de HER3 com um "split" de 50/50. Pacientes que expressam Her3 20 baixo (menos do que o 50° percentil) têm uma duração aumentada de PFS como medida em meses comparada a pacientes que expressam Her3 alto (maior ou igual ao 50° percentil). Essa correlação é mais pronunciada nas Figuras 20A e B onde pacientes que expressam Her3 baixo foram caracterizados como aqueles em menos do que o 25° percentil e pacientes que ex25 pressam Her3 alto eram aqueles em mais do que ou igual ao 25° percentil. O valor de P para a diferença em HR entre os dois subgrupos de diagnóstico foi de 0,0007. O 25° percentil é igual a 1,19 CNR
Dados preliminares estão disponíveis para a sobrevida global (OS), Tais dados para todos os pacientes são fornecidos nas Figuras 21A e B. As Figuras 22A e B comparam OS por qRT-PCR de HER3, comparando a expressão baixa de HER3 (menos do que o 50° percentil) e a expressão alta de HER3 (maior ou igual ao 50° percentil). As Figuras23A e B ilustram PFS por qRT-PCR de HER3 com divisão 50/50, tempo de recidiva (HR) alto versus baixo. O quadro completo de dados de PFS incluindo os percentis entre 5% a 95% são mostrados nas Figuras 24A e B.
A média de expressão da taxa normalizada calibrada de HER3 é mostrada na Figura 26. Essa média é de cerca de 20 a 80 vezes.
Os resultados de PFS foram avaliados ainda com relação a proporção de HER2:HER3. Os resultados dessas análises posteriores estão ilustrados nas Figs 29 a 31. Como todas essas figuras mostram, a atividade de pertuzumab é máxima em pacientes com uma proporção alta de HER2:HER3.
Conclusões
A atividade de pertuzumab é máxima em pacientes com câncer que expressa Her3 baixo e tende a aumentar conforme a expressão do gene de HER3 diminui. A atividade de pertuzumab também é máxima em pacientes com câncer que expressa HER2:Her3 alto e tende a aumentar conforme o nível de expressão do gene de HER2:HER3 aumenta. A maioria dos pacientes com nível baixo de expressão de HER3 que responderam a terapia com pertuzumab também tiveram uma proporção alta de HER2.HER3.
Pode haver uma interação negativa entre pertuzumab e gencitabina em pacientes com tumores que expressam Her3 alto.
A expressão de HER3 pode ser prognostica sobre o comportamento da quimioterapia com tumores com expressão alta respondendo melhor.
Os resultados foram surpreendentes e inesperados.
Exemplo 2
Pertuzumab para terapia de câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente
Esse exemplo diz respeito a um experimento clínico multicêntrico, aberto, na fase II, de pacientes com câncer ovariano. Pacientes com câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente foram tratados com pertuzumab, um anticorpo humanizado para HER2. Pacientes com câncer ovariano recorrente foram arrolados para receber uma terapia com o agente pertuzumab isolado em "dose baixa"; pertuzumab foi administrado intravenosamente (IV) com uma dose de ataque de 840 mg seguida por 420 mg a cada 3 semanas.
Uma segunda coorte de paciente foi tratada com pertuzumab em
"dose alta"; 1050 mg a cada 3 semanas, administrado como agente único.
Avaliações do tumor foram obtidas após 2, 4, 6, 8, 12 e 16 ciclos. A Taxa de Resposta (RR) PR RECIST foi o primeiro ponto de corte. A segurança e a tolerabilidade foram adicionalmente avaliadas. Os pontos de corte secundários foram TTP, duração da resposta, duração da sobrevida, farmacocinética (PK) e FOSI (coorte 2).
Ensaios de qRT-PCR foram realizados em tecidos arquivados fixados em formalina embebidos em parafina. Os dados do ensaio estão disponíveis para 46/117 pacientes. PFS e OS por qRT-PCR de HER3 com 15 25/75 selecionada como a melhor divisão são mostradas na Figura 25. Aqui, as expressões elevadas de HER3 eram maiores ou iguais ao 75° percentil, enquanto que expressões baixas de HER# eram menores do que o 75° percentil.
Novamente, os pacientes com baixa expressão de HER3 apresentaram melhores resultados em termos de PFS e OS.
Exemplo 3
Pertuzumab para terapia de câncer ovariano resistente à platina
Nesse estudo clínico randomizado, aberto na Fase II, a eficácia e a segurança do tratamento com pertuzumab em combinação com quimio25 terapia padronizada baseada em carboplatina foram investigadas em pacientes com câncer ovariano recorrente sensível a platina. O tamanho da amostra-alvo é de 100 a 500 indivíduos. O tamanho da amostra alvo é de 148. Critérios de inclusão
• câncer ovariano, peritoneal primário ou da trompa falopiana histologicamente confirmado;
• apenas um regime prévio, que deveria ser baseado em platina;
• doença sensível a platina que é definida por um intervalo sem progressão maior do que 6 meses após o término da quimioterapia baseada em platina.
Critérios de exclusão:
• radioterapia prévia;
· tratamento prévio com uma vacina anticâncer ou qualquer te
rapia direcionada;
• cirurgia importante ou lesão traumática dentro de 4 semanas
do estudo;
• história ou evidência de metástases para o sistema nervoso
central.
Os resultados são mostrados nas Figuras 32-35. Os resultados do mesmo experimento confirmam ainda que a atividade de pertuzumab é ótima em pacientes com câncer que expressa Her3 baixo e tende a aumentar conforme o nível de expressão do gene de HER3 diminui. A atividade de 15 pertuzumab também é ótima em pacientes com câncer que expressa HER2:Her3 alto e tende a aumentar conforme o nível de expressão de HER2.HER3 aumenta. A maioria dos pacientes com nível de expressão de Her3 baixo que responderam a terapia com pertuzumab também tiveram uma proporção de HER2:Her3 alto.
Pode haver uma interação negativa entre pertuzumab e gencita
bina em pacientes com tumores que expressam Her3 alto.
A expressão de HER3 pode ser prognostica sobre o comportamento da quimioterapia com tumores com expressão alta respondendo melhor.
Exemplo 4
Análise da expressão de gene da via de HER em um estudo na Fase Il de pertuzumab + gencitabina vs. gencitabina + placebo em pacientes com câncer ovariano epitelial resistente à platina
Antecedentes: Um experimento randomizado na fase Il (N=130) de pertuzumab + gencitabina vs. gencitabina + placebo em pacientes com câncer ovariano epitelial (EOC) resistente à platina (CCDP-R) sugeriu que pertuzumab poderia prolongar a PFS (HR 0,66, 95% Cl 0,43, 1,03) e gue a duração de PFS poderia estar associada com a expressão do gene de HER3 (Vide Exemplos 2 e 3).
Métodos: Pacientes com CDDP-R EOC foram randomizados para G+P ou G+placebo. O tratamento foi dado até a progressão ou até a 5 toxicidade inaceitável. O ponto de corte primário foi PFS. Um objetivo secundário foi avaliar a eficácia dos resultados em paciente com perfis de expressão relacionados a ativação de HER2. Um ensaio de qRT-PCR usando tecido arquivado fixado em formalina embebido em parafina (FFPET)1 realizado como descrito acima, permitiu a análise de expressão de mRNA de 10 genes da via de HER, incluindo HER1, HER2, HER3, anfirregulina e betacelulina. Os resultados foram descritos pela expressão baixa do gene (< média) e pela expressão alta do gene (>média).
Resultados: Dos 5 biomarcadores testados, apenas a expressão do gene de HER3 sugeriu um subgrupo de pacientes com um resultado dife15 rencial de PFS e OS baseado nos resultados baixo vs alto como se segue:
G + P G + Placebo Taxa de Risco (95%CI) PFS (média em meses) Todos os pacientes (n=130) 2,9 2,6 0,66* (0,43, 1,03) Her3 baixo (N=61) 5,3 1,4 0,34(0,18, 0,63) Her3 alto (N=61) 2,8 5,5 1,48 (0,83, 2,63) OS (média em meses) Todos os pacientes (n=130) 13,0 13,1 0,91* (0,58,1,41) Her3 baixo (N=61) 11,8 8,4 0,62 (0,35, 1,11) Her3 alto (N=61) 16,1 18,2 1,59 (0,8, 3,2) * Todas as análises dos pacientes foram estratificadas pela situação de ECOG, mensurabilidade da doença e N0 de regimes anteriores para a doença CDDP-R.
Conclusões: Essa análise exploratória sugere que níveis de ex20 pressão baixos de gene de HER3 em tumores podem ser usados como indicadores do prognóstico em pacientes com CDDP-R EOC. O tratamento com pertuzumab pode somar-se a atividade clínica de gencitabina em pacientes cujos tumores tem baixa expressão de gene de HER3. Esses dados sugerem que os níveis de expressão de mRNA de HER3 podem ser usados co25 mo um prcqncstico e um bicmarcador preditivo de diagnóstico.

Claims (105)

1. Composição compreendendo um inibidor da dimerização de HER para uso em um método para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito inibidor da dimerização de HER ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível que é menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer do paciente expresse HER3 em um nível que é menor do que o 25° percentil de expressão de HER3 no tipo de câncer.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a expressão de HER3 foi determinada usando a reação em cadeia da polimerase (PCR).
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a PCR é uma reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRTPCR).
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o inibidor da dimerização de HER é um inibidor da dimerização de HER2.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o inibidor da dimerização de HER inibe a heterodimerização de HER.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o inibidor da dimerização de HER é um anticorpo.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo se liga a um receptor de HER selecionado do grupo que consiste em EGFR, HER2 e HER3.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo se liga a HER2.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, na qual o anticorpo HER2 se liga ao Domínio Il do domínio extracelular de HER2.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o anticorpo se liga a uma junção entre os domínios I, Il e Ill do domínio extracelular de HER2.
12. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o anticorpo HER2 compreende as seqüências de aminoácido variáveis leves e variáveis pesadas das SEQ ID N0 3 e 4 , respectivamente.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo HER2 é pertuzumab.
14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, em que o anticorpo HER é um anticorpo nu, um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno.
15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tipo de câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer da trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula nãopequena (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal.
16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que o tipo de câncer é ovariano, câncer peritoneal ou câncer da trompa falopiana.
17. Composição de acordo com a reivindicação 16, em que o tipo de câncer é resistente à platina.
18. Composição de acordo com a reivindicação 16, em que o tipo de câncer é câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que prolonga a sobrevida livre de progressão (PFS) ou a sobrevida global (OS) do paciente.
20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o inibidor da dimerização de HER é administrado como o único agente antitumor.
21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que o tratamento compreende a administração de um segundo agente terapêutico ao paciente.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um agente quimioterápico, anticorpo HER, anticorpo direcionado contra um antígeno associado ao tumor, composto anti-hormonal, cardioprotetor, citocina, fármaco direcionado para EGFR, agente antiangiogênico, inibidor da tirosina quinase, inibidor de COX, fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor da farnesil transferase, anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA125, vacina para HER2, terapia direcionada a HER, inibidor de Raf ou ras, doxorrubicina lipossomal, topotecan, taxano, inibidor duplo de tirosina quinase, TLK286, EMD-7200, um medicamento que trata náuseas, um medicamento que previne ou trate erupção cutânea ou terapia padronizada para acne, um medicamento que trata ou previne diarréia, um medicamento que reduz a temperatura corporal e um fator de crescimento hematopoiético.
23. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico.
24. Composição de acordo com a reivindicação 23, em que o agente quimioterápico é selecionado do grupo que consiste em gencitabina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, topotecan e doxorrubicina lipossomal.
25. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o agente quimioterápico é um antimetabólito.
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.
27. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que o segundo agente terapêutico é trastuzumab, erlotinib ou bevacizumab.
28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
29. Composição de acordo com a reivindicação 28, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o nível mediano da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
30. Composição de acordo com a reivindicação 29, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
31. Uso de pertuzumab na preparação de um medicamento para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de pertuzumab, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
32. Uso de acordo com a reivindicação 31, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o 25° percentil da expressão de HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
33. Uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, em que a expressão de HER3 foi determinada usando a reação em cadeia da polimerase (PCR).
34. Uso de acordo com a reivindicação 33, em que a PCR é uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRTPCR).
35. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34 que prolonga a sobrevida livre de progressão (PFS) ou sobrevida global (OS).
36. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a35, em que o paciente tem câncer ovariano.
37. Uso de acordo com a reivindicação 36, em que o câncer ovariano é câncer ovariano resistente à platina.
38. Uso de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação 37, em que o paciente tem câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
39. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 38 compreendendo ainda administrar um agente quimioterápico ao paciente.
40. Uso de acordo com a reivindicação 39, em que o agente quimioterápico é selecionado do grupo que consiste em gencitabina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, topotecan e doxorrubicina lipossomal.
41. Uso de acordo com a reivindicação 40, em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito.
42. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.
43. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 42, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o nível mediano da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
45. Uso de acordo com a reivindicação 44, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
46. Método in vitro para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER compreendendo determinar a expressão de HER3 em uma amostra de câncer do paciente in vitro e selecionar um inibidor da dimerização de HER como a terapia se a amostra de câncer expressar HER3 em um nível menor do que o nível médio da expressão de HER3 no tipo de câncer.
47. Artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor da dimerização de HER em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o inibidor ou a composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível maior do que o nível mediano de expressão de HER3 no tipo de câncer.
48. Método para fabricar um inibidor da dimerização de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo, compreendendo combinar em uma embalagem o inibidor ou a composição farmacêutica e um selo determinando que o inibidor ou a composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor da dimerização de HER, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano de expressão de HER3 no tipo de câncer.
49. Método para divulgar um inibidor da dimerização de HER ou uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo promover, para um público-alvo, o uso do inibidor da dimerização de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer, onde o câncer do paciente expressa HER3 em um nível menor do que o nível mediano de expressão de HER3 no tipo de câncer.
50. Método in vitro para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um agente quimioterápico, compreendendo determinar a expressão de HER3 na amostra de câncer do paciente in vitro e selecionar um agente quimioterápico como a terapia se a amostra de câncer expressar HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o tipo de câncer é câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o tipo de câncer é câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana resistente à platina.
53. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o tipo de câncer é câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.
56. Uso de um inibidor de HER na preparação de um medicamento para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de HER ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
57. Uso de acordo com a reivindicação 57, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o nível mediano da expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer.
58. Uso de acordo com a reivindicação 57, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível que é maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
59. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a58, em que a expressão de HER2 e HER3 foi determinada usando a reação em cadeia da polimerase (PCR).
60. Uso de acordo com a reivindicação 59, em que a PCR é uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
61. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a60, em que o inibidor de HER é um inibidor da dimerização de HER.
62. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61, em que o inibidor de HER é um inibidor de HER2.
63. Uso de acordo com a reivindicação 61 ou reivindicação 62, em que o inibidor da dimerização de HER é um inibidor da dimerização de HER2.
64. Uso de acordo com a reivindicação 61, em que o inibidor de HER inibe a heterodimerização de HER.
65. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a64, em que o inibidor de HER é um anticorpo.
66. Uso de acordo com a reivindicação 65, em que o anticorpo se liga a um receptor de HER selecionado do grupo que consiste em EGFR, HER2 e HER3.
67. Uso de acordo com a reivindicação 66, em que o anticorpo se liga a HER2.
68. Uso de acordo com a reivindicação 67, em que o anticorpo HER2 se Iiqa ao Domínio Il do domínio extracelular de HER2.
69. Uso de acordo com a reivindicação 67, em que o anticorpo se liga a uma junção entre os domínios I, Il e Ill do domínio extracelular de HER2.
70. Uso de acordo com a reivindicação 69, em que o anticorpo HER2 compreenda as seqüências de aminoácido variáveis leves e variáveis pesadas das SEQ ID N0 3 e 4 , respectivamente.
71. Uso de acordo com a reivindicação 70, em que o anticorpo HER2 é pertuzumab.
72. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 71, em que o anticorpo HER é um anticorpo nu, um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno.
73. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a72, em que o tipo de câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer da trompa falopiana, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal.
74. Uso de acordo com a reivindicação 73, em que o tipo de câncer é câncer ovariano, câncer peritoneal ou câncer da trompa falopiana.
75. Uso de acordo com a reivindicação 74, em que o tipo de câncer é resistente à platina.
76. Uso de acordo com a reivindicação 74, em que o tipo de câncer é câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
77. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 76 que prolonga a sobrevida livre de progressão (PFS) ou sobrevida global (OS).
78. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 77, em que o inibidor de HER é administrado como o único agente antitumor.
79. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 77, compreendendo administrar um segundo agente terapêutico ao paciente.
80. Uso de acordo com a reivindicação 79, em que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um agente quimioterápico, anticorpo HER, anticorpo direcionado contra um antígeno associado ao tumor, composto anti-hormonal, cardioprotetor, citocina, fármaco direcionado a EGFR, agente antiangiogênico, inibidor da tirosina quinase, inibidor de COX1 fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor da farnesil transferase, anticorpo que se liga a proteína oncofetal CA125, vacina para HER2, terapia direcionada a HER, inibidor de Raf ou ras, doxorrubicina lipossomal, topotecan, taxano, inibidor duplo de tirosina quinase, TLK286, EMD-7200, um medicamento que trata náuseas, um medicamento que previne ou trata erupção cutânea ou terapia padronizada para acne, um medicamento que trata ou previne diarréia, um medicamento que reduz a temperatura corporal e um fator de crescimento hematopoiético.
81. Uso de acordo com a reivindicação 80, em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico.
82. Uso de acordo com a reivindicação 81, em que o agente quimioterápico é selecionado do grupo que consiste em gencitabina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, topotecan e doxorrubicina lipossomal.
83. Uso de acordo com a reivindicação 81, em que o agente quimioterápico é um antimetabólito.
84. Uso de acordo com a reivindicação 83, em que o agente quimioterápico um antimetabólito é gencitabina.
85. Uso de acordo com a reivindicação 80, em que o segundo agente terapêutico é trastuzumab, erlotinib ou bevacizumab.
86. Uso de pertuzumab na preparação de um medicamento para tratar um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pertuzumab ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 25° percentil da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
87. Uso de acordo com a reivindicação 86, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o nível mediano da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
88. Uso de acordo com a reivindicação 87, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 75° percentil da expressão de HER2:HER3 no câncer ovariano, peritoneal ou da trompa falopiana.
89. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a88, em que a expressão de HER2 e HER3 foi determinada pela reação em cadeia da polimerase (PCR).
90. Uso de acordo com a reivindicação 89, em que a PCR é uma reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).
91. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a90, que prolonga a sobrevida livre de progressão (PFS) ou a sobrevida global (OS) do paciente.
92. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a91, em que o paciente tem câncer ovariano.
93. Uso de acordo com a reivindicação 92, em que o câncer ovariano é câncer ovariano resistente à platina.
94. Uso de acordo com a reivindicação 92 ou reivindicação 93, em que o paciente tem câncer ovariano avançado, refratário ou recorrente.
95. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 94, compreendendo ainda administrar um agente quimioterápico ao paciente.
96. Uso de acordo com reivindicação 95, em que o agente quimioterápico é selecionado do grupo que consiste em gencitabina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, topotecan e doxorrubicina lipossomal.
97. Uso de acordo com a reivindicação 95, em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito.
98. Uso de acordo com a reivindicação 97, em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.
99. Método in vitro para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, compreendendo determinar a expressão de HER2 e HER3 na amostra de câncer do paciente in vitro e selecionar um inibidor de HER como a terapia se a amostra de câncer expressar HER2.HER3 em um nível maior do que o .25° percentil da expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
100. Artigo de manufatura compreendendo, na mesma embalagem, uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de HER em um veículo farmaceuticamente aceitável e um selo determinando que o inibidor ou a composição farmacêutica é indicado para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 25° percentil de expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
101. Método para fabricar um inibidor de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo, compreendendo combinar em uma embalagem o inibidor ou a composição farmacêutica e um selo determinando que o inibidor ou a composição farmacêutica são indicados para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, em que o câncer do paciente expressa HER2.HER3 em um nível maior do que o 25° percentil de expressão de HER2.HER3 no tipo de câncer.
102. Método para divulgar um inibidor de HER ou uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo promover, para um público-alvo, o uso do inibidor de HER ou uma composição farmacêutica do mesmo para tratar uma população de pacientes com um tipo de câncer, em que o câncer do paciente expressa HER2:HER3 em um nível maior do que o 25° percentil de expressão de HER2:HER3 no tipo de câncer.
103. Uso de um inibidor de HER na preparação de um medicamento para tratar um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de HER ao paciente, em que o câncer do paciente expressa HER3 em um nível que é menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
104. Método in vitro para selecionar uma terapia para um paciente com um tipo de câncer que é capaz de responder a um inibidor de HER compreendendo determinar a expressão de HER3 em uma amostra de câncer do paciente in vitro e selecionar um inibidor de HER como a terapia, se a amostra de câncer expressar HER3 em um nível menor do que o nível mediano da expressão de HER3 no tipo de câncer.
105. Método de acordo com a reivindicação 103 ou reivindicação104, em que o inibidor de HER é um inibidor de HER2.
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