BRPI0812682A2 - tratamento de cáncer de mama metastático - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao tratamento de câncer de mama metástico HER2 positivo anteriormente não tratado com uma combinação de um anticorpo contra HER2 inibidor de crescimento, um anticorpo inibidor de dimerização de HER2, e um taxeno. Em particular, a invenção considera o tratamento de câncer de mama metástico HER2 positivo em pacientes que não receberam anteriormente quimioterapia ou terapia biológica com um anticorpo contra HER2 se ligando essencialmente ao epítopo 2C4, um anticorpo contra HER2 se ligando essencialmente ao epitopo 4D5, e um taxeno. A invenção adicionalmente compreende estender a sobrevida de tais pacientes pela terapia de combinação da presente invenção. Em uma modalidade preferencial, o tratamento envolve a administração de trastuzumabe, pertuzumabe e docetaxel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMENTODE CÂNCER DE MAMA METASTÁTICO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao tratamento de câncer de ma-ma metástico HER2 positivo anteriormente não tratado com uma combina-ção de um anticorpo contra HER2 inibidor de crescimento, um anticorpo ini-bidor de dimerização contra HER2 e um taxeno. Em particular, a invençãorefere-se ao tratamento de câncer de mama metástico HER2 positivo empacientes que não receberam antes quimioterapia ou terapia biológica comum anticorpo contra HER2 ligando essencialmente à epítopo 2C4, um anti-corpo contra HER2 ligando essencialmente à epítopo 4D5, e um taxeno. Ainvenção adicionalmente compreende estender a sobrevida de tais pacientespela terapia de combinação da presente invenção. Em uma modalidade pre-ferencial, o tratamento envolve a administração de trastuzumabe, pertuzu-mabe e docetaxel.

Antecedentes da Invenção

Receptores HER e Anticorpos contra esses

Os membros da família HER de receptor de tirosina quinase sãoimportantes mediadores do crescimento, diferenciação e sobrevida celular. Afamília do receptor inclui quatro membros distintos incluindo receptor de fator decrescimento epidérmico ((EGFR, ErbB1, ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185neü),HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2)).

O EGFR, codificado pelo gene erbB1, foi implicado de formacausai na malignidade humana. Em particular, a expressão aumentada deEGFR foi observada em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoçoe estômago bem como em glioblastomas. A expressão de receptor EGFRaumentada é freqüentemente associada com a produção aumentada do li-gante do EGFR, fator de crescimento transformante alfa (TGF-oc), pelasmesmas células tumorais resultando em ativação do receptor por uma rotaestimulatória autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154(1994). Os anticorpos monoclonais contra o EGFR ou seus ligantes, TGF-oce EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de taismalignidades. Vide, por exemplo, Baselga e Mendelsohn, acima; Masui eoutros, Câncer Research 44:1002-1007 (1984); eWue outros, J. Clin. In-vest. 95:1897-1905 (1995).

O segundo membro da família HER, p185neü, foi originalmenteidentificado como o produto do gene transformante a partir de neuroblasto-mas de ratos quimicamente tratados. A forma ativada do proto-oncogeneneu resulta de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na regiãotransmembrana da proteína codificada. A amplificação do homologo humanode neu é observada em cânceres de mama e de ovário e correlaciona comum prognóstico pobre (Slamon e outros, Science, 235:177-182 (1987); Sla-mon e outros, Science, 244:707-712 (1989); e Patente US N2 4.968.603).Até agora, nenhuma mutação pontual análoga a essa no proto-oncogeneneu foi relatada para tumores humanos. A superexpressão de HER2 (fre-qüentemente, mas não uniformemente devido à amplificação de gene) foitambém observada em outros carcinomas incluindo carcinomas do estôma-go, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas, e be-xiga. Vide, entre outros, King e outros, Science, 229:974 (1985); Yokota eoutros, Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige e outros, Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin e outros, Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen e ou-tros, Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura e outros, Câncer Res., 51:1034(1991); Borst e outros, Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner e outros,Câncer Res., 50:421-425 (1990); Kern e outros, Câncer Res., 50:5184(1990); Park e outros, Câncer Res., 49:6605 (1989); Zhau e outros, Mol.Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland e outros Br. J. Câncer 57:358-363(1988); Williams e outros, Pathobiology 59:46-52 (1991); and McCann e ou-tros, Câncer, 65:88-92 (1990). HER2 pode ser superexpresso em câncer depróstata (Gu e outros, Câncer Lett. 99:185-9 (1996); Ross e outros, Hum.Pathol. 28:827-33 (1997); Ross e outros, Câncer 79:2162-70 (1997); e Sa-dasivan e outros, J. Urol. 150:126-31 (1993)).

Os anticorpos direcionados contra os produtos de proteínap185neude rato e HER2 humana foram descritos.

Drebin e amigos elevaram os anticorpos contra o produto de ge-ne neu de rato, p185neu. Vide, por exemplo, Drebin e outros, Ce//41:695-706(1985); Myers e outros, Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); e W094/22478.Drebin e outros Oncogene 2:273-277 (1988) relataram que misturas de anti-corpos que reagem com duas regiões distintas de p185neu resultam em efei-tos cinergísticos antitumor em células NIH-3T3 transformadas por neu im-plantadas em ratos pelados. Vide também Patente U.S. 5.824.311 emitidaem 20 de Outubro de 1998.

Hudziak e outros, Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) descre-vem a geração de um painel de anticorpos contra HER2 que foram caracte-rizados usando a linhagem celular de tumor de mama humano SK-BR-3. Aproliferação das células SK-BR-3 seguindo a exposição aos anticorpos foideterminada por coloração violeta cristal das monocamadas depois de 72horas. Usando esse ensaio, a inibição máxima foi obtida com o anticorpochamado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos nopainel reduziram a proliferação celular em uma extensão menor nesse en-saio. O anticorpo 4D5 foi adicionalmente encontrado para sensibilizar as li-nhagens celulares de tumor na mama com superexpressão de HER2 aosefeitos citotóxicos de TNF-a. Vide também Patente U.S. N2 5.677.171 emiti-da em 14 de Outubro de 1997. Os anticorpos contra HER2 discutidos emHudziak e outros são adicionalmente caracterizados em Fendly e outrosCâncer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts e outros In Vitro 26(3):59A(1990) ; Sarup e outros Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard e outrosJ. Clin. Immunol. 11 (3):117-127 (1991); Kumar e outros Mol. Cell. Biol.11(2):979-986 (1991); Lewis e outros Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras e outros Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta e outrosCâncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski e outros J. Biol. Chem.269(20):14661-14665 (1994); Scott e outros J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991) ; D'souza e outros Proc. Natl. Acad. Sei. 91:7202-7206 (1994); Lewis eoutros Câncer Research 56:1457-1465 (1996); e Schaefer e outros Oncoge-ne 15:1385-1394 (1997).

Uma versão humanizada recombinante do anticorpo contraHER2 4D5 de ratos (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumabe ou HER-CEPTIN®; Patente U.S. N2 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientescom câncer de mama metástico com superexpressão de HER2 que recebe-ram terapia anticâncer anterior extensiva (Baselga e outros, J. Clin. Oncol.14:737-744 (1996)). O trastuzumabe recebeu aprovação de comercializaçãoa partir da Food and Drug Administration em 25 de Setembro de 1998, parao tratamento de pacientes com câncer de mama metástico cujos tumores su-perexpressam a proteína HER2. Enquanto a administração de trastuzumabelevou a excelentes resultados no tratamento de câncer de mama, dados recen-tes a partir de exames clínicos de lapirinib parecem sugerir que mesmo com aadministração de trastuzumabe, HER2 executa uma função ativa na biologiado tumor (Geyer e outros, N Engl J Med 2006; 355:2733-2743).

Outros anticorpos contra HER2 com várias propriedades foramdescritos em Tagliabue e outros, Int. J. Câncer 47:933-937 (1991); McKenziee outros Oncogene 4:543-548 (1989); Maier e outros Câncer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus e outros Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stan-covski e outros PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus e outros Câncer Re-search 52:2580-2589 (1992); Xu e outros Int. J. Câncer 53:401 -408 (1993);WO94/00136; Kasprzyk e outros Câncer Research 52:2771-2776 (1992); Han-cock e outros Câncer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver e outros CâncerRes. 54:1367-1373 (1994); Arteaga e outros Câncer Res. 54:3758-3765(1994); Harwerth e outros J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); PatenteU.S. N- 5.783.186; e Klapper e outros Oncogene 14:2099-2109 (1997).

Exames da homologia resultaram na identificação de dois outrosmembros da família do receptor de HER; HER3 (Patente U.S. N-s 5.183.884e 5.480.968 bem como Kraus e outros PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) eHER4 (Pedido de Patente EP N2 599.274; Plowman e outros, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman e outros, Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos esses receptores exibem expressão aumentada em aomenos algumas linhagens celulares de câncer de mama.

Os receptores de HER são geralmente encontrados em váriascombinações em células e crê-se que a heterodimerização aumenta a diver-sidade de respostas celulares em uma variedade de ligantes de HER (Earp eoutros, Breast Câncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFRé ligado por seis ligantes diferentes, fator de crescimento epidérmico (EGF),fator de crescimento transformante alfa (TGF-a), anfiregulina, fator de cres-cimento epidérmico de ligação da heparina (HB-EGF), betacelulina e epire-gulina (Groenen e outros, Growth Factors 11:235-257 (1994)). Uma família deproteínas heregulina resultante da união alternativa de um único gene são li-gantes para HER3 e HER4. A família de heregulina inclui heregulinas alfa, betae gama (Holmes e outros, Science, 256:1205-1210 (1992); Patente U.S. N25.641.869; e Schaefer e outros Oncogene 15:1385-1394 (1997)); fatores dediferenciação neu (NDFs), fatores de crescimento da glia (GGFs); atividadede indução de receptor de acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurôniosensorial e motor (SMDF). Para uma revisão, vide Groenen e outros, GrowthFactors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262(1996) e Lee e outros Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recentemente, três ligan-tes de HER adicionais foram identificados; neuregulina-2 (NRG-2) que é relata-do como ligando ou HER3 ou HER4 (Chang e outros Nature 387 509-512(1997) ; e Carraway e outros, Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 queliga HER4 (Zhang e outros, PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); e neureguli-na-4 que se liga a HER4 (Harari e outros, Oncogene 18:2681-89 (1999)),HB-EGF, betacelulina e epiregulina também se ligam a HER4.

Enquanto EGF e TGF-a não se ligam a HER2, EGF estimulaEGFR e HER2 a formarem um heterodímero, que ativa EGFR e resulta emtransfosforilação de HER2 no heterodímero. A dimerização e/ou a transfosfo-rilação parece ativar a tirosina quinase de HER2. Vide Earp e outros, acima.Igualmente, quando HER3 é co-expresso com HER2, um complexo de sina-lização ativo é formado e anticorpos direcionados contra HER2 são capazesde romper esse complexo (Sliwkowski e outros, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). Adicionalmente, a afinidade de HER3 para heregulina(HRG) é aumentada a um estado de afinidade mais alto quando co-expressacom HER2. Vide também, Levi e outros, Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435(1995); e Lewis e outros, Câncer Res., 56:1457-1465 (1996) com relação aocomplexo de proteínas HER2-HER3. HER4, como HER3, forma um comple-xo de sinalização ativo com HER2 (Carraway e Cantley, Ce//78:5-8 (1994)).

As publicações de patente referidas a anticorpos contra HERincluem: US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 5.725.856, US5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063,US2002/0192211A1, US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603, US5.821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US2004/0236078A1, US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US6.821.515, WO 98/17797, US 6.127.526, US 6.333.398, US 6.797.814, US6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, WO 99/31140, US 2003/0147884A1,US 2003/0170234A1, US 2004/0037823A1, US 2005/0002928A1, US6.573.043, US 6.905.830, US 2003/0152987A1, WO 99/48527, US 2002/0141993A1, US2005/0244417A1, Patente US N- 6.949.245, US 2003/0086924, US 2004/0013667A1, WO 00/69460, US 2003/0170235A1, US7.041.292, WO 01/00238, US 2006/0083739, WO 01/15730, US6.627.196B1, US 6.632.979B1, WO01/00244, US 2002/0001587A1, US2002/0090662A1, US 6.984.494B2, WO 01/89566, US 2002/0064785, US2003/0134344, WO 2005/099756, US2006/0013819, WO2006/07398A1,US2006/0018899, WO 2006/33700, US2006/0088523, US 2006/0034840,WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131,US2003/0228663, WO2004/008099A2, US2004/0106161, WO2004/048525,US2004/0258685A1, WO 2005/16968, US2005/0038231A1US 5.985.553,US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401.638, US 5.604.107, WO 87/07646,WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412.116 B1, EP 494.135 B1, US5.824.311, EP 444.181 B1, EP 1.006.194 A2, US 2002/0155527A1, WO91/02062, US 5.571.894, US 5.939.531, EP 502.812 B1, WO 93/03741, EP554.441 B1, EP 656.367 A1, US 5.288.477, US 5.514.554, US 5.587.458,WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305, WO 93/21319, WO 93/21232,US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486, US 6.028.059, WO 96/07321,US 5.804.396, US 5.846.749, EP 711.565, WO 96/16673, US 5.783.404, US5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271, US 6.270.765, US 6.395.272, US5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186, US 6.458.356, WO 97/20858, WO97/38731, US 6.214.388, US 5.925.519, WO 98/02463, US 5.922.845, WO98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 B1,US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6.582.919,US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328,US 6.602.670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5.705.157, US 6.123,939, EP 616.812 B1,US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 B1, WO 00/61145, WO00/61185, US 6.333.348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791,WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO02/070008, WO 02/089842, e WO 03/86467.

Os pacientes tratados com anticorpo contra HER2 trastuzumabesão selecionados para terapia baseada na superexpressão/amplificação deHER2. Vide, por exemplo, WO 99/31140 (Paton e outros), US 2003/0170234A1(Hellmann, S.), e US 2003/0147884 (Paton e outros); bem como WO 01/89566,US 2002/0064785, e US 2003/0134344 (Mass e outros). Vide, também, PatenteU.S. N2 6.573.043, Patente U.S. N2 6.905.830, e US 2003/0152987, Cohen eoutros, considerando imuno-histoquímica (IHC) e hibridização in situ por fluo-rescência (FISH) para detectar superexpressão e amplificação de HER2.

WO 2004/053497 e US 2004/024815A1 (Bacus e outros), bemcomo US 2003/0190689 (Crosby e Smith), referem-se a determinar ou pre-ver resposta à terapia com trastuzumabe. US 2004/013297A1 (Bacus e ou-tros) considera determinar ou prever resposta a terapia com anticorpos EG-FR ABX0303. WO 2004/000094 (Bacus e outros) é direcionada a determinarresposta a GW572016, uma pequena molécula, inibidor de tirosina quinaseEGFR-HER2. WO 2004/063709, Amler e outros, refere-se a biomarcadorese métodos para determinar sensibilidade ao inibidor de EGFR, cloridrato deerlotinibe. US 2004/0209290 e WO 04/065583, Cobleigh e outros, consideramos marcadores de expressão de gene para prognóstico de câncer de mama.Vide, também, WO 03/078662 (Baker e outros), e WO03/040404 (Bevilacqua eoutros). WO 02/44413 (Danenberg, K.) refere-se a determinar expressão degene EGFR e HER2 para determinar um regime de quimioterapia.

Os pacientes tratados com pertuzumabe podem ser seleciona-dos para terapia baseada em ativação ou dimerização de HER. As publica-ções de patente considerando pertuzumabe e a seleção de pacientes paraterapia com ele incluem: Patente US N2 6.949.245, WO 01/00245, US 2005/0208043, US 2005/0238640, US 2006/0034842, e US 2006/0073143 (Adams eoutros); US 2003/0086924 (Sliwkowski, M.); US 2004/0013667A1 (Sliwkowski,M.); bem como WO 2004/008099A2, e US 2004/0106161 (Bossenmaier eoutros).

Cronin e outros, Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004) descreve amedição de expressão de gene em tecidos embutidos em parafina arquiva-dos. Ma e outros, Câncer Ce//5:607-616 (2004) descreve perfil de gene pormicroarranjo de oligonucleotídeo de gene usando RNA isolado de seções detecido de tumor obtido de biópsias primárias arquivadas.

O pertuzumabe (também conhecido como anticorpo monoclonalhumano recombinante 2C4; OMNITARG®, Genentech, Inc, South San Fran-cisco) representa o primeiro de uma nova classe de agentes conhecidoscomo inibidores de dimerização de HER (HDI) e funciona para inibir a capa-cidade do HER2 formar heterodímeros ativos com outros receptores de HER(tal como EGFR/HER1, HER3 e HER4) e é ativo desprezando os níveis deexpressão de HER2. Vide, por exemplo, Harari e Yarden, Oncogene 19:6102-14(2000); Yarden e Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); SliwkowskiNat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho e outros, Nature 421:756-60 (2003); eMalik e outros, ProAm Soe Câncer Res 44:176-7 (2003).

O bloqueio de pertuzumabe da formação de heterodímerosHER2-HER3 em células tumorais foi demonstrado como inibindo a sinaliza-ção celular crítica, que resulta em proliferação e sobrevida com tumor redu-zidas (Agus e outros, Câncer Cell 2:127-37 (2002)).O pertuzumabe passou por testes como um único agente na clí-nica com um exame de fase Ia em pacientes com cânceres avançados eexames de fase II em pacientes com câncer no ovário e câncer de mamabem como câncer de pulmão e próstata. Em um estudo de fase I, os pacien-tes com tumores sólidos metásticos ou recorrentes, localmente avançados,incuráveis que progrediram durante ou depois de terapia padrão foram trata-dos com pertuzumabe obtido intravenosamente a cada 3 semanas. O pertu-zumabe foi geralmente bem tolerado. A regressão do tumor foi alcançadaem 3 de 20 pacientes avaliados por resposta. Dois pacientes confirmaramrespostas parciais. Doença estável durando por mais de 2,5 meses foi ob-servada em 6 dos 21 pacientes (Agus e outros, Pro Am Soe Clin Oncol22:192 (2003)). Em doses de 2,0 0 15 mg/kg, a farmacocinética de pertuzu-mabe foi linear, e a folga média está na faixa de 2,69 a 3,74 mL/dia/kg e ameia vida de eliminação terminal estava na faixa de 15,3 a 27,6 dias. Os an-ticorpos para pertuzumabe não foram detectados (Allison e outros, Pro AmSoe Clin Oncol 22:197 (2003)).

US 2006/0034842 descreve métodos para tratar câncer de ex-pressão de ErbB com combinações de anticorpo anti ErbB2. WO 08/031531descreve o uso de trastuzumabe e pertuzumabe no tratamento de câncermetástico de HER2 positivo, tal como câncer de mama. Baselga e outros, JClin Oncol, 2007 ASCO Annual Meeting Proccedings Part I, Col. 25, N- 18S(Suplemento de 20 de Junho), 2007:1004 relatam o tratamento de pacientescom câncer de mama de HER2 positivo pré-tratados, que progrediram du-rante o tratamento com trastuzumabe, com uma combinação de trastuzumabee pertuzumabe. Portera e outros, J Clin Oncol, 2007 ASCO Annual MeetingProceedings Part I. Vol. 25, N- 18S (Suplemento de 20 de Junho), 2007:1028avaliou a eficácia e segurança da terapia de combinação de trastuzumabe +pertuzumabe em pacientes com câncer de mama de HER2 positivo, que te-ve doença progressiva em terapia à base de trastuzumabe. Aos autoresconcluíram que avaliação adicional da eficácia de tratamento de combinaçãofoi exigido definir o risco geral e benefício desse regime de tratamento.

O pertuzumabe foi avaliado em estudos de Fase II em combina-ção com trastuzumabe em pacientes com câncer de mama metastico deHER2 positivo que receberam previamente trastuzumabe para doença me-tástica. Um estudo, conduzido pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI), arro-lou 11 pacientes com câncer de mama metastico de HER2 positivo previa-mente tratados. Dois dos 11 pacientes exibiram uma resposta parcial (RP)(Baselga e outros, J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings;25:18S (Suplemento de 20 de Junho): 1004.

O câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres, comuma prevalência global de mais de 1 milhão de pacientes e uma taxa demortalidade de aproximadamente 400.000 mortes por ano (International A-gency for Research on Câncer; http://www-dep.iarc.fr; Globocan 2002). En-quanto a detecção anteriormente aprovada e avanços na terapia sistêmicapara doença em estágio precoce resultaram em um declínio em mortalidadede câncer de mama desde 1989, câncer de mama metastico (MBC) perma-nece amplamente incurável com uma sobrevida média de aproximadamente24 meses. Os fatores associados com a sobrevida pobre incluem idade > 50anos, doença visceral, intervalo de doença livre mais curto (DFI), tumoresaneuplóide, tumores com uma alta fração de fase S, acúmulo p53, baixa ex-pressão bcl-2, estado de receptor de hormônio negativo, e estado de recep-tor 2 de fator de crescimento epidérmico humano positivo (HER2) (Chang J,e outros, Câncer 2003; 97:545-53).

Embora os agentes quimioterápicos, tal como antraciclinas, ta-xenos, agentes alquilantes, e/ou vinca alcalóides, usados como únicos agen-tes, produziram importantes resultados em estender a sobrevida de pacien-tes com câncer de mama metastico, as raras respostas completas são devida curta, e usualmente a doença continua a progredir. (Chung C, CarlsonR. The Oncologist 2003; 8:514-20; Bernard-Marty C, e outros, The Oncolo-gist2003; 9:617-32).

O anticorpo contra HER2 trastuzumabe é aprovado para usocomo monoterapia ou em combinação com quimioterapia no ajuste metasti-co, e em combinação com quimioterapia como tratamento adjuvante paracâncer de mama de HER positivo. O gerenciamento otimizado de câncer demama metástico agora leva em conta não somente uma condição geral dopaciente, histórico médico, volume do tumor, e estado do receptor, mas tam-bém o estado de HER2.

Um estudo de Fase II randomizado avaliou trastuzumabe e do-cetaxel versus somente docetaxel como um tratamento de primeira linha pa-ra câncer de mama metástico de HER2 positivo (Marty e outros, J Clin Oncol2005; 23:4265-4274).

O aprimoramento na sobrevida é um objetivo importante no tra-tamento de pacientes diagnosticados com câncer de mama metástico deHER2 positivo. Apesar dos avanços em terapia de câncer, há significativanecessidade médica para novos regimes de tratamento de modo a alcançaresse objetivo.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece dados clínicos de pacientes huma-nos com câncer de mama tratados com uma combinação de trastuzumabe,pertuzumabe e docetaxel.

Em um aspecto, a invenção considera um método para o trata-mento de câncer de mama, compreendendo administrar a um paciente comcâncer de mama metástico de HER2 positivo uma quantidade eficaz de umanticorpo contra HER2 inibidor de crescimento, um anticorpo inibidor de di-merização de HER2, e um taxeno, sendo que o paciente não recebeu quimi-oterapia antes ou terapia biológica.

Em uma modalidade, o anticorpo contra HER2 inibidor de cres-cimento se liga a um epítopo dentro do Domínio IV (ID SEQ NO:17) da se-quência de aminoácido HER2.

Em outra modalidade, o anticorpo contra HER2 inibidor de cres-cimento se liga essencialmente ao epítopo 4D5 de HER2.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo inibidor de dimerizaçãode HER2 se liga a HER2 na junção dos domínios I, II e III (ID de SEQ N2S14, 15e16).

Em uma modalidade adicional, o anticorpo inibidor de dimeriza-ção de HER2 se liga essencialmente ao epítopo 2C4.Em ainda uma modalidade adicional, o anticorpo inibidor decrescimento e/ou o anticorpo inibidor de dimerização de HER2 é um frag-mento de anticorpo.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo inibidor de cresci-mento e/ou o anticorpo inibidor de dimerização de HER2 é quimérico, huma-nizado ou humano.

Em uma modalidade particular, o anticorpo inibidor de cresci-mento é trastuzumabe, ou um fragmento desse, o anticorpo de dimerizaçãode HER2 é pertuzumabe, ou um fragmento desse, e o taxeno é docetaxel.

Em outro aspecto, a invenção considera um método para o tra-tamento de câncer de mama, compreendendo administrar a um pacientecom câncer de mama metástico com HER2 positivo uma quantidade eficazde um primeiro anticorpo contra HER2 ligando essencialmente ao epítopo2C4, um segundo anticorpo contra HER2 ligando essencialmente ao epítopo4D5, e um taxeno, sendo que o paciente não recebeu quimioterapia antes outerapia biológica.

Em uma modalidade, o paciente é um paciente humano.

Em outra modalidade, o primeiro e o segundo anticorpos sãoanticorpos monoclonais.

Em ainda outra modalidade, ao menos um do primeiro e do se-gundo anticorpos é um fragmento de anticorpo.

Em uma modalidade diferente, ao menos um do primeiro e dosegundo anticorpo é quimérico, humanizado ou humano.

Em uma modalidade particular, o primeiro anticorpo é pertuzumabe.

Em outra modalidade particular, o segundo anticorpo é trastu-zumabe.

Em ainda outra modalidade particular, o taxeno é docetaxel.

Em uma modalidade adicional, o primeiro e o segundo anticor-pos e o dito taxeno são administrados ao mesmo tempo.

Em uma modalidade ainda adicional, o primeiro e o segundo anti-corpos e o taxeno são administrados consecutivamente, em qualquer ordem.

Em outra modalidade, a administração do primeiro anticorpoprecede a administração do segundo anticorpo e o taxeno.

Em ainda outra modalidade, ao menos um do pertuzumabe e dotrastuzumabe é um anticorpo nu.

Em uma modalidade diferente, ao menos um do pertuzumabe edo trastuzumabe é um anticorpo intacto.

Em uma modalidade adicional, a administração do pertuzumabe,trastuzumabe e docetaxel resulta em um efeito cinergístico.

Em uma modalidade ainda adicional, a administração do pertu-zumabe, trastuzumabe e docetaxel estende a sobrevida do paciente humanoem relação ao tratamento na ausência de ao menos um de pertuzumabe,trastuzumabe e docetaxel. Em uma modalidade particular, a sobrevida livrede progressão (PFS) ou sobrevida global (OS) é estendida.

Embora os métodos da presente invenção possam ser executa-dos na ausência de quaisquer outros meios de terapia contra câncer, porexemplo, na ausência de um agente terapêutico adicional, incluindo agentesquimioterápicos e biológicos, os métodos podem opcionalmente compreen-der a administração de um agente terapêutico adicional selecionado a partirdo grupo que consiste em agente quimioterápico, um anticorpo HER diferen-te, anticorpo direcionado contra um antígeno associado a tumor, compostoanti-hormonal, cardioprotetor, citoquina, inibidor de COX, fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor de farnesil transferase, anticorpo que seliga à proteína oncofetal CA 125, vacina contra HER2, terapia específica pa-ra HER, inibidor de Raf ou ras, doxorrubicina lipossômica, topotecana, taxe-no, inibidor de tirosina quinase duplo, TLK286, EMD-7200, um medicamentoque trata náusea, um medicamento que impede ou trata erupções na pele outerapia de acne padrão, um medicamento que trata ou impede diarréia, ummedicamento que reduz a temperatura do corpo, e um fator de crescimentohematopoiético.

Em outro aspecto, a invenção considera um kit compreendendoum primeiro anticorpo contra HER2 ligando-se essencialmente ao epítopo2C4, um segundo anticorpo contra HER2 ligando-se essencialmente ao epí-topo 4D5, e um taxeno, e um elemento de bula ou rótulo com direções paratratar um paciente com câncer de mama metástico com HER2 positivo, quenão recebeu antes de quimioterapia ou terapia biológica.

Em ainda outro aspecto, a invenção considera um método depromover pertuzumabe para o tratamento de um paciente com câncer demama metástico com HER2 positivo que não recebeu antes quimioterapiaou terapia biológica, em combinação com trastuzumabe e um taxeno. Exa-tamente como antes, o taxeno, pode ser, por exemplo, docetaxel.

Em um aspecto adicional, a invenção considera um método depromover trastuzumabe para o tratamento de um paciente com câncer demama metástico com HER2 positivo que não recebeu antes quimioterapiaou terapia biológica, em combinação com pertuzumabe e um taxeno, tal co-mo docetaxel.

Em um aspecto ainda adicional, a invenção considera um méto-do para promover um taxeno para o tratamento de um paciente com câncerde mama metástico com HER2 positivo que não recebeu antes quimioterapiaou terapia biológica, em combinação com pertuzumabe e trastuzumabe, sendoque o taxeno pode, por exemplo, ser docetaxel. Sem limitação, a promoçãopode estar na forma de um material escrito, ou um elemento de bula.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 fornece um esquema da estrutura de proteína HER2,e seqüências de aminoácido para Domínios l-IV (ID SEQ N-s 14-17, respec-tivamente) do domínio extracelular dessas.

As Figuras 2A e 2B descrevem alinhamentos das seqüências deaminoácidos dos domínios da variável leve (VL) (Fig. 2A) e da variável pesa-da (VH) (Fig. 2B) de anticorpo monoclonal de ratos 2C4 (ID SEQ N2S 1 e 2,respectivamente); os domínios VL e VH de variante 574/pertuzumabe (IDSEQ N2S 3 e 4, respectivamente), e estruturas de consenso de VL e VH hu-manas (k1 hum, kappa leve subgrupo I; humlll, subgrupo III pesado) (IDSEQ N2S 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam diferenças entreos domínios variáveis de pertuzumabe e anticorpo monoclonal de ratos 2C4ou entre domínios variáveis de pertuzumabe e a estrutura humana. As Regi-ões de Determinação de Complementaridade (CDRs) estão em colchetes.As Figuras 3A e 3B mostram as seqüências de aminoácidos decadeia leve de pertuzumabe (Fig. 3A; ID SEQ N2 7) e cadeia pesada (Fig.3B; ID SEQ Ns 8). As CDRs são mostradas em negrito. As massas molecu-lares calculadas da cadeia leve e da cadeia pesada são 23.526,22 Da e49.216,56 Da (cisteínas na forma reduzida). A porção de carboidrato é ane-xada a Asn 299 da cadeia pesada.

As Figuras 4A e 4B mostram as seqüências de aminoácidos dacadeia leve (Fig. 4A; ID SEQ N2 9) e cadeia pesada (Fig. 4B; ID SEQ N2 10)de trastuzumabe, respectivamente.

As Figuras 5A e 5B descrevem uma seqüência de cadeia levede pertuzumabe (Fig. 5A; ID SEQ N2 11) e uma seqüência de cadeia pesadade pertuzumabe variante (Fig. 5B; ID SEQ N2 12), respectivamente.

A Figura 6 mostra Concentrações de Pertuzumabe em Soro(u.g/ml_) para os primeiros 84 dias (através do Dia de Estudo 85) para Estu-dos TOC2689g e B016934.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais

I. Definições

Os termos "terapia biológica" e "imunoterapia" são usados aquide forma intercambiável e se referem a tratamentos contra câncer utilizandoo sistema imunológico do corpo para lutar contra o câncer, sem considerarseu mecanismo de ação. A terapia biológica especificamente inclui tratamen-to com anticorpos.

O termo "quimioterapia" como usado aqui se refere a tratamentocompreendendo a administração de um agente quimioterápico, como defini-do abaixo.

"Sobrevida" se refere à vida restante do paciente, e inclui a so-brevida global bem como a sobrevida livre de progressão.

"Sobrevida global" ou "OS" se refere à vida restante do pacientepor um período definido de tempo, tal como 1 ano, 5 anos, etc. a partir dahora do diagnóstico ou tratamento. Para os propósitos do exame clínico des-crito nos exemplos, a sobrevida global (OS) é definida como o tempo a partirda data de randomização da população de pacientes até a data de morte porqualquer causa.

"Sobrevida livre de progressão" ou "PFS" refere-se à vida restan-te do paciente, sem a progressão do câncer ou ficando pior. Para o propósitodo exame clínico descrito nos exemplos, a sobrevida livre de progressão(PFS) é definida como o tempo a partir da randomização da população deestudo à primeira doença progressiva documentada, ou morte por qualquercausa, o que ocorrer primeiro. A progressão da doença pode ser documen-tada por quaisquer métodos clinicamente aceitos, tal como, por exemplo,doença progressiva radiográfica, como determinado por Response Evaluati-on Criteria in Solid Tumors (RECIST) (Therasse e outros, J Natl Ca Inst2000; 92(3):205-216), meningite carcinomatosa diagnosticada por avaliaçãocitológica de fluido espinhal cerebral, e/ou fotografia médica para monitorarrecorrências na parede torácica de lesões subcutâneas.

Por "sobrevida estendida" entende-se sobrevida livre de pro-gressão ou total aumentada em um paciente tratado de acordo com a pre-sente invenção, em relação a um paciente não tratado e/ou em relação a umpaciente tratado com um ou mais agentes antitumor aprovados, mas nãorecebendo tratamento de acordo com a presente invenção. Em um exemploparticular, "sobrevida estendida" significa sobrevida livre de progressão(PFS) e/ou sobrevida global (OS) de pacientes com câncer de mama rece-bendo a terapia de combinação da presente invenção (por exemplo, trata-mento com uma combinação de um anticorpo contra HER2 ligando essenci-almente ao epítopo 2C4, um anticorpo contra HER2 ligando essencialmenteao epítopo 4D5, e um taxeno, por exemplo, pertuzumabe + trastuzumabe +docetaxel) em relação a pacientes tratados com um anticorpo contra HER2essencialmente ao epítopo 4D5, e um taxeno, por exemplo, trastuzumabe +docetaxel, na ausência de um anticorpo contra HER2 ligando essencialmen-te ao epítopo 2C4, isto é, pertuzumabe.

Aqui, "tempo para progressão de doença" ou "TTP" refere-se aotempo, geralmente medido em semanas ou meses, a partir do tempo de tra-tamento inicial até o progresso do câncer ou que piore. Tal progressão podeser avaliada pelo médico versado na técnica. A progressão da doença podeser avaliada e documentada por quaisquer métodos aceitos clinicamente, talcomo, por exemplo, doença progressiva radiográfica, como determinado porResponse Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) (Therasse e outros,J Natl Ca Inst 2000; 92(3):205-216), meningite carcinomatosa diagnosticadapor avaliação citológica de fluido espinhal cerebral, e/ou fotografia médicapara monitorar recorrências de parede torácica de lesões subcutâneas.

Por "TTP estendida" significa aumentar o tempo para progressãoda doença em um paciente tratado de acordo com a presente invenção emrelação a um paciente não tratado e/ou em relação a um paciente tratadocom um ou mais agentes antitumor aprovados, mas não recebendo trata-mento de acordo com a presente invenção. Em um exemplo particular, "TTPestendida" significa tempo para progressão da doença de pacientes comcâncer de mama recebendo a terapia de combinação da presente invenção(tratamento com uma combinação de um anticorpo de HER2 se ligando es-sencialmente ao epítopo 2C4, um anticorpo contra HER2 ligando essencial-mente ao epítopo 4D5, e um taxeno, por exemplo, pertuzumabe + trastuzu-mabe + docetaxel) em relação a pacientes tratados com um anticorpo contraHER2 ligando essencialmente ao epítopo 4D5, e um taxeno, por exemplo,trastuzumabe + docetaxel, na ausência de um anticorpo contra HER2 ligan-do essencialmente ao epítopo 2C4, isto é, pertuzumabe.

Uma "resposta objetiva" refere-se a uma resposta medida, inclu-indo a resposta completa (RC) ou resposta parcial (RP).

Por "resposta completa" ou "RC" entende-se o desaparecimentode todos os sinais de câncer em resposta a tratamento. Isso nem sempresignifica que o câncer foi curado.

"Resposta parcial" ou "RP" refere-se a uma diminuição no tama-nho de um ou mais tumores ou lesões, ou na extensão do câncer no corpo,em resposta ao tratamento.

"Receptor de HER" é um receptor de proteína tirosina quinaseque pertence à família de receptor de HER e inclui receptores de EGFR,HER2, HER3 e HER4. O receptor de HER geralmente compreenderá umdomínio extracelular, que pode ligar um ligante HER e/ou dimerizar com outramolécula de receptor de HER; um domínio de transmembrana lipofílica; umdomínio de tirosina quinase intracelular conservado; e um terminal carboxilasinalizando domínio abrigando vários resíduos de tirosina que podem serfosforilados. O receptor de HER pode ser um receptor de HER de "sequên-cia nativa" ou uma "seqüência de aminoácido variante" desse. Preferencial-mente, o receptor de HER é receptor de HER humano de seqüência nativa.

Os termos "ErbB1", "HER1", "receptor de fator de crescimentoepidérmico" e "EGFR" são usados de forma intercambiável aqui e se referema EGFR como descrito, por exemplo, em Carpenter e outros, Ann. Rev. Bio-chem. 56:881-914 (1987), incluindo formas mutantes naturalmente ocorren-do desses (por exemplo, um EGFR mutante de apagamento como em Hum-phrey e outros, PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 refere-se ao genecodificando o produto de proteína EGFR.

As expressões "ErbB2" e "HER2" são usadas de forma inter-cambiável aqui e se referem a proteína HER2 humana descrita, por exem-plo, em Semba e outros, PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto eoutros, Nature 319:230-234 (1986) (número de acesso ao GenebankX03363). O termo "erbB2" refere-se ao gene codificando ErbB2 humano e"neu" se refere ao gene codificando p185neu de ratos. A HER2 preferencial éHER2 humano de seqüência nativa.

Aqui, "domínio extracelular de HER2" ou "ECD de HER2" refere-se a um domínio de HER2 que está fora de uma célula, ou ancorado a umamembrana celular, ou em circulação, incluindo fragmentos dessa. A seqüên-cia de aminoácido de HER2 é mostrada na Figura 1. Em uma modalidade, odomínio extracelular de HER2 pode compreender quatro domínios: "DomínioI" (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 1-195; SEQ ID N- 14),"Domínio II" (resíduos de aminoácidos de aproximadamente 196-319; IDSEQ N- 15), "Domínio III" (resíduos de aminoácidos de aproximadamente320-488: ID SEQ N2 16), e "Domínio IV" (resíduos de aminoácidos de apro-ximadamente 489-630; ID SEQ N2 17) (numeração de resíduo sem peptídeosinal). Vide Garrett e outros, Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho e outros,Nature 421: 756-760 (2003), Franklin e outros, Câncer Cell 5:317-328 (2004), ePlowman e outros, Proc. A/ar/. Acad. Sei. 90:1746-1750 (1993), bem como aFig. 6 aqui.

"ErbB3" e "HER3" referem-se ao polipeptídeo receptor comodescrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N-s 5.183.884 e 5.480.968 bemcomo Kraus e outros, PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989).

Os termos "ErbB4" e "HER4" aqui se referem ao polipeptídeoreceptor como descrito, por exemplo, em Pedido de Patente EP N2 599.274;Plowman e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993); ePlowman e outros, Nature, 366:473-475 (1993), incluindo isoformas dessas, porexemplo, como descrito em WO 99/19488, publicado em 22 de Abril de 1999.

Por "ligante de HER" entende-se um polipeptídeo que se ligae/ou ativa um receptor de HER. O ligante de HER de interesse particular a-qui é um ligante de HER humano de seqüência nativa tal como fator decrescimento epidérmico (EGF) (Savage e outros, J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); fator de crescimento transformante alfa (TGF-a) (Marquardt eoutros, Science 223:1079-1082 (1984)); anfiregulina também conhecida co-mo fator de crescimento autócrino de queratinócito ou schwanoma (Shoyabe outros, Science 243:1074-1076 (1989); Kimura e outros, Nature 348:257-260 (1990); e Cook e outros, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelu-lina (Shing e outros, Science 259:1604-1607 (1993); e Sasada e outros, Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); fator de crescimento epi-dérmico de ligação de heparina ((HB-EGF) (Higashiyama e outros, Science251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda e outros, J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki e outros, Oncogene 15:2841-2848 (1997)); a he-regulina (vide abaixo); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway e outros, Nature387:512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang e outros, Proc. Natl.Acad. Sei. 94:9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari e outros,Oncogene 18:2681-89 (1999)); e cripto (CR-1) (Kannan e outros, J. Biol.Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Os ligantes de HER que se ligam a EGFRincluem EGF, TGF-a, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF e epiregulina. Osligantes de HER que se ligam a HER3 incluem heregulinas. Os ligantes deHER capazes de se ligarem a HER4 incluem betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4, e heregulinas.

"Heregulina" (HRG) quando usado aqui se refere a um polipeptí-deo codificado pelo produto de gene heregulina como descrito na PatenteU.S. N2 5.641.869, ou Marchionni e outros, Nature, 362:312-318 (1993). Osexemplos de heregulinas incluem heregulina-cc, heregulina-pi, heregulina-p2e heregulina-p3 (Holmes e outros, Science, 256:1205-1210 (1992); e PatenteU.S. N2 5.641.869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles e outros, Ce//69:205-216 (1992)); atividade de indução de receptor de acetilcolina (ARIA) (Fallse outros, Cell 72:801-815 (1993)); fatores de crescimento de glia (GGFs)(Marchionni e outros, Nature, 362:312-318 (1993)); fator derivado de neurô-nio sensorial e motor (SMDF) (Ho e outros, J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995)); Y-heregulina (Schaefer e outros, Oncogene 15:1385-1394 (1997)).

Um "dímero de HER" aqui é um dímero associado não covalen-temente compreendendo ao menos dois receptores de HER. Tais complexospodem se formar quando uma célula expressando dois ou mais receptoresde HER é exposta a um ligante de HER e pode ser isolada por imunoprecipi-tação e analisada por SDS-PAGE como descrito em Sliwkowski e outros, J.Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo. Outras proteínas,tais como uma subunidade de receptor de citoquina (por exemplo, gp130)podem ser associadas com o dímero. Preferencialmente, o dímero de HERcompreende HER2.

Um "heterodímero de HER" aqui é um heterodímero associadonão covalentemente compreendendo ao menos dois receptores HER dife-rentes, tal como heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 ou HER2-HER4.

Um "anticorpo contra HER" é um anticorpo que se liga a um re-ceptor HER. Opcionalmente, o anticorpo contra HER adicionalmente interfe-re na ativação ou função da HER. Preferencialmente, o anticorpo contraHER se liga ao receptor HER2. Os anticorpos contra HER2 de interesse aquisão pertuzumabe e trastuzumabe.

"Ativação de HER" refere-se à ativação, ou fosforilação, dequaisquer um ou mais receptores HER. Geralmente, a ativação de HER re-sulta em transdução de sinal (por exemplo, a causada por um domínio dequinase intracelular de um receptor HER fosforilando resíduos de tirosina noreceptor de HER ou um polipeptídeo de substrato). A ativação de HER podeser mediada pelo ligante de HER se ligando a um dímero de HER compre-endendo o receptor HER de interesse. O ligante de HER ligando-se a umdímero de HER pode ativar um domínio de quinase de um ou mis dos recep-tores HER no dímero e desse modo resulta em fosforilação de resíduos detirosina em um ou mais dos receptores HER e/ou fosforilação de resíduos detirosina em polipeptídeo(s) de substrato adicional, tal como quinases intrace-lulares Akt ou MAPK.

"Fosforilação" refere-se à adição de um ou mais grupo(s) fosfatoa uma proteína, tal como um receptor HER, ou substrato desse.

Um anticorpo que "inibe a dimerização de HER" é um anticorpoque inibe, ou interfere com a formação de um dímero de HER. Preferencial-mente, tal anticorpo se liga à HER2 no sítio de ligação heterodimérica dessa.

O anticorpo de inibição de dimerização mais preferencial aqui é pertuzuma-be ou MAb 2C4. Outros exemplos de anticorpos que inibem a dimerizaçãode HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem a dimerizaçãodesse com um ou mais outros receptores HER (por exemplo, anticorpo mo-noclonal EGFR 806, MAb 806, que se liga a EGFR ativado ou "não ligado";vide Johns e outros, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); anticorposque se ligam a HER3 e inibem a dimerização dessa com um ou mais outrosreceptores HER; e anticorpos que se ligam a HER4 e inibem a dimerizaçãodessa com um ou mais outros receptores HER.

Um "inibidor de dimerização de HER2" é um agente que inibe aformação de um dímero ou heterodímero compreendendo HER2.

Um "sítio de ligação heterodimérica" em HER2, refere-se a umaregião no domínio extracelular de HER2 que contata, ou está voltada parauma região no domínio extracelular de EGFR, HER3 ou HER4 mediante aformação de um dímero com esses. A região é encontrada no Domínio II deHER2 (ID SEQ No: 15). Franklin e outros, Câncer Cell 5:317-328 (2004).

O anticorpo contra HER2 que "se liga a um sítio de ligação hete-rodimérica" de HER2, se liga a resíduos no Domínio II (ID SEQ No: 15) eopcionalmente também se liga a resíduos em outros dos domínios do domí-nio extracelular de HER2, tal como os domínios I e III, ID SEQ Nos: 14 e 16,e pode impedir de forma estérica, ao menos a alguma extensão, a formaçãode um heterodímero de HER2-EGFR, HER2-HER3, ou HER2-HER4. Fran-klin e outros, Câncer Ce//5:317-328 (2004) caracterizam a estrutura cristalde pertuzumabe-HER2, depositada com o Banco de Dados de ProteínaRCSB (Código ID IS78), ilustrando um anticorpo exemplificado que se ligaao sítio de ligação heterodimérica de HER2.

Um anticorpo que "se liga ao domínio II" de HER2 se liga a resí-duos no domínio II (ID SEQ No: 15) e opcionalmente resíduos em outrosdomínios de HER2, tal como os domínios II e III (ID SEQ Nos: 14 e 16, res-pectivamente). Preferencialmente, o anticorpo que se liga ao domínio II seliga à junção entre os domínios I, II e III de HER2.

"Expressão" de proteína se refere à conversão da informaçãocodificada em um gene em RNA mensageiro (mRNA) e então à proteína.

Aqui, uma amostra ou célula que "expressa" uma proteína deinteresse (tal como um receptor HER ou ligante de HER) é uma na qualmRNA codificando a proteína, ou a proteína, incluindo fragmentos dela, édeterminado como estando presente na amostra ou célula.

A técnica de "reação em cadeia de polimerase" ou "PCR" comousada aqui geralmente se refere a um procedimento onde quantidades deminutos de uma parte específica de ácido nucléico, RNA e/ou DNA, são am-plificadas como descrito na Patente U.S. N2 4.683.195 emitida em 28 de Ju-lho de 1987. Geralmente, a informação de seqüência a partir das extremida-des da região de interesse ou além das necessidades disponíveis, tal que osiniciadores de oligonucleotídeo possam ser projetados; esses iniciadoresserão idênticos ou similares em seqüência a filamentos opostos do modelo aser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5 dos dois iniciadores podemcoincidir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usadopara amplificar seqüência de RNA específicas, seqüências de DNA específi-cas de DNA genômico total, e cDNA transcrito de RNA celular total, seqüên-cias de plasmídeo ou bacteriófago, etc. Vide geralmente Mullis e outros,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, e<±, PCR Te-chnology, (Stockton Press, NY, 1989). Como usado aqui, PCR é considera-do como sendo um, mas não somente o único, exemplo de um método dereação de polimerase de ácido nucléico para amplificar uma amostra testede ácido nucléico, compreendendo o uso de um ácido nucléico conhecido(DNA ou RNA) como um iniciador e utiliza uma polimerase de ácido nucléicopara amplificar ou gerar uma parte específica de ácido nucléico ou para am-plificar ou gerar uma parte específica de ácido nucléico que é complementara um ácido nucléico particular.

"Reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativa"ou "qRT-PCR" refere-se a uma forma de PCR onde a quantidade de produtode PCR é medida em cada etapa em uma reação PCR. Essa técnica foidescrita em várias publicações incluindo Cronin e outros, Am. J. Pathol.164(1 ):35-42 (2004); e Ma e outros, Câncer Cell 5:607-616 (2004).

O termo "microarranjo" refere-se a um arranjo ordenado de ele-mentos de arranjo hibridizável, preferencialmente provas de polinucleotídeo,em um substrato.

O termo "polinucleotídeo", quando usado no singular ou plural,geralmente refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonu-cleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modi-ficado. Assim, por exemplo, polinucleotídeos como definido aqui incluem,sem limitação, DNA de filamento único e de filamento duplo, DNA incluindoregiões de filamento único e de filamento duplo, RNA de filamento único e defilamento duplo, e RNA incluindo regiões de filamento único e de filamentoduplo, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser defilamento único ou, mais tipicamente, de filamento duplo ou incluem regiõesde filamento único e de filamento duplo. Em adição, o termo "polinucleotí-deo" como usado aqui se refere a regiões de filamento triplo compreendendoRNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Os filamentos em tais regiões podem serda mesma molécula ou de diferentes moléculas. As regiões podem incluir todasde uma ou mais das moléculas, mas mais tipicamente envolvem somente umaregião de algumas das moléculas. Uma das moléculas de uma região heli-coidal tripla freqüentemente é um oligonucleotídeo. O termo "polinucleotí-deo" especificamente inclui cDNAs. O termo inclui DNAs (incluindo cDNAs) eRNAs que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, DNAs ou RNAscom cadeias principais modificadas para estabilidade ou para outras razõessão "polinucleotídeos" como este termo pretende aqui. Além disso, DNAs ouRNAs compreendendo bases incomuns, tal como inosina, ou bases modifi-cadas, tal como bases tritiadas, são incluídas no termo "polinucleotídeos"como definido aqui. Em geral, o termo "pplinucleotídeo" abrange todas asformas química, enzimática e/ou metabolicamente modificadas de polinucle-otídeos não modificados, bem como as formas químicas de DNA e RNA ca-racterísticos de vírus e células, incluindo células simples e complexas.

O termo "olinucleotídeo" refere-se a um polinucleotídeo relativa-mente curto, incluindo, sem limitação, desoxirribonucleotídeos de filamentoúnico, ribonucleotídeos de filamento único ou de filamento duplo, híbridosRNA:DNA e DNAs de filamento duplo. Os oligonucleotídeos, tal como osoligonucleotídeos de prova de DNA de filamento único, são freqüentementesintetizados por métodos químicos, por exemplo, usando sintetizadores deoligonucleotídeo automatizados que estão comercialmente disponíveis. En-tretanto, os oligonucleotídeos podem ser obtidos por uma variedade de ou-tros métodos, incluindo técnicas mediadas por DNA recombinante in vitro epor expressão de DNAs em células e organismos.

A frase "amplificação de gene" refere-se a um processo peloqual múltiplas cópias de um gene ou fragmento de gene são formadas emuma célula particular ou linhagem celular. A região duplicada (um estiramen-to de DNA amplificado) é freqüentemente referida como "amplicon". Usual-mente, a quantidade do RNA mensageiro (mRNA) produzida também au-menta na proporção do número de cópias feitas do gene particular expresso.

A "Estringência" de reações de hibridização é prontamente de-terminada por um versado na técnica, e geralmente é um cálculo empíricodependente do comprimento da prova, temperatura de lavagem, e concen-tração de sal. Em geral, provas mais longas exigem temperaturas mais altaspara anelamento apropriado, enquanto provas mais curtas necessitam detemperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende da capacida-de do DNA desnaturado para reanelar quando filamentos complementaresestão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão,

Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre a prova e a seqüênciade hibridização, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada. Comoum resultado, segue que temperaturas relativas mais altas tenderiam a tor-nar as condições de reação mais estringentes, enquanto temperatura maisbaixas tenderiam a tornar as condições de reação menos estringentes. Paradetalhes e explicação adicionais de estringência de reações de hibridização,vide Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Intersci-ence Publishers, (1995).

"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência",como definido aqui, tipicamente: (1) empregar baixa resistência iônica e altatemperatura para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015 M / citratode sódio a 0,0015 M / 0,1 % de dodocil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregardurante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, porexemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino /0,1% de Ficoll / 0,1% de polivinilpirrolidona / 50 mM de tampão de fosfato desódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódioa 42°C; ou (3) empregar 50% de formamida, SSC 5x (NaCI a 0,75 M, citratode sódio a 0,075 M), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfatode sódio, solução de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmão sonicado (50&gr;g/ml), 0,1% SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a42°C em 0,2xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a55°C, seguido por uma lavagem de alta estringência de 0,1xSSC contendoEDTA a 55°C.

"Condições moderadamente estringentes" podem ser identifica-das como descrito por Sambrook e outros, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de so-lução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura,resistência iônica e % SDS) menos estringentes que aquelas descritas aci-ma. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é incubaçãonoturna a 37°C em uma solução compreendendo: 20% de formamida, SSC5x (NaCI a 150 mM, citrato de trisódio de 15 mM), 50 mM de fosfato de só-dio (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, e 20mg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, seguidopor lavagem dos filtros em SSC 1x em aproximadamente 37 - 50°C. O ver-sado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica,etc. como necessário para acomodar fatores tais como comprimento de pro-va e seus similares.

Um polipeptídeo de "seqüência nativa" é um que tem a mesmaseqüência de aminoácido de um polipeptídeo (por exemplo, receptor HER ouligante de HER) derivado da natureza, incluindo variantes ocorrendo natu-ralmente ou alélicos. Tais polipeptídeos de seqüência nativa podem ser iso-lados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ousintéticos. Assim, um polipeptídeo de seqüência nativa pode ter a seqüênciade aminoácido de polipeptídeo humano naturalmente ocorrendo, polipeptí-deo de ratos, ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamífero.

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e espe-cificamente cobre anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorposmultiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos deanticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se refere a umanticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos,isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticose/ou ligam o mesmo epítopo(s), exceto por possíveis variantes que podemaparecer durante a produção de anticorpo monoclonal, tais variantes geral-mente estando presentes em menores quantidades. Tal anticorpo monoclo-nal tipicamente inclui um anticorpo compreendendo uma seqüência de poli-peptídeo que liga um alvo, onde a seqüência de polipeptídeo de ligação aalvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única seqüênciade polipeptídeo de ligação alvo a partir de uma pluralidade de seqüências depolipeptídeo. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de umclone exclusivo de uma pluralidade de clones, tal como uma piscina de cio-nes de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Dever-se-ia entender que a seqüência de ligação alvo selecionada pode ser adicio-nalmente alterada, por exemplo, para aperfeiçoar a afinidade para o alvo,para humanizar a seqüência de ligação alvo, para aperfeiçoar sua produçãoem cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar umanticorpo multiespecífico, etc, e que um anticorpo compreendendo a se-qüência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal dessainvenção. Em contraste a preparações de anticorpo policlonal que tipicamen-te incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinan-tes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpomonoclonal é direcionado contra um único determinante em um antíge N2

Em adição a sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonalsão vantajosas, uma vez que elas são tipicamente não contaminadas poroutras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anti-corpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente ho-mogênea de anticorpos, e não como sendo interpretado como exigindo pro-dução do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticor-pos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção po-dem ser obtidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, ométodo de hibridoma (por exemplo, Kohler e outros, Nature, 256:495 (1975);Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor La-boratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling e outros, em: Monoclonal Antibo-dies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos deDNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. N2 4.816.567), tecnolo-gias de exibição de fagos (vide, por exemplo, Clackson e outros, Nature,352:624-628 (1991); Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhue outros, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee e outros,J.Mo/.S/o/.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. USA101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee e outros, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004), e tecnologias para produzir anticorpos tipo humanos ouhumanos em animais que têm partes ou todas as seqüências de imunoglo-bulina humana de codificação de genes ou locais de imunoglobulina humana(vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO1991/10741; Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits e outros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann e outros, YearinImmu N2, 7:33 (1993); Patentes U.S. N2S 5.545.806; 5.569.825; 5.591.669 (to-das de GenPharm); Patente U.S. N2 5.545.807; WO 1997/17852; PatentesU.S. N2S 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e5.661.016; Marks e outros, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg eoutros, Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994);Fishwild e outros, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Im-munol., 13:65-93(1995)).

Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anti-corpos "quiméricos" nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idên-tica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados deuma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anti-corpos particular, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntico ou homólogo aseqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie oupertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmen-tos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica dese-jada (Patente U.S. N2 4.816.567; e Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui in-cluem anticorpos "primatizados" compreendendo seqüências de ligação comantígeno de domínio variável derivadas de um primata não-humano (por e-xemplo, Macaco do Mundo Velho, Macacos da família dos Pongídeos, etc.)e seqüências de região constante humanas, bem como anticorpos "humani-zados".

As formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por e-xemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mí-nima derivada de imunoglobulina não-humana. Para a maior parte, os anti-corpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo do receptor)nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídospor resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anti-corpo do doador) tal como camundongo, rato, ou primata não-humano tendoa especificidade desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os re-síduos da região de estrutura (RE) da imunoglobulina humana são substituí-dos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo do receptor ou no anticorpo do doador. Essas modificações sãofeitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, oanticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de ao menosum, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancial-mente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imuno-globulina não-humana e todos ou substancialmente todas as REs são aque-las de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizadoopcionalmente também compreenderá ao menos uma parte de uma regiãoconstante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobuli-na humana. Para detalhes adicionais, vide Jones e outros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Os anticorpos contra HER2 humanizados incluem huMAb4D5-1,huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, hu-MAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou trastuzumabe (HERCEPTIN®) como descritona Tabela 3 da Patente U.S. 5.821.337 expressamente incorporada aqui porreferência; 520C9 humanizado (W093/21319); e anticorpos 2C4 humaniza-dos tal como pertuzumabe como descrito aqui.

Para os propósitos aqui citados, "trastuzumabe," "HERCEPTIN®," e"huMAb4D5-8" se referem a um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácido de cadeia leve e pesada em ID SEQ N2S 9 e 10, respectivamen-te.

Aqui, "pertuzumabe" e "OMNITARG®" se referem a um anticorpocompreendendo as seqüências de aminoácido de cadeia leve e pesada nosID SEQ N2S 7 e 8, respectivamente.

Um "anticorpo intacto" aqui citado é um que compreende duasregiões de ligação com antígeno, e uma região Fc. Preferencialmente, o an-ticorpo intacto tem uma região Fc funcional.

"Fragmentos de anticorpo" compreende uma parte de um anti-corpo intacto, preferencialmente compreendendo a região de ligação comantígeno desse. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentosFab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anti-corpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmen-to^) de anticorpos.

Os "anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterote-traméricas de aproximadamente 150.000 Dáltons, compostos de duas ca-deias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (P) idênticas. Cada cadeialeve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfídeo covalente,enquanto o número de ligações dissulfídeo varia entre as cadeias pesadasde diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve tam-bém tem pontes dissulfídeo intracadeia regularmente espaçadas. Cada ca-deia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido porum número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio vari-ável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extre-midade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro do-mínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve éalinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que os resíduosde aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variá-veis de cadeia leve e de cadeia pesada.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas partes dosdomínios variáveis diferem extensivamente em seqüência entre anticorpos esão usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seuantígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é regularmente distribuí-da por todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em trêssegmentos chamados regiões hipervariáveis ambas nos domínios variáveisde cadeia leve e de cadeia pesada. As partes conservadas mais altamentede domínios variáveis são chamadas as regiões de estrutura (REs). Cadaum dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas compreendequatro REs, amplamente adotando uma configuração de folha B, conectadapor três regiões hipervariáveis, que formam laços conectando, e em algunscasos formando parte da estrutura de folha p. As regiões hipervariáveis emcada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas REs e, com as regi-ões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio deligação com antígeno de anticorpos (vide Kabat e outros, Sequences of Pro-teins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institu-tes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não são en-volvidos diretamente em ligar um anticorpo a um antígeno, mas exibem vá-rias funções efetoras, tal como a participação do anticorpo em citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC).

O termo "região hipervariável" quando usado aqui se refere aosresíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligaçãocom antíge N2 A região hipervariável geralmente compreende resíduos deaminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou "C-DR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domíniovariável de cadeia leve e 31-35 (P1), 50-65 (P2) e 95-102 (P3) no domíniovariável de cadeia pesada; Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immu-nological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "laço hipervariável" (porexemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variávelde cadeia leve e 26-32 (P1), 53-55 (P2) e 96-101 (P3) domínio variável decadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Os resí-duos de "Região de estrutura" ou "RE" são aqueles resíduos de domínio va-riável além dos resíduos de região hipervariável como aqui definido.

A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentosde ligação com antígeno, chamados fragmentos "Fab", cada um com umúnico sítio de ligação com antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo no-me reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento compepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação com an-tígeno e é ainda capaz de antígeno de ligação cruzada.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio dereconhecimento de antígeno completo e de ligação com antíge N2 Essa re-gião consiste em um dímero de um domínio de cadeia pesada e um de ca-deia leve em associação não covalente estreita. Está nesta configuração queas três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para defi-nir um sítio de ligação com antígeno na superfície do dímero VH-Vl. Coleti-vãmente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligaçãocom antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável(ou metade de um Fv compreendendo somente três regiões hipervariáveisespecíficas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o an-tígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentosFab diferem dos fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos no términocarbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínasda região de junção de anticorpos. Fab'-SH é a designação aqui para Fab'no qual o resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes produz ao menosum grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmenteproduzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de junção en-tre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos sãotambém conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie de verte-brado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chama-dos kappa (k) e lambda (k), baseado nas seqüências de aminoácido de seusdomínios constantes.

O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região determinal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc deseqüência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc deuma cadeia pesada de imunoglobulina devam variar, a região Fc de cadeiapesada IgG humana é usualmente definida como estirando a partir de umresíduo de aminoácido na posição Cys226, ou a partir de Pro230, ao términocarboxila desses. A lisina de terminal C (resíduo 447 de acordo com o siste-ma de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, duran-te a produção ou purificação do anticorpo, ou elaborando de forma recombi-nante o ácido nucléico codificando uma cadeia pesada do anticorpo. Conse-quentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreenderpopulações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, popula-ções de anticorpos sem resíduos K447 removidos, e populações de anticor-pos tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

A menos que de outra forma indicado, aqui a numeração dosresíduos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é a do índice EU comoem Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991),expressamente incorporado aqui por referência. O "índice EU como em Ka-bat" refere-se à numeração de resíduo do anticorpo EU lgG1 huma N2

Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de umaregião Fc de seqüência nativa. As "funções efetoras" exemplificadas incluemligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptorFc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fa-gocitose, regulação de receptores de superfície celular (por exemplo, recep-tor de célula B, BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente exigem que aregião Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um do-mínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaioscomo aqui descritos, por exemplo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüên-cia de aminoacido idêntica à seqüência de aminoacido de uma região Fcencontrada na natureza. As regiões Fc humanas de seqüência nativa inclu-em uma região Fc lgG1 humana de seqüência nativa (alótipos A e não -A),região Fc lgG2 humana de seqüência nativa, região Fc lgG3 humana de se-qüência nativa, e região Fc lgG4 humana de seqüência nativa, bem comovariantes dessas ocorrendo naturalmente.

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência de ami-noácidos que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtu-de de ao menos uma modificação de aminoacido, preferencialmente uma oumais substituições de aminoacido. Preferencialmente, a região Fc variantetem ao menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fcde seqüência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo pai, por exemplo, deaproximadamente uma a aproximadamente dez substituições de aminoáci-do, e preferencialmente, de aproximadamente uma a aproximadamente cin-co substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ouna região Fc do polipeptídeo pai. A região Fc variante aqui possuirá prefe-rencialmente ao menos aproximadamente 80% de homologia com uma regi-ão Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo pai, emais preferencialmente ao menos aproximadamente 90% de homologia comelas, mais preferencialmente ao menos aproximadamente 95% de homolo-gia com elas.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constantede suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a dife-rentes "classes". Há cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD,IgE, IgG, e IgM, e várias dessas podem ser adicionalmente divididas em"subclasses" (isotipo), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Osdomínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentesclasses de anticorpos são chamados a, õ, e, v> e |i, respectivamente. As es-truturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classesde imunoglobulinas são bem-conhecidas.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" com-preendem os domínios VH e VL de anticorpos, sendo que esses domíniosestão presentes em uma cadeia única de polipeptídeos. Preferencialmente,o polipeptídeo Fv adicionalmente compreende um ligador de polipeptídeoentre os domínios VH e VL que habilita o scFv a formar a estrutura desejadapara a ligação com antíge N- Para revisão de scFv, vide Pluckthun em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Mooreeds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Os fragmentos scFVde anticorpo contra HER2 são descritos em W093/16185; Patente U.S. N25.571.894 e Patente U.S. N2 5.587.458.

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti-corpos com dois sítios de ligação com antígeno, fragmentos que compreen-dem um domínio pesada variável (VH) conectado a um domínio leve variável(VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Usando-se um ligador queé muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mes-ma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios com-plementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação com antíge N- Osdiacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097;WO 93/11161; e Hollinger e outõros, Proc. A/aí/. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Um "anticorpo nu" é um anticorpo que não é conjugado a umamolécula heteróloga, tal como uma porção citotóxica ou radioetiqueta.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ourecuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentescontaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam comusos diagnósticos e terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas,hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modali-dades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) para mais de 95% dopeso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferenci-almente, mais de 99% do peso, (2) a um grau suficiente para obter ao me-nos 15 resíduos de seqüência de aminoácido interna ou de terminal N pelouso de um sequenciador de recipiente giratório, ou (3) a homogeneidade porSDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Co-omassie ou, preferencialmente, coloração prata. O anticorpo isolado inclui oanticorpo in situ nas células recombinantes desde que ao menos um compo-nente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente,entretanto, o anticorpo isolado será preparado por ao menos uma etapa depurificação.

Um anticorpo "de afinidade madura" é um com uma ou mais al-terações em uma ou mais regiões hipervariáveis desse que resultam em me-lhorar a afinidade do anticorpo com o antígeno, comparado a um anticorpopai que não possui essas alterações. Os anticorpos de afinidade madurapreferenciais terão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antí-geno alvo. Os anticorpos de afinidade madura são produzidos por procedi-mentos conhecidos na técnica. Marks e outros, Bio/Technology 10:779-783(1992) descrevem a maturação da afinidade misturando-se os domínios VHe VL. A mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descritapor: Barbas e outros, Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schiere outros, Gene 169:147-155 (1995); Yelton e outros, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson e outros, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkinse outros, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

O termo "anticorpo de espécie principal" aqui se refere à estrutu-ra do anticorpo em uma composição que é a molécula de anticorpo quantita-tivamente predominante na composição. Em uma modalidade, o anticorpode espécie principal é um anticorpo contra HER2, tal como o anticorpo quese liga ao Domínio II de HER2, anticorpo que inibe a dimerização de HERmais eficazmente do que o trastuzumabe, e/ou um anticorpo que se liga aum sítio de ligação heterodimérica de HER2. A modalidade preferencial aquido anticorpo de espécie principal é uma compreendendo as seqüências deaminoácidos de cadeia leve e pesada variáveis de ID SEQ N2S 3 e 4, e maispreferencialmente, compreendendo as seqüências de aminoácidos de ca-deia leve e pesada de ID SEQ N2S 7 e 8 (pertuzumabe).

Um anticorpo "de seqüência de aminoácido variante" aqui citadoé um anticorpo com uma seqüência de aminoácido que difere de um anticor-po de espécie principal. Normalmente, as variantes de seqüência de amino-ácido possuirão ao menos aproximadamente 70% de homologia com o anti-corpo de espécie principal, e preferencialmente, elas serão ao menos apro-ximadamente 80%, mais preferencialmente ao menos aproximadamente90% homólogas ao anticorpo de espécie principal. As variantes de seqüên-cia de aminoácido possuem substituições, apagamentos, e/ou adições emcertas posições dentro ou adjacente à seqüência de aminoácido do anticor-po de espécie principal. Exemplos de variantes de seqüência de aminoácidoaqui citados incluem uma variante ácida (por exemplo, variante de anticorpodeamidado), uma variante básica, um anticorpo com uma extensão guia determinal amino (por exemplo, VHS-) em uma ou duas cadeias leves desse,um anticorpo com um resíduo de lisina de terminal C em uma ou duas ca-deias pesadas desse, etc, e inclui combinações de variações nas seqüên-cias de aminoácido de cadeias pesadas e/ou leves. A variante de anticorpode particular interesse aqui é o anticorpo compreendendo uma extensãoguia de terminal amino em uma ou duas cadeias leves desse, opcionalmenteademais compreendendo outras seqüências de aminoácido e/ou diferençasde glicosilação em relação ao anticorpo de espécie principal.

Um anticorpo de "variante de glicosilação" aqui citado é um anti-corpo com uma ou mais porções de carboidrato anexadas a esse que dife-rem de uma ou mais porções de carboidrato anexadas a um anticorpo deespécie principal. Exemplos de variantes de glicosilação aqui citadas inclu-em anticorpo com uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2, ao invés deuma estrutura de oligossacarídeo GO, anexadas a uma região Fc desse, an-ticorpo com uma ou duas porções de carboidrato anexadas a uma ou duascadeias leves desse, anticorpo sem carboidrato anexado a uma ou duas ca-deias pesadas do anticorpo, etc, e combinações de alterações de glicosila-ção.

Quando o anticorpo tem uma região Fc, uma estrutura de oligos-sacarídeo pode ser anexada a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo,por exemplo, no resíduo 299 (298, numeração EU de resíduos). Para pertu-zumabe, GO era a estrutura de oligossacarídeo predominante, com outrasestruturas de oligossacarídeo tais como GO-F, G-1, Man5, Man6, G1-1,G1(1-6), G1(1-3) e G2 sendo encontradas em menores quantidades nacomposição de pertuzumabe.

A menos que de outra forma indicado, uma "estrutura de oligos-sacarídeo G1" aqui citada inclui estruturas G-1, G1-1, G1(1-6) e G1(1-3).

Uma "extensão guia de terminal amino" aqui citada refere-se aum ou mais resíduos de aminoácido da seqüência guia de terminal aminoque estão presentes no término amino de quaisquer uma ou mais cadeiaspesadas ou leves de um anticorpo. Uma extensão guia de terminal aminoexemplificada compreende ou consiste em três resíduos de aminoácido,VHS, presentes em uma ou ambas as cadeias leves de uma variante de an-ticorpo.Um anticorpo "deaminado" é um que um ou mais resíduos deasparagina desse foram derivatizados, por exemplo, a um ácido aspártico,uma succinimida, ou um ácido isoaspártico.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por cres-cimento celular desregulado. O câncer tratado de acordo com a presenteinvenção é qualquer tipo de câncer de mama de HER2 positivo metástico,incluindo, sem limitação, qualquer adenocarcinoma hitológica ou citologica-mente confirmado da mama com doença metástica ou localmente recorrente(onde a doença localmente recorrente não é amenizável para resseção comintenção curativa), carcinoma ductal metástico de HER2 positivo, carcinomalobular metástico de HER2 positivo, especificamente incluindo ambos cânce-res de mama de ER positivo e de ER negativo, e podem, mas não são exigi-dos a, expressar outros receptores HER, tal como EGFR e/ou HER3 e/ouHER4 e/ou um ou mais ligantes de HER.

Um câncer "avançado" é um que se difundiu fora do sítio ou ór-gão de origem, ou por invasão local ou metástase.

Um câncer "refratário' é um que progride mesmo através de umagente antitumor, tal como um agente quimioterápico, que está sendo admi-nistrado ao paciente com câncer. Um exemplo de um câncer refratário é umque é refratário à platina.

Um câncer "recorrente" é um que cresceu novamente, ou no sí-tio inicial ou em um sítio distante, depois de uma resposta à terapia inicial.

Aqui, um "paciente" é um paciente humano. O paciente pode serum "paciente com câncer", isto é, um que está sofrendo ou em risco de so-frer de um ou mais sintomas de câncer.

Uma "amostra de tumor" aqui citada é uma amostra derivada de,ou compreendendo células tumorais a partir de um tumor de pacientes, in-cluindo câncer, como definido acima. Exemplos de amostras de tumor aquicitadas incluem, mas não estão limitadas a, biópsias de tumor, células tumo-rais circulantes, proteínas de plasma circulantes, fluido ascítico, culturas decélulas primárias ou linhas celulares derivadas de tumores ou exibindo pro-priedades similares ao tumor, bem como amostras de tumor preservadas, talcomo amostras de tumor fixadas por formalina, embutidas em parafina ouamostras de tumor congeladas.

Uma amostra de tumor "fixa" é uma que foi histologicamentepreservada usando um fixador.

Uma amostra de tumor "fixada com formalina" é uma que foipreservada usando formaldeído como o fixador.

Uma amostra de tumor "embutida" é uma circundada por ummeio geralmente firme e rígido tal como parafina, cera, celoidina, ou umaresina. O embutimento torna possível o corte de finas seções para examemicroscópico ou para a geração de microarranjos de tecidos (TMAs).

Uma amostra de tumor "embutida em parafina" é uma circunda-da por uma mistura purificada de hidrocarbonetos sólidos derivados de pe-tróleo.

Aqui, uma amostra de tumor "congelada" refere-se a uma amos-tra de tumor que está, ou foi, congelada.

Uma amostra biológica ou de câncer que "exibe expressão, am-plificação ou ativação de HER" é uma que, em um teste de diagnóstico, ex-pressa (incluindo superexpressa) um receptor HER, tem gene de HER ampli-ficado, e/ou de outra forma demonstra ativação ou fosforilação de um recep-tor HER.

Uma amostra biológica ou de câncer que "exibe ativação deHER" é uma que, em um teste de diagnóstico demonstra ativação ou fosfori-lação de um receptor HER. Tal ativação pode ser determinada diretamente(por exemplo, medindo-se a fosforilação de HER por ELISA) ou indiretamen-te (por exemplo, por perfil de expressão de gene ou apagando heterodíme-ros de HER, como descrito aqui).

Aqui, "perfil de expressão de gene" refere-se a uma avaliação deexpressão de um ou mais genes como um substituto para determinar fosfori-lação de HER diretamente.

Um "ensaio fosfo-ELISA" aqui citado é um ensaio no qual a fos-forilação de um ou mais receptores HER, especialmente HER2, é avaliadaem um ensaio imunoabsorvente ligado à enzimas (ELISA) usando um rea-gente, usualmente um anticorpo, para detectar receptor HER fosforilado,substrato, ou molécula de sinalização descendente. Preferencialmente, umanticorpo que detecta HER2 fosforilada é usado. O ensaio pode ser execu-tado em lisatos de células, preferencialmente a partir de amostras biológicasfrescas ou congeladas.

Uma célula de câncer com "superexpressão ou amplificação dereceptor HER" é um que tem níveis significativamente altos de uma proteínaou gene de receptor HER comparado a uma célula não-cancerosa do mes-mo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação degene ou por transcrição ou tradução aumentada. A superexpressão ou am-plificação de receptor HER pode ser determinada em um ensaio diagnósticoou prognóstico avaliando-se níveis aumentados da proteína HER presentena superfície de uma célula (por exemplo, via um ensaio de imunohistoquí-mica, IHC). Alternativamente, ou adicionalmente, um pode medir níveis deácido nucléico codificando HER na célula, por exemplo, via hibridização insitu fluorescente (FISH; vide /45479 publicado em Outubro de 1998), sou-thern blotting, ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR), talcomo PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR). Um pode estudar super-expressão ou amplificação de receptor HER medindo antígeno disperso (porexemplo, domínio extracelular de HER) em um fluido biológico tal como soro(vide, por exemplo, Patente U.S. N2 4.933.294 emitida em 12 de Junho de1990; WO 91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente U.S.5.401.638 emitida em 28 de Março de 1995; e Sias e outros, J. Immunol.Methods 132: 73-80 (1990)). À parte dos ensaios acima, vários ensaios invivo estão disponíveis ao profissional versado na técnica. Por exemplo, umpode expor células no corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmen-te rotulado com uma etiqueta detectável, por exemplo, um isótopo radioativo,e a ligação do anticorpo a células no paciente pode ser avaliada, por exem-pio, por varredura externa por radioatividade ou analisando-se uma biópsiaobtida de um paciente previamente exposto ao anticorpo.

De forma oposta, um câncer que "não superexpressa ou amplifi-ca receptor HER" é um que não tem níveis mais alto do que o normal de pro-teína ou gene receptor HER comparado a uma célula não cancerosa domesmo tipo de tecido. Os anticorpos que inibem a dimerização de HER, talcomo pertuzumabe, podem ser usados para tratar câncer que não superex-pressa ou amplifica receptor HER2.

Aqui citado, um "agente antitumor" refere-se a um fármaco usa-do para tratar câncer. Exemplos não-limitantes de agentes antitumor aquicitados incluem agentes quimioterápicos, inibidores de dimerização de HER,anticorpos contra HER, anticorpos direcionados contra antígenos associadosao tumor, compostos anti-hormonais, citoquinas, fármacos direcionados aEGFR, agentes antiangiogênicos, inibidores de tirosina quinase, agentesinibitórios de crescimento e anticorpos, agentes citotóxicos, anticorpos queinduzem apoptose, inibidores COX, inibidores de farnesil transferase, anti-corpos que ligam proteína oncofetal CA 125, vacinas contra HER2, inibido-res Raf ou ras, doxorrubicina lipossômica, topotecana, taxeno, inibidores detirosina quinase, TLK286, EMD-7200, pertuzumabe, trastuzumabe, erlotini-be, e bevacizumabe.

Um "agente antitumor aprovado" é um fármaco usado para tratarcâncer que obedece a aprovação de comercialização por uma autoridaderegulatória tal como a Food and Drug Administration (FDA) ou equivalenteestrangeiro dessa.

Quando um inibidor de dimerização de HER é administrado co-mo um "único agente antitumor", ele é o único agente antitumor administradopara tratar o câncer, isto é, ele não é administrado em combinação com ou-tro agente antitumor, tal como quimioterapia.

Um "agente inibidor de crescimento" quando usado aqui se refe-re a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula,especialmente uma célula de câncer expressando HER ou in vitro ou in vivo.Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser um que reduz significati-vãmente a porcentagem de células expressando HER na fase S. Exemplosde agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a pro-gressão do ciclo de célula (em um local além da fase S), tal como agentesque induzem interrupção de G1 e interrupção de fase M. Os bloqueadoresde fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxenos, einibidores de topo II tal como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina,etoposídeo, e bleomicina. Esses agentes que interrompem G1 também so-brefluxo na interrupção de fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNAtal como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloroetamina, cisplatina,metotrexato, 5-fluorouracila, e ara-C. Informação adicional pode ser encon-trada em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capí-tulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"por Murakami e outros (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmentepág. 13.

Exemplos de anticorpos "inibidores de crescimento" são aquelesque se ligam a HER2 e inibem o crescimento de células de câncer superex-pressando HER2. Os anticorpos contra HER2 inibidores de crescimento pre-ferenciais inibem o crescimento de células tumorais de mama SK-BR-3 emcultura de célula em mais de 20%, e preferencialmente, mais de 50% (porexemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) em umaconcentração de anticorpos de aproximadamente 0,5 a 30 ng/ml, onde a ini-bição de crescimento é determinada seis dias após a exposição das célulasSK-BR-3 ao anticorpo (vide Patente U.S. N2 5.677.171 emitida em 14 de Ou-tubro de 1997). O ensaio de inibição de crescimento de célula SK-BR-3 édescrito mais detalhadamente nessa patente e abaixo. O anticorpo inibidorde crescimento preferencial é uma variante humanizada de anticorpo mono-clonal de ratos 4D5, por exemplo, trastuzumabe.

Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celularprogramada como determinado pela ligação de anexina V, fragmentação deDNA, encolhimento de célula, dilatação de retículo endoplásmico, fragmen-tação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (chamados corposapópticos). A célula é usualmente uma que superexpressa o receptor HER2.

Preferencialmente, a célula é uma célula tumoral, por exemplo, célula damama, ovário, estômago, endometrial, glândula salivar, pulmão, rim, cólon,tiróide, pancreática, ou da bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, célula Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Váriosmétodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados comapoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (FS) pode sermedida por ligação com anexina, a fragmentação de DNA pode ser avaliadaatravés de escalonamento de DNA, e condensação nuclear/cromatina juntocom fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento em cé-lulas hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo que induz apoptose é umque resulta em aproximadamente 2 a 50 vezes, preferencialmente aproxi-madamente 5 a 50 vezes, e mais preferencialmente, aproximadamente 10 a50 vezes a indução de ligação de anexina em relação a célula não tratadaem um ensaio de ligação de anexina usando células BT474 (vide abaixo).Exemplos de anticorpos HER2 que induzem apoptose são 7C2 e 7F3.

O "epítopo 2C4" é a região no domínio extracelular de HER2 aoqual o anticorpo 2C4 se liga. De modo a examinar por anticorpos que se li-gam essencialmente ao epítopo 2C4, um ensaio de bloqueio cruzado de ro-tina tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser executado.Preferencialmente, o anticorpo bloqueia a ligação de 2C4 a HER2 em apro-ximadamente 50% ou mais. Alternativamente, o mapeamento de epítopopode ser executado para avaliar se o anticorpo se liga essencialmente aoepítopo 2C4 de HER2. O epítopo 2C4 compreende resíduos do Domínio II(ID SEQ N2 15) no domínio extracelular de HER2. 2C4 e pertuzumabe seligam ao domínio extracelular de HER2 na junção dos domínios I, II e III (IDSEQ N2S14, 15 e 16, respectivamente). Franklin e outros, Câncer Cell 5:317-328 (2004).

O "epítopo 4D5" é a região no domínio extracelular de HER2 aoqual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e trastazumabe se ligam. Esse epí-topo está próximo ao domínio transmembrana de HER2, e dentro do Domí-nio IV de HER2 (ID SEQ N2 17). Para examinar os anticorpos que se ligamessencialmente ao epítopo 4D5, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina talcomo aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Har-bor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser executado. Al-ternativamente, o mapeamento de epítopo pode ser executado para avaliarse o anticorpo se liga essencialmente ao epítopo 4D5 de HER2 (por exem-plo, qualquer um ou mais resíduos na região de aproximadamente o resíduo529 a aproximadamente o resíduo 625, inclusive do HER2 ECD, numeraçãode resíduo incluindo peptídeo sinal).

O "epítopo 7C2/7F3" é a região no término N, dentro do DomínioI (ID SEQ N2 14), do domínio extracelular de HER2 ao qual os anticorpos7C2 e/ou 7F3 (cada um depositado com o ATCC, vide abaixo) se ligam. Pa-ra examinar os anticorpos que se ligam essencialmente ao epítopo 7C2/7F3,um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como o descrito em Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and DavidLane (1988), pode ser executado. Alternativamente, o mapeamento de epí-topo pode ser executado para estabelecer se o anticorpo se liga essencial-mente ao epítopo 7C2/7F3 em HER2 (por exemplo, quaisquer um ou maisdos resíduos na região de aproximadamente o resíduo 22 a aproximada-mente o resíduo 53 do HER2 ECD, numeração de resíduo incluindo peptí-deo sinal).

"Tratamento" refere-se a ambos o tratamento terapêutico e me-didas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade de tratamentoincluem aqueles já com câncer bem como aqueles nos quais o câncer é pre-venido. Portanto, o paciente a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticadocomo tendo câncer ou pode ser predisposto ou suscetível a câncer.

O termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de umfármaco eficaz para tratar câncer no paciente. A quantidade eficaz do fárma-co pode reduzir o número de células de câncer, reduzir o tamanho do tumor,inibir (isto é, retardar em alguma extensão e preferencialmente parar) a infil-tração de célula de câncer em órgãos periféricos, inibir (isto é, retardar emalguma extensão e preferencialmente parar) metástase do tumor, inibir, emalguma extensão, o crescimento do tumor, e/ou aliviar em alguma extensãoum ou mais dos sintomas associados com o câncer. No caso do fármacopoder prevenir o crescimento e/ou matar células de câncer existentes, elepode ser citostático e/ou citotóxico. A quantidade eficaz que pode estender asobrevida livre de progressão (por exemplo, medida por Critérios de Avalia-ção de resposta para Tumores Sólidos, RECIST, ou mudanças CA-125),resulta em uma resposta objetiva (incluindo uma resposta parcial, RP, ouresposta completa, RC), aumenta o tempo de sobrevida global, e/ou melhoraum ou mais sintomas de câncer (por exemplo, como avaliado por FOSI).

O termo "agente citotóxico" como usado aqui se refere a umasubstância que inibe ou impede o funcionamento de células e/ou causa adestruição delas. O termo pretende incluir isótopos radiativos (por exemplo,I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), a-gentes quimioterapicos, e toxinas tais como toxinas de molécula pequena outoxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ouanimal, incluindo fragmentos e/ou variantes dessas.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra-tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapicos incluem agentesalquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®, alquil sulfonatostais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilame-laminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trieti-lenotiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeni-nas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol(dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulíni-co; a camptotecina (incluindo o topotecana análoga sintética (HYCAMTIN®),CPT-11 (irinotecana, CAMPTOSAR®, acetilcamptotecina, escopolectina, e9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus aná-logos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina), podofilotoxina, ácidopodofilínico, teniposida, criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptofi-cina 8), dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1), eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina,mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida,estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto de oxido de meclore-tamina, melfalana, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida,mostarda de uracila, nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocina, fote-mustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina, bisfosfonatos, tais como clo-dronato; antibióticos tais como os antibióticos de enedina {por exemplo, cali-cheamicina, especialmente calicheamicina gammall e calicheamicina ome-gah (vide, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) eantraciclinas tais como anamicina, AD 32, aclarubicina, daunorubicina, de-xrazoxana, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menoga-rila, dinemicina, incluindo dinemicina A, uma esperamicina, cromóforo deneocarzinostatina e cromóforos de antibiótico de enedina de cromoproteínarelacionada, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomi-cinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas,dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA®doxorubicina (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina,2-pirrolino-doxorubicina, doxorubicina lipossômica, e desoxidoxorubicina),esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido mico-fenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina,quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ube-nimex, zinostatina, e zorubicina, análogos de ácido fólico tais como denopte-rina, pteropterina, e trimetrexato, análogos de purina tais como fludarabina,6-mercaptopurina, tiamiprina, e tioguanina, análogos de pirimidina tais comoancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina,doxifluridina, enocitabina, e floxuridina, andrógenos tais como calusterona,propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, e testolactona,antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotana, e trilostana, reabastece-dor de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina), aceglatona, agentesantineoplásicos antifolate tais como ALIMTA®, pemetrexed LY231514, inibi-dores de diidrofolato redutase tais como metotrexato, antimetabólitos taiscomo 5-fluorouracila (5-FU) e seus pró-fármacos tais como UFT, S-1 e ca-pecitabina, e inibidores de timidilato sintase e inibidores de glicinamida ribo-nucleotídeo formiltransferase tas como raltitrexed (TOMUDEXRM, TDX), ini-bidores de diidropirimidina desidrogenase tais como eniluracila, aldofosfami-da glicosídeo; ácido aminolevulínico, amsacrina, bestrabucila, bisantrena,edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de elip-tínio, uma epotilona, etoglucida, nitrato de gálio, hidroxiuréia, lentinana, loni-dainina, maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas, mitoguazona,mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina,losoxantrona, 2-etilidrazida, procarbazina, complex polissacarídeo PSK7(JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxana, rizoxina, sizofirana, espiro-germânio, ácido tenuazônico, triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina, tricote-cenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina), ure-tana, vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), dacarbazina, manomustina, mi-tobronitol, mitolactol, pipobromana, gacitosina, arabinosida ("Ara-C"), ciclo-fosfamida, tiotepa, taxóides e taxenos, por exemplo, paclitaxel TAXOL®(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre deCremofor, formação de nanopartículas elaboradas com albumina de paclita-xel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e docetaxelTAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França), cloranbucila, genci-tabina (GEMZAR®), 6-tioguanina, mercaptopurina, platina, análogos de pla-tina ou análogos à base de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carbo-platina, vinblastina (VELBAN®), etoposida (VH-16), ifosfamida, mitoxantro-na, vincristina (ONCOVIN®), vinca alcalóide, vinorelbina (NAVELBINE®),novantrona, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato,inibidor de topoisomerase RFS 2000, difluormetilornitina (DMFO), retinóidestal como ácido retinóico, sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou deri-vados de quaisquer dos acima, bem como combinações de dois ou mais dosacima tal como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ci-clofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma a-breviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™)combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonaisque agem para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores tais comoantiestrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs),incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®),raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno,LY117018, onapristona, e toremifeno FARESTON®, inibidores de aromataseque inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nasglândulas adrenais, tal como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida,acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano,fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, e anastrozol ARIMIDEX®,e antiandrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, egoserelina, bem como troxacitabina (um análogo de citosina 1,3-dioxolanonucleosídeo), oligonucleotídeos anti-senso, particularmente aqueles que exi-bem expressão de genes em rotas de sinalização implicadas em proliferaçãode célula anormal, tal como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptorde fator de crescimento epidérmico (EGF-R), vacinas tais como vacinas deterapia, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, e VAXID®, rlL-2PROLEUKIN®, inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®, rmRH ABA-RELIX®, e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dequaisquer dos acima.

Um "agente quimioterápico antimetabólito" é um agente que éestruturalmente similar a um metabólito, mas não pode ser usado pelo corpode uma maneira produtiva. Muitos agentes quimioterapicos antimetabólitointerferem na produção dos ácidos nucléicos, RNA e DNA. Exemplos de a-gentes quimioterapicos antimetabólito incluem gencitabina (GEMZAR®), 5-fluorouracila (5-FU), capecitabina (XELODA™), 6-mercaptopurina, metotre-xato, 6-tioguanina, pemetrexed, raltitrexed, arabinosilcitosina citarabina ARA-C (CYTOSAR-U®), dacarbazina (DTIC-DOME®), azocitosina, deoxicitosina,piridmideno, fludarabina (FLUDARA®), cladrabina, 2-desóxi-D-glicose, etc.O agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.

A "gencitabina" ou "2'-desóxi-2', 2'-difluorcitidina monoidrocloreto(b-isômero)" é um análogo de nucleosídeo que exibe atividade antitumor. Afórmula empírica para HCI de gencitabina é C9H11F2N304 A HCI. O HCI degencitabina é vendido por Eli Lilly sob a marca GEMZAR®.

Um "agente quimioterápico à base de platina" compreende umcomposto orgânico que contém platina como uma parte integrada da molé-cula. Exemplos de agentes quimioterapicos à base de platina incluem carbo-platina, cisplatina, e oxaliplatina.Por "quimioterapia à base de platina" entende-se terapia com umou mais agentes quimioterápicos à base de platina, opcionalmente em com-binação com um ou mais outros agentes quimioterápicos.

Por câncer "resistente à quimioterapia" entende-se que o pacien-te com câncer progrediu enquanto recebendo um regime de quimioterapia(isto é, o paciente é "ref rata rio à quimioterapia"), ou o paciente progrediu em12 meses (por exemplo, em 6 meses) depois de completar um regime dequimioterapia.

Por câncer "resistente à platina" entende-se que o paciente comcâncer progrediu enquanto recebendo quimioterapia à base de platina (istoé, o paciente é "refratário à platina"), ou o paciente progrediu em 12 meses(por exemplo, em 6 meses) depois de completar um regime de quimioterapiaà base de platina.

Um "agente antiangiogênico" refere-se a um composto que blo-queia, ou interfere em algum grau no desenvolvimento de vasos sangüíneos.O fator antiangiogênico pode, por exemplo, ser uma pequena molécula ouanticorpo que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de cres-cimento envolvido em promover angiogênese. O fator antiangiogênico prefe-rencial aqui citado é um anticorpo que se liga ao fator de crescimento endo-telial vascular (VEGF), tal como bevacizumabe (AVASTIN®).

O termo "citoquina" é um termo genérico para proteínas libera-das por uma população de células que age em outra célula como mediado-res intercelulares. Exemplos de tais citoquinas são linfoquinas, monoquinase hormônios de polipeptídeo tradicionais. Incluídos entre as citoquinas estãoo hormônio de crescimento tal como hormônio de crescimento humano, hor-mônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de crescimento bo-vino, hormônio paratiróide, tirozina, insulina, pró-insulina, relaxina, pró-relaxina, hormônios de glicoproteína tais como hormônio estimulante de foií-culo (FSH), hormônio estimulante de tiróide (TSH), e hormônio de luteiniza-ção (LH), fator de crescimento hepático, fator de crescimento de fibroblasto,prolactina, lactógeno placentário, fator a e p de necrose de tumor, substân-cia de inibição muleriana, peptídeo associado com gonadotropina de ratos,inibiria, activina, fator de crescimento endotelial vascular, integrina, trombo-poietina (TPO), fatores de crescimento de nervos tal como NGF-B, fator decrescimento de plaquetas, fatores de crescimento transformantes (TGFs)tais como TGF-a e TGF-B, fator-l e fator-ll de crescimento similar à insulina,eritropoietina (EPO), fatores osteoindutivos, interferonas tais como interfero-na-a, -B, e -y, fatores estimuladores de colônia (CSFs) tais como CSF demacrófagos (M-CSF), CSF de macrófagos ganulócitos (GM-CSG), e CSF degranulócitos (G-CSF), interleuquinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, um fator de necrose de tumortal como TNF-oc ou TNF-B, e outros fatores de polipeptídeos incluindo LIF ekit ligante (KL). Como usado aqui, o termo citoquina inclui proteínas de fon-tes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologica-mente ativos das citoquinas de seqüência nativa.

Como usado aqui, o termo "fármaco direcionado a EGFR" refe-re-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe aativação de EGFR. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e peque-nas moléculas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam aEGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRLHB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide,Patente US N2 4.943.533, Mendelsohn e outros) e variantes desses, tal co-mo 225 quimerizado (C225 ou Cetuximabe; ERBUTIX®) e human 225 hu-mano redimensionado (H225) (vide, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.);IMC-11F8, um anticorpo direcionado a EGFR completamente humano (Im-clone), anticorpos que se ligam a EGFR mutante tipo II (Patente US N-5.212.290), anticorpos quiméricos e humanizados que se ligam a EGFR co-mo descrito na Patente US N2 5.891.996, e anticorpos humanos que se li-gam a EGFR, tal como ABX-EGF (vide WO 98/50433, Abgenix); EMD 55900(Stragliotto e outros, Eur. J. Câncer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matu-zumabe) um anticorpo EGFR humanizado direcionado contra EGFR quecompete com ambos EGF e TGF-alfa para ligação com EGFR, e mAb 806ou mAb 806 humanizado (Johns e outros, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agentecitotóxico, assim gerando um imunoconjugado (vide, por exemplo, EP659.439A2, Merck Patent GmbH). Exemplos de pequenas moléculas que seligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinibe (IRESSA; Astra Zeneca), CP-358774 ou Erlotinibe (TARCEVA™; Genentech/OSI), e AG 1478, AG 1571(SU 5271; Sugen), EMD-7200.

Um "inibidor de tirosina quinase" é uma molécula que inibe aatividade de uma tirosina quinase tal como um receptor HER. Exemplos detais inibidores incluem os fármacos direcionados a EGFR observados noparágrafo anterior, inibidor de tirosina quinase HER2 de pequena moléculatal como TAK165 disponível a parti de Takeda, CP-724.714, um inibidor se-letivo oral do receptor de tirosina quinase ErbB2 (Pfizer e OSI), inibidores deHER duplos tal como EKB-569 (disponível a partir de Wyeth) que preferenci-almente se liga a EGFR, mas inibe ambas as células superexpressandoHER2 e EGFR, GW572016 (disponível a partir da Glaxo) um inibidor de tiro-sina quinase HER2 e EGFR oral, PKI-166 (disponível a partir da Novartis),inibidores pan-HER tal como canertinibe (CI-1033; Pharmacia), inibidores deRaf-1 tal como agente antissenso ISIS-5132 disponível a partir de ISISPharmaceuticals que inibe sinalização de Raf-1, inibidores TK direcionados anão HER tal como mesilato de Imatinibe (Gleevac™) disponível a partir daGlaxo, inibidor de quinase I regulada extracelular MAPK CI-1040 (disponívela partir de Pharmacia), quinazolinas, tal como PD 153035,4-(3-cloroanilino)quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tais co-mo CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706, pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoranilino)ftalimida), tirfostinas contendo porções de nitrotiofeno, PD-0183805 (Warner-Lamber), moléculas antissenso (por exemplo, aquelas quese ligam a ácido nucléico codificando HER), quinoxalinas (Patente US N-5.804.396), trifostinas (Patente US N2 5.804.396), ZD6474 (Astra Zeneca),PTK-787 (Novartis/Schering AG), inibidores pan-HER tal como CI-1033 (Pfi-zer), Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly), mesilato de Imatinibe (Gleevac; Novar-tis), PKI 166 (Novartis), GW2016 (Glaxo SmithKline), CI-1033 (Pfizer), EKB-569 (Wyeth), Semaxinibe (Sugen), ZD6474 (AstraZeneca), PTK-787 (Novar-tis/Schering AG), INC-1C11 (Imclone), ou como descrito em qualquer dasseguintes publicações de patente: Patente US N2 5.804.396, WO 99/09016(American Cyanimid), WO 98/43960 (American Cyanamid), WO 97/38983(Warner Lambert), WO 99/06378 (Warner Lambert), WO 99/06396 (WarnerLambert), WO 96/30347 (Pfizer, Inc), WO 96/33978 (Zeneca), WO 96/3397(Zeneca), e WO 96/33980 (Zeneca).

Uma dose "fixa" ou "estável" de um agente terapêutico aqui cita-do se refere a uma dose que é administrada a um paciente humano semconsiderar o peso (WT) ou área de superfície corporal (BSA) do paciente. Adose fixa ou estável é, portanto, não fornecida como uma dose MG/kg ouuma dose MG/m2, mas de preferência como uma quantidade absoluta doagente terapêutico.

Uma dose "de carga" aqui citada geralmente compreende umadose inicial de um agente terapêutico administrada a um paciente, e é se-guida por uma ou mais doses de manutenção desse agente. Geralmente,uma única dose de carga é administrada, mas múltiplas doses iniciais sãoobservadas aqui. Usualmente, a quantidade de dose de carga administradaexcede a quantidade da dose(s) de manutenção administrada e/ou as dosesiniciais são administradas mais freqüentemente do que a dose(s) de manu-tenção, tal como para alcançar a concentração em regime permanente dese-jada do agente terapêutico antes do que pode ser alcançado com a dose(s)de manutenção.

Uma dose de "manutenção" aqui citada se refere a uma ou maisdoses de um agente terapêutico administrado ao paciente por um período detratamento. Usualmente, as doses de manutenção são administradas emintervalos espaçados de tratamento, tal como aproximadamente a cada se-mana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3semanas, ou aproximadamente a cada 4 semanas.

II. Produção de Anticorpos

O antígeno de HER a ser usado para a produção de anticorpospode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de umreceptor HER ou uma parte desse, contendo o epítopo desejado. Alternati-vãmente, as células expressando HER em sua superfície de célula (por e-xemplo, células NIH-3T3 transformadas para superexpressar HER2, ou umalinha celular de carcinoma tal como células SK-BR-3, vide Stancovski e ou-tros, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) pode ser usada para gerar anticor-pos. Outras formas de receptor HER úteis para gerar anticorpos estarão a-parentes aos versados na técnica.

(i) Anticorpos Policlonais

Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados emanimais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) doantígeno relevante e de um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno re-levante para uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada,por exemplo, hemocianina do molusco heyhole limpet, albumina de soro,tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina da soja usando um agente bifun-cional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuc-cinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida(através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCb, ouR1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquila.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imu-nogênicos, ou derivados combinando-se, por exemplo, 100 fig ou 5 |ig daproteína ou conjugado (para coelhos ou ratos, respectivamente) com 3 vo-lumes de adjuvante completo de Freund e injetando-se a solução de formaintradérmica em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são reforçadoscom 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adju-vante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é ensaiado por concen-tração de anticorpo. Os animais são reforçados até a paralisação da concen-tração. Preferencialmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmoantígeno, mas conjugado para uma proteína diferente e/ou através de umreagente de reticulação diferente. Os conjugados podem também ser feitosem culturas de células recombinantes como fusões de proteínas. Também,os agentes de agregação tal como alume são adequadamente usados paraintensificar a resposta imune.(ii) Anticorpos Monoclonais

Vários métodos para obter anticorpos monoclonais aqui citadosestão disponíveis na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais po-dem ser obtidos usando o método de hibridoma primeiramente descrito porKohler e outros, Nature, 256:495 (1975), por métodos de DNA recombinante(Patente U.S. N2 4.816.567).

No método de hibridoma, um rato ou outro animal hospedeiroapropriado, tal como um hamster, é imunizado como acima descrito paraextrair linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos quese ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativa-mente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos então sãofundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, talcomo polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclo-nal Antibodies: Principies and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cul-tivadas em um meio de cultura adequado que preferencialmente contémuma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevida das célulasparentais de mieloma não fundidas. Por exemplo, se as células parentais demieloma carecem da enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente inclui-rá hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias que impe-dem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

As células de mieloma preferenciais são aquelas que se fundemeficazmente, suportam a produção estável em alto nível de anticorpos pelascélulas que produzem anticorpos selecionados, e são sensíveis a um meiotal como meio HAT. Dentre essas, as linhagens celulares de mieloma prefe-renciais são linhagens de mieloma de ratos, tal como aquelas derivadas detumores em ratos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis a partir de Salk InstituteCell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis a partir de American Type Culture Collection, Rockville,Maryland, USA. As linhagens celulares de mieloma humano e de heteromie-loma rato-humano também foram descritas para a produção de anticorposmonoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur eoutros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág.51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão cres-cendo é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais direcionadoscontra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade da ligação de anticor-pos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada porimunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimu-noensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exem-plo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson e outros, Anal. Bio-chem., 107:220 (1980).

Depois que as células de hibridoma são identificadas que produ-zem anticorpos da especificidade, afinidade, e/ou atividade desejada, os clo-nes podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e culti-vados por métodos padrões (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies andPractice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura ade-quados para esse propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Em adição, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo comotumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são a-dequadamente separados do meio de cultura, o fluido de ascite, ou soro porprocedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por e-xemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforeseem gel, diálise, ou cromatografia de afinidade.

O DNA codificando os anticorpos monoclonais é prontamenteisolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo,usando provas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamen-te a genes codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos de ratos). Ascélulas de hibridoma servem como uma fonte preferencial de tal DNA. Umavez isolado, o DNA pode ser localizado em vetores de expressão, que sãoentão transfectados em células de hospedeiro como células E. coli, célulasCOS de macacos, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou célulasde mieloma que não produzem, de outra forma, proteína de anticorpo, paraobter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombi-nantes. Artigos de revisão de expressão recombinante em bactérias de DNAcodificando o anticorpo incluem Skerra e outros, Curr. Opinion in Immunol.,5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Em uma modalidade adicional, os anticorpos monoclonais oufragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de anticorposexpressas em fagos geradas usando as técnicas descritas em McCafferty eoutros, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson e outros, Nature, 352:624-628(1991) e Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o iso-lamento de anticorpos de ratos e de seres humanos, respectivamente, usan-do bibliotecas de fagos. Subsequentes publicações descrevem a produçãode anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) por mistura de cadeia(Marks e outros, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecçãocombinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para construirbibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse e outros, Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)). Assim, essas técnicas são alternativas viáveis a téc-nicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento deanticorpos monoclonais.

O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo-se a seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada ede cadeia leve humanas em lugar das seqüências de ratos homólogas (Pa-tente U.S. N- 4.816.567, e Morrison, e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA,81:6851 (1984)), ou unindo de forma covalente à seqüência de codificaçãotoda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina.

Tipicamente tais polipeptídeos não-imunoglobulina são substitu-ídos para os domínios constantes de um anticorpo, ou eles são substituídospara os domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de umanticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo umsítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno eoutro sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antíge-no diferente.

(iii) Anticorpos Humanizados

Os métodos para humanizar anticorpos não-humanos foramdescritos na técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado tem umou mais resíduos de aminoácido introduzidos nele a partir de uma fonte quenão é humana. Esses resíduos de aminoácido não-humanos são freqüente-mente referidos como resíduos "importados" que são tipicamente obtidos deum domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenteexecutada seguindo o método de Winter e co-trabalhadores (Jones e outros,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen e outros, Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindoseqüências de região hipervariável para as seqüências correspondentes deum anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N2 4.816.567) sendo que substan-cialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituídopela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, osanticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais al-guns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FRsão substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesa-do, para ser usada em obter os anticorpos humanizados é muito importantepara reduzir antigenicidade. De acordo com o então chamado método "me-lhor ajuste", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor éexaminada contra a biblioteca inteira de seqüências de domínio variável hu-manas conhecidas. A seqüência humana que está mais próxima daquela doroedor é então aceita como a região de estrutura humana (RE) para o anti-corpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia eoutros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método usa uma região de estru-tura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorposhumanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesmaestrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes(Carter e outros, Proc. A/aí/. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta e ou-tros, J. ImmunoL, 151:2623 (1993)).

É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humani-zados com a retenção de alta afinidade para o antígeno e outras proprieda-des biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo com ummétodo preferencial, anticorpos humanizados são preparados por um pro-cesso de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizadosconceituais usando modelos tridimensionais das seqüências parentais e hu-manizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumentedisponíveis e são familiares aos versados na técnica. Os programas decomputador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem estruturas con-formacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulinacandidata. A inspeção dessas exibições permite a análise da função prová-vel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candida-ta, isto é, a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobu-lina candidata para ligar a seu antígeno. Dessa forma, os resíduos de REpodem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e importam se-qüências tal que a característica de anticorpo desejada, tal como a afinidadeaumentada para o antígeno(s) alvo é alcançada. Em geral, os resíduos deregião hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos eminfluenciar ligação com antígeno.

A Patente U.S. N2 6.949.245 descreve a produção de anticorposHER2 humanizados exemplificados que se ligam a HER2 e bloqueiam a ati-vação de ligante de um receptor HER. O anticorpo humanizado usado nosmétodos da presente invenção é rhuMAb 2C4 (pertuzumabe), ou um anti-corpo que se liga essencialmente ao mesmo epítopo do domínio extracelularde HER2 como pertuzumabe. Em outras modalidades, um dos anticorposusados nos métodos da presente invenção bloqueia ativação mediada porEGF, TGF-oc e/ou HRG de MAPK essencialmente eficazmente como anticor-po monoclonal de ratos 2C4 (ou um fragmento Fab desse) e/ou se liga aHER2 essencialmente como eficazmente como anticorpo monoclonal de ra-tos 2C4 (ou um fragmento Fab desse). O anticorpo humanizado aqui citadopode, por exemplo, compreender resíduos de região hipervariavel não-humano incorporados em um domínio pesado variável humano e pode adi-cionalmente compreender uma substituição de região de estrutura (RE) emuma posição selecionada a partir do grupo que consiste em 69H, 71H e 73Hutilizando o sistema de numeração de domínio variável apresentado em Ka-bat e outros, Sequences oi Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Em umamodalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições de RE emduas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.

Um anticorpo humanizado exemplificado de interesse aqui citadocompreende resíduos de determinação de complementaridade de domíniopesado variável GFTFTDYTMX (ID SEQ N- 18), onde X é preferencialmenteD ou S, DVNPNSGGSIYNQRFKG (ID SEQ N2 19), e/ou NLGPSFYFDY (IDSEQ Ne 20), opcionalmente compreendendo modificações de aminoácidodaqueles resíduos de CDR, por exemplo, onde as modificações essencial-mente mantêm ou aperfeiçoam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, umavariante de anticorpo para uso nos métodos da presente invenção pode terde aproximadamente um a aproximadamente sete ou aproximadamente cin-co substituições de aminoácido nas seqüências de CDR pesada variáveis.

Tais variantes de anticorpo podem ser preparadas por maturação de afinida-de, por exemplo, como descrito abaixo.

O anticorpo humanizado pode compreender resíduos de deter-minação de complementaridade de domínio leve variável KASQDVSIGVA(ID SEQ N2 21), SASYX1X2X3, onde X1 é preferencialmente R ou L, X2 é pre-ferencialmente Y ou E, e X3 é preferencialmente T ou S (ID SEQ N2 22); e/ouQQYYIYPYT (ID SEQ N2 23), por exemplo, em adição àqueles resíduosCDR de domínio pesado variável no parágrafo anterior. Tais anticorpos hu-manizados opcionalmente compreendem modificações de aminoácido dosresíduos de CDR acima, por exemplo, onde as modificações essencialmentemantêm ou aperfeiçoam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, a variante deanticorpo de interesse pode ter de aproximadamente um a aproximadamentesete ou aproximadamente cinco substituições de aminoácidos nas sequên-cias de CDR leves variáveis. Tais variantes de anticorpos podem ser prepa-radas por maturação de afinidade, por exemplo, como descrito abaixo.

O presente pedido de patente também observa os anticorpos deafinidade madura que se ligam a HER2. O anticorpo pai pode ser um anti-corpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, um compreen-dendo as seqüências de cadeia leve variável e/ou de cadeia pesada variávelde ID SEQ N2S 7 e 8, respectivamente (isto é, compreendendo o V|_ e/ou VHde pertuzumabe). Uma variante de afinidade madura de pertuzumabe prefe-rencialmente se liga ao receptor HER2 com uma afinidade superior àquelade ratos 2C4 ou pertuzumabe (por exemplo, afinidade aperfeiçoada aproxi-madamente duas ou aproximadamente quatro vezes, a aproximadamente100 vezes ou aproximadamente 1000 vezes, por exemplo, como avaliadousando um domínio extracelular de HER2 (ECD) ELISA). Os resíduos deCDR pesada variáveis exemplificados para substituição incluem H28, H30,H34, H35, H64, H96, H99, ou combinações de dois ou mais (por exemplo,dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete desses resíduos). Exemplos de resí-duos de CDR leve variáveis para alteração incluem L28, L50, L53, L56, L91,L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois,três, quatro, cinco, ou mais até aproximadamente dez desses resíduos).

A humanização de anticorpo 4D5 de ratos para gerar varianteshumanizadas desse, incluindo trastuzumabe, é descrita na Patente U.S. N2S5.821.337, 6.054.297, 6.407.213, 6.639.055, 6.719.971, e 6.800.738, bemcomo Carter e outros, PNAS (USA), 89:4285-4289 (1992). HuMAb4D5-8(trastuzumabe) limita o antígeno de HER2 3 vezes mais firmemente do que oanticorpo 4D5 de ratos, e tinha função imune secundária (ADCC) que permi-tiu atividade citotóxica direcionada do anticorpo humanizado na presença decélulas efetoras humanas. HuMAb4D5-8 compreendeu resíduos CDR leve(VL) variáveis incorporados em uma estrutura de consenso de subgrupo I VL,e os resíduos de CDR pesada (VH) variáveis incorporados em uma estruturade consenso de subgrupo III VH. O anticorpo adicionalmente compreendeusubstituições de região de estrutura (RE) como posições: 71, 73, 78, e 93 doVH (numeração de Kabat de resíduos de RE, e uma substituição de RE naposição 66 do VL (numeração de Kabat de resíduos de RE). Trastuzumabecompreende região Fc 1 y humana de alótipo não -A.

Várias formas do anticorpo humanizado ou anticorpo de afinida-de madura são observadas. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou anti-corpo de afinidade madura pode ser um fragmento de anticorpo, tal comoum Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxi-cos de modo a gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo hu-manizado ou anticorpo de afinidade madura pode ser um anticorpo intacto,tal como um anticorpo lgG1 intacto.

(iv) Anticorpos Humanos

Como uma alternativa à humanização, os anticorpos humanospodem ser gerados. Por exemplo, é agora possível produzir animais trans-gênicos (por exemplo, ratos) que são capazes, mediante imunização, deproduzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de pro-dução de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que o apaga-mento de homozigoto do gene de região de união de cadeia pesada de anti-corpo (Jh) em ratos mutantes de linha genética e quimérica resulta em inibi-ção completa de produção de anticorpo endógeno. A transferência do arran-jo de gene de imunoglobulina de linha genética humana em tais ratos mutan-tes de linha genética resultará na produção de anticorpos humanos medianteo desafio de antígeno. Vide, por exemplo, Jakobovits e outros, Proc. A/aí/.Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits e outros, Nature, 362:255-258(1993); Bruggermann e outros, Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patente U.S.N2S 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807. Alternativamente, a tecnologia de exi-bicão de fagos (McCafferty e outros, Nature 348:552-553 (1990)) pode serusada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro,a partir de repertórios de gene de domínio variável (V) de doadores não imu-nizados. De acordo com essa técnica, os genes de domínio V de anticorposão clonados no quadro ou no gene de proteína de revestimento maior oumenor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibido comofragmentos de anticorpo funcional na superfície da partícula de fago. Como apartícula filamentosa contém uma cópia de DNA de filamento único do ge-noma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anti-corpo também resultam em seleção do gene codificando o anticorpo exibindoessas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B.A exibição de fago pode ser executada em uma variedade de formatos, parasua revisão vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural S/o/ogy 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos degene V podem ser usadas para exibição de fago. Clackson e outros, Nature,352.624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos antioxazolonade uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dosbaços de ratos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanosnão-imunizados pode ser construído e anticorpos para um arranjo diverso deantígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente se-guindo as técnicas descritas por Marks e outros, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991), ou Griffith e outros, EMBO J. 12:725-734 (1993). Vide, também, Pa-tente U.S. Nss 5.565.332 e 5.573.905.

Como discutido acima, os anticorpos humanos podem tambémser gerados por células B ativadas in vitro (vide Patentes U.S. 5.567.610 e5.229.275).

Os anticorpos contra HER2 humanos são descritos na PatenteU.S. N2 5.772.997 emitida em 30 de Junho de 1998 e WO 97/00271 publica-da em 3 de Janeiro de 1997.

(v) Fragmentos de Anticorpo

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag-mentos de anticorpos compreendendo uma ou mais regiões de ligação aantígeno. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados via digestãoproteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto e outros,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992), e Bren-nan e outros, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podemagora ser produzidos diretamente por células de hospedeiro recombinantes.

Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecasde anticorpos expressas em fagos discutido acima. Alternativamente, osfragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimi-camente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e outros, Bi-o/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, osfragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura celular dehospedeiro recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentosde anticorpo estarão aparentes aos versados na técnica. Em outras modali-dades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de única cadeia (scFv).Vide WO 93/16185, Patente U.S. N2 5.571.894, e Patente U.S. N2 5.587.458.

O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exem-plo, como descrito na Patente U.S. 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentosde anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(vi) Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especifici-dades de ligação para ao menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos bi-específicos exemplificados podem se ligar a dois epítopos diferentes da pro-teína HER2. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação aHER2 com o sítio(s) de ligação para EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativa-mente, um braço de HER2 pode ser combinado com um braço que se liga auma molécula de disparo em um leucócito tal como a molécula receptora decélula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), talcomo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) tal como para focarmecanismos de defesa celular à célula de expressão de HER2. Os anticor-pos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxi-cos para células que expressam HER2. Esses anticorpos possuem um braçode ligação a HER2 e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exem-pio, anti-interferona-a, vinca alcalóide, cadeia de ricina A, metotrexato ouhapteno de isótopo radioativo). Os anticorpos biespecíficos podem ser pre-parados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anti-corpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico HER2/FcyRIHe a Patente U.S. N2 5.837.234 descreve um IDM1 de anticorpo biespecíficoHER2/FcyRI (Osidem). Um anticorpo biespecífico HER2/Fca é mostrado emWO 98/02463. A Patente U.S. N2 5.821.337 apresenta um anticorpo biespe-cífico HER2/CD3. MDX-210 é um Ab biespecífico HER2-FcyRIM.

Métodos para obter anticorpos biespecíficos são conhecidos natécnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimentocompleto é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve-cadeiapesada de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especifici-dades (Millstein e outros, Nature, 305:537-539 (1983)). Por causa da varie-dade aleatória de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, esses hibri-domas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 diferentes molé-culas de anticorpos, das quais somente uma tem a estrutura biespecíficacorreta. A purificação da molécula correta, que é usualmente feita por etapasde cromatografia de afinidade, é de preferência complicada, e os rendimen-tos do produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO93/08829, e em Traunecker e outros, EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveisde anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combi-nação anticorpo-antígeno) são fundidos em seqüências de domínio constan-te de imunoglobulina. A fusão preferencialmente é com um domínio constan-te de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo ao menos parte daarticulação, regiões CH2, e CH3. É preferencial ter a primeira região cons-tante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação decadeia leve, presente em ao menos uma das fusões. Os DNAs codificandoas fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia levede imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e sãoco-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornecegrande flexibilidade em ajustar as proporções mútuas dos três fragmentos depolipeptídeo em modalidades quando relações desiguais das três cadeias depolipeptídeo usadas na construção fornecem os rendimentos otimizados. É,entretanto, possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas astrês cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão deao menos duas cadeias de polipeptídeos em relações iguais resulta em altosrendimentos ou quando as relações não são de significância particular.

Em uma modalidade preferencial dessa abordagem, os anticor-pos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulinahíbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um parde cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (fornecendo umasegunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essaestrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejadode combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, à medida que apresença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente uma metadeda molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Essa a-bordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geraranticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh e outros, Methods inEnzymology, 121:210(1986).

De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N-5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode serelaborada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recupe-rados da cultura de célula recombinante. A interface preferencial compreen-de ao menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anti-corpo. Nesse método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoáci-dos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por ca-deias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades"compensatórias de tamanho idêntico ou similar à grande cadeia(s) lateralsão criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo asgrandes cadeias laterais de aminoácido com menores (por exemplo, alanina outreonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do hetero-dímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugadopode ser acoplado a avidina, o outro à botina. Tais anticorpos foram, por e-xemplo, propostos para focar células de sistema imune a células indeseja-das (Patente U.S. N- 4.676.980), e para tratamento de infecção por HIV (WO91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados po-dem ser obtidos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Osagentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são descri-tos na Patente U.S. Ne 4.676.980, junto com inúmeras técnicas de reticulação.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmen-tos de anticorpos foram também descritas na literatura. Por exemplo, os an-ticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Bren-nan e outros, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento ondeanticorpos intactos são clivados de forma proteolítica para gerar fragmentosF(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente complexan-te de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir a for-mação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são entãoconvertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então re-convertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e émisturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB paraformar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podemser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

O recente progresso tem facilitado a recuperação direta defragmentos Fab'-SH de E. coli, que pode ser quimicamente acoplado paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby e outros, J. Exp. Med., 175: 217-225(1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab')2 biespe-cífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamentesecretado a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionadoin vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assimformado foi capaz de se ligara a células superexpressando o receptor HER2e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfóci-tos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.

Várias técnicas de obter e isolar fragmentos de anticorpos bies-pecíficos diretamente de cultura de células recombinantes foram tambémdescritas. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos foram produzidos usandozíperes de leucina. Kostelny e outros, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992).

Os peptídeos de zíper de leucina a partir de proteínas Fos e Jun foram liga-dos às partes Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os ho-modímeros de anticorpo foram reduzidos na região de articulação para for-mar monômeros e então reoxidados para formar os heterodímeros de anti-corpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodí-meros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger e ou-tros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um meca-nismo alternatico para obter fragmentos de anticorpo biespecífico. Os frag-mentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conecta-do a domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligador que é muito curtopara permitir emparelhamento entre dois domínios na mesma cadeia. Con-sequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forcados a empa-relhar com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, dessemodo formando dois sítios de ligação com antígeno. Outra estratégia paraobter fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dimeros Fv de cadeiaúnica (sFv) foi também relatada. Vide See Gruber e outros, J. Immunol.,152:5368 (1994).

Os anticorpos com mais de duas valências são observados. Porexemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt e outros, J.Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Outras modificações na seqüência de aminoácidos

As modificações na seqüência de aminoácido dos anticorposdescritas aqui são observadas. Por exemplo, pode ser desejável aperfeiçoara afinidade de ligação e/ou propriedades biológicas do anticorpo. As varian-tes de seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas introduzindo-se mudanças de nucleotídeo apropriadas no ácido nucléico do anticorpo, oupor síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, apaga-mentos, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências deaminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de apagamento, inserção esubstituição é feita para chegar na construção final, já que esta possui ascaracterísticas desejadas. As mudanças de aminoácidos também podemalterar processos pós-translacionais do anticorpo, tal como mudar o númeroou posição de sítios de glicosilação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiõesdo anticorpo que são localizações preferenciais para mutagênese é chama-do "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham eWells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resí-duos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tal como arg,asp, his, Lys, e glu) e substituídos por um aminoácido negaticamente carre-gado (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interaçãodos aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácidos de-monstrando sensibilidade funcional às substituições então são refinadas in-troduzindo-se outras variantes nos sítios de substituição ou para eles. Assim,enquanto o sítio para introduzir uma variação de seqüência de aminoácido épredeterminado, a natureza da mutação, por si mesma, não necessita serpredeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutaçãoem um dado sítio, a mutagênese de varredura de alanina ou mutagênesealeatória é conduzida ao códon ou região alvo e as variantes de anticorposexpressas são examinadas para a atividade desejada.

As inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões determinal amino e/ou carboxila na faixa de comprimento de um resíduo a poli-peptídeos contendo centenas de resíduos ou mais, bem como inserções in-trassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos deinserções de terminais incluem anticorpo com resíduo metionila em terminalN ou o anticorpo fundido em um polipeptídeo citotóxico. Outras variantesinsercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão no terminal N ou C doanticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo queaumenta a meia-vida do soro do anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoá-cido. Essas variantes têm ao menos um resíduo de aminoácido na moléculade anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interes-se para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariaveis, masalterações de RE são também observadas. As substituições conservativassão mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferenciais". Setais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, entãomais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplificadas"na Tabela 1, ou como adicionalmente descrito abaixo em relação a classesde aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos examinados.Tabela 1

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As modificações substanciais nas propriedades biológicas doanticorpo são executadas selecionando-se substituições que diferem significativamente em seu efeito de manter (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformaçãoem lâmina ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, segunda ed., págs. 73-75, Worth Publi-shers, New York (1975)):

(1) não-polar: Ala (A), Vai (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F),Trp (W), Met (M)

(2) polar não carregada: Gly (G), Ser (S), Tr (T), Cys (C), Tir (Y),Asn (N), Gln (Q)

(3) ácida: Asp (D), Glu (E)

(4) básica: Lys (K), Arg (R), His(H).

Alternativamente, os resíduos naturalmene ocorrendo podem serdivididos em grupos baseados em propriedades comuns de cadeia lateral:

(1) Hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ne,

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Tr, Asn, Gln,

(3) ácida: Asp, Glu,

(4) básica: His, Lys, Arg,

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro,

(6) aromática: Trp, Tir, Phe.

As substituições não-conservativas exigirão trocar um membrode uma dessas classes para outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a con-formação apropriada do anticorpo pode também ser substituído, geralmentecom serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da molécula e impedirreticulação aberrante. De forma oposta, as ligações de cisteína podem seradicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmentequando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferencial de variante substitucionalenvolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anti-corpo pai (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente,a variante(s) resultante selecionada para desenvolvimento adicional terápropriedades biológicas aperfeiçoadas em relação ao anticorpo pai a partirdo qual elas são geradas. Uma forma conveniente para gerar tais variantessubstitucionais envolve maturação de afinidade usando exibição de fago.

Brevemente, os vários sítios da região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7)são mudados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveisem cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas em ummodelo monovalente de partículas de fagos filamentosos como fusões aoproduto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibi-das em fagos são então examinadas para sua atividade biológica (por e-xemplo, afinidade de ligação) como aqui descrita. De modo a identificar ossítios da região hipervariável candidatos para modificação, a mutagênese devarredura de alanina pode ser executada para identificar resíduos de regiãohipervariável contribuindo significativamente para ligação com antígeno. Al-ternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estruturaem cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contatoentre o anticorpo e HER2 humana. Tais resíduos de contato e resíduos vizi-nhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elabora-das aqui. Uma vez que tais variantes sejam geradas, o painel de variantes ésubmetido a exame como descrito aqui e os anticorpos com propriedadessuperiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados paradesenvolvimento adicional.

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o pa-drão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração entende-se apagaruma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicio-nar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou ligada a N ou liga-da a O. Por ligada a N, entende-se a ligação da porção de carboidrato à ca-deia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo as-paragina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácidoexceto prolina, são seqüências de reconhecimento para ligação enzimáticada porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presençade qualquer uma dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo criaum sítio de glicosilação potencial. Por glicosilação ligada a O entende-se aligação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, or xilose a umácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é conveniente-mente executada alterando-se a seqüência de aminoácido tal que ela conte-nha uma ou mais das seqüências de tripeptídeo descritas acima (para sítiosde glicosilação ligados a N). A alteração pode também ser feita pela adiçãoou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à equência doanticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a O).

Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidratoligado a essa pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estruturade carboidrato madura que carece de frutose ligada a uma região Fc do anti-corpo são descritos no Pedido de Patente U.S. N2 2003/0157108 A1, Presta,L. Vide também US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Osanticorpos com um N-acetilglicosamina (GlcNAc) bissecionado no carboidra-to ligado a uma região Fc do anticorpo são referidos em WO 03/011878, Je-an-Mairet e outros, e Patente U.S. N2 6.602.684, Umana e outros. Os anti-corpos com ao menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado auma região Fc do anticorpo são relatados em WO 97/30087, Patel e outros.

Vide também WO 98/58964 (Raju, S.) e WO 99/22764 (Raju, S.) conside-rando anticorpos com carboidrato alterado ligado à região Fc desse.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com rela-ção à função efetora, por exemplo, tal como para intensificar a citotoxicidademediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou complementar ci-totoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode seralcançado introduzindo-se uma ou mais substituições de aminoácido emuma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, os resí-duos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, desse modo permitin-do formação de ligação dissulfeto intercadeia nessa região. O anticorpo ho-modimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização aperfeiçoa-da e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC). Vide Caron e outros, J. Exp Med.176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Osanticorpos homodiméricos com atividade antitumor intensificada podem tam-bém ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais como descritoem Wolff e outros, Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente,um anticorpo pode ser elaborado, o qual tem regiões Fc duplas e pode, des-se modo, ter capacidades de lise de complemento e ADCC intensificadas.Vide Stevenson e outros, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função ADCCaperfeiçoada na presença de células efetoras humanas, onde os anticorposcompreendem substituições de aminoácidos na região Fc desses. Preferen-cialmente, o anticorpo com ADCC aperfeiçoada compreende substituiçõesnas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos).

Preferencialmente, a região Fc alterada é uma região Fc de lgG1 humanocompreendendo ou consistindo em substituições em uma, duas ou três des-sas posições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com substi-tuições que aumentam a ligação C1q e/ou CDC.

Os anticorpos com ligação C1q e/ou citotoxidade dependente decomplemento (CDC) são descritos em WO 99/51642, Patente US Ns6.194.551B1, Patente US N2 6.242.195B1, Patente US N2 6.528.624B1 ePatente US N2 6.538.124 (Idusogie e outros). Os anticorpos compreendemuma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de aminoácido270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc desse (numeraçãoEU de resíduos).

Para aumentar a meia-vida de soro do anticorpo, um pode incor-porar um epítopo de ligação com receptor de salvação no anticorpo (especi-almente um fragmento de anticorpo) como descrito na Patente US N25.739.277, por exemplo. Como usado aqui, o termo "epítopo de ligação comreceptor de salvação" refere-se a um epítopo da região Fc de uma moléculaIgG (por exemplo, Igd, lgG2, lgG3, ou lgG4) que é responsável por aumen-tar a meia-vida de soro in vivo da molécula IgG.

Os anticorpos com ligação aperfeiçoada com o receptor Fc neo-natal (FcRn), e meias-vidas aumentadas, são descritos em WO 00/42072(Presta, L.) e US 2005/0014934A1 (Hinton e outros). Esses anticorpos com-preendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesta que aperfei-çoam a ligação da região Fc com FcRn. Por exemplo, a região Fc pode tersubstituições em uma ou mais posições 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303,305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413,424, 428 ou 434 (numeração EU de resíduos). A variante de anticorpo com-preendendo a região Fc preferencial com ligação FcRn aperfeiçoada com-preende substituições de aminoácidos em uma, duas, ou três das posições307, 380 e 434 da região Fc desse (numeração EU de resíduos).

Os anticorpos elaborados com três ou mais (preferencialmentequatro) sítios de ligação com antígeno funcionais são também observados(Pedido US N2 US 2002/0004587 A1, Miller e outros).

As moléculas de ácido nucléico codificando variantes de se-quência de aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade demétodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estãolimitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de se-qüência de aminoácido naturalmente ocorrendo) ou preparação por mutagê-nese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada a sítio), mutagênesePCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ouuma versão não-variante do anticorpo.

(viii) Exame por anticorpos com as propriedades desejadas

As técnicas para gerar anticorpos foram descritas acima. Umpode adicionalmente selecionar anticorpos com certas características bioló-gicas, como desejado.

Para identificar um anticorpo que bloqueia ativação de ligante deum receptor HER, a capacidade do anticorpo bloquear a ligação de ligantede HER a células expressando o receptor HER (por exemplo, em conjuga-ção com outro receptor HER com o qual o receptor HER de interesse formauma HER (hetero-oligômero) pode ser determinada. Por exemplo, as célulasnaturalmente expressando, ou transfectadas para expressar receptores HERdo hetero-oligômero de HER podem ser incubadas com o anticorpo e entãoexpostas ao ligante HER etiquetado. A capacidade do anticorpo bloquear aligação do ligante com o receptor HER no hetero-oligômero de HER podeentão ser avaliada.

Por exemplo, a inibição de ligação HRG com as linhagens decélulas tumorasis de mama MCF7 por anticorpos contra HER2 pode ser e-xecutada usando culturas de MCF7 monocamada em gelo em um formatode placa com 24 cavidades essencialmente como descrito na Patente US N26.949.245. Os anticorpos monoclonais contra HER2 podem ser adicionadosa cada cavidade e incubados por 30 minutos. rHRGpM 177-224 etiquetado1251 (25 pm) pode então ser adicionado, e a incubação pode ser continuadapor 4 a 16 horas. As curvas de resposta a dose podem ser preparadas e umvalor IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma moda-lidade, o anticorpo que bloqueia a ativação do ligante de um receptor HERterá um IC50 para inibir ligação HRG com células MCF7 nesse ensaio deaproximadamente 50 nM ou menos, mais preferencialmente 10 nM ou me-nos. Quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como o segmentoFab, o IC50 para inibir ligação HRG a células MCF7 nesse ensaio pode, porexemplo, ser aproximadamente 100 nM ou menos, mais preferencialmente50 nM ou menos.

Alternativamente, ou adicionalmente, a capacidade de um anti-corpo para bloquear fosforilação de tirosina estimulada por ligante de HERde um receptor HER presente em um hetero-oligômero de HER pode seravaliada. Por exemplo, as células expressando de forma endógena os re-ceptores HER ou transfectadas para expressá-los podem ser incubadas como anticorpo e então ensaiadas para atividade de fosforilação de tirosina de-pendente de ligante de HER usando um antifosfotirosina monoclonal (que éopcionalmente conjugado com uma etiqueta detectável). O ensaio de ativa-ção de receptor de quinase descrito na Patente U.S. N- 5.766.863 está tam-bém disponível para determinar ativação de receptor HER e bloqueio dessaatividade por um anticorpo.

Em uma modalidade, um pode examinar por um anticorpo queinibe estimulação HRG de fosforilação de tirosina p180 em células MCF7essencialmente como descrito na Patente U.S. N2 6.949.245. Por exemplo,as células MCF7 podem ser laminadas em placas de 24 cavidades e anti-corpos monoclonais contra HER2 podem ser adicionados a cada cavidade eincubados por 30 minutos em temperatura ambiente, então rHRG(31177-244pode ser adicionado a cada cavidade em uma concentração final de 0,2 nM,e a incubação pode ser continuada por 8 minutos. Os meios podem ser aspi-rados a partir de cada cavidade, e as reações podem ser paradas pela adi-ção de 100 ^l de tampão de amostra de SDS (5% SDS, 25 mM DTT, e 25mM Tris-HCI, pH 6,8). Cada amostra (25 pil) pode ser submetida à eletrofo-rese em um gel de gradiante 4-12% (Novex) e então transferida de formaeletroforetica à membrana de difluoreto de polivinilideno. Immunoblots deAntifosfotirosina (a 1 (ig/ml) podem ser desenvolvidas, e a intensidade dabanda reativa predominante em Mr -180.000 pode ser quantificada por den-sitometria de refletância. O anticorpo selecionado preferencialmente signifi-cativamente inibirá estimulação HRG de fosforilação de tirosina p180 emaproximadamente 0-35% de controle nesse ensaio. Uma curva de respostaà curva para inibição de estimulação HRG de fosforilação de tirosina p180como determinado por densitometria de refletância pode ser preparada e umIC50 para o anticorpo de interesse pode ser calculado. Em uma modalidade,o anticorpo que bloqueia a ativação de ligante de um receptor HER terá umIC50 para inibir a estimulação HRG de fosforilação de tirosina p180 nesseensaio de aproximadamente 50 nM ou menos, mais preferencialmente 10nM ou menos. Quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal comoum fragmento Fab, o IC50 para inibir estimulação HRG de fosforilação detirosina p180 nesse ensaio pode, por exemplo, ser aproximadamente 100nM ou menos, mais preferencialmente 50 nM ou menos.

Um pode também avaliar os efeitos inibidores de crescimento doanticorpo em células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente como des-crito em Schaefer e outros, Oncogene 15:1385-1394 (1997). De acordo comesse ensaio, as células MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpomonoclonal contra HER2 (10 u.g/ml_) por 4 dias e manchadas com violetacristal. A incubação com um anticorpo contra HER2 pode mostrar um efeitoinibitório de crescimento nessa linhagem celular similar ao exibido pelo anti-corpo monoclonal 2C4. Em uma modalidade adicional, HRG exógeno nãoreverteria significativamente essa inibição. Preferencialmente, o anticorposerá capaz de inibir proliferação celular de células MDA-MB-175 a uma ex-tensão maior do que o anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente a umaextensão maior do que o anticorpo monoclonal 7F3), ambos na presença eausência de HRG exógeno.

Para identificar anticorpos contra HER2 inibidores de crecimen-to, um pode examinar por anticorpos que inibem o crescimento de célulascancerígenas que superexpressam HER2. Em uma modalidade, o anticorpoinibidor de crescimento de escolha é capaz de inibir o crescimento de célulasSK-BR-3 em cultura celular por aproximadamente 20-100% e preferencial-mente aproximadamente 50-100% em uma concentração de anticorpo deaproximadamente 0,5 a 30 ng/ml. Para identificar tais anticorpos, o ensaioSK-BR-3 descrito na Patente U.S. N2 5.677.171 pode ser executado. De a-cordo com esse ensaio, as células SK-BR-3 são cultivadas em uma mistura1:1 de F12 e o meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal,glutamina e estreptomicina + penicilina. As células SK-BR-3 são laminadasem 20.000 células em um prato de cultura de 35 mm (2 mls/35 mm prato).0,5 a 30 u.g/ml do anticorpo contra HER2 é adicionado por prato. Após seisdias, o número de células, comparado a células não tratadas são contadosusando um contador de células eletrônico COULTER™. Esses anticorposque inibem o crescimento das células SK-BR-3 em aproximadamente 20-100% ou aproximadamente 50-100% podem ser selecionados como anticor-pos inibidores de crescimento. Vide Patente U.S. N2 5.677.171 para ensaiospara exame para anticorpos inibidores de crescimento, tal como 4D5 e 3E8.

Com a finalidade de selecionar os anticorpos que induzem apop-tose, um ensaio de ligação de anexima usando células BT474 é disponível.

As células BT474 são cultivadas e semeadas em pratos como discutido noparágrafo anterior. O meio é então removido e substituído com meio frescosozinho ou meio contendo 10 jig/ml do anticorpo monoclonal. Seguindo umperíodo de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBSe desconectadas por tripsinização. As células são então centrifugadas, res-suspensas em um tampão de ligação Ca2+ e divididas em alíquotas em tu-bos como discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos entãorecebem anexina etiquetada (por exemplo, anexina V-FTIC) (1|ig/ml). Asamostras podem ser analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN™ esoftware FACSCONVERT™ CelIQuest (Becton Dickinson). Esses anticorposque induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina emrelação a controle são selecionados como anticorpos de indução de apopto-se. Em adição ao ensaio de ligação de anexina, o ensaio de coloração deDNA usando células BT474 está disponível. Com a finalidade de executaresse ensaio, as células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de inte-resse como descrito nos dois parágrafos anteriores são incubadas com9 ug/ml de HOECHST 33342™ por 2 horas em 37°C, então analisadas emum citômetro de fluxo EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) usando softwareMODFIT LT™ (Verity Software House). Os anticorpos que induzem uma mu-dança na porcentagem de células apoptóticas que é duas vezes ou mais (epreferencialmente 3 vezes ou mais) do que as células não tratadas (mais de100% de células apoptóticas) podem ser selecionados como anticorpos pró-apoptóticos usando esse ensaio. Vide WO 98/17797 para ensaios para e-xame de anticorpos que induzem apoptose, tal como 7C2 e 7F3.

Para examinar anticorpos que se ligam a um epítopo em ligaçãocom HER2 por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado derotina tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser executadopara avaliar se os blocos cruzados de anticorpo se ligando a um anticorpo,tal como 2C4 ou pertuzumabe, a HER2. Alternativamente, ou adicionalmen-te, o mapeamento de epítopo pode ser executado por métodos conhecidosna técnica e/ou um pode estudar a estrutura anticorpo-HER2 (Franklin e ou-tros, Câncer Ce//5:317-328 (2004)) para vide qual domínio(s) de HER2 es-tá/estão ligados pelo anticorpo.

(ix) Composições de Pertuzumabe

Em uma modalidade de uma composição de anticorpo contraHER2, a composição compreende uma mistura de um anticorpo pertuzuma-be de espécie principal e uma ou mais variantes desse. A modalidade prefe-rencial aqui de um anticorpo de espécie principal pertuzumabe é um com-preendendo as seqüências de aminoacido de cadeia leve e pesada variáveisnos ID de SEQ N2S 3 e 4, e mais preferencialmente compreendendo umaseqüência de aminoácido de cadeia leve de ID SEQ N- 7, e uma seqüênciade aminoácido de cadeia pesada de ID SEQ N2 8 (incluindo variantes desa-midadas e/ou oxidadas dessas seqüências). Em uma modaldidade, a com-posição compreende uma mistura do anticorpo pertuzumabe de espécieprincipal e uma variante de seqüência de aminoácido desse compreendendouma extensão guia de terminal amino. Preferencialmente, a extensão guiade terminal amino está em uma cadeia leve da variante de anticorpo (porexemplo, em uma ou duas cadeias leves da variante de anticorpo). O anti-corpo contra HER2 de espécie principal ou a variante de anticorpo pode serum anticorpo de comprimento completo ou fragmento de anticorpo (por e-xemplo, fragmentos Fab de F(ab=)2), mas preferencialmente ambos são an-ticorpos de comprimento completo. A variante de anticorpo aqui citada podecompreender uma extensão guia de terminal amino em qualquer uma oumais das cadeias leve ou pesada desse. Preferencialmente, a extensão guiade terminal amino está em uma ou duas cadeias leves do anticorpo. A ex-tensão guia de terminal amino preferencialmente compreende ou consisteem VHS. A presença da extensão guia de terminal amino na composiçãopode ser detectada por várias técnicas analíticas incluindo, mas não limita-das a, análise de seqüência de terminal N, ensaio para heterogeneidade decarga (por exemplo, cromatografia de troca de cátions ou eletroforese dezona capilar), espectrometria de massa, etc. A quantidade da variante deanticorpo na composição geralmente está na faixa de uma quantidade queconstitui o limite de detecção de qualquer ensaio (preferencialmente análisede seqüência de terminal N) usado para detectar a variante em uma quanti-dade menor do que a quantidade do anticorpo de espécie principal. Geral-mente, aproximadamente 20% ou menos (por exemplo, de aproximadamen-te 1% a aproximadamene 15%, por exemplo, de 5% a aproximadamente15%) das moléculas de anticorpo na composição compreende uma extensãoguia de terminal amino. Tais quantidades de porcentagem são preferencial-mente determinadas usando análise de seqüência de terminal N quantitativaou análise de troca de cátions (preferencialmente usando uma coluna detroca de cátions fraca, de alta resolução, tal como coluna de troca de cátionsPROPAC WCX-10™). À parte da variante de extensão guia de terminal ami-no, alterações de seqüência de aminoácidos adicionais do anticorpo de es-pécie principal e/ou variante são observadas, incluindo, mas não limitadas aum anticorpo compreendendo um resíduo de lisina de terminal C em uma ouambas as cadeias pesadas desse, uma variante de anticorpo desamidada,etc.

Além disso, o anticorpo de espécie principal ou variante podeadicionalmente compreender variações de glicosilação, exemplos não-limitantes dos quais incluem anticorpo compreendendo estrutura de oligos-sacarídeo G1 ou G2 anexada à região Fc dessa, anticorpo compreendendouma porção de carboidrato anexada a uma cadeia leve desse (por exemplo,uma ou duas porções de carboidrato, tal como glicose ou galactose, anexa-da a uma ou duas cadeias leves do anticorpo, por exemplo, anexada a umou mais resíduos de lisina), anticorpo compreendendo uma ou duas cadeiaspesadas não-glicosiladas, ou anticorpo compreendendo um oligossacarídeosialidated anexado a uma ou duas cadeias pesadas desse, etc.

A composição pode ser recuperada a partir de uma linhagemcelular geneticamente elaborada, por exemplo, uma linhagem celular de O-vário de Hamster Chinês (CHO) expressando o anticorpo contra HER2, oupode ser preparado por síntese de peptídeo.

(x) Composições de Trastuzumabe

A composição de trastuzumabe geralmente compreende umamistura de um anticorpo de espécie principal (compreendendo seqüênciasde cadeia leve e pesada de ID SEQ N2S 9 e 10, respectivamente), e formasvariantes desse, em variantes ácidas particulares (incluindo variantes desa-minadas). Preferencialmente, a quantidade de tais variantes ácidas na com-posição é menor do que aproximadamente 25%. Vide, Patente U.S. N26.339.142. Vide, também, Harris e outros, J. Chromatography, B 752:233-245 (2001) considerando formas de trastuzumabe dissolvido por cromatogra-fia por troca de cátions, incluindo Pico A (Asn30 desamidado em Asp emambas as cadeias leves), Pico B (Asn55 desamidado para isoAsp em umacadeia pesada), Pico 1 (Asn30 desamidado para Asp em uma cadeia leve),Pico 2 (Asn30 desamidado para Asp em uma cadeia leve, e Asp102 isomeri-zado para isoAsp em uma cadeia pesada), Pico 3 (forma de pico principal,ou anticorpo de espécie principal), Pico 4 (Asp102 isomerizado para isoAspem uma cadeia leve), e Pico C (succinimida Asp102 (Asu) em uma cadeiapesada). Tais formas variantes e composições são incluídas na invençãoaqui citada.

(xi) Imunoconjugados

A invenção também pertence a imunoconjugados compreenden-do um anticorpo conjugado para um agente citotóxico tal como um agentequimioterápico, toxina (por exemplo, uma toxina de pequena molécula ouuma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de plantaou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes desses), ou um isótopo ra-dioatico (isto é, um radioconjugado).

Os agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunocon-jugados foram descritos acima. Os conjugados de um anticorpo e uma oumais toxinas de pequena molécula, tais como calicheamicina, uma maitansi-na (Patente U.S. N2 5.208.020), um tricoteno, e CC1065 são também obser-vados aqui.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo é con-jugado para uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, aproxima-damente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula deanticorpo). A maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Meque pode ser reduzida a May-SH3 e reagida com anticorpo modificado (Cha-ri e outros, Câncer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunocon-jugado de anticorpo-maitansinóide.

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpoconjugado para uma ou mais moléculas de calicheamicina. A família de anti-bióticos calicheamicina é capaz de produzir quebras de DNA de filamentoduplo em concentrações sub-picomolares. Os análogos estruturais de cali-cheamicina que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, yV. ®2,a3\ N-acetil-Yi1, PSAG e 9\ (Hinman e outros, Câncer Research 53: 3336-3342(1993) e Lode e outros. Câncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Vide, tam-bém, Patente U.S. N2S 5.714.586, 5.712.374, 5.264.586, e 5.773.001 expres-samente incorporadas aqui por referência.

As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos dessas que po-dem ser usadas incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantesde toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa),cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina,proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca ame-ricana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, croti-na, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomi-cina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publica-do em 28 de Outubro de 1993.

A presente invenção adicionalmente observa um imunoconjuga-do formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica(por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA tal comouma desoxiribonuclease, DNase).

Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para aprodução de anticorpos contra HER2 radioconjugados. Exemplos incluemAt211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos deLu.

Conjugados do anticorpo e do agente citotóxico podem ser feitosusando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionaltal como N-succinimidiI-3-(2-piridiIditioI) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivadosbifuncionais de imidoésteres (tal como HCL de dimetil adipimidato), ésteresativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeí-do), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), de-rivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina),diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúorbis-ativo (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imuno-toxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e outros, Science238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminepenta-acético (MX-DTPA) rotulado Carbono-14 é um agente quelante exemplifica-do para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. Oligador pode ser um "ligador clivável" facilitando a liberação do fármaco cito-tóxico na célula. Por exemplo, um ligador ácido-lábil, ligador peptidase-sensível, ligador dimetil ou ligador contendo dissulfeto (Chari e outros, Can-cer Research 52: 127-131 (1992)) pode ser usado.

Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anti-corpo e o agente citotóxico pode ser obtida, por exemplo, por técnicas re-combinantes ou síntese de peptídeo.

Outros imunoconjugados são observados aqui. Por exemplo, oanticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não protei-náceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, oucopolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo também po-de ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicasde coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulasde hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas depoli-(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas de liberação de fárma-co coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microe-mulsões, nanoparticulas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais téc-nicas são descritas em fíemington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição,Oslo, A., Ed., (1980).

Os anticorpos descritos aqui podem ser também formulados co-mo imunolipossomas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparadospor métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein e outros,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985), Hwang e outros, Proc. Natl A-cad. Sei. USA, 77:4030 (1980), Patente U.S. N2S 4.485.045 e 4.544.545, eWO 97/38731 publicado em 23 de Outubro de 1997. Os lipossomas comtempo de circulação intensificado são descritos na Patente U.S. N25.013.556.

Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelométodo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeocompreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatiza-dos de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros detamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro deseja-do. Os fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser con-jugados para os lipossomas como descrito em Martin e outros, J. Biol.Chem. 257: 286-288 (1982) via uma reação de intercâmbio de dissulfeto. Umagente quimioterápico está opcionalmente contido no lipossoma. Vide Gabi-zon e outros, J. National Câncer /nsf.81 (19)1484 (1989).(xii) Docetaxel

O docetaxel é um agente antineoplásico que se liga à tubulinalivre e promove a montagem de tubulina em microtúbulos estáveis enquantosimultaneamente inibindo sua montagem. Isso leva à produção de feixes demicrotúbulos sem função normal e à estabilização de microtúbulos, bloque-ando as células na fase M do ciclo de célula e levando à morte celular.

III. Selecionando paciente para a terapia

A presente invenção considera o tratamento de paciente quetêm câncer de mama metástico de HER2 positivo e não recebeu anterior-mente quimioterapia ou terapia biológica (incluindo vacina ou inibidores detirosina quinase/HER aprovados ou investigacionais) para sua doença me-tástica. Os pacientes podem ter recebido tratamento de câncer de mamasistêmico no ajuste neo-adjuvante ou adjuvante, já que o paciente experi-mentou um intervalo livre da doença (DFI) de > 12 meses para completar otratamento sistêmico adjuvante (excluindo terapia hormonal) para diagnósti-co metástico. Os pacientes podem ter recebido trastuzumabe e/ou um taxe-no durante o tratamento adjuvante ou neo-adjuvante.

A detecção de superexpressão de proteína HER2 é importantepara a seleção de pacientes para o tratamento de acordo com a presenteinvenção. Vários ensaios comerciais aprovados pela FDA estão disponíveispara identificar pacientes com câncer de mama cujo câncer superexpressaHER2. Esses métodos incluem HERCEPTEST™ (Dako) e PATHWAY® HER-2/neu (ensaios de imunohistoquímica (IHC)) e PathVysion e HER2 FISHpharmDx™ (ensaios FISH). Os usuários deveriam se referir às bulas de kitsde ensaio específicos para informação na validação e desempenho de cadaensaio.Por exemplo, a superexpressão de HER2 pode ser analisada porIHC, por exemplo, usando HERCEPTEST® (Dako). Seções de tecido embu-tidas em parafina a partir de uma biópsia de tumor podem ser submetidas aoensaio IHC e concordadas com critérios de intensidade de coloração de pro-teína HER2 como segue:

Pontuação 0 - Nenhuma coloração é observada ou coloração demembrana é observada em menos de 10% de células de tumor.

Pontuação 1+ - uma fraca coloração de membrana dificilmenteperceptível é detectada em mais de 10% das células tumorais. As célulassão somente coloridas em parte de sua membrana.

Pontuação 2+ - uma coloração de fraca a moderada da mem-brana completa é observada em mais de 10% das células tumorais.

Pontuação 3+ - uma coloração de moderada a forte de membra-na completa é observada em mais de 10% das células tumorais.

Esses tumores com pontuações 0 ou 1+ para avaliação de su-perexpressão de HER2 podem ser caracterizados como não superexpressãode HER2, sendo que esses tumores com pontuações 2+ ou 3+ podem sercaracterizados como superexpressando HER2.

Os tumores superexpressando HER2 podem ser classificadospor pontuações imunohistoquímicas correspondentes ao número de cópiasde moléculas de HER2 expressas por célula, e podem ser determinados bi-oquimicamente:

0 = 0-10.000 cópias/célula,1+ = ao menos aproximadamente 200.000 cópias/célula,2+ = ao menos aproximadamente 500.000 cópias/célula,3+ = ao menos aproximadamente 2.000.000 cópias/célula.

A superexpressão de HER2 no nível 3+, que leva à ativação in-dependente de ligante da tirosina quinase (Hudziak e outros, Proc. A/aí/. A-cad. Sei. USA, 84:7159-7163 (1987)), ocorre em aproximadamente 30% doscânceres de mama, e nesses pacientes, a sobrevida livre de reincidência e asobrevida global são diminuídas (Slamon e outros, Science, 244:707-712(1989), Slamon e outros, Science, 235:177-182 (1987)).A presença de superexpressão de proteína HER2 e a amplifica-çao de gene estão altamente correlacionadas, portanto, alternativamente, ouadicionalmente, o uso de ensaios FISH para detectar a amplificaçao de genepode também ser empregado para seleção de pacientes apropriados paratratamento de acordo com a presente invenção. Os ensaios FISH tal como oINFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) ou PathVysion® (Vysis, Illinois)podem ser executados em tecido tumoral embutido em parafina fixadas porformalina para determinar a extensão (se houver alguma) da amplificaçao deHER2 no tumor.

Mais comumente, o estado HER2 positivo é confirmado usandotecido tumoral embutido em parafina arquivado, usando quaisquer dos mé-todos anteriores.

Preferencialmente, os pacientes HER2 positivo tendo uma pon-tuação IHC 3+ ou uma relação de amplificaçao FISH 2,0 são selecionadospara tratamento de acordo com a presente invenção.

IV. Formulações Farmacêuticas

As formulações farmacêuticas dos anticorpos contra HER2 usa-dos de acordo com a presente invenção são preparadas para armazena-mento misturando-se um anticorpo tendo o grau desejado de pureza comcarreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabili-zantes (Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed.(1980)), geralmente na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquo-sas. Os cristais de anticorpos são também observados (vide Pedido de Pa-tente U.S. 2002/0136719). Os carreadores, excipientes, ou estabilizantesaceitáveis não são tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações em-pregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos or-gânicos, antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina, conservantes(tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio,cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butil ou benzil álcool,alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol, e m-cresol), polipeptídeos de baixo peso molecular(menos de aproximadamente 10 resíduos), proteínas, tal como albumina desoro, gelatina, ou imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tais como polivinil-pirrolidona, aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina,arginina, ou lisina, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratosincluindo glicose, manose, ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA,açúcares tais como sacarose, manitol, trealose, ou sorbitol, contra-íons deformação de sal tal como sódio, complexos de metal (por exemplo, comple-xos de proteína Zn), e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™,PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). As formulações de anticorpo liofi-lizado são descritas em WO 97/04801, expressamente incorporadas aqui porreferência.

As formulações de anticorpo liofilizado são descritas nas Paten-tes U.S. N2S 6.267.958, 6.685.940 e 6.821.515, expressamente incorporadasaqui por referência. A formulação de HERCEPTIN® (trastuzumabe) preferen-cial é um pó liofilizado livre de conservantes amarelo pálido a branco estérilpara administração intravenosa (iv), compreendendo 440 mg de trastuzuma-be, 400 mg de a,a-trehalose dihidrato, 9,9 mg HCI de L-histidina, 6,4 mg deL-histidina, e 1,8 mg de polisorbato 20, USP. A reconstituição de 20 mL deágua bacteriostática para injeção (BWFI), contendo 1,1% de álcool benzílicocomo um conservante, produz uma solução de múltiplas doses contendo 21mg/mL de trastuzumabe, em pH de aproximadamente 6,0. Para detalhesadicionais, vide informação de prescrição de trastuzumabe.

A formulação de pertuzumabe preferencial para uso terapêuticocompreende 30 mg/mL de pertuzumabe em 20 mM de acetado de histidina,120 mM de sacarose, 0,02% de polissorbato 20, em pH 6,0. Uma formulaçãode pertuzumabe alternativa compreende 25 mg/mL de pertuzumabe, 10 mM detampão histidina-HCI, 240 mM de sacarose, 0,02% de polissorbato 20, pH 6,0.

A formulação do placebo usado nos exames clínicos descritosnos Exemplos é equivalente a pertuzumabe, sem o agente ativo.

A formulação aqui citada pode também conter mais do que umcomposto ativo se necessário para a indicação particular sendo tratada, pre-ferencialmente aqueles com atividades complementares que não afetam ad-versamente uma a outra. Vários fármacos que podem ser combinados com oinibidor de dimerizaçao de HER são descritos na Seção Método abaixo. Taismoléculas são adequadamente presentes em combinação em quantidadesque são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em mi-crocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilceluloseou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), res-pectivamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidais (por exemplo,lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas enanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Re-mington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).

As preparações de liberação sustentadas podem ser prepara-das. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anti-corpo, matrizes que estão na forma de artigos formados, por exemplo, pelí-culas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada in-cluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po-li(vinilálcool)), polilactidas (Patente U.S. Ns 3.773.919), copolímeros de ácidoL-glutâmico e v etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não-degradável, copo-límeros de ácido glicólico-ácido lático degradáveis tais como LUPRON DE-POT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido glicólico-ácido lático e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de-vem ser estéreis. Isso é prontamente executado por filtração através de membranas de filtração estéreis.

V. Métodos de Tratamento

Os métodos de tratamento da presente invenção compreendem,consistem essencialmente, ou consistem na administração de um anticorpocontra HER2 inbidor de crescimento, um anticorpo inibidor de dimerizaçaode HER2 e um taxeno. Em uma modalidade particular, os métodos de trata-mento da presente invenção compreendem, consistem essencialmente, ouconsistem na administração de uma ligação de anticorpo essencialmente aoepítopo 2C4, um anticorpo contra HER2 se ligando essencialmente ao epí-topo 4D5, e um taxeno para pacientes com câncer de mama metásticoHER2 positivo como acima definido, que não receberam anteriormente qui-mioterapia ou terapia biológica para sua doença metástica. Em uma modali-dade preferencial, o tratamento compreende, consiste essencialmente ouconsiste em tratamento com pertuzumabe + trastuzumabe + docetaxel. Osmétodos de tratamento aqui citados podem resultar em um benefício ciner-gístico, terapêutico, ou mais do que aditivo ao paciente.

A terapia de acordo com a presente invenção estende a sobrevi-da livre de progressão (PFS) e/ou a sobrevida global (OS) do tratamento dopaciente. Em uma modalidade, o tratamento estende PFS ou OS ao menosaproximadamente 5%, ou ao menos aproximadamente 10%, ou ao menosaproximadamente 15% ou ao menos aproximadamente 20%, ou ao menosaproximadamente 25% mais do que PFS ou OS alcançado por administra-ção de trastuzumabe + docetaxel ao paciente com câncer de mama metásti-co a ser tratado.

Os anticorpos se ligando essencialmente ao epítopo 2C4 especi-ficamente incluem, sem limitação, rhuMAb 2C4 (pertuzumabe). Os anticor-pos se ligando essencialmente ao epítopo 4D5 especificamente incluem,sem limitação, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4,huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (trastuzumabe).

Os anticorpos e taxeno, tal como pertuzumabe, trastuzumabe, edocetaxel são administrados a um paciente humano de acordo com métodosconhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como umbolus ou por infusão contínua por um período de tempo, por vias intramuscu-lar, intraperitoneal, intracérebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasi-novial, intratecal, oral, tópica e inalação. Para anticorpos, a administraçãointravenosa é preferencial.

De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, umadose fixa de inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumabe) deaproximadamente 840 mg (dose de carga) é administrada, seguida por umaou mais doses de aproximadamente 420 mg (dose(s) de manutenção) doanticorpo. As doses de manutenção são preferencialmente administradasaproximadamente a cada 3 semanas, por um total de ao menos duas doses,até doença progressiva clínica ou radiográfica, ou toxicidade não controlável,preferencialmente até 17 ou mais doses.

O anticorpo contra HER2 inibidor de crescimento preferencial-mente é trastuzumabe, que tipicamente é administrado como uma dose decarga intravenosa de aproximadamente 8 mg/kg, seguida pela administraçãode doses de 6 mg/kg em ciclos subsequentes. O trastuzumabe é tipicamenteadministrado a cada 3 semanas até que doença progressiva clínica ou radio-gráfica ou toxicidade não controlável, preferencialmente até 17 ou mais doses.

O taxeno preferencialmente é docetaxel, que é tipicamente ad-ministrado como uma dose IV de 75 mg/m2 a cada 3 semanas por ao menos6 ciclos até doença progressiva clínica ou radiográfica ou toxicidade nãocontrolável.

Os anticorpos contra HER2 preferencialmente são administradoscomo anticorpos nus. Entretanto, o inibidor administrado pode ser conjugadocom um agente citotóxico. Preferencialmente, o inibidor conjugado e/ou antí-geno ao qual ele está ligado está internalizado pela célula, resultando emeficácia terapêutica aumentada do conjugado em matar a célula cancerígenaa qual ele se liga. Em uma modalidade preferencial, o agente citotóxico dire-ciona ou interfere com o ácido nucléico na célula cancerígena. Exemplos detais agentes citotóxicos incluem maitansinóides, calicheamicinas, ribonucle-ases e endonucleases de DNA.

Em uma modalidade, o tratamento inicia a administração de per-tuzumabe, ou anticorpo inibidor de dimerização de HER2, seguido por admi-nistração de trastuzumabe ou outro anticorpo contra HER2 inibidor de cres-cimento e um taxeno, por exemplo, docetaxel, no dia seguinte. Em outramodalidade, o tratamento inicia com trastuzumabe, ou outro anticorpo inibi-dor de dimerização de HER2, e um taxeno, por exemplo, docetaxel. Em ain-da outra modalidade, todos os três agentes são administrados no mesmodia, em qualquer ordem.

As dosagens e protocolos de tratamento descritos aqui são parapropósitos de informação somente, e podem ser alterados por um médicoversado na técnica considerando os fatores específicos ao paciente e o cân-cer a ser tratado, tal como a idade, o peso, a condição física total, o históricode tratamento do paciente, a gravidade e o tipo do câncer de mama a sertratado, a extensão e natureza da metástase, e seus similares.

VI. Depósito de Materiais

As seguintes linhagens celulares de hibridoma foram deposita-das com a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Designação do Anticorpo ATCC N2 Data de Depósito

7C2 ATCC HB-12215 17 de Outubro de 1996

7F3 ATCC HB-12216 17 de Outubro de 1996

4D5 ATCC CRL 10463 24 de Maio de 1990

2C4 ATCC HB-12697 8 de Abril de 1999

Esses depósitos foram feitos sob os fornecimentos do Tratadode Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Patente e as Regulações sob esse tratado. Issoassegura a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos apartir da data de depósito. Os depósitos serão tornados disponíveis pelaATCC sob os termos do Tratado de Budapeste, e submetidos a um acordoentre Genentech, Inc. e ATCC, que assegura que todas as restrições impos-tas pelo depositor na disponibilidade ao público do material depositado serãoremovidas de forma irrevogável mediante a concessão da Patente U.S. per-tinente, assegura disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cul-tura do deposito ao público mediante emissão da Patente U.S. pertinente oumediante deixar aberta ao público de qualquer pedido de patente U.S. ouestrangeira, o que vier primeiro, e assegura disponibilidade da progênie aum determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas U.S. a ser intiulado aesse de acordo com 35 USC § 122 e as regras do Comissário de acordocom esse (incluindo 37 CFR §1.14 com referência particular a 886 OG 638).

Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos seguintesExemplos não-limitantes. As descrições de todas as citações na especifica-ção são expressamente incorporadas aqui por referência.Glossário de Abreviações:

FACT-B Avaliação Funcional de Terapia de Câncer de Mama

FFPE Embutido em parafina fixado em formalina

FISH Hibridização in situ por fluorescência

GGT Gama glutamil transferase

ICH Conferência Internacional de Harmonização

IHC Imunohistoquímica

ITT Intenção de tratar

IV Intravenoso

JVP Pressão Venosa Jugular

LDH Lactato desidrogenase

LLN Limite abaixo do normal

MBC Câncer de mama metástico

MRI imagem de ressonância magnética

NCI-CTC Critérios de Toxicidade Comum do Instituto Nacional do Câncer

NCI-CTCAE Critérios de Terminologia Comum do Instituto Nacional do Câncerpara Eventos Adversos

ORR Taxa de resposta objetiva

OS Sobrevida global

PD Doença Progressiva

PFS Sobrevida livre de progressão

PK Farmaco-cinético

RP resposta parcial

PS Estado de Desempenho

aRTT tempo de tromboplastina parcial ativada

RECIST Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos

SAE Evento adverso sério

SD Doença estável

TOI-PFB índice de Resultado de Tentativa - Função médica da mama

ULN Limite acima do normalExemplo 1

Estudo Clínico de Fase III para avaliar a eficácia e segurança dotratamento de Pertuzumabe + Trastuzumabe + Docetaxel de Câncer deMama Metástico Anteriormente Não Tratado

Objetivos Primários

O objetivo primário desse estudo é comparar a sobrevida livre deprogressão (PFS) baseado nas avaliações de tumor por uma instalação derevisão independente (IRF) entre paciente em dois braços de tratamento:

Placebo + trastuzumabe + docetaxel versus pertuzumabe + tras-tuzumabe + docetaxel.

Objetivos Secundários

- Comparar a sobrevida global (OS) entre os dois braços

- Comparar PFS entre os dois braços de tratamento com basena avaliação do investigador de progressão

- Comparar a taxa de resposta objetiva total entre os dois braçosde tratamento

- Comparar a duração da resposta objetiva entre os dois braçosde tratamento

- Comparar o perfil de segurança entre os dois braços de tratamento

- Comparar o tempo de progressão dos sintomas, se avaliadopelo índice de Resultado de Tentativa - Função médica da mama (TOI-PFB)

- Avaliar se biomarcadores de tecidos tumorais ou amostrassangüíneas (por exemplo, expressão de HER3, Fcy, e ECD/HER2 de soroe/ou concentrações de ligantes de HER) se correlacionam com os resultadosclínicos.

População Alvo

O estudo arrola 800 pacientes de aproximadamente sítios pelomundo. A população de estudo é pacientes com câncer de mama metásticoHER2 positivo (MBC) que não foram anteriormente tratados com quimiotera-pia e/ou terapia biológica para seu MBC. Pacientes com doença no EstágioIV em apresentação de doença inicial bem como aqueles que progrediramseguindo ou terapia neo-adjuvante ou adjuvante com um intervalo livre dedoença de ao menos 12 meses são incluídos, e eles podem ter recebidotrastuzumabe e/ou taxenos no ajuste adjuvante.

Fármaco Investigacional

O fármaco investigacional é pertuzumabe em combinação comtrastuzumabe e docetaxel, comparado à administração de placebo em com-binação com trastuzumabe e docetaxel.

Pertuzumabe/Placebo Cego

Pertuzumabe/Placebo são administrados como uma dose decarga IV de 840 mg para o Ciclo I, e 420 mg para os ciclos subsequentes.

Pertuzumabe/Placebo são administrados a cada 3 semanas até doença pro-gressiva clínica ou radiográfica avaliada por investigador, ou toxicidade in-controlável. A administração pode ser retardada para avaliar ou tratar even-tos adversos tais como eventos adversos cardíacos ou mielossupressão.

Nenhuma redução de dose é permitida.

Se o paciente perde uma dose de pertuzumabe/placebo para 1ciclo (isto é, os 2 tempos de administração seqüencial são 6 semanas oumais espaçadas), uma dose de recarga de pertuzumabe/placebo (840 mg)deveria ser dada. Se a recarga é exigida para um dado ciclo, as 2 terapiasde estudo deveriam ser dadas na mesma programação como Ciclo 1, isto é,pertuzumabe/placebo no Dia 1, e trastuzumabe e docetaxel no Dia 2. Dosesde pertuzumabe de manutenção subsequentes de 420 mg são então dadasa cada 3 semanas, iniciando 3 semanas mais tarde.

Como a formulação de pertuzumabe/placebo não contém umconservante, a vedação do frasco pode somente ser perfurada uma vez.

Qualquer solução restante deveria ser descartada.

O volume indicado de solução de pertuzumabe/placebo deveriaser retirado dos frascos e adicionado a uma IV bolsa de 250 cc de 0,9% deinjeção de cloreto de sódio.

Trastuzumabe

O trastuzumabe é administrado como uma IV dose de carga de8 mg/kg para o Ciclo 1, e 6 mg/kg para os ciclos subsequentes. A dose detrastuzumabe não necessita ser recalculada a menos que o peso corporaltenha mudado em mais de ±10 % da linha de base.

O trastuzumabe é administrado a cada 3 semanas até a doençaprogressiva clínica ou radiográfica avaliada por investigador, ou toxicidadeincontrolável. A administração pode ser retardada para avaliar ou tratar e-ventos adversos tais como eventos adversos cardíacos ou mielossupressão.

Nenhuma redução de dose é permitida.

Se o paciente perde uma dose de trastuzumabe para 1 ciclo (istoé, os 2 tempos de administração seqüenciais são 6 semanas ou mais espa-çados), uma dose de recarga de pertuzumabe/placebo (8 mg/kg) deveria serdada. Se a recarga é exigida para um dado ciclo, as 3 terapias de estudodeveriam ser dadas na mesma programação como Ciclo 1, isto é, pertuzu-mabe/placebo no Dia 1, e trastuzumabe e docetaxel no Dia 2. Doses de tras-tuzumabe de manutenção subsequentes de 6 mg/kg são então dadas a cada3 semanas, iniciando 3 semanas mais tarde.

Para administração, cada frasco de trastuzumabe de 150 mg éreconstituído com 7,2 ml_ de Água estéril para Injeção (SWFI). Essa formu-lação não contém um conservante e é adequada para único uso somente.

Cada frasco de trastuzumabe de 440 mg é reconstituído com 20mL ou de SWFI ou de Água Bacteriostática para Injeção (BWFI), USP, 1,1%de benzil álcool preservado, como fornecido. Se o trastuzumabe é reconsti-tuído com SWFI, ele é adequado para único uso somente.

A solução reconstituída contém 21 mg/mL de trastuzumabe, emum pH de aproximadamente 6,0, e o volume calculado apropriado será adi-cionado a 250 mL de Injeção de Cloreto de Sódio 0,9. O volume apropriadoé calculado (em mL) usando a seguinte fórmula:

Peso corporal (em kg) x Dose (8 mg/kg para carga ou 6 mg/kgpara manutenção) / 21 mg/mL (concentração de solução reconstituída).

Docetaxel

O docetaxel é administrado como uma IV dose de 75 mg/m2 acada 3 semanas por ao menos 6 ciclos até a doença progressiva clínica ouradiográfica avaliada por investigador, ou toxicidade incontrolável. Na discre-ção do médico que está tratando, a dose de docetaxel é aumentada a 100mg/m2 para pacientes que toleram ao menos 1 ciclo sem quaisquer das se-guintes toxicidades, neutropenia febril, neutropenia de grau 4 por >5 dias ouANC <100/fil_ por mais de 1 dia, ou outras toxicidades não hemtoloicais deGrau > 2 (NCI/CTCAE, Versão 3). Para detalhes adicionais, referir-se à bulado docetaxel.

Programação de Tratamento

Para o primeiro ciclo de tratamento, pertuzumabe/placego cegoé dado no Dia 1 por 60 minutos seguido por um período de observação de60 minutos. Trastuzumabe e docetaxel são administrados no Dia 2 do Ciclo Iusando as diretrizes para administração.

Se a administração de todos os três agentes é bem tolerada noCiclo 1, eles podem ser dados seqüencialmente no Dia 1 em ciclos subse-quentes depois desse. Se o sujeito não pode tolerar todos os três farmacosdados no mesmo dia, a programação de dosagem do Ciclo 1 (pertuzuma-be/placebo no Dia 1, trastuzumabe e docetaxel no Dia 2) é seguida.

Se um ou ambos os farmacos de estudo de anticorpo monoclo-nal necessitam ser permanentemente descontinuados ou são mantidos pormais de dois ciclos, o sujeito é tirado do tratamento de estudo. Entretanto, seo docetaxel necessita ser permanentemente descontinuado por razões rela-cionadas à toxicidade, o sujeito pode continuar com farmacos de estudo deanticorpo monoclonal.

Critérios de Inclusão

Critérios de Inclusão Específicos de Doença

1. Adenocarcinoma da mama histológica ou citologicamente con-firmado com doença metástico ou localmente recorrente, e candidato paraquimioterapia. Pacientes com lesão mensurável e não mensurável são ade-quados.

A doença localmente recorrente não precisa ser amenizável pararesseção com intenção curativa.

Nota: Pacientes com doença em Estágio IV novamente são ade-quados.2. MBC HER2 positivo (definido como IHC 3+ ou relação de am-plificação FISH > 2,0) confirmado por um laboratório central designado porresponsável. É fortemente recomendado que um bloco de tecido embutidoem parafina fixado por formalina (FFPE) do tumor primário seja enviado paraconfirmação no laboratório central de adequabilidade de HER2, entretanto,se isso não é possível, 25 fatias recentemente cortadas e descobridas serãoenviadas. (O tecido será subseqüentemente usado para avaliação de bio-marcadores).

Critérios de Inclusão Gerais:

3. Idade > 18 anos

4. Fração de Ejeção Ventricular Esquerda (LVEF) > 50% na linhade base (em 42 dias de randomização) como determinado ou por ECHO ouMUGA (ECHO é o método preferencial. Se o paciente é randomizado, omesmo método de avaliação de LVEF, ECHO ou MUGA, deve ser usado portodo o estudo, e à extensão possível, ser obtido na mesma instituição). Todosos valores de LVEF de pré-estudo e tratamento adjuvante pós-trastuzumabepara pacientes que receberam tal terapia adjuvante antes de alistamento noestudo serão coletados.

5. Estado de Desempenho de Grupo de Oncologia Cooperativodo Leste (ECOG)

(PS) 0 ou 1

6. Para mulheres com potencial para procriar, o acordo para u-sar uma forma eficaz de contracepção (paciente e/ou parceiro, por exemplo,esterilização cirúrgica, um método de barreira confiável) e para continuar seuuso pela duração do tratamento de estudo e pelos 6 meses depois da últimadose de tratamento de estudo.

7. Consentimento informado escrito assinado (aprovado peloQuadro de Revisão Institucional ou Comitê de Ética Independente) obtidoantes de qualquer procedimento de estudo.

Critérios de Exclusão Relacionados ao Câncer

1. Histórico de terapia anticâncer para MBC (com a exceção deum regime hormonal anterior para MBC). Isso inclui qualquer EGFR ou a-gentes anti-HER2 ou vacinas, quimioterapia citotóxica, ou mais de um regi-me hormonal anterior para MBC.

2. Histórico de inibidores de tirosina quinase/HER investigativosou aprovados para câncer de mama em qualquer configuração de tratamen-to, exceto trastuzumabe usado na configuração neo-adjuvante ou adjuvante.

3. Histórico de tratamento de câncer de mama sistêmico na con-figuração neo-adjuvante ou adjuvante com um intervalo livre de doença apartir do término do tratamento sistêmico (excluindo a terapia hormonal) paradiagnóstico metástico de < 12 meses.

4. Histórico de toxicidade hematológica de Grau persistente £ 2resultando de terapia adjuvante anterior.

5. Neuropatia periférica atual de NCI-CTCAE, Versão 3,0, Grau> 3 em randomização.

6. Histórico de outras malignidades nos últimos 5 anos, excetopelo carcinoma in situ do carcinoma de célula basal ou cérvix.

7. Evidência radiográfica ou clínica atual de metástases de sis-tema nervoso central (CNS). A varredura CT ou MRI do cérebro é obrigatória(nos 28 duas de randomização) em casos de suspeita clínica de metástasesno cérebro.

8. Histórico de exposição às seguintes doses cumulativas deantraciclinas:

- doxorubicina ou doxorubicina lipossômica > 360 mg/m2

- epirubicina > 720 mg/m2

- mitoxantrona > 120 mg/m2 e idarubicina > 90 mg/m2

- outros (por exemplo, doxorubicina lipossômica ou outra antra-ciclina > o equivalente de 360 mg/m2 de doxorubicina)

- se mais de 1 antraciclina foi usada, então a dose cumulativanão precisa exceder o equivalente de 360 mg/m2 de doxorubicina.

Função Hematológica, Bioquímica, e de Órgão

9. Hipertensão não controlada atual (sistólica > 150 mmHg e/oudiastólica > 100 mmHg) ou angina instável

10. Histórico de CHF de quaisquer critérios da New York HeartAssociation (NYHA), ou arritmia cardíaca séria exigindo tratamento (exce-ção, fibrilação atrial, taquicardia acimaventricular paroxística).

11. Histórico de infarto no miocárdio em 6 meses de randomização.

12. Histórico de declínio LVEF para abaixo de 50% durante oudepois de terapia anterior neo-adjuvante ou adjuvante de trastuzumabe.

13. Dispnéia atual no resto devido às complicações de malignidadeavançada, ou outras doenças que exigem terapia com oxigênio contínua.Critérios de Exclusão Gerais

14. Função de órgão inadequada, evidenciada pelos seguintesresultados de laboratório em 28 dias antes da randomização:

- Contagem de neutrófilos absoluta < 1.500 células/mm3

- Contagem de Plaquetas < 100.000 células/mm3

- Hemoglobina < 9 g/dL

- Bilirrubina total > limite acima do normal (ULN) (a menos que opaciente tenha documentado síndrome de Gilbert)

- AST (SGOT) e ALT (SGPT) > 2,5 x ULN

- AST (SGOT) ou ALT (SGPT) > 1,5 x ULN com fosfatase alcalinade soro > 2,5 x ULN (a menos que metástases de osso estejam presentes)

- creatinina de soro > 2,0 mg/dL ou 177 umol/L

- relação normalizada internacional (INR) e tempo de trombo-plastina parcial (aPTT) > 1,5 x ULN (a menos que em coagulação terapêutica)

15. Doença sistêmica não controlada grave atual (por exemplo,doença cardiovascular, pulmonar, ou metabólica clinicamente significativa,desordens de cicatrização da ferida, úlceras, ou fraturas nos ossos).

16. Procedimento cirúrgico principal ou lesão traumática signifi-cativa em 28 dias antes do início do tratamento de estudo ou antecipação danecessidade por cirurgia principal durante o curso do tratamento de estudo.

17. Mulheres grávidas ou lactantes.

18. Histórico de recebimento de qualquer tratamento investiga-cional nos 28 dias de randomização.

19. Infecção conhecida atual com HIV, HBVou HCV.

20. Recebimento de antibióticos IV para infecção nos 14 dias derandomizaçao.

21. Tratamento diário crônico atual com corticoesteróides (dosede 10 mg/dia de metilprednisolona equivalente) (excluindo esteróides inalados).

22. Hipersensibilidade conhecida a qualquer dos fármacos deestudo.

23. Avaliado pelo investigador a ser incapaz ou não desejandoobedecer às exigências do protocolo.

Avaliações

Eficácia

O ponto final primário é PFS baseado em avaliações IRF. PFS édefinido como o tempo a partir da randomizaçao à primeira doença progressivaradiográfica documentada, como determinado pelo IRF usando RECIST atual(Therasse e outros, 2000), ou morte por qualquer causa, o que ocorra primeiro.

A meningite carcinomatosa diagnosticada por avaliação citológi-ca de fluido espinhal cerebral também definirá doença progressiva. A foto-grafia médica também ser permitida para monitorar recorrências na paredetorácica de lesões subcutâneas.

A sobrevida global é o ponto final secundário chave, e é definidacomo o tempo a partir da data de randomizaçao até a data de morte porqualquer causa.

Segurança

- Medidas de resultados de segurança são como segue:

- Incidência de eventos de disfunção sistólica ventricular esquer-da sintomática (Insuficiência cardíaca congestiva (CHF)) e de fração de eje-ção ventricular esquerda assintomática

- medições LVEF durante o curso do estudo

- Incidência e gravidade de eventos adversos (AEs) e eventosadversos sérios (SAEs)

- Anormalidades de teste de laboratório

Farmacocinéticas/QT (Subestudo)

Um subconjunto de principais investigadores e pacientes partici-pa em um subestudo fármacocinético, de interação fármaco-fármaco, e deintervalo QTc como detalhado em um protocolo separado (vide Exemplo 2).A aprovação IRB/IEC e o Formulário de Consentimento Informado serão e-xigidos para participação no subestudo.

Qualidade de Vida/Fármacoeconomia

Avaliações de Resultados Relatados pelo paciente: Este estudousa a Avaliação Funcional da Terapia do Câncer de Mama (FACT-B), Ver-são 4. A FACT-B tem uma pontuação genérica de 28 itens para todos ospacientes, mais nove itens específicos para o câncer de mama. Os pacien-tes avaliam todos os itens em uma escala de cinco pontos na faixa de "demodo algum" a "muito". A FACT-B fornece classificações avaliatórias de do-mínio suplementar ou pesos de utilidade, assim fornecendo uma estimativada importância relativa de cada qualidade de domínio de vida para um paci-ente individual. A FACT-B fornece uma pontuação QoL total bem como in-formação sobre bem-estar físico, bem-estar social/família, bem-estar funcio-nal, e considerações específicas à doença. A FACT-B tem sido usada exten-sivamente e tem demonstrado confiabilidade, validade, e sensibilidade paramudar pelo tempo. Somente pacientes fêmeas nesse estudo serão questio-nados para completar o questionário FACT-B.

Avaliações Fármaco-econômicas

Uma avaliação econômica comparando vários custos entre osdois braços de tratamento é conduzida para avaliar hospitalizações enquan-to em tratamento de estudo. O número de visitas ao hospital, número de diasadmitidos, e tipo de visitas (sala de emergência versus atendimento hospita-lar) serão coletados. Essa informação será coletada a partir da informaçãoenviada em formulários de relatório de caso eletrônico AE e SAE (eCRFs).

Coleta de Amostra

Amostras de tumor de arquivo a partir do tumor primário (ou sí-tios metásticos, se o tumor primário não está disponível) são enviadas a par-tir de todos os sujeitos durante o exame e enviadas a um laboratório de pa-tologia central para avaliação de estado de HER2 via IHC e FISH para ade-quabilidade do estudo, bem como para a avaliação de biomarcadores detecido tumoral para predição de resposta a pertuzumabe/trastuzumabe. Asamostras de tecido tumoral são enviadas na forma de ou blocos de parafinaou fatias recentemente cortadas sem coloração contendo tecido tumoral fi-xado por formalina. Como os processos de oxidação não controlados nasfatias pode afetá-las, os blocos de tecido tumoral são preferenciais. Entre-tanto, se um bloco de tumor não está disponível, 25 fatias recentemente cor-tadas sem coloração de 4 \im são enviadas (o número de fatias enviadaspode ser reduzido dependendo das exigências regulatórias e de IEC de al-guns países). As fatias precisam ser enviadas ao laboratório central dentrode 2 dias de serem cortadas. A partir dos blocos de tumor enviados, no labo-ratório central, um máximo de 15 fatias serão cortadas e 2 núcleos serãoremovidos de modo a construir microarranjos de tecido (TMAs) para análiseposterior. A parte restante do bloco de tumor será retornada à instituição. Oteste de HER2 será priorizado e o tecido será subseqüentemente usado pa-ra avaliação de biomarcadores.

Para a avaliação de biomarcadores de tecido tumoral, uma vari-edade de metodologias de análise pode ser usada, incluindo, mas não limi-tada a, qRT-PCR, IHC, hibridização in situ, e perfil de expressão de gene.No fim do processo de coleta, as metodologias analíticas mais adequadasserão selecionadas e empregadas.

Construção de Microarranjo de Tecido (TMA)

Os blocos de tumor são também usados para configurar umTMA: um máximo de 2 núcleos de tecido de 1,5 mm cada um são obtidosusando um puncionador e então re-arranjados como um arranjo em um blo-co de cera. Um único arranjo pode incluir núcleos de tecido a partir de dife-rentes pacientes. Esse processo protege o tecido contra oxidação e permitearmazenamento em longo prazo e análise posterior.

Para análise posterior, as seções de tecido podem ser geradasusando o último microarranjo de tecido. Essa tecnologia permite uma análisede alto rendimento (muitas amostras de pacientes em uma fatia de vidro) debiomarcadores.

Extração de DNA/RNA

Os blocos de tumor enviados são usados para gerar seções emfatias de vidro para a extração de DNA e RNA de tumor para análise posteri-or. Essas fatias são preparadas em um laboratório central para assegurar amesma qualidade para todas as amostras e em estudos posteriores. Nota-seque como tumorigênese é um processo de múltiplas etapas ligado a eventossomáticos, a análise de DNA focará em mutações esporádicas especifica-mente encontradas em tecido tumoral, mas não mudanças herdadas encon-tradas no corpo todo. Para esse propósito, algumas seções contendo tumorserão obtidas do bloco e usadas para o processo de extração. As amostrasde tecido tumoral serão armazenadas na instalação do patrocinador do estudoou uma instalação de laboratório de contrato por até 7 anos depois do fecha-mento da base de dados, no tempo em que as amostras serão destruídas.

Amostras de Tecido Tumoral Metástico para Análise de Biomarcador (Opcional)

Se uma biópsia do tecido tumoral metástico do paciente estádisponível, ela é enviada a partir do consentimento do paciente em linha debase (depois que o paciente determinou como sendo adequado para o estu-do, mas antes da primeira administração de medicação de estudo) para aavaliação de biomarcadores de tecido tumoral para predição de resposta apertuzumabe/trastuzumabe.

Amostras de soro para Análise de ECD/HER2 e Liqantes de HER

Para avaliação de biomarcadores de soro que podem indicarresposta a pertuzumabe e trastuzumabe, amostras de soro (de uma retiradade sangue de aproximadamente 5 mL) são coletadas na linha de base (de-pois que o paciente foi determinado como sendo adequado para o estudo,mas antes da primeira administração de medicação de estudo) e durante oestudo na hora de cada avaliação de tumor. Avaliações de biomarcador comessas amostras incluirão níveis de ECD/HER2, ligantes de HER selecionados,e/ou marcadores sendo importantes para a sinalização de família HER ou res-posta a inibidores de HER e ativação de HER. Sobras de amostras podem serusadas para re-teste ou para desenvolver e validar testes de diagnósticosexistentes e/ou novos referidos a pertuzumabe ou trastuzumabe, ou ambos.

Amostra de Sangue Integral para Análise de Polimorfismo Fcy(Genotipagem Clínica)Uma amostra de sangue integral (3 ml_) para avaliação de poli-morfismo Fcv é coletada a partir de pacientes na linha de base (depois que opaciente foi determinando como sendo adequado para o estudo, mas antesda primeira administração de medicação de estudo). Uma análise de poli-morfismo de receptor Fcv é correlacionada com resultados clínicos de modoa adicionalmente avaliar o mecanismo de ação de ambos trastuzumabe epertuzumabe. A coleta de sangue obrigatória para análise polimórfica de-penderá das exigências regulatórias e/ou de IEC dos países individuais.Soro e Plasma para Pesquisa de Repositório de Amostra de Biomarcador(BSR) (Opcional)

Amostras de sangue para extração de soro e amostras de plas-ma (aproximadamente 5 ml_ por amostra) para descoberta de biomarcador,validação, e aplicação serão coletadas a partir do consentimento dos pacien-tes. Essas amostras são coletas na linha de base (depois que o paciente foidetermiando como sendo adequado para o estudo, mas antes da primeiraadministração de medicação de estudo) e durante o estudo a cada 9 sema-nas na hora da cada avaliação do tumor até doença progressiva determina-da por IRF. A PD determinada por IRF ocorre antes do pós-tratamento dasemana 18, amostras BSR continuarão a ser coletadas a cada 9 semanasaté o pós-tratamento da semana 18.

As amostras BSR coletadas serão armazenadas com a instala-ção do patrocinador do estudo ou uma instalação de laboratório de contratopor até 15 anos depois do fim do estudo associado (fechamento da base dedados), hora na qual as amostras serão destruídas. Essas amostras serãousadas somente para propósitos de pesquisa para identificar biomarcadoresdinâmicos que podem ser preditivos de resposta a tratamento com pertuzu-mabe e trastuzumabe (em termos de dose, segurança, tolerabilidade, e efi-cácia) e ajudarão a entender melhor a patogênese, curso e resultado docâncer de mama e doenças relacionadas e eventos adversos.

As amostras de sangue coletadas podem ser usadas para de-senvolver e validar ensaios de diagnóstico e permitir a geração de dados debiomarcadores estatisticamente significativos relacionados a doença de cân-cer de mama HER2 positivo ou resposta a pertuzumabe e/ou trastuzumabe.Desde que a identificação de novos marcadores que correlacionam com aatividade da doença e a eficácia ou segurança do tratamento está rapida-mente se desenvolvendo, a lista definitiva de análise resta ser determinada.

Duração do Estudo

Os pacientes permanecem na fase de tratamento do estudo atéa doença progressiva clínica ou radiográfica avaliada pelo investigador, toxi-cidade não controlável, ou término do estudo pelos patrocinadores. Os paci-entes não receberão pertuzumabe de rótulo aberto depois da descontinua-ção do tratamento de estudo. Depois da descontinuação do tratamento deestudo, avaliações de tumor continuarão até progressão avaliada por IRF.

Em adição, os pacientes serão seguidos pela sobrevida até a morte, perdade acompanhamento, retirada do consentimento, ou término do estudo pelospatrocinadores. As avaliações de tumor serão conduzidas a cada 9 semanasa partir da data de randomização. Retardos na administração do tratamentonão causarão impacto no intervalo de avaliações de tumor. Se uma avalia-ção de tumor precisa ser executada anteriormente/posteriormente, as avali-ações subsequentes serão conduzidas de acordo com a programação origi-nal de cada 9 semanas a partir da data de randomização. As avaliações detumor precisam ser conduzidas até a doença progressiva (PD) determinadapor IRF, mesmo se o tratamento foi descontinuado devido a um PD determi-nado por investigador ou toxicidade inaceitável.

Depois do término do tratamento de estudo, os pacientes conti-nuarão a ser seguidos pela sobrevida até a morte, perda de acompanha-mento, ou término do estudo.

Tamanho da Amostra

Um tamanho de amostra de 800 pacientes é necessário parafornecer 80% de energia para detectar um aperfeiçoamento de 33% em OS(HR = 0,75) no nível de significância de dois lados de 5%. Desde que ambasas análises PFS e OS são acionadas por evento, e para evitar período deespera prolongado depois da análise PFS final para dados OS para alcançaro número de eventos exigidos, a abordagem é projetada para arrolar o nú-mero suficiente de pacientes tal que aproximadamente 50% das mortes exi-gidas serão observadas na hora da análise PFS final.

Assume-se que o OS médio no braço de controle é 36 meses eOS é exponencialmente distribuído, uma análise interina em 50% das mortesexigidas totais, e uma função de gasto alfa Lan-DeMets com o limite de pa-rada 0'Brien-Fleming, aproximadamente 385 mortes serão exigidas. Em adi-ção, assume-se que a taxa real é aproximadamente 40 pacientes por mêsdepois de um período de rampa de 9 meses, 800 pacientes necessitarão seralistados e seguidos por 29,5 meses adicionais para obter 385 mortes. Operíodo de alistamento é estimado como sendo 26,5 meses, e 50% das mor-tes exigidas serão alcançadas em torno de 33,5 meses.

Assume-se que PFS é exponencialmente distribuído com umamédia de 10,5 meses no braço de controle, é estimado que 381 eventosPFS avaliados por investigador, correspondendo a aproximadamente 448eventos avaliados por investigador, terão ocorrido quando 50% das mortesexigidas (193 mortes) é alcançado. A análise primária de PFS será executa-da depois de 381 eventos avaliados por IRF terem ocorrido.

Métodos Estatísticos

Análises de Eficácia

As análises de PFS, OS, e tempo de progressão de sintoma se-rão baseadas na população com intenção de tratar (ITT), definido como pa-cientes que foram randomizados. Para resposta objetiva, somente pacientescom doença mensurável na linha debase serão incluídos na análise. Paraduração de resposta, somente os que respondem serão incluídos na análise.

Todas as análises de eficácia serão baseadas no braço de tratamento aoqual os pacientes foram randomizados.Análise de Variável Primária

O ponto final primário é PFS baseado em avaliações IRF. Parapacientes que descontinuam tratamento de estudo devido a razões além damorte ou progressão avaliada por IRF, cada esforço será feito para continuaravaliações de tumor até doença progressiva determinada por IRF ou mortedo paciente. Os dados para pacientes que não documentaram doença pro-gressiva ou que não morreram dentro das 18 semanas da última avaliaçãode tumor serão verificados na hora da última avaliação de tumor estimadapor IRF (ou, se nenhuma avaliação de tumor é executada depois da visita delinha de base, na hora da randomização mais 1 dia).

Para pacientes cuja progressão determinada por IRF não estádisponível, substituir morte a qualquer hora como um evento progressivopode artificialmente prolongar o tempo de PFS por causa de uma expectativade vida muito maior nessa população de pacientes comparada com PFS. Por-tanto, somente mortes dentro das 18 semanas das últimas avaliações de tumorserão incluídas como um evento na análise primária. Entretanto, uma análisede sensibilidade será executada incluindo todas as mortes como um evento.

O teste "log-rank", estratificado por estado de tratamento anterior(terapia adjuvante ou neo-adjuvante anterior e novamente) e região (Europa,América do Norte, América do Sul, e Ásia), será usado para comparar PFSentre os dois braços de tratamento. Os resultados do teste de log-rank nãoestratificados serão também fornecidos como uma análise de sensibilidade.

A abordagem de Kaplan-Meier será usada para estimar PFS média para ca-da braço de tratamento. O modelo de risco proporcional de Cox, estratificadopor estado e região de tratamento anterior, será usado para estimar o HRentre os dois braços de tratamento (isto é, a magnitude do efeito do trata-mento) e seu intervalo de confiança (Cl) de 95%.

As análises mencionadas anteriormente serão executadas emsubgrupos demográficos como apropriado. Por exemplo, a análise pode serexecutada em subgrupos de pacientes com base na origem racial já que háum tamanho de amostra razoável nos subgrupos de interesse.

Variáveis SecundáriasSobrevida Global. Os pacientes que vivos ou perderam o acom-panhamento na hora da análise serão censurados na última data viva co-nhecida. Os pacientes que sem informação pós-linha de base serão censu-rados na hora da randomização mais 1 dia. Os métodos de análie são osmesmos daqueles descritos para o ponto final primário. Para minimizar achance de uma estimativa OS induzida resultante do acompanhamento pro-gramado de sobrevida a cada 18 semanas, imediatamente antes dos dadoscortados para a análise PFS final e a análise OS final, os sítios investigativoscontatarão cada paciente que está vivo para confirmar o estado de sobrevidaatual. (O patrocinador do estudo notificará todos os investigadores do inter-valo de tempo dessa varredura de dados de sobrevida).

PFS baseado em avaliações do investigador. Os dados para ospacientes que não documentaram doença progressiva ou que não morreramnas 18 semanas da última avaliação de tumor serão censurados na hora daúltima avaliação de tumor pelo investigador (ou, se nenhuma avaliação detumor é executada depois da visita de linha de base, na hora da randomiza-ção mais 1 dia). Os métodos de análise são os mesmo daqueles descritospara o ponto final primário.

Resposta objetiva. Somente pacientes com doença mensurávelna linha de base serão incluídos na análise da resposta objetiva. Os pacien-tes sem uma avaliação de tumor de linha de base serão considerados comosendo os que não respondem. A análise da resposta objetiva será baseadanas avaliações IRF.

Uma estimativa da taxa de resposta objetiva e seu Cl de 95%será calculada para cada braço de tratamento. A diferença na taxa de res-posta objetiva será também fornecida com Cys de 95%. O teste x2 de Man-tel-Haenszel estratificado pelo estado e região de tratamento anterior seráusado para comparar a taxa de resposta objetiva entre os dois braços detratamento. Um resultado do teste exato de Fisher não ajustado será tam-bém fornecido como uma análise de sensibilidade.

Duração de resposta objetiva. Somente pacientes com uma res-posta objetiva serão incluídos na análise de duração de resposta objetiva. Ométodo para manipular a censura é o mesmo do descrito para o ponto finalprimário. A análise de duração da resposta objetiva será baseada nas avali-ações de IRF.

A duração média da resposta objetiva para cada braço será es-timada usando a abordagem de Kaplan-Meier. A relação de risco entre osdois braços também será estimada usando regressão de Cox.

Tempo para progressão de sintomas. Uma diminuição de cincopontos em TOI-PFB é considerad progressão de sintomas. Dados para paci-entes que não têm progressão de sintomas observada serão censurados naúltima data de avaliação TOI-PFB observada. Se a avaliação de TOI-PBF delinha de base não está disponível, ou se não há avaliação de TOI-PFB pós-linha de base executada, os dados serão censurados na hora da randomiza-ção mais 1 dia. Os métodos de análise são os mesmos daqueles descritospara o ponto final primário.

Análises de Biomarcador. Para avaliar o efeito de marcadoresmolecular nos resultados de eficácia, esses serão resumidos para todos ospacientes, e pelo braço de tratamento, em cada subgrupo determinado pelosmarcadores exploratórios. Os marcadores a serem considerados incluem oestado de receptores HER, ligantes de HER, Fc-y, antígenos dispersos (porexemplo, ECD/HER2), e outros marcadores relevantes para a rota da famíliaHER. Ênfase especial será colocada em marcadores que mostraram associ-ação com resultados clínicos em pacientes tratados com pertuzumabe emestudos anteriores:

Marcadores qRT-PCR: perfis de expressão de gene de tumorassociados com ativação de HER2.

Marcadores de soro de linha de base: níveis de ECD/HER2 eligantes de HER.

Resultados de eficácia considerados para essa análise incluirãoPFS, taxa de resposta objetiva, e OS. O PFS e a resposta objetiva serãobaseados nas avaliações de IRF.

As análises de biomarcador na hora do desenvolvimento do pro-tocolo não tomam a forma de hipóteses fixadas de teste envolvendo cortesespecíficos ou outras regras de predição pré-especificadas. É planejado pa-ra o Plano de Análise Estatística (a ser gerado antes de abrir os olhos dessaabordagem) usar toda evidência científica disponível a partir dos estudosindependentes ou publicações para especificar regras de predição testadas.

Em adição, esse plano especificará nos devidos detalhes como as regras depredição adaptadas aos dados serão derivadas (por exemplo, pesquisa decorte sistemático) e como a multiplicidade/indução inerente será corrigida demodo a impedir conclusões induzidas.

A diferença no benefício do tratamento através dos estados dobiomarcador definido por uma regra de predição adequada será avaliadatestando-se o efeito de interação de tratamento e o estado de predição u-sando regressão de Cox para PFS e OS, e usando-se regressão logísticapara taxa de resposta. Esses modelos envolvendo um termo de interaçãotambém serão usados para estimar os resultados de eficácia condicionais,condicionais ao estado de predição do biomarcador ou braço de tratamento,incluindo e excluindo os fatores de estratificação no modelo.

Covariaveis clínicas podem ser de valor prognóstico e poderiaminteragir com o benefício do tratamento e com o estado do biomarcador. Oscandidatos aqui são variáveis de linha de base de valor prognóstico descre-vendo propriedades de tumor e estado de morbidez ou valores de laboratóriocomuns. A predição do biomarcador será verificada envolvendo covariaveisclínicas relevantes, que poderiam ser parte da função de predição do bio-marcador, se necessário.

Análises de Segurança. A segurança de pertuzumabe em com-binação com tratuzumabe e quimioterapia será avaliada através de resumosde AEs, AEs específicos cardíacos, medições LVEF, e resultados de teste delaboratório. Os pacientes que recebem qualquer quantidade de tratamento deestudo serão incluídos em análises de segurança. Os resultados de segurançaserão resumidos pelo tratamento que os pacientes realmente recebem.Exemplo 2

Farmacocinética, interação fármaco-fármaco, e subestudo de intervalo QTc

Esse subestudo em dois objetivos principais: (1) descrever osefeitos potenciais de pertuzumabe no intervalo QTc, e (2) avaliar o perfil fár-macocinético de pertuzumabe na presença de trastuzumabe e docetaxel edescrever quaisquer interações fármaco-fármaco que devem ser observadasquando todos os três fármacos são co-administrados.

Prolongamento QTC

O prolongamento induzido por fármaco do intervalo QT/QT corri-gido (QTc) resultando em susceptibilidade aumentada à arritmia cardíaca éuma complicação reconhecida de muitos fármacos através de um amplo es-pectro terapêutico (Morissette e outros, Can J Cardiol 2005; 21:857-64). Oprolongamento do intervalo QT/QTc, que é usualmente assintomático, podeser manifestado por síncope resultante de arritmias cardíacas tais como tor-sades de pointes (TdP), arritmia ventricular, e morte cardíaca súbita (Mor-ganroth rnst Schering Res Found Workshop 2007; 59:171-84).

A medição de QT é feita por um eletrocardiograma (ECG) e éum substituto para a re-polarização ventricular. O intervalo QT é definidocomo o tempo a partir do início do complexo QRS ao fim da onda T. Como ointervalo QT é inversamente relacionado à taxa cardíaca, as seguintes fór-mulas são comumente usadas para corrigir o intervalo QT (Strevel e outros,J Clin Oncol 2007; 25:3362-71).

- Correção de Fridericia (QTcF): QTcF = QT/RR0,33- Correção de Bazett (QTcB): QTcB = QT/RR0,5

QTc é considerado prolongado quando ele é maior do que 450milisegundos (MS) de duração. O intervalo QT/QTc pode ser afetado pelalocalização da sonda do ECG, gênero, hora do dia, terapia com fármaco, oucondições congênitas. Vários fatores de predisposição podem influenciararritmia induzida por fármaco secundária para QT/QTc prolongado, incluindoinstabilidade de eletrólito, bradicardia, toxinas, doença cerebrovascular, ini-bição de citocromo p450, e inibição de p-glicoproteína (Kannankeril e Roden,Curr Opin Cardiol 2007; 22:39-43, Morissette e outros, 2005, acima).O mecanismo comum de prolongamento de intervalo QT/QTcinduzido por fármaco é o bloqueio direto dos canais de potássio específicos,codificados pelo gene relacionado a hERG éter-a-go-go humano, que regulamre-polarização cardíaca ou romper tráfico de proteína de canal hERG, ou am-bos. Os fármacos foram classificados por sua propensão para prolongar o in-tervalo QTc, a classificação fornecida na Tabela 2 é comumente usada (Woos-ley http//www.arizonacert.org (atualizada como de 1 de Março de 2006)). Atéagora, os fármacos conhecidos para bloquear canais de potássio são pe-quenas moléculas, tal como antiarrítmicos, alguns antibióticos, antieméticos,anti-histaminas, antipsicóticos, antidepressivos, bronquiodilatadores, e al-guns estimulantes do sistema nervoso central (CNS) (Morissette e outros,2005m acima, Woosley 2006, acima). O sítio de ligação para bloqueio decanal de potássio está localizado em um domínio intracelular, um sítio que édifícil para grandes moléculas (isto é, anticorpos monoclonais) acessarem.

As classes de agentes terapêuticos de oncologia molecularmen-te direcionados associados com efeitos no intervalo QT foram identificadas,incluindo inibidores de proteína farnesil transferase, arsênico, inibidores de qui-nase Scr/Abl, inibidores de tirosina quinase multidirecionados, inibidores de his-toria desacetilase, agentes de rompimento vascular, e inibidores de proteínaquinase C. Um mecanismo direto comum a esses agentes em associação comefeitos QT não foi descrito (Streval e outros, J Clin Oncol 2007; 25:3362-71).

Tabela 2

Classificação dos Fármacos por Propensão para Prolongar Intervalo QTc

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Pertuzumabe - Mecanismo de Ação e Experiência Não-Clínica

Como descrito anteriormente, pertuzumabe é um anticorpo mo-noclonal humanizado baseado em seqüências de estrutura (k) de lgG1 hu-mano e consiste em duas cadeias pesadas (449 resíduos) e duas cadeias leves (214 resíduos). Como trastuzumabe (Herceptin®), pertuzumabe é pro-duzido em células de ovário de hamster chinês (CHO) e é direcionado contraHER2. Entretanto, ele difere do trastuzumabe nas regiões de ligação com epítopo da cadeia leve (12 diferenças de aminoácidos) e cadeia pesada (29 diferenças de aminoácidos). Como um resultado, o pertuzumabe se liga aum epítopo diferente em HER2.

O pertuzumabe age bloqueando-se a associação de HER2 comoutros membros da família HER, incluindo HER1 (EGFR), HER3, e HER4. Como um resultado, ele inibe sinalização intracelular iniciada com liganteatravés de duas rotas de sinal principais, quinase MAP e quinase PI3. A inibicão dessas rotas de sinalização pode resultar em interrupção de crescimento e apoptose, respectivamente (Hanahan e Weinberg, Cell 2000;

100:57-70). Os dados não clínicos demonstraram que a superexpressão de HER2 não é exigida para a atividade antitumor de pertuzumabe.

Pró-arritmias secundárias a repolarização ventricular anormal eprolongamento de QT foram de interesse no desenvolvimento de fármacos.

Duas diretrizes da Conferência Internacional em Harmonização (ICH) parateste não clínico (S7B) e clínico (E14) foram recentemente desenvolvidas(Conferência Internacional em Harmonização de Exigências Técnicas paraRegistro de Farmacêuticos para Uso Humano 2005). Baseado nessas dire-trizes, o efeito de pertuzumabe em QTc em pacientes com câncer de mamaserá investigado nesse subestudo.

De modo a completamente caracterizar quaisquer efeitos poten-ciais de pertuzumabe no coração, pontos finais cardíacos adicionais foramincluídos em dois estudos de toxicologia de múltiplas doses não clínicas e-xecutados para suportar o desenvolvimento clínico de pertuzumabe. Em umestudo de toxicidade e tóxico-cinético intravenoso de 7 semanas em maca-cos cinomolgus com um período de recuperação de 4 semanas (estudo 00-377-1821), telemetria foi medida em dois animais por sexo nos grupos decontrole e de alta dose (150 mg/kg/dose) para coletar pontos finais eletro-cardiográficos. Em dois pontos no tempo antes da iniciação do tratamento, enos Dias 1 e 28, os animais telemedidos tinham pressão arterial sistólica,diastólica, média, batimento cardíaco, intervalo PR, QRS, QT, e dados ECGII. Quatro rastreamentos de 1 minuto foram coletados para cada animal de 2a 22 horas depois da dosagem e interpretados por um cardiologista veteriná-rio certificado. Em adição aos parâmetros químicos de soro de rotina avalia-dos, o soro foi também analisado para isozimas creatinina quinase e Tropo-nina T em Dias de Estudo 2/3 e 44/45 para todos os animais. Em um estudode toxicidade e tóxico-cinético intravenoso de 26 semanas com pertuzumabeem macacos cinomolgus com um período de recuperação de 8 semanas(Estudo 01-458-1821), ECG (sonda de superfície padrão) e medições depressão arterial foram registrados em todos os animais. Registros foram ob-tidos em dois pontos no tempo antes da iniciação de tratamento e uma vezdurante as semanas 4, 16 e 26 em animais anestesiados e foram interpreta-dos por um cardiologista veterinário certificado. Em adição aos parâmetrosquímicos de soro de rotina avaliados, o soro foi também analisado para Tro-ponina T na pré-dose do Dia 1 e nos Dias 114, 184 e 239 (recuperação) paratodos os animais. Os resultados a partir de ambos os estudos de toxicidadede múltiplas doses concluíram que não houve evidência de lesões cardíacascausadas por tratamento de pertuzumabe, como determinado por histopato-logia, ausência de aumentos em parâmetros químicos de soro relevantes(Troponina T e isozimas creatina quinase), e ECGs normais, pressões san-güíneas, e batimentos cardíacos.

Em exames clínicos como de Novembro de 2006, não houveassociação notada de um aumento de TdP em pacientes tratados com per-tuzumabe.

Farmacocinéticas de pertuzumabe

Sumário

Os resultados fármacocinéticos (PK) observados em estudos

anteriores com pertuzumabe não mostraram mudança em folga em doses de2,0 a 15,0 mg/kg ((140 mg - 1050 mg para um paciente de 70 kg). Um mo-delo de dois compartimentos adequadamente descreveu os dados de tempode concentração, com uma folga de soro sistêmica de aproximadamente0,24 L/dia e uma meia vida de terminal de aproximadamente 17 dias paraum paciente típico. Baseado nesses dados, um intervalo de dosagem de 3semanas é recomendado em estudos clínicos. Em estudos de Fase II, umadosagem de carga de 840 mg (seguido por 420 mg a cada 3 semanas), le-vou ao alcance das concentrações de regime permanente de rebaixo (Cmin)e de pico (Cmax) pelo segundo ciclo e alcançado um alvo PK de 20 ug/ml_(baseado nos modelos xenográficos de tumor pré-clínico). A modelagem PKde população de dados de estudos de Fase Ia e Fase II suporta o uso conti-nuado de dosagem fixa não baseada em peso em pacientes fêmeas. Nãohouve evidência de que o pertuzumabe causou impacto no PK de agentesquimioterápicos co-administrados (docetaxel e capecitabina em estudos deFase Ib e gentamicina em um estudo de Fase II).

Farmacocinética em Estudos de Único Agente

Em estudos de único agente de Fase II (Estudos TOC2689g eB016934), os dados de concentração-tempo mostram que a dose de cargade 840 mg (seguida por 420 mg a cada 3 semanas) resultou no alcance deCmin e Cmax de regime permanente pelo segundo ciclo, e também alcançouconcentrações alvo de pertuzumabe de soro > 20 ug/mL na maior parte dospacientes. Cmin e Cmax de soro médios para os dois primeiros ciclos detratamento em pacientes com câncer de mama ovariano e metástico (MBC)são apresentados na Tabela 3. A Figura 6 mostra os perfis de concentração-tempo para os primeiros 84 dias.

Tabela 3

Concentrações em Soro de Rebaixo e de Pico médias (±SD) no Fim do Pri-meiro e Segundo Ciclos de Tratamento (estudos TOC2689q e BQ16934)

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Os parâmetros PK foram estimados usando um modelo de doiscompartimentos (vide Tabela 4). A folga sistêmica média desses pacientes(0,225-0,285 L/dia), e o volume médio de distribuição do compartimentocentral (2,70 - 3,11 L; isto é, aproximadamente o volume de soro), foramsimilares àquelas observadas no estudo de Fase Ia (Estudo TOC2297g). Ameia vida inicial média e a meia vida terminal média estavam também dentrodas faixas observadas através de grupos de dose 2-15 mg/kg no estudo deFase Ia.Tabela 4

Estimativas3 de Parâmetros Fármacocinéticos de Pertuzumabe seguindoInfusão Intravenosa (Média ± SP)

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CL = folga sistêmica; Vc= = volume do compartimento central; Vss = volume de distribuição em regimepermanente; íi« initial = meia-vida de distribuição inicial; U12 terminal = meia-vida terminalaParâmetros Farmaco-Cinéticos estimados por análise posterior do modelo fármacocinético de populaçãode 2 compartimentos.

bFarmacocinética não executada para Estudo TOC2572g.

Farmacocinética em Estudos de Terapia de Combinação

As análises dos dados PK de estudos de Fase Ib de capecitabi-na (Estudo BO17003) e docetaxel (Estudo BO17021) indicam que pertuzu-mabe não altera o PK desses dois agentes citotóxicos. Em ambos os estu-dos, os parâmetros PK para pertuzumabe foram similares aos parâmetrosPK obtidos em estudos com pertuzumabe de único agente.

A análise PK preliminar a partir de um estudo de Fase li paraavaliar a eficácia de pertuzumabe em combinação com gentabina em paci-entes com câncer de ovário resistente à platina (Estudo TOC3258g) indicaque pertuzumabe não altera o PK de gentabina ou seu metabólito principal,dFdU. Em adição, as concentrações em soro de pertuzumabe foram simila-res às concentrações nos estudos de Fase II de único agente em câncer deovário e MBC (Estudos TOC2689g e B016934).Regime de Dose de Pertuzumabe

Um regime de dosagem de pertuzumabe administrado a cada 3semanas a pacientes em estudos de Fase II (Estudos TOC2689g eB016934) usando uma dose de carga de 840 mg fixa (Equivalente a 12mg/kg para um paciente de 70 kg) para Ciclo 1 de tratamento e uma dose demanutenção de 420 mg fixa (equivalente a 6 mg/kg para um paciente de 70kg) para subsequentes ciclos de tratamento resultou em Cm/n do soro deregime permanente de aproximadamente 60 |ig/mL pelo segundo ciclo detratamento. Em estudos xenográficos de resposta à dose não clínicos usan-do ratos pelados implantados com tumores de câncer de pulmão de célulasnão pequenas (NSCLC) e de câncer de mama (níveis de expressão deHER2 baixo e alto), > 80% de supressão de crescimento de tumor foi alcan-çada quando concentrações de rebaixo de regime permanente de pertuzu-mabe alcançaram 5-25 (ig/mL Assim, Cmin de regime permanente que fo-ram observados em pacientes nos estudos de Fase II são maiores do que asconcentrações mostradas como sendo eficazes em modelos de tumor ani-mal, e, portanto, esperadas como resultando em um efeito biológico.

Uma análise PK de população preliminar dos estudos de Fase Ia(Estudo TOC2297g) e de Fase lia (Estudos TOC2689g e B016934), com-preendendo um total de 153 pacientes (faixa de peso: 45,0 - 150,6 kg) e1458 concentrações-pontos no tempo, mostrou que a variabilidade da popu-lação de concentração de rebaixo em regime permanente e exposição foramsimilares à dose fixa, dosagem baseada na área de superfície do corpo, edosagem baseada no peso. Portanto, uma dose baseada na área de super-fície do corpo ou no peso não foi superior a uma dose fixa. Esses dados su-portam o uso continuado de uma dose fixa de pertuzumabe em pacientesfêmeas com MBC e câncer de ovário.

A dependência de folga de soro de pertuzumabe do peso corpo-ral para ambos pacientes fêmeas e machos será avaliada adicionalmenteusando todos os dados PK clínicos disponíveis a partir dos estudos com per-tuzumabe.Objetivos

Objetivos Farmacocinéticos

Os objetivos PK desse estudo são os seguintes:

- Caracterizar a farmacocinética de pertuzumabe em pacientescom MBC HER2 positivo, e comparar esses dados com dados PK de outrosestudos clínicos.

- Caracterizar o potencial de uma interação fármaco-fármaco depertuzumabe na farmacocinética de docetaxel (na presença de trastuzuma-be), e na farmacocinética de trastuzumabe (na presença de docetaxel).

Objetivos de Eletrocardiograma

Os objetivos ECG são exploratórios e podem incluir o seguinte:

- Descrever o efeito de pertuzumabe na mudança de linha debase no intervalo QTc como calculado usando correção de Fridericia (QTcF).

- Descrever o efeito de pertuzumabe na mudança de linha debase no intervalo QTc como calculado usando correção de Bazett (QTcB).

- Descrever a proporção de pacientes com prolongamento deintervalo QTc e mudança de linha de base no intervalo QTc, calculado usan-do ambas as correções de Fridericia e de Bazett.

- Descrever o efeito de pertuzumabe nos seguintes parâmetrosECG: batimento cardíaco, intervalo QT, intervalo PR, e duração QRS.

Projeto de Estudo

Descrição do Estudo

Esse é um estudo suplementar ao Estudo TOC4129g/WO20698que é projetado para avaliar o efeito de pertuzumabe no intervalo QTc, adi-cionalmente avaliar a farmacocinética de pertuzumabe, e caracterizar a inte-ração fármaco-fármaco de pertuzumabe em farmacocinética de docetaxel(na presença de trastuzumabe), e na farmacocinética de trastuzumabe (napresença de docetaxel).

Um sub-conjunto de sítios investigativos participando no EstudoTOC4129g/WO20698 participará nesse subestudo. Os pacientes nessessítios que consentiram em participar e foram determinados como sendo ade-quados para alistamento no Estudo TOC4129g/WO20698 serão convidados aparticipar nesse subestudo. A participação nesse subestudo é opcional, por-tanto, o consentimento informado para esse subestudo será obtido separa-damente do consentimento para participar do Estudo TOC4129g/WO20698.A recusa em participar nesse subestudo não afetará a adequabilidade dopaciente para o Estudo TOC4129g/WO20698. Cinqüenta pacientes adequa-dos (25 por braço de tratamento) serão alistados para esse subestudo.

Cada paciente alistado receberá tratamento como especificadoem TOC4129g/WO20698. O Dia 1 de TOC4129g/WO20698 corresponderáao Dia 1 desse subestudo.

Todos os pacientes participando desse subestudo terão alfa-1-glicoproteína ácida testada na linha de base por um laboratório local, emadição a testes de hematologia padrão e de química de soro no EstudoTOC4129g/WO20698.

Medições de ECG de 12 fios triplicadas serão obtidas durante operíodo de linha de base de pré-tratamento do Dia -7 ao Dia -1 (isto é, nos 7dias anteriores ao Dia 1 do Ciclo 1), no Dia 1 do Ciclo 1, no Dia 3 do Ciclo 1,coincidentes com amostra PK de docetaxel de 23 horas, e no Dia 1 do Ciclo3 (correspondendo a Cmin e Cmax em regime permanente de pertuzuma-be/placebo). No Dia 1 do Ciclo 1 e do Ciclo 3, as medições ECG de 12 fiostriplicadas serão obtidas nos seguintes pontos no tempo: -30 e -15 minutospré-infusão de pertuzumabe/placebo (qualquer pré-medicação que é exigidaantes da infusão de pertuzumabe/placebo deve ser dada entre esses doispontos no tempo pré-dose), imediatamente pós-infusão de pertuzuma-be/placebo, e 60 - 75 minutos pós-infusão de pertuzumabe/placebo. Os re-sultados de ECG serão enviados a um laboratório de cardiologia central paraa determinação do intervalo QT/QTc, que será usado como os dados paraesse subestudo.

Para minimizar as variações devido aos ritmos circadianos, asinfusões de pertuzumabe/placebo de Ciclo 1 e Ciclo 3 deveriam ser adminis-tradas na mesma hora do dia, e as leituras de ECG de linha de base (Dia -7a Dia -1) precisam ser obtidas na mesma hora correspondente do dia comoas medições ECG de Ciclo 1 e de Ciclo 3. A gravidade do prolongamento deQTc será graduada de acordo com os Critérios de Toxicidade Comuns doInstituto Nacional do Câncer para Eventos Adversos (NCI-CTCAE), Versão3,0. Um algoritmo de tratamento é fornecido para guiar as decisões de tra-tamento de estudo com base no intervalo QT/QTc observado em cada pontono tempo. Se a qualquer hora durante esse subestudo, o intervalo QTc ex-ceder 500 ms ou um alto grau de artefato estiver presente no ECG, a consul-ta cardíaca com o laboratório central de ECG está disponível.

Amostras sangüíneas para avaliação PK de pertuzumabe serãoretiradas antes e depois das infusões de pertuzumabe/placebo nos Ciclos 1,3, 6, 9, 12, 15, 18 com uma amostra adicional retirada na Visita de Desconti-nuação de Tratamento (28 - 42 dias depois da última dose do tratamento deestudo). Nos ciclos 1 e 3, as amostras PK pós-pertuzumabe serão retiradas60 - 75 minutos depois do fim da infusão de pertuzumabe/placebo para cor-responder aos ECGs executados nesses dias.

As amostras sangüíneas para avaliação PK de trastuzumabeserão coletadas nos Ciclos 1 e 3, antes e depois das infusões de trastuzumabe.

As amostras sangüíneas para avaliação PK de docetaxel serãocoletadas no Ciclo 1 nos pontos no tempo seguintes à iniciação de infusãode docetaxel (Ponto no tempo 0): 0,5 hora (durante a infusão), 1,0 hora (nofim da infusão, EOI), 1,25 horas (15 minutos depois da EOI), 2 horas (1 horadepois da EOI), 4 horas (3 horas depois da EOI), 6 horas (5 horas depois daEOI), 8 horas (7 horas depois da EOI), e 24 horas (Dia 3 do Ciclo 1, 23 horasdepois da EOI).

Raciocínio para Projeto de Estudo

Raciocínio para Projeto de Estudo de QTc

O estudo avaliará o efeito de pertuzumabe no intervalo QTc empacientes com MBC HER2 positivo. Normalmente, um estudo QTc completoé executado em voluntários saudáveis quando possível. Como o QTc é ava-liado em uma população com câncer com múltiplos fatores de confusão (do-ença de linha de base, medicações de linha de base, incluindo antieméticos,antibióticos, e outras medicações de cuidado assistente), esse subestudo foiprojetado para descrever a mudança no intervalo QTc a partir da linha debase ao estado permanente em pacientes de controle com placebo e trata-dos com pertuzumabe. Se os paciente exigem antieméticos ou outras pré-medicações antes da infusão de pertuzumabe/placebo, eles precisam serdados entre as duas pré-doses, medições de ECG em uma tentativa de con-trolar os efeitos da medicação concomitante no intervalo QT/QTc. O guiaICH recomenda que os estudos devam caracterizar o efeito de um fármacono QT/QTc e executar gravações de ECG nos pontos do tempo em torno deCmax.

Como determinado no guia E14 de ICH, a correção de Bazettgeralmente sobre-corrige em taxas cardíacas elevas e subcorrige em taxascardíacas abaixo de 60 batimentos por minuto (bpm). A correção de Frideri-cia foi escolhida como a correção primária porque ele leva em conta o efeitode taxas cardíacas alteradas no intervalo QT.

As amostras PK de pertuzumabe serão retiradas na hora dasleituras de ECG do Ciclo 1 do Ciclo 3 quando as concentrações terapêuticasem soro de pertuzumabe são esperadas para serem alcançadas. A exposi-ção a pertuzumabe estará correlacionada a QTc. O Dia 1 do Ciclo 3 (assu-mindo ciclos de 21 dias) foi escolhido para medição de QTc em concentra-ção de regime permanente com base nos estudos de Fase II, durante o qualuma dose de carga de 840 mg (seguida por 420 mg a cada 3 semanas) re-sultou no alcance de Cmin e Cmax em regime permanente pelo segundociclo. Portanto, a maior parte da população deveria estar em estado perma-nente pelo Ciclo 3.

Embora um fármaco de comparação de controle positivo (porexemplo, moxifloxacina) seja recomendado por diretrizes ICH para validar asensibilidade do ensaio, um fármaco de controle positivo não será adminis-trado a pacientes nesse subestudo à medida que é sentido que o uso deuma medicação de controle positivo não seria ético em uma população depacientes com câncer metástico. Ademais, os pacientes têm variabilidade delinha de base secundáia para medicações já sendo administradas.

Por recomendações ICH, taxas de eventos adversos selecionados, se ob-servados (TdP, morte súbita, taquicardia ventricular, fibrilação e palpitaçãoventricular, síncope, e ataques) serão comparadas entre os pacientes decontrole e os tratados com pertuzumabe, como parte de dados coletadospara Estudo TOC4129g/WO20698. Adicionalmente, a incidência de prolon-gamento de intervalo QTc e a mudança de linha de base no intervalo QTcserão resumidas.

Raciocínio para Amostragem Farmacocinética

O esquema de amostragem proposto para avaliações de con-centração de pertuzumabe nesse subestudo deveria permitir a caracteriza-ção adequada de farmacocinéticas de pertuzumabe. Os resultados de con-centração de pertuzumabe serão comparados com os dados disponíveis deoutros estudos clínicos de pertuzumabe. Em adição, os dados de concentra-ção de pertuzumabe serão usados para modelagem PK de população paragerar estimativas de parâmetro PK. Esses dados podem também contribuirpara uma futura análise PK de população para investigar o efeito de covariá-veis fisiológicas e relacionadas à doença em parâmetros PK.

O estudo TOC4129g/WO20698 propõe combinar pertuzumabecom trastuzumabe e docetaxel. Com base em mecanismos de folga parapertuzumabe, não há expectativa de que pertuzumabe alterará a farmacoci-nética do docetaxel. Entretanto, as concentrações de docetaxel serão medi-das para avaliar uma interação potencial relacionada a PK entre docetaxel epertuzumabe (na presença de trastuzumabe). Em adição, as concentraçõesde trastuzumabe serão medidas para avaliar uma interação potencial relacio-nada a PK entre trastuzumabe e pertuzumabe (na presença de docetaxel).

A farmacocinética na faixa de dose não será executada, e uma doseacima-terapêutica não será administrada no Estudo TOC4129g/WO20698,Medidas de Resultado

Medidas de Resultado Farmacocinético: as medidas de resulta-do PK são as seguintes:

- Concentrações em soro de pertuzumabe mínima e máxima ob-servadas (Cmin e Cmax), e estimativas de parâmetro PK (CL, AUC, Vd, ty2).

- Concentrações em soro de trastuzumabe mínima e máxima(Cmin 6 Cmax)-

- Área sob a curva (AUC) para concentrações em plasma de do-cetaxel.

Medidas de Resultado de Eletrocardiograma: as medidas de re-sultado de ECG são as seguintes:

- QTcF corrigido em placebo ajustado por linha de base compa-rado no tempo.

- QTcB corrigido em placebo ajustado por linha de base compa-rado no tempo.

- Proporção de pacientes em cada ponto no tempo cujas grava-ções de ECG alcançam os seguintes critérios:

Nova incidência de prolongamento de intervalo QTc abasoluto(com base na correção de Fridericia) de > 450 ms, > 470 ms, e > 500 ms.

As seguintes mudanças a partir da linha de base no intervaloQTc (com base na correção de Fridericia): Aumentos em QTc > 30 ms, au-mentos em QTc > 60 ms.

Mudança a partir da linha de base na taxa cardíaca de > 25%,resultante em uma taxa cardíaca final < 50 batidas por minuto (bpm) ou >120 bpm.

Nova incidência de ondas U anormaisNova incidência de ondas T anormaisNova incidência de morfologia ECG anormal

- Diferenças corrigidas em placebo ajustadas pela linha de basecomparadas no tempo nos seguintes parâmetros ECG: taxa cardíaca, inter-valo QT, intervalo PR, e duração QRS.

Plano de Segurança

Mudanças de ECG clinicamente significativas detectadas duran-te esse subestudo serão relatadas e gerenciadas de acordo com as exigên-cias de relatório e de monitoramento de segurança do EstudoTOC4129g/WO20698. O grau de prolongamento QTc será graduado de a-cordo com o NCI-CTCAE, Versão 3,0. O algoritmo de tratamento é fornecidopara guiar as decisões do tratamento em estudo no evento de prolongamen-to de QT/QTc durante esse estudo. Um laboratório central de ECG estarádisponível para avaliar quaisquer casos de prolongamento de QT/QTc.

Grupo de Controle

Como o Estudo TOC4129g/WO20698 é um estudo controladocom placebo, randomizado e duplo-cego, o grupo de controle consistirá empacientes randomizados para receber placebo ao invés de pertuzumabe.Minimização de Indução

Para propósitos do estudo principal, os procedimentos abertosserão executados de acordo com o protocolo TOC4129g/WO20698. Paraesse subestudo, o tratamento do paciente (pertuzumabe versus controle)será determinado pela análise de amostras de soro PK para a presença ouausência de pertuzumabe, portanto, para manter o estudo principal cego, aequipe patrocinadora envolvida na análise de amostras PK de pertuzumabee análise desse subestudo não será envolvida com quaisquer dos aspectosoperacionais ou de análise do Estudo TOC4129g/WO20698. Toda equipe deestudo envolvida no estudo principal TOC4129g/WO20698 permanecerácega (por exemplo, equipe do sítio, investigadores, pacientes, estatísticos,etc).

OS leitores de ECG centralizados estarão cegos ao tratamentodo paciente e ao ponto no tempo do ECG.

Pacientes

Seleção de Paciente

Os pacientes que consentiram em participar no Estudo TOC4129g/WO20698 em um subconjunto de sítios investigativos serão adequados paraalistamento nesse subestudo.

Critérios para Inclusão: os pacientes precisam alcançar os se-guintes critérios para serem adequados para a entrada no subestudo:

- Alistamento no Estudo TOC4129g/WO20698.

- Formulário de Consentimento Informado Assinado para essesubestudo.

Critérios de Exclusão: os pacientes que alcançaram quaisquerdos seguintes critérios serão excluídos da entrada no subestudo:- Marca-passo implantável ou desfribilador cardioversor implan-tável automático (AICD).

- Síndrome Congênita de QT longo.

- Histórico familiar de síndromo de QT longo.

- QTc de linha de base > 450 ms como avaliado localmente emcada sítio de estudo.

- Pacientes atualmente exigindo uso regular de medicações quesão conhecidas para prolongar intervalo QTc ou induzir TdP (vide Apêndice B).

- Bradicardia clinicamente significativa (definida como < 50 bpm)na linha de base.

- Evidência de bloco cardíaco.

- Hipocalemia, hipomagnesemia, e hipocalcemia que não podemser corrigidas com suplemento de eletrólito.

Método de tipo de Tratamento e mascaramento.

O tipo de tratamento será de acordo com o protocolo descrito no

Exemplo 1.

A abertura do tratamento de estudo estará de acordo com osprocedimentos especificados no Exemplo 1. Os leitores de ECG centraliza-dos permanecerão cegos ao tratamento de paciente e pontos no tempo doECG.

Tratamento em Estudo

O tratamento em estudo será especificado no Exemplo 1.

Terapias Concomitantes e Excluídas

O julgamento clínico deveria ser aplicado quando determinandoopções de tratamento e tratamento de cuidado assistente para cada pacien-te.

Outras medicações concomitantes e excluídas serão direciona-das no Exemplo 1.

Avaliações de Estudo

As infusões de tratamento em estudo, as medições de ECG, eretiradas de sangue deveriam ser consistentemente administradas, grava-das, e coletadas na mesma hora do dia, entre 9 h - 12 h e > 1 hora pós-refeição, de modo a minimizar as variações devido a ritmos cicardianos.Avaliações de Varredura e Pré-Tratamento

O consentimento informado precisa ser obtido antes das avalia-ções específicas de estudo serem executadas. O processo de consentimen-to informado deveria ser documentado no gráfico médico do paciente.

As seguintes avaliações de subestudo e procedimentos serãoexecutados durante o período de linha de base do estudo descrito no Exemplo 1:

- Consentimento informado escrito.

- Revisão de critérios de inclusão e exclusão.

- Química de soro para avaliar valores de eletrolito.

- Coleta de amostra de sangue para teste de alfa-1-glicoproteínaácida e análise por um laboratório local, como uma adoção ao teste de he-matologia e química padrão no estudo descrito no Exemplo 1.

Medições de ECG

Os níveis de potássio, magnésio e cálcio em soro precisam estardentro dos limites normais antes de executar ECGs, como determinado porteste de laboratório local executado como especificado no protocolo principalTOC4129gAA/O20698. Os pacientes podem receber suplemento de eletrolitopor prática padrão institucional para levar os níveis de eletrolito dentro delimites normais antes de executar os ECGs, re-testar os níveis de potássio,magnésio e cálcio deveriam ser executados de acordo com a prática padrãoinstitucional.

As leituras de ECG de 12 fios triplicadas serão obtidas durante operíodo de linha de base (Dia -7 a Dia -1, isto é, dentro dos 7 dias antes doDia 1 do Ciclo 1) na mesma hora do dia no qual as medições de ECG serãoexecutadas nos Ciclos 1 e 3.

Para minimizar a variabilidade postural, é importante que os pa-cientes estejam descansando e em uma posição de costas por ao menos 10minutos antes de cada coleta de ECG. As retiradas de sangue e outros pro-cedimentos deveriam ser evitados durante o período imediatamente antesda medição de ECG, e a atividade deveria ser controlada o máximo possívelde modo a minimizar a variabilidade devido aos efeitos de estresse fisiológi-co. As refeições deveriam ser padronizadas o máximo possível entre pacien-tes, para evitar efeitos pós-refeições. Se possível, os ECGs deveriam sercoletados no mesmo tipo de máquina para cada sítio envolvido no estudo, ea mesma máquina deveria ser usada para todos os ECGs para um pacienteespecífico. As instruções detalhadas em aquisições de ECG são fornecidasno manual do laboratório central de ECG.

Medições de ECG de 12 fios triplicadas precisam ser obtidas emcada ponto no tempo de avaliação, e deveriam ser coletadas por um períodode 2 minutos (por exemplo, um único ECG a cada minuto).Avaliações durante o Tratamento

Todas as visitas e avaliações durante o tratamento são executa-das nos dias indicados. Para o protocolo descrito no Exemplo 1, um ciclodura 21 dias.

Medições de ECG durante o Dia 1 do Ciclo 1, Dia 3 do Ciclo 1, eDia 1 do Ciclo 3

ECGs de 12 fios (triplicadas) serão executados antes de coletaras amostras PK correspondentes. Todos os ECGs para um paciente deveri-am ser obtidos na mesma máquina.

Níveis de potássio, magnésio e cálcio em soro precisam estardentro dos limites normais antes de executar ECGs, como determinado porteste de laboratório local executado como especificado no protocolo principalTOC4129g/WO20698. Os pacientes podem receber suplemento de eletrólitopor prática padrão institucional para levar os níveis de eletrólito dentro doslimites normais antes de executar ECGs, retestar os níveis de potássio,magnésio, e cálcio que deveriam ser executados de acordo com a práticapadrão institucional.

Leituras de ECG de 12 fios triplicadas serão obtidas durante oDia 1 do Ciclo 1 e Dia 1 do Ciclo 3 na mesma hora das medições de ECG delinha de base, nas horas seguintes do dia: 30 minutos e 15 minutos (± 5 mi-nutos) antes de infusão de pertuzumabe/placebo.Quaisquer pré-medicações que são exigidas para infusões depertuzumabe/placebo precisam ser dadas entre as duas medições de ECGpré-infusão.

- 0 - 15 minutos pós-infusão de pertuzumabe/placebo

- 60 - 75 minutos pós-infusão de pertuzumabe/placebo

Leituras de ECG de 12 fios triplicadas serão também obtidasdurante o Dia 3 do Ciclo 1, pós-infusão de docetaxel e coincidente com a-mostra PK de 23 horas.

Amostras Sangüíneas Farmacocinéticas

A menos que de outra forma especificado, amostras sangüíneaspara avaliações PK deveriam ser retiradas nos seguintes pontos no tempo:

- Pré-dose: dentro de 15 minutos antes da infusão.

- Pós-dose: dentro de 15 minutos depois do fim da infusão.

Aproximadamente 5 ml_ de sangue serão retirados em cada pon-to no tempo PK.

Farmacocinéticas de Pertuzumabe

As amostras de sangue para avaliação PK de pertuzumabe se-rão retiradas pré-infusão de pertuzumabe/placebo e pós-infusão de pertu-zumabe/placebo nos seguintes ciclos: Ciclos 1, 3, 6, 9, 12, 15, e 18. Umaamostra adicional será retirada na Visita de Descontinuaçao de Tratamento(28 - 42 dias depois da última dose de tratamento em estudo).

- Nos ciclos 1 e 3, a amostra PK pós-pertuzumabe será retirada60 - 75 minutos depois do fim da infusão de pertuzumabe/placebo (antes daadministração de trastuzumabe).

- Nos ciclos 1 e 3, as amostras PK pré-pertuzumabe e _PK preci-sam ser coletadas depois dos ECGs correspondentes serem executadosnesses pontos no tempo.

Farmacocinética de Trastuzumabe

As amostras de sangue para avaliação PK de trastuzumabe se-rão retiradas pré-infusão e pós-infusão de trastuzumabe nos Ciclos 1 e 3.

No ciclo 3, a dose de trastuzumabe deveria ser retardada atédepois das avaliações de ECG 60 - 75 minutos pós-pertuzumabe e da cole-ta de amostra PK ter sido completada.Farmacocinética de Docetaxel

As amostras de sangue para avaliação PK de docetaxel serãocoletadas no Ciclo 1 nos pontos no tempo seguintes depois da iniciação dainfusão de docetaxel (ponto no tempo 0):

- Dia 2 do Ciclo 1

0,5 hora (durante infusão)

1 hora (EOI)

1,25 horas (15 minutos depois de EOI)

2 horas (1 hora depois de EOI)

4 horas (3 horas depois de EOI)

6 horas (5 horas depois de EOI)

8 horas (7 horas depois de EOI)

- Dia 3 do Ciclo 1

24 horas (Ciclo 1: Dia 3, 23 horas depois de EOI)

Eventos Adversos

Os eventos adversos serão coletados e seguidos de acordo comas exigências do protocolo do estudo descrito no Exemplo 1.Métodos de Ensaio

Ensaio Farmacocinético de Docetaxel

Amostras de plasma serão analisadas para concentrações dedocetaxel usando um método de cromatografia líquida de alto desempenho(HPLC) (ou equivalente), e as concentrações de plasma serão quantificadascomparando os resultados contra padrões conhecidos. O limite inferior dequantificação (LLOQ) para docetaxel em plasma humano será determinadode acordo com métodos de ensaio validados estabelecidos pelo laboratóriocontratado para executar as análises.

Ensaio Farmacocinético de Pertuzumabe

Amostras de soro serão ensaiadas para concentrações de per-tuzumabe usando um ELISA que é atualmente sendo desenvolvido. A con-centração mínima quantificavel (MQC) para pertuzumabe em soro humanomedido por esse ensaio é determinada.Ensaio Farmacocinético de Trastuzumabe

Amostras de soro coletadas na linha de base serão ensaiadaspara concentrações de trastuzumabe usando um ELISA de ligação com re-ceptor. Esse ensaio usa HER2-ECD de antígeno imobilizado para capturartrastuzumabe de amostras de soro. O MQC para trastuzumabe em soro hu-mano medido por esse ensaio é 156 ng/mL.

As amostras de soro coletadas depois da administração de per-tuzumabe serão ensaiadas para concentrações de trastuzumabe usando umELISA que está atualmente sendo desenvolvido. O MQC para pertuzumabeem soro humano medida por esse ensaio é determinado.

Descontinuação do Paciente

Os pacientes podem voluntariamente retirar ou ser descontinua-dos desse subestudo a qualquer hora. Os pacientes que são retirados desseestudo podem continuar a participação no Estudo TOC4129gA/VO20698. Asrazões para descontinuação do paciente do subestudo incluem, mas nãoestão limitadas ao seguinte:

- Retirada voluntária do consentimento

- Não adesão

- Determinação do investigador que não é do interesse do paci-ente continuar (por exemplo, doença ou condição que exige o uso de fárma-cos proibidos ou tratamento proibido).

- Retirada do paciente do Protocolo TOC4129gAA/O20698.

A razão primária para descontinuação cedo precisa ser gravadano formulário de relatório eletrônico apropriado (eCRF).

Métodos Estatísticos

Devido ao pequeno tamanho da amostra, a ênfase de todas asanálises será em estimativas. Nenhum teste de hipótese estatística formal éplanejado.

Análise do Comportamento do Estudo

O alistamento e descontinuação desse subestudo serão resumidos.Análise de Comparabilidade do Grupo de Tratamento

As características demográficas e de linha de base, tal comoidade, sexo, e raça, serão resumidas usando médias, desvios padrão, faixas(para variáveis contínuas), e freqüências e porcentagens (para variáveis ca-tegóricas). Os resumos serão apresentados pelo tratamento em estudo queos pacientes atualmente receberam.

Análises Farmacocinéticas

A modelagem da população será usada para derivar estimativasde parâmetro PK post-hoc (CL, AUC, Vd, e f1/2) para pertuzumabe, e seráresumida para o grupo de tratamento. Observados Cmax e Cmin para pertu-zumabe e trastuzumabe serão resumidos para cada ponto no tempo de a-mostragem PK especificada. As estatísticas descritivas incluirão médias,faixas, e desvios padrão, como apropriado. Os parâmetros PK de pertuzu-mabe e dados de concentração-tempo de soro serão comparados com osdados disponíveis de outros estudos clínicos de pertuzumabe.

As amostras PK para docetaxel serão obtidas nos Dias 2 e 3 doCiclo 1 somente. As concentrações de plasma e o AUC para docetaxel serãoresumidas pelo braço de tratamento usando estatísticas descritivas comodescrito acima. A relação de média geométrica para AUC entre os braços decontrole e experimental será computada e os intervalos de confiança de 90%correspondentes serão fornecidos.

Análises de Eletrocardioqrama

A população de análise avaliada por ECG compreenderá todosos pacientes que recebem qualquer fármaco de estudo (como por ProtocoloTOC4129g/WO20698) e que têm dados de ECG disponíveis para linha debase, o ponto no tempo pré-pertuzumabe/placebo no Dia 1 do Ciclo 1, e aomenos um ponto no tempo seguindo a administração de pertuzuma-be/placebo no Ciclo 1 ou Ciclo 3. A média das leituras de ECG em triplicatapara cada ponto no tempo será utilizada nas análises.

As estatísticas descritivas serão usadas para valor QTcF absolu-to e mudança da linha de base em QTcF para cada ponto no tempo. A dife-rença no QTcF médio ajustado à linha de base entre os dois braços de tra-tamento (ddQTcF) será fornecida bem como o intervalo de confiança de 90%de dois lados.

QTcB, HR, PR, e QRS comparados no tempo, ajustados à linhade base, e corrigidos por placebo serão resumidos em um modelo similar.

O número e a porcentagem de pacientes com gravações deECG alcançando os critérios como descritos na Seção 3.2.2 serão tabuladospara cada braço de tratamento e cada ponto no tempo pós-linha de basecomo apropriado.

Dados Perdidos

Nenhum dado de ECG perdido será inserido. Contanto que umdos ECGs triplicados é interpretado em cada ponto no tempo, um QTc serácalculado. Se os pacientes não têm ECGs correspondentes em pontos notempo de linha de base e pós-linha de base de interesse, eles não serãoincluídos na análise para esse ponto no tempo.

Determinação do Tamanho da Amostra

Ao menos 50 pacientes avaliados por ECG foram alistados paraesse subestudo. O tamanho da amostra para esse subestudo foi primaria-mente escolhido para fornecer uma estimativa de parâmetros PK e ECGchave. Nenhum teste de hipótese estatística é planejado. Assumindo umataxa igual de participação entre os braços de tratamento (25 paciente porbraço de tratamento) e um desvio padrão estimado de 20 ms, o intervalo deconfiança de 90% de dois lados para a diferença ajustada à linha de baseem QTcF entre os braços de tratamento (ddQTcF) estará dentro de 10 msda diferença observada.

É esperado que ao menos 40 paciente alistados nesse subestu-do serão avaliados PK. Um paciente avaliado PK é definido como um paci-ente que teve amostras PK completas coletadas no Ciclo 1 e no Ciclo 3.Com um tamanho de amostra de 40 pacientes avaliados e um coeficienteinter-paciente de variação em AUC de 30%, o intervalo de confiança de 90%para a relação da média geométrica das concentrações de docetaxel entreos braços de tratamento será (86%, 117%) se a média geométrica de AUCsobservada para ambos os braços de tratamento são idênticos.Um paciente avaliado por ECG é definido como um paciente quetem um ECG de linha de base interpretável bem como um ECG interpretávelno Dia 1 do Ciclo 3 imediatamente pós-infusão de pertuzumabe/placebo(Cmax em regime permanente). Com esse tamanho de amostra de 40 paci-entes adequados e um desvio padrão estimado de 20 ms, um intervalo deconfiança de 95% para a diferença entre os braços de tratamento na mu-dança média em QTcF a partir da linha de base ao Ciclo 3 será ± 12,4 ms apartir da mudança média observada.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> GENENTECH, INC.

F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

<120> TRATAMENTO DE CÂNCER DE MAMA METASTÁTICO

<130> GNE-0318

<140> PCT/US2008/085416<141> 03-12-2008

<150> 61/061,962<151> 16-06-2008

<160> 23

<170> Patentln version 3.5

<210> 1<211> 107<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 1

Asp Thr Vai Met Thr Gln Ser His Lys lie Met Ser Thr Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser lie Gly20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Vai Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr lie Tyr Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys100 105

<210> 2<211> 119<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 2

Glu Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Thr15 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Vai Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Vai Asp Arg Ser Ser Arg Ile Vai Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser115

<210> 3<211> 107<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintéti-co"

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser Ile Gly20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys100 105

<210> 4<211> 119<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintético"

<400> 4

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Thr Met Asp Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser115

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys100 105

<210> 6<211> 119<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 6

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Vai lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Arg Vai Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

115

<210> 7

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da

CO"

<400> 7

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5

10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser lie Gly20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala100 105 110

Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 8

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (65)..(65)

<223> Qualquer aminoácido

<400> 8

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Thr Met Asp Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60

Xaa Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 135 140

Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro195 200 205

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240

Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser245 250 255

Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp260 265 270

Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn275 280 285Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai290 295 300

Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr355 360 365

Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445

<210> 9<211> 214<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintético"

<400> 9

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Vai Asn Thr Ala20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala100 105 110

Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 10<211> 449<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético"

<400> 10

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30

Tyr Ile His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140

Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu260 265 270

Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu355 360 365

Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445

Gly

<210> 11<211> 217<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintético"

<400> 11

Vai His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala15 10 15

Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai20 25 30

Ser Ile Gly Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser65 70 75 80

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile85 90 95Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr100 105 110

Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro130 135 140

Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His180 185 190

Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215

<210> 12<211> 449<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético"

<400> 12

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Thr Met Asp Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 135 140

Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro195 200 205

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240

Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser245 250 255

Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp260 265 270

Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai290 295 300

Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr355 360 365Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445

Lys

<210> 13

<400> 13

000

<210> 14<211> 195<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 14

Thr Gln Vai Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser15 10 15

Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln20 25 30

Vai Vai Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser35 40 45

Leu Ser Phe Leu Gln Asp lie Gln Glu Vai Gln Gly Tyr Vai Leu lie50 55 60

Ala His Asn Gln Vai Arg Gln Vai Pro Leu Gln Arg Leu Arg lie Vai65 70 75 80

Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Vai Leu Asp85 90 95

Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Vai Thr Gly Ala Ser Pro100 105 110

Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu lie Leu Lys115 120 125

Gly Gly Vai Leu lie Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr130 135 140

lie Leu Trp Lys Asp lie Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr145 150 155 160

Leu lie Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met165 170 175

Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser180 185 190

Leu Thr Arg195

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Thr Vai Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr15 10 15

Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His20 25 30

Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly lie Cys Glu35 40 45

Leu His Cys Pro Ala Leu Vai Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser50 55 60

Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Vai Thr65 70 75 80

Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Vai Gly Ser Cys Thr Leu85 90 95

Vai Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Vai Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln100 105 110

Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Vai115 120

<210> 16<211> 169<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Vai Arg Ala Vai Thr15 10 15

Ser Ala Asn lie Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys lie Phe Gly Ser20 25 30

Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr35 40 45

Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Vai Phe Glu Thr Leu Glu Glu50 55 60

lie Thr Gly Tyr Leu Tyr lie Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp65 70 75 80

Leu Ser Vai Phe Gln Asn Leu Gln Vai lie Arg Gly Arg lie Leu His85 90 95

Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly lie Ser Trp Leu100 105 110

Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu lie His115 120 125

His Asn Thr His Leu Cys Phe Vai His Thr Vai Pro Trp Asp Gln Leu130 135 140

Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu145 150 155 160

Asp Glu Cys Vai Gly Glu Gly Leu Ala165

<210> 17<211> 142<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 17

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr15 10 15

Gln Cys Vai Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Vai Glu20 25 30

Glu Cys Arg Vai Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Vai Asn Ala Arg35 40 45

His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Vai50 55 60

Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Vai Ala Cys Ala His TyrLys Asp Pro

Pro Phe Cys Vai Ala Arg Cys Pro Ser Gly Vai Lys Pro85 90 95

Asp Leu Ser

Tyr Met Pro lie Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala100 105 110

Cys Gln Pro115

Cys Pro lie Asn Cys Thr His Ser Cys Vai Asp Leu Asp120 125

Asp Lys Gly130

Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr135 140

<210> 18<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintéti-

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> /substituir="Ser"

<220>

<221> misc_feature<222> (10) . . (10)

<223> /observação = "Resíduo determinado na seqüência não tem preferência emrelação ao resíduo na informação dada pela referida posição"

<400> 18

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp15 10

<210> 19<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético"

<400> 19

Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gln Arg Phe Lys15 10 15

Gly

<210> 20<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintético"

<400> 20

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr15 10

<210> 21<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintéti-

<400> 21

Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser lie Gly Vai Ala1 5 10

<210> 22<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptídio sintéti-

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5) .. (5)

<223> /substituir="Leu"

<220>

<221> VARIANTE<222> (6)..(6)<223> /substituir="Glu"

<220>

<221> VARIANTE<222> (7) .. (7)<223> /substituir="Ser"

<220>

<221> misc_feature<222> (5) .. (7)

<223> /observação = "Resíduo determinados na seqüência não tem preferênciaem relação aos resíduos nas informações dadas pelas referidas posições"

<400> 22

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr1 5

<210> 23<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> fonte

<223> /observação="Descrição da Seqüência Artificial: Polipeptidio sintético"

<400> 23

Gln Gln Tyr Tyr He Tyr Pro Tyr Thr1 5

Claims (36)

1. Método para o tratamento de câncer de mama, compreen-dendo administrar a um paciente com câncer de mama metástico HER2 po-sitivo uma quantidade eficaz de um anticorpo contra HER2 inibidor de cres-cimento, um anticorpo inibidor de dimerização de HER2, e um taxeno, emque o paciente não recebeu quimioterapia ou terapia biológica anterior.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpocontra HER2 inibidor de crescimento se liga a um epítopo dentro do DomínioIV (ID SEQ Ne 17) da seqüência de aminoácido de HER2.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpocontra HER2 inibidor de crescimento se liga a um epítopo 4D5 de HER2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpoinibidor de dimerização de HER2 se liga a HER2 na junção dos domínios I, IIelll(IDSEQ Nes14, 15e16).

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpoinibidor de dimerização de HER2 se liga essencialmente ao epítopo 2C4.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpoinibidor de crescimento e/ou anticorpo inibidor de dimerização de HER2 éum fragmento de anticorpo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpoinibidor de crescimento e/ou anticorpo inibidor de dimerização de HER2 équimérico, humanizado ou humano.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpoinibidor de crescimento é trastuzumabe, ou um fragmento desse, o anticorpode dimerização de HER2 é pertuzumabe, ou um fragmento desse, e o taxe-no é docetaxel.

9. Método para o tratamento de câncer de mama, compreen-dendo administrar a um paciente com câncer de mama metástico HER2 po-sitivo uma quantidade eficaz de um primeiro anticorpo contra HER2 se ligan-do essencialmente ao epítopo 2C4, um segundo anticorpo contra HER2 seligando essencialmente ao epítopo 4D5, e um taxeno, em que o pacientenão recebeu anteriormente quimioterapia ou terapia biológica.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o pacienteé um paciente humano.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o primeiroe o segundo anticorpos são anticorpos monoclonais.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que ao menosum dos ditos primeiro e segundo anticorpos é um fragmento de anticorpo.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que ao menosum dos ditos primeiro e segundo anticorpos é quimérico, humanizado ouhumano.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o ditoprimeiro anticorpo é pertuzumabe.

15. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 14, em que odito segundo anticorpo é trastuzumabe.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o dito ta-xeno é docetaxel.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o dito ta-xeno é docetaxel.

18. Método de acordo com a reivindicação 10, em que os ditosprimeiro e segundo anticorpos e o dito taxeno são administrados ao mesmotempo.

19. Método de acordo com a reivindicação 10, em que os ditosprimeiro e segundo anticorpos e o dito taxeno são administrados consecuti-vamente, em qualquer ordem.

20. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a admi-nistração do primeiro anticorpo precede a administração do segundo anti-corpo e do taxeno.

21. Método de acordo com a reivindicação 16, em que ao menosum do pertuzumabe e do trastuzumabe é um anticorpo nu.

22. Método de acordo com a reivindicação 16, em que ao menosum do pertuzumabe e do trastuzumabe é um anticorpo intacto.

23. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a admi-nistração do pertuzumabe, trastuzumabe e docetaxel resulta em um efeitocinergístico.

24. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a admi-nistração do pertuzumabe, trastuzumabe e docetaxel estende a sobrevida dopaciente humano em relação ao tratamento na ausência de ao menos um depertuzumabe, trastuzumabe e docetaxel.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a sobre-vida livre de progressão (PFS) é estendida.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a sobre-vida global (OS) é estendida.

27. Método de acordo com a reivindicação 10, adicionalmentecompreendendo a administração de um agente terapêutico adicional sele-cionado a partir do grupo que consiste em agente quimioterápico, um anti-corpo contra HER diferente, anticorpo direcionado contra um antígeno asso-ciado a tumor, composto anti-hormonal, cardioprotetor, citoquina, fármacodirecionado a EGFR, antiangiogênico, inibidor de tirosina quinase, inibidorCOX, fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor de farnesil transfera-se, anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA 125, vacina contra HER2,terapia de direcionamento à HER, inibidor Raf ou ras, doxorrubicina lipossô-mica, topotecana, taxeno, inibidor de tirosina quinase duplo, TLK286, EMD-7200, um medicamento que trata náusea, um medicamento que impede outrata brotoejas na pele ou terapia padrão contra acne, um medicamento quetrata ou impede diarréia, um medicamento de redução de temperatura docorpo, e um fator de crescimento hematopoiético.

28. Kit compreendendo um primeiro anticorpo contra HER2 seligando essencialmente ao epítopo 2C4, um segundo anticorpo contra HER2se ligando essencialmente ao epítopo 4D5, e um taxeno, e uma bula ou rótu-lo com direções para tratar um paciente com câncer de mama metasticoHER positivo, que não recebeu anteriormente quimioterapia ou terapia bioló-gica.

29. Método de promover pertuzumabe para o tratamento de umpaciente com câncer de mama metastico HER2 positivo que não recebeuanteriormente quimioterapia ou terapia biológica, em combinação com tras-tuzumabe e um taxeno.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o taxenoé docetaxel.

31. Método de promover trastuzumabe para o tratamento de umpaciente com câncer de mama metástico HER2 positivo que não recebeuanteriormente quimioterapia ou terapia biológica, em combinação com pertu-zumabe e um taxeno.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o taxenoé docetaxel.

33. Método de promover um taxeno para o tratamento de umpaciente com câncer de mama metástico HER2 positivo que não recebeuanteriormente quimioterapia ou terapia biológica, em combinação com pertu-zumabe e trastuzumabe.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o taxenoé docetaxel.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34, em que a promoção está na forma de um material escrito.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34, em que a promoção está na forma de uma bula.