BRPI0714347A2 - processo aperfeiÇoado para o cultivo de cÉlulas - Google Patents

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Gerben Meile Zijlstra
Robert Patrick Hof
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Abstract

PROCESSO APERFEIÇOADO PARA O CULTIVO DE CÉDULAS. A invenção refere-se a um processo para o cultivo de células, preferivelmente células HER imortalizadas - E1, mais preferivelmente células PER. C6 em um reator em suspensão em um meio de cultura de células, onde as células produzem uma susbstância biológica, preferivelmente um anticorpo, em que pelo menos um componente de meio cultura de células é alimentado para a cultura de células e me que a cultura de célula compreendendo as células, a substância biológica e o meio de cultura de células são circulados sobre um sistema de separação e em que o sistema de separação separa a substância biológica a partir das substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica e em que a substância biológica é retirada em ou realimentada para o reator. Preferivelmente parte das substâncias de peso molecular mais baixo é continuamente removida da cultura de células.

Description

PROCESSO APERFEIÇOADO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS
A invenção refere-se a um processo para o cultivo de células em um reator em suspensão em um meio de cultura de células.
Tal processo é, por exemplo, conhecido a partir de
W004/099396. Descreve-se aqui como a densidade das células da cultura de células e o rendimento do material biológico desejado podem ser aperfeiçoados mediante otimização das condições de crescimento, em um processo de batelada alimentada.
Além disso, W005/095578 revela um processo para o cultivo de células por cultivar por perfusão contínua uma cultura de células compreendendo meio de cultura de células e células, onde o meio de cultura de células é adicionado â cultura de células, a cultura de células é circulada através de um módulo de filtro compreendendo fibras ocas que resultam em um escoamento de líquido tendo uma densidade mais baixa de células do que a cultura de células, e o fluxo dentro do módulo de filtro é um fluxo 2 0 tangencial alternado, onde as células produzem uma substância biológica. Nos exemplos de W005/095578 é mostrado que 0,9 g/L/dia de produto são produzidos, correspondendo a uma concentração de produto no escoamento de aproximadamente 0,3 g/L. Quanto maior o volume de líquido contendo a
substância biológica, mais laboriosa se torna a purificação da substância biológica. A concentração de substância biológica obtida não é tão elevada nos processos como revelado em W004/099396 e W005/095578. Portanto, o processamento a jusante dessa substância biológica é incômodo, porque a substância biológica necessita ser concentrada antes que etapas de purificação adicionais sejam aplicadas ou volumes grandes de substância biológica menos concentrada necessitam ser purificados. Além disso, o cultivo de células em densidades mais baixas de células resulta em produtividade volumétrica inferior e, portanto requer recipientes de cultivo maiores e/ou em maior número e desse modo investimentos mais elevados em equipamentos para um nível dado de produção. Portanto, é o objetivo da invenção fornecer um
processo onde o produto seja obtido a partir da cultura de células em concentrações mais elevadas.
Um objetivo adicional da presente invenção é permitir cultivo das células e produção do material biológico durante um período prolongado.
Esses objetivos são obtidos por um processo para o cultivo de células em um reator em suspensão em um meio de cultura de células, onde as células produzem uma substância biológica, em que pelo menos um componente de meio de cultivo de células é alimentado à cultura de células e em que a cultura de células compreendendo a substância biológica e cultura de células é circulada sobre um sistema de separação e em que o sistema de separação separa a substância biológica a partir de substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica e em que a substância biológica é retida em ou realimentada para dentro do reator.
Por exemplo, a invenção refere-se a um processo para o cultivo de células em um reator em um meio de cultura de células, onde as células produzem uma substância biológica, em que nutrientes e/ou meio de cultura de células é/são alimentados ao reator e onde a cultura de células compreendendo as células e o meio de cultura de células é circulada sobre um filtro tendo um tamanho de poro ou corte de peso molecular entre 5 e 500 kD.
Verificou-se que utilizando um sistema de separação que separa a substância biológica a partir de substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica, a substância biológica pode ser acumulada na
cultura de células em concentrações mais elevadas.
Conseqüentemente, a presente invenção difere do cultivo de células descrito na técnica anterior em que permite acúmulo do material biológico desejado juntamente com a massa de células.
Em uma modalidade preferida da presente invenção
parte das substâncias de peso molecular inferior é continuamente removida da cultura de células.
Uma vantagem adicional do processo da presente invenção é que concentração de células viáveis, mais
2 0 elevada, pode ser atingida em comparação, por exemplo, com
processos de batelada ou batelada alimentada. Além disso, a linha de produção - o período durante o qual as células produzem a substância biológica - pode ser estendida em comparação, por exemplo, com processos de batelada ou
batelada alimentada. Também, em comparação com um processo de batelada ou batelada alimentada, é possível utilizar um reator menor. O uso de reatores menores é vantajoso visto que isso reduz os investimentos relacionados à instalação e equipamento.
3 0 Além disso, concentrações mais elevadas da substância biológica podem ser obtidas em tempos mais curtos.
Verificou-se que era possível obter concentrações elevadas de substância biológica no reator sem diminuir abruptamente a viabilidade de células e consequentemente sem limitar o tempo de produção. A pessoa versada na arte teria esperado que a inibição de produto, isto é, inibição de produção da substância biológica pela própria substância biológica ou inibição por outras macromoléculas produzidas pela célula (como, por exemplo, proteínas de célula hospedeira, enzimas ou resíduos celulares), ocorreria. Além disso, verificou-se que o acúmulo do material biológico desejado não prejudica a função do sistema de separação.
O processo da presente invenção prove uma vantagem considerável em termos de densidade de célula, concentração de produto na cultura de células e período de cultivo prolongado em comparação com os processos de acordo com WOO5/0 9557 8 e W004/099396. Como resultado o presente processo resulta em uma produção aperfeiçoada do material biológico desejado.
Células que podem ser utilizadas para produzir a substância biológica são em princípio todas as células conhecidas para a pessoa versada na arte, que têm a capacidade de produzir um produto biológico. As células podem ser eucarióticas, por exemplo, fungos filamentosos, por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, leveduras, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Phaffia rhodozyma, levedura a partir do gênero Pichia, por exemplo, Pichia pastoris ou procarióticas, por exemplo, Escherichia coli, Baeillus sp., por exemplo Β. Iicheniformis, Β. subtilis, Β. amyloliquefaciens, Β. alkalophilus, Streptomyees sp., Corynebaeterium glutamicum, Pseudomonas sp. Os exemplos de células eueariótieas são, por exemplo, também descritos em Chu, L., Robinson, D.K. (2001) Curr. Opinion Biotechn., vol. 12, pág. 180-187. Preferivelmente, as células que são utilizadas no processo da presente invenção são as células de animais, em particular, células de mamíferos. Os exemplos de células de mamíferos incluem células de CHO (Ovário de Hamster chinês), hibridomas, células de BHK (Rim de Hamster filhote), células de mieloma, células humanas, por exemplo, células HEK-293, células Iinfoblastóide humanas, células HER imortalizadas El, células de camundongos, por exemplo, células NSO. Mais preferivelmente, células HER imortalizadas El são utilizadas, mais preferivelmente células PER.C6.
Células de retina embriônica humana primárias (HER) podem ser isoladas de fetos (Byrd P., Brown KW, Gallimore PH, 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69- 72, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of ElA + ras. Oncogene 2:477 - 484). Células primárias morrerão após cultivo por várias passagens. Células HER imortalizadas-El para a finalidade da presente invenção são derivadas de células HER primárias por expressar DNA codificando proteínas ElA e ElB nas mesmas, para obter células imortalizadas. Tais células imortalizadas podem ser cultivadas por mais de 100 passagens. Os métodos para obter células HER imortalizadas-El foram descritas, por exemplo, na patente US 5.994.128, em Byrd P., Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69- 71, em Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of ElA + ras. Oncogene 2:477-484, e em Gallimore, P.H., Grand, R.J.A e Byrd, P.J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. AntiCancer Res. 6, pág. 4 99-508. Por exemplo, células HER imortalizadas, incluindo células PER.Cl, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 e PER.C9, foram geradas por transfecção de células HER primárias utilizando um plasmídeo que continha o sorotipo adenovirus 5 (ad5) seqüências de codificação de ElA e ElB (nucleotídeos Ad5 459-3510) sob o controle do promotor fosfoglicerato cinase humano ("PGK") (vide a patente US 5.994.128).
Em uma modalidade preferida, as células no processo da presente invenção são células HER imortalizadas-El, mais preferivelmente células PER.C6 (vide a patente US 5.994.128). Células PER.C6 são exemplificadas por células como depositado sob ECACC número 96022940 (vide, por exemplo, a patente US 5.994.128, EP 0833934 BI).
No processo da invenção, as células podem ser cultivadas em suspensão em qualquer forma, por exemplo, como células imobilizadas, células únicas ou em grupos de células ou como uma combinação das mesmas. Preferivelmente as células são cultivadas como células únicas e/ou como grupos de células pequenos de não mais do que 100 células, mais pref erivelmente de não mais do que 2 0 células. As células podem, por exemplo, ser imobilizados em microportadoras conforme estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da GE Healthcare (Cytodex).
Um reator, como definido aqui, é um sistema que compreende a cultura de células cuja cultura de células, por sua vez, compreende células e um meio de cultura de células. Provê preferivelmente barreiras estéreis, como filtros de ar, para evitar que outras células contaminem as células desejadas e mantém preferivelmente um ambiente favorável para as células pela provisão das condições corretas de cultura como mistura, temperatura, pH, concentração de oxigênio, etc. O reator pode, por exemplo, ser de uma natureza mais
permanente, por exemplo, o reator pode ser de aço inoxidável ou vidro ou pode, por exemplo, ser de uma natureza descartável, por exemplo, o reator pode ser uma bolsa ou frasco de plástico. Os exemplos de reatores apropriados para uso na presente invenção incluem, porém não são limitados aos recipientes de tanque agitado, recipientes de levantamento de ar e bolsas descartáveis que podem ser misturadas por oscilação, movimento de agitação ou mistura. Preferivelmente (bio)reatores descartáveis são utilizados visto que são favoráveis pois exigem custos de investimento relativamente baixos, têm grande flexibilidade operacional, tempos de retorno curtos e são facilmente configuráveis para o processo. (Bio) reatores descartáveis são comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de 3 0 Hyclone, Sartorius, Applikon ou Wave. O termo "sistema de separação" é definido aqui na estrutura da invenção como um sistema capaz de separar com base em peso molecular. 0 sistema de separação utilizado no processo da invenção é capaz de separar a substância biológica das substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica. Em outras palavras, o corte de peso molecular é escolhido de tal modo que o corte de peso molecular (MWCO) é menor do que, mais preferivelmente pelo menos um fator 2, mais preferivelmente pelo menos um fator 3 menor do que o peso molecular da substância biológica. Tipicamente, porém evidentemente dependendo do peso molecular da substância biológica produzida no processo da presente invenção, o MWCO do sistema de separação é preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e pref erivelmente no máximo 500 kDa, mais preferivelmente no máximo 300 kDa, mais preferivelmente no máximo 100 kDa. Por exemplo, para um igG com um peso molecular de 150 kDa, um sistema de separação tendo um MWCO de no máximo 50 kDa é mais preferido.
Os exemplos de sistemas de separação incluem, porém não são limitados a filtros, centrífugas e sistemas de extração de duas fases aquosos.
0 termo "filtro", como utilizado aqui, pretende incluir todos os dispositivos com a capacidade de separar partículas com base em tamanho ou peso molecular. Em princípio, no processo da presente invenção, qualquer filtro pode ser utilizado desde que o tamanho de poro ou MWCO seja escolhido de tal modo que a substância biológica 3 0 seja separada a partir das substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica, tipicamente isso será um tamanho de poro ou MWCO entre 5 e 500 kDa. Os exemplos de filtros apropriados para uso na presente invenção incluem filtros de membrana, filtros de cerâmica e filtros de metal. 0 filtro pode ser utilizado em qualquer formato; o filtro pode ser, por exemplo, enrolado em espiral ou tubular ou pode ser utilizado na forma de uma folha. Preferivelmente, no processo da invenção, o filtro utilizado é um filtro de membrana, preferivelmente um filtro de fibra oca. Com o termo "fibra oca" se quer dizer uma membrana tubular. 0 diâmetro interno do tubo é pelo menos 0,1 mm, mais pref erivelmente pelo menos 0,5 mm, mais preferivelmente pelo menos 0,75 mm e preferivelmente o diâmetro interno do tubo é de no máximo 10 mm, mais pref erivelmente no máximo 6 mm; mais pref erivelmente no máximo 1 mm. Módulos de filtro compreendendo fibras ocas são comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, da General Electric (GE, anteriormente Amersham).
Por circular a cultura de células compreendendo a substância biológica, células e o meio de cultura de células sobre um sistema de separação, a substância biológica e células são retidas no reator e o escoamento líquido tem, portanto, uma concentração mais baixa de substância biológica e uma densidade de célula inferior do que a cultura de células. Normalmente no processo da invenção, o escoamento líquido não contém ou dificilmente contém qualquer substância biológica e células. Normalmente, o escoamento líquido conterá essencialmente, somente o componente tendo um peso molecular mais baixo do 3 0 que aquele da substância biológica. Essencialmente todas as células e essencialmente toda a substância biológica são, portanto, normalmente retidas no reator.
Preferivelmente, o tamanho de poro ou MWCO do filtro é escolhido de tal modo que o tamanho dos poros ou MWCO do filtro é menor do que, mais preferivelmente pelo menos um fator 2, mais pref erivelmente pelo menos um fator 3 menor do que o diâmetro ou peso molecular do produto, assegurando uma elevada retenção de produto. Tipicamente, porém evidentemente dependendo do tamanho ou peso molecular do produto, isto é substância biológica produzida no processo da presente invenção, o tamanho de poro ou MWCO do filtro é preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 10, mais pref erivelmente pelo menos 3 0 kDa e/ou o tamanho de poro ou MWCO do filtro/membrana é preferivelmente no máximo 500 kDa, mais preferivelmente no máximo 3 00 kDa, mais preferivelmente no máximo 100 kDa.
Com corte de peso molecular (MWCO) se quer dizer o peso molecular acima do qual pelo menos 90% das partículas são retidas pelo sistema de separação. A circulação da cultura de célula sobre um sistema
de separação, por exemplo, um filtro significa que a cultura de células é passada através de um sistema de separação, por exemplo, um filtro que resulta em um escoamento líquido e um fluxo cujo conteúdo é mantido em ou realimentado para dentro do reator. 0 fluxo cujo conteúdo é mantido em ou realimentado para dentro do reator normalmente conterá somente essencialmente componentes tendo um peso molecular pelo menos igual àquele da substância biológica ou mais elevado e, portanto, o fluxo 3 0 compreenderá mais substância biológica do que o escoamento líquido.
Em princípio, não é crítico quando a circulação da cultura de célula sobre o sistema de separação é iniciada durante o processo da invenção. A circulação da cultura de célula pode, por exemplo, ser iniciada diretamente a partir do início do processo ou quando a densidade de células viáveis das células atingiu certo nível.
A circulação da cultura de célula sobre um filtro pode ser um fluxo substancialmente perpendicular com relação à superfície de filtro, também conhecida como fluxo de fim de linha ou um fluxo substancialmente paralelo à superfície de filtro, também conhecido como fluxo tangencial, por exemplo, fluxo tangencial unidirecional (TFF) ou fluxo transversal. Um exemplo preferido de fluxo transversal é fluxo tangencial alternado (ATF) visto que com ATF verificou-se que a obstrução do filtro não ocorre (rapidamente) mesmo em densidades muito elevadas de células. É conhecimento geral comum que em filtração em profundidade, o filtro de poro pequeno final necessita ser protegido contra obstrução por pré-filtros grossos. Essa prática se baseia no conhecimento geral comum de que filtros com poros menores ou com um MWCO menor obstruem mais facilmente, desse modo limitando o tempo de produção. Se ATF for utilizado, o uso de um pré-filtro se torna supérfluo.
0 fluxo pode ser orientado movendo a cultura de célula, movendo o filtro ou ambos. 0 filtro pode ser, por exemplo, movido por rotação (filtro giratório) ou vibração (filtro vibratório). Alternativamente, se o fluxo for 3 0 orientado movendo a cultura de células somente, o filtro é estático e a cultura de células pode ser, por exemplo, movida por intermédio de bombas ou pressão.
Com "fluxo tangencial alternado" se quer dizer que há um fluxo na mesma direção que (isto é, tangencial a) superfície(s) do filtro, cujo fluxo está indo para frente e para trás, e que há outro fluxo em uma direção substancialmente perpendicular à superfície de filtro. O fluxo tangencial alternado pode ser obtido de acordo com métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica (por exemplo, como descrito em US 6.544.424) .
Durante o cultivo das células, pelo menos um componente de meio de cultura de células, por exemplo, um ou mais nutrientes e/ou meio de cultura de células pode ser alimentado para as células. No processo de acordo com a invenção, é vantajoso suplementar em parte ou preferivelmente integralmente pelo menos um dos nutrientes esgotados por intermédio de uma alimentação desse nutriente ou esses nutrientes para o reator. Por exemplo, o meio de cultura de células completo pode ser alimentado para o 2 0 reator, que é vantajoso como uma alimentação separada então não necessita ser preparada separadamente. 0 meio de cultura de célula pode ser, por exemplo, também alimentado para as células em uma forma mais concentradas; isto é vantajoso visto que volumes menores são mais fáceis de
2 5 manipular. Também um ou mais nutrientes podem ser
alimentados ao reator. Por exemplo, carboidratos, por exemplo, glicose ou frutose; aminoácidos, como glutamina e/ou peptídeos podem ser vantajosamente alimentados para o reator.
3 0 Em uma modalidade preferida da invenção, condições de cultura de célula são escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento de células e/ou produtividade especifica das células não é limitada e mais preferivelmente de tal modo que a concentração de pelo menos um dos componentes do meio de cultura de célula permanece essencialmente constante. Os exemplos de condições de cultura de células de limitação são limitações de nutrientes e formação de metabólitos de inibição, como amônia, dióxido de carbono e Iactato. Por exemplo, condições de cultura de células como a alimentação podem ser escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento de células não é limitada, por exemplo, pelo fornecimento de nutrientes suficientes de modo a compensar o esgotamento e/ou evitar a produção de metabólitos de inibição como lactato ou amônia. Por exemplo, as condições de aeração podem ser escolhidas de tal modo que a formação de dióxido de carbono não esteja limitando a taxa de crescimento de células. 0 crescimento da célula sob condições de não limitação é altamente vantajoso do ponto de vista de Boa Prática de fabricação (GMP) visto que: 1) pode fornecer um
2 0 ambiente de cultura de célula constante que em muitos casos
também fornecer qualidade de produto boa e constante e 2) isso pode levar a viabilidade elevada de células, em alguns casos a uma viabilidade de células maior do que 98%. A viabilidade elevada de células reduz a liberação de contaminantes relacionados a células, como proteínas de células hospedeiras, o que facilita a purificação de produto. Além disso, o crescimento das células em taxa ilimitada de crescimento de células e/ou produtividade específica ilimitada tem a vantagem comercial de que é
3 0 possível produzir mais substância biológica em um tempo ainda mais curto visto que densidade mais elevada de células será atingida mais cedo no processo.
"Produtividade específica" das células é a quantidade de uma substância biológica dada produzida por célula por unidade de tempo e é normalmente expressa em pg. célula"Mia"1.
A taxa de adição de pelo menos um componente de meio de cultura de célula, por exemplo, nutrientes e/ou meio de cultura de células à cultura de células (a taxa de influxo ou taxa de perfusão) influencia a viabilidade e a densidade das células. No processo da invenção, o(s) componente(s) de meio de cultura de célula, como nutrientes e/ou meio de cultura de células pode ser alimentado, por exemplo, em um fluxo contínuo, fluxo semicontínuo, por exemplo, fluxo em etapas ou fluxo disperso. Preferivelmente, o(s) componente(s) de meio de cultura de célula, por exemplo, nutrientes e/ou meio de cultura de células são adicionados em um fluxo contínuo.
0(s) componente (s) de meio de cultura de célula, como meio de cultura de célula completo e/ou nutrientes em princípio pode(m) ser alimentados ao reator a qualquer momento durante o processo. Preferivelmente, a alimentação é iniciada antes dos substratos, como glutamina e glicose terem atingido esse níveis baixos de modo a fazer com que o crescimento das células cesse, ou antes que metabólitos inibidores, por exemplo, lactato ou amônia atinjam tais níveis elevados que o crescimento cessaria. A partir desse ponto em diante, o(s) componente (s) de meio de cultura de célula, como nutrientes e/ou meio de cultura de células completo são preferivelmente alimentados ao reator em uma taxa tal que a demanda de substrato é atendida.
Em uma modalidade da invenção, o meio de cultura de células é adicionado em uma Taxa de Alimentação de acordo com a fórmula (1) :
Taxa de alimentação = SFR χ (volume de cultura de células total) χ (densidade de células viável) (1)
Onde a taxa de alimentação é expressa em litros por dia, em que SFR é a Taxa de alimentação específica, isto é a taxa na qual o meio de cultura de células é alimentado à cultura de células expressa como o volume de meio adicionado por célula viável por unidade de tempo e onde a densidade de células viável é o número de células viáveis por unidade de volume. 0 número de células viáveis pode ser determinado pela pessoa versada na arte, por exemplo, via o método de exclusão de triptano azul. A taxa de alimentação específica é preferivelmente escolhida entre 0,01 e 0,3 nL/célula/dia, mais preferivelmente entre 0,01 e 0,2 nL/célula/dia.
Pode ser vantajoso levar em consideração parâmetros adicionais ao ajustar a taxa de alimentação, por exemplo, a quantidade de glicose a ser alimentada à cultura e/ou a taxa de absorção de oxigênio. Por exemplo, para PER.C6 a taxa de alimentação do meio de cultura de células e/ou os nutrientes é preferivelmente escolhida de tal modo que a concentração de glicose é mantida entre 3 e 20 mmol/L, mais preferivelmente entre 5 e 15 mmol/L. Preferivelmente a concentração de glicose é pelo menos 3 mmol/L, mais preferivelmente pelo menos 5 mmol/L e preferivelmente no máximo 20 mmol/L, mais preferivelmente no máximo 15 mmol/L.
Em uma modalidade especial da invenção a cultura de células (compreendendo células, substância biológica e meio de cultura de células) é removida pelo menos uma vez a partir do reator e líquido, por exemplo, meio de cultura de células ou uma alimentação de nutrientes é adicionada ao reator para compensar pela remoção de cultura de células. A remoção de cultura de células pode levar a tempos de processo mais longos em densidades de célula elevadas em combinação com viabilidades elevadas de células resultando em produtividade mais elevada. A cultura de células pode ser removida continuamente ou em etapas.
Em uma modalidade preferida da invenção, a cultura de células (compreendendo células, meio de cultura de células e substância biológica) é removida a partir do reator assim que a densidade desejada de células, por exemplo, uma densidade de células de pelo menos 10.IO6 células viáveis/ml, preferivelmente pelo menos 20.IO6 células viáveis/ml, mais preferivelmente pelo menos 30.IO6 células viáveis/ml, por exemplo, uma densidade de células de no máximo 200.IO6 células viáveis/ml, é atingida e o líquido, por exemplo, meio de cultura de células ou alimentação de nutrientes é adicionado ao reator para compensar a remoção de cultura de células. Preferivelmente, a cultura de células é removida em tal taxa que a densidade de células permanece na faixa desejada de densidade de células. Essa modalidade da invenção é altamente vantajosa em comparação com um processo de batelada ou batelada alimentada convencional, visto que combina as vantagens do processo da invenção com elevada viabilidade que pode ser mantida por mais tempo, tornando possível realizar uma 3 0 produtividade volumétrica geral ainda mais elevada. Com "produtividade volumétrica" se quer dizer a quantidade de substância biológica produzida por volume de reator de unidade por tempo de unidade e normalmente é expresso em g. L"1. dia"1. Em comparação com um processo de perfusão convencional, essa modalidade da invenção também é altamente vantajosa visto que combina as vantagens do processo da invenção com um fluxo de remoção de cultura de células tendo uma elevada concentração de substância biológica. A elevada concentração de substância biológica no fluxo de remoção de cultura de célula torna comercialmente interessante colher a substância biológica a partir desse lugar. Em um processo de perfusão convencional onde a cultura de células é removida, o fluxo de remoção de cultura de células não contém substância biológica suficiente para fazer com que seja vantajoso comercialmente colher a substância biológica; e o fluxo de remoção de cultura de células é, portanto, normalmente considerado como refugo. Consequentemente, nessa modalidade da invenção, em teoria toda substância biológica produzida pode ser colhida em um modo direto, economicamente exeqüivel e simples.
Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, as condições de cultura de célula são escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento de células e/ou produtividade específica das células não é limitada e mais preferivelmente de tal modo que também a concentração de pelo menos um dos componentes do meio de cultura de célula, como glicose ou glutamina permanece constante e a cultura de célula é removida pelo menos uma vez a partir do reator 3 0 assim que a densidade desejada de células é atingida e o líquido, por exemplo, meio de cultura de células é adicionado ao reator para compensar a remoção de cultura de células.
Preferivelmente, a taxa do escoamento é escolhida de tal modo que é substancialmente igual à taxa da adição de pelo menos um componente de meio de cultura de célula, por exemplo, nutrientes e/ou meio de cultura de célula menos a taxa da remoção opcional de cultura de células.
Células que produzem uma substância biológica são, por exemplo, células capazes de expressar um gene que codifica a substância biológica. Células capazes de expressar um gene que codifica a substância biológica podem, por exemplo, ser preparadas por transfecção das células com um plasmídeo contendo o gene que codifica a substância biológica e gene que codifica um marcador de seleção apropriado, por exemplo, um gene que codifica uma resistência a neomicina (gene marcador Neo). Células estavelmente transfectadas podem ser então selecionadas por pressão de seleção, por exemplo, - no caso de um gene marcador Neo -, mediante cultivo das células transfectadas na presença de G418 (genericina) e triagem imediata das células por células que apresentam expressão de nível elevado da substância biológica. Os métodos para preparar clones de células HER imortalizadas-El que expressam uma proteína, e métodos para cultivar tais células para produzir a proteína, são bem conhecidos pela pessoa versada, e podem ser, por exemplo, encontrados na US 6 . 855.544.
Substâncias biológicas que podem ser produzidas pelas células, por exemplo, por expressar uma codificação de gene (recombinante) são, portanto, por exemplo, proteínas (recombinantes), em particular receptores, enzimas, proteínas de fusão, proteínas de sangue como proteínas a partir da cascata de coagulação de sangue, proteínas multifuncionais como, por exemplo,
eritropoietina, vírus ou proteínas bacterianas, por exemplo, para uso em vacinas; imunoglobulinas como anticorpos, por exemplo, IgG ou IgM, e similares; preferivelmente uma proteína, mais preferivelmente um anticorpo é produzido pelas células. Preferivelmente, as substâncias biológicas como proteínas ou vacinas produzidas pelas células podem ser utilizadas como um ingrediente ativo em um preparado farmacêutico. No contexto da presente invenção, os termos 'produto' e 'substância biológica' são intercambiáveis.
Na estrutura da presente invenção, com preparado farmacêutico se quer dizer qualquer preparado, que possa ser utilizado como remédio, em particular como remédio em seres humanos. Tal remédio pode, por exemplo, ser utilizado para diagnóstico, ou para fins profiláticos como, por exemplo, uma vacina, e/ou para fins terapêuticos, como por exemplo, uma enzima ou proteína para a qual um paciente tem deficiência, ou um anticorpo para matar células indesejáveis. Um preparado farmacêutico pode conter ainda um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, cujos exemplos são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica.
A linhagem de células PER.C6 pode ser utilizada para a produção de substâncias biológicas, como adenovírus deletado-El (vide, por exemplo, a patente US 6.994.128; Nichols e outros, 2002; Propagation of adenoviral vectors; use of PER.C6 cells. Em: Currie D., Douglas JT, editores. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier, pág. 129-167), outros vírus (vide, por exemplo, WO 01/38262), ou proteínas recombinantes (vide, por exemplo, a patente US 6.855.544; Yallop e outros, 2006, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 volumes, 779-807, Jorg Knablein (editor)).
Os exemplos de proteínas que podem ser utilizadas como ingrediente ativo em preparados farmacêuticos (com o nome de marca entre parênteses) incluem: Tenecteplase (TN Kase™) , fator anti-hemofílico (recombinante (ReFacto ™) , interferon Iinfoblastóide a-nl (Weliferon™) , fator de coagulação (recombinante (NovoSeven™) , Etanercept, (Enbrel™) , Trastuzumab (Herceptin™) , Infliximab
(Remicade™) , Palivizumab (Synagis™) , Basimiximab
(Simulect™) , Daclizumab (Zenapaz™) , Rituximab (Rituxan™) , fator de coagulação IX (recombinante) (Benefix™) e Interferon B-Ia (Avonex™) .
Os exemplos de vacinas que podem ser utilizadas como ingredientes ativos, em preparado farmacêutico, incluem: antígenos de proteína isolados, cujos exemplos incluem, porém não são limitados a vacina de Rotavírus viva, oral, tetravalente (RotaShield™) , vacina contra raiva (RanAvert™) , vacinas de gripe e vacina de hepatite A inativada (VAQTA™) .
0 pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido e osmolaridade do meio de cultura de célula não são, em princípios críticos e dependem do tipo de célula escolhida. Preferivelmente, o pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido e osmolaridade são escolhidos de tal modo que é ótimo para o crescimento e produtividade das células. A pessoa versada na técnica sabe como encontrar o pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido e osmolaridade ótimos para a cultura (vide, por exemplo, WO 2004/099396). Preferivelmente, para o processo da invenção ao utilizar células HER imortalizadas El, o pH é escolhido entre 6,6 e 7,6 e/ou a temperatura é escolhida entre 3 0 e 39°C e/ou a osmolaridade é escolhida entre 260 e 400 mOsm/kg. Para manter condições ótimas de processo é desejável automação para controlar as condições de processo. Para otimizar condições de processo, por exemplo, para obter detenção de crescimento para produtividade celular aumentada, durante a cultura pode-se aplicar um deslocamento nas condições de cultura. Isso pode ser estabelecido, por exemplo, por um deslocamento de temperatura (como de 37 a 32°C), um deslocamento de pH ou um deslocamento de osmolaridade.
O processo da presente invenção em principio pode
2 0 ser executado em qualquer tipo de meio de cultura de
células apropriado para o cultivo de células. Diretrizes para escolher um meio de cultura de células e condições de cultura de células são bem conhecidas e são, por exemplo, fornecidas no capitulo 8 e 9 de Freshney, R.I. Culture of animais cells (um manual de técnicas básicas), 4a edição 2000, Wiley-Liss e em Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell Sc Tissue culture,- Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
Por exemplo, o meio de cultura de células pode
3 0 compreender como um componente de meio de cultura de células, uma fonte de carboidrato, sais e/ou aminoácidos e/ou vitaminas e/ou lipídeos e/ou detergentes e/ou tampões e/ou fatores de crescimento e/ou hormônios e/ou citocinas e/ou elementos residuais. Os exemplos de fontes de carboidrato incluem glicose, frutose, galactose e piruvato. Os exemplos de sais incluem sais de magnésio, por exemplo, MgCl2.6H20, MgSO4 e MgSO4.7H20 sais de ferro, por exemplo FeSO4.7H2, sais de potássio, por exemplo KH2PO4, KCl; sais de sódio, por exemplo, NaH2PO4, Na2HPO4 e sais de cálcio, por exemplo CaCl2.2H20. Os exemplos de aminoácidos incluem todos os aminoácidos proteinogênicos conhecidos, por exemplo, histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Os exemplos de vitaminas incluem: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Os exemplos de lipídeos incluem: ácidos graxos, por exemplo, ácido linoléico e ácido oléico; os exemplos de detergentes incluem Tween® 80 e Pluronic® F68. 0 exemplo de tampões inclui HEPES e Na2CO3. Os exemplos de fatores de crescimento/hormônios/citocinas incluem IGF (fator de crescimento semelhante à insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Os exemplos de elementos residuais são conhecidos para a pessoa versada na técnica e incluem Zn, Mg e Se. 0 meio de cultura de células pode, por exemplo, também compreender outros componentes de meio de cultura de células, por exemplo, peptona de soja ou etanol amina.
Para a produção de substâncias biológicas, de acordo com a invenção, em particular se as substâncias biológicas devem ser utilizadas como ingredientes ativos em preparados 3 0 farmacêuticos, meios sem soro são preferidos a meios que contêm uma fonte de soro. 0 motivo para isso é que os meios de fonte de soro podem ser contaminados com vírus, apresentando risco de infecções priônicas, podendo criar um grande obstáculo no processamento a jusante do produto biofarmacêutico (isto é, a purificação adicional da substância biológica a partir da cultura de células). Portanto, o processo da invenção é preferivelmente executado em um meio de cultura de células que não compreende soro a partir de uma fonte animal, incluindo ser humano. Uma vez que os compostos a partir de uma fonte de mamífero também apresentam um risco de infecção, preferivelmente o meio de cultura de células é livre de fonte de mamífero (isto é, o meio de cultura de célula não compreende soro ou componentes a partir de uma fonte de mamífero) . Mais pref erivelmente o meio de cultura de células é livre de fonte animal (isto é, o meio de cultura de células não compreende soro ou componentes a partir de uma fonte animal, incluindo ser humano. Os exemplos de meios livres de soro que podem ser utilizados para o cultivo de células PER.C6 incluem meios comercialmente disponíveis, como por exemplo, meio EX Cell™ VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino™ (HyClone) , IS ProVec CD (Irvine Scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
Em modalidades preferidas, a substância biológica produzida no processo da presente invenção é colhida a partir do fluxo cujo conteúdo é mantido em ou preferivelmente realimentado para dentro do reator ou a partir da cultura de células que é removida do reator ou a partir de ambos. A(s) substância(s) biológica(s) produzida(s) no processo da presente invenção pode(m) ser adicionalmente colhida(s) a partir da cultura de células; no denominado processamento a jusante, utilizando métodos que dependem da substância biológica, cujos métodos são bem conhecidos pela pessoa versada. 0 processamento a jusante compreende normalmente várias etapas de purificação em combinações de variação e ordem. Os exemplos de etapas de purificação no processamento a jusante são etapas de separação (por exemplo, por cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de permuta de íons e/ou extração por sistemas de duas fases aquosos e/ou precipitação, por exemplo, por sulfato de amônio), etapas para a concentração da substância biológica (por exemplo, por ultrafiltração ou diafiltração), etapas para trocar tampões e/ou etapas para remover ou inativar vírus (por exemplo, por filtração de vírus, deslocamento de pH ou tratamento detergente de solvente).
Em um aspecto, a invenção refere-se a uma cultura de células compreendendo células de mamíferos, preferivelmente células HER imortalizadas-El, mais preferivelmente células 2 0 PER.C6, tendo uma densidade de célula viável de pelo menos 50.IO6 células/mL, preferivelmente pelo menos 60.IO6 células/mL, em particular pelo menos 90.IO6 células/mL e uma concentração de substância biológica de pelo menos 5 g/L, mais pref erivelmente pelo menos 10 g/L, em particular pelo menos 11 g/L. Em princípio a concentração de substância biológica pode ser tão elevada quanto a solubilidade da substância biológica permite. A concentração de células viáveis não é tipicamente maior do que 200.IO6 células/mL; e preferivelmente compreendida na faixa de 80-150.IO6 células/mL. A densidade de célula viável pode, por exemplo, ser determinada utilizando o método de extrusão de triptano azul, por exemplo, utilizando um contador de células como comercialmente disponível a partir, por exemplo, de Innovatis (contador de células Cedex).
Com cultura de células se quer dizer o líquido compreendendo meio de cultura de células, células e substância biológica, cujo líquido é o resultado de um processo para o cultivo de células em um reator em um meio de cultura de células, onde as células produzem a substância biológica.
A invenção será elucidada agora por intermédio dos seguintes exemplos sem, entretanto, ser limitada aos mesmos.
Descrição das figuras
A figura 1/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6.ml"1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e Cl (processo da invenção).
A figura 2/9 mostra a concentração IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e Cl (processo da invenção).
A figura 3/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6.ml"1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada) , B (batelada alimentada) e C2 (processo da invenção) .
A figura 4/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C2 (processo da invenção).
A figura 5/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6.ml-1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C3 (processo da invenção).
A figura 6/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A3) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C3.
A figura 7/9 mostra o rendimento cumulativo Q (% em comparação com o rendimento no processo A, por L de volume de reator) traçado versus o tempo de processo X (dias) para o processo A, B e C3.
A figura 8/9 mostra o número de célula Y (IO6.ml"1) traçado versus o tempo de processo X (dias) para C4 (processo da invenção).
A figura 9/9 mostra a concentração de IgG no reator 2 0 Z (% em comparação com a concentração IgG máxima atingida) versus o tempo de processo X (dias) para o processo C4 (uma modalidade do processo da invenção).
Exemplos
Exemplo 1: comparação entre um processo de batelada, um processo de batelada alimentada e o processo de acordo com a invenção.
Nesse exemplo o desempenho do processo, de acordo com a presente invenção foi comparado com processos de batelada e batelada alimentada. A figura 1/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6-Tnl"1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada) , B (batelada alimentada) e Cl (processo da invenção).
A figura 2/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e Cl (processo da invenção).
Todas as fermentações foram executadas utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 3 6,5°C, o pH entre 7,2 e 6,8 e o DO em 50% de saturação de ar e em 2 00 rpm. 0 mesmo IgG produzindo linhagem de célula PER.C6 (vide WO 2004/099396) foi utilizado em todos os experimentos.
Processo de batelada A
0 processo de batelada foi executado em volume de trabalho de 4 L em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3 χ 10e5 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina e subseqüentemente cultivado por 17 dias.
Processo de batelada alimentada B
0 processo de batelada alimentada foi executado em 4 L de volume de trabalho em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3xl0e5 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina. Durante a cultura glicose e glutamina foram adicionados para manter a concentração acima respectivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e peptideos foram adicionados a partir do 5o dia para completar os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção Cl O processo da invenção foi executado em um recipiente Applikon de 2 L. Uma membrana de fibra oca de Corte de Peso Molecular de 100 kDa (MWCO) obtida a partir da General Electric (GE) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) foi utilizada para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl0e5 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mL L-glutamina. O meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina foi perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando uma Taxa de fluxo específica (SFR) entre 0,05 e 0,2 nL/célula/dia. A concentração mais elevada do produto obtida foi de 1,4 g/L.
O processo da invenção resultou em densidades aumentadas de células viáveis e concentrações aumentadas do produto em comparação com modos de cultivo mencionados em menos tempo, como pode ser visto a partir da figura 1 e figura 2 abaixo.
Exemplo 2: comparação entre um processo de batelada, um processo de batelada alimentada e o processo de acordo
2 0 com a invenção
Nesse exemplo processo, de acordo com a presente invenção, é novamente comparado com processos de batelada e batelada alimentada; no processo C2, a pressão de CO2 é controlada e um sistema de separação de 50 kDa foi utilizado.
A figura 3/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6.ml"1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada) , B (batelada alimentada) e C2 (processo da invenção).
3 0 A figura 4/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C2 (processo da invenção).
Todas as fermentações foram executadas utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5 °C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 50% de saturação de ar e em 2 00 rpm. O mesmo IgG (de aproximadamente 150 kDa) produzindo linhagem de célula PER.C6 (vide WO 2004/099396) foi utilizado em todos os experimentos.
Processo de batelada A
O processo de batelada foi executado em volume de trabalho de 4 L em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3 χ 10e5 células, ml/1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina e subseqüentemente cultivado por 17 dias.
Processo de batelada alimentada B
O processo de batelada alimentada foi executado em 4 L de volume de trabalho em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3xl0e5 células.mL"1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina. Durante a cultura glicose e glutamina foram adicionados para manter a concentração acima respectivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e peptídeos foram adicionados a partir do 5° dia para completar os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção C2
0 processo da invenção foi executado em um recipiente Applikon 2 L. Uma membrana oca de Corte de Peso Molecular de 50 kDa (MWCO) (GE) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) foi utilizada para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl0e5 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mL L-glutamina. 0 meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina é perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando uma SFR entre 0,05 e 0,2 nL/célula"1. dia"1. A pressão CO2 foi controlada abaixo de 15%.
Resultado
Como pode ser visto a partir da figura 3/9 e a partir da figura 4/9, o processo, de acordo com a invenção resulta em densidades de célula, viáveis,
significativamente aumentadas e concentrações aumentadas do produto (2415% χ rendimento de batelada; 690% χ rendimento de batelada alimentada) em tempo igual ou menor (100% tempo de batelada; 81% tempo de batelada alimentada).
0 aumento de produtividade geral em g.L^.dia"1 do processo da invenção é 23,9 vezes a produtividade de batelada em g. LT1. dia"1) e 8,5 vezes a produtividade de batelada alimentada em g. L"1. dia"1. No processo da invenção C2, 11,1 g de produto/L foi produzido. A obstrução do dispositivo de retenção não ocorreu durante 17 dias, mesmo com densidade de célula muito elevada.
Exemplo 3: comparação entre um processo de batelada, um processo de batelada alimentada e o processo de acordo com a invenção
Nesse exemplo o desempenho do processo, de acordo com a presente invenção, com remoção de cultura de célula e novamente comparado com processos de batelada e batelada alimentada; no processo C3 a cultura de células foi removida.
A figura 5/9 mostra a densidade de célula viável Y (IO6.ml"1) traçada versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C3 (processo da invenção).
A figura 6/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A3) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A (batelada), B (batelada alimentada) e C3.
A figura 7/9 mostra o rendimento cumulativo Q (% em
comparação com o rendimento no processo A, por L de volume de reator) traçado versus o tempo de processo X (dias) para o processo A, B e C3.
Todas as fermentações foram executadas utilizando um
controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 3 6,5°C; pH entre 7,2 e 6,8 e DO em 50% de saturação de ar e em 2 00 rpm. 0 mesmo IgG (aproximadamente 0 kDa) produzindo linhagem de célula PER.C6 (vide WO 2004/099396) foi utilizado em todos os experimentos.
2 0 Processo de batelada A
0 processo de batelada foi executado em volume de trabalho de 4 L em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3. IO5 células. mL"1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina e subseqüentemente
cultivado por 17 dias.
Processo de batelada alimentada B
0 processo de batelada alimentada foi executado em 4
L de volume de trabalho em um recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3.IO5 células.mL"1 em meio VPRO
3 0 (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina. Durante a cultura glicose e glutamina foram adicionados para manter a concentração acima respectivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e peptídeos foram adicionados a partir do 5° dia para completar os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção C3
0 processo da invenção foi executado em um recipiente Applikon 2 L. Uma membrana oca de Corte de Peso Molecular de 100 kDa (MWCO) (GE) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) foi utilizada para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl0e5 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mL L-glutamina. 0 meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM L-glutamina é perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando uma SPR entre 0,05 e 0,2 nL/célula-1. dia"1. A cultura de células é removida a 10% do volume de trabalho por dia acima de 10. IO6 células. mL"1 e a 30% do volume de trabalho por dia quando a densidade de célula viável excede 30.IO6 células .mL"1 e em diante.
Resultado
Como pode ser visto a partir da figura 5/9 com o processo da invenção densidades de célula, viáveis, mais elevadas são atingidas rapidamente. Além disso, a figura 5/9 também mostra que a viabilidade das células pode ser mantida mais tempo com o processo da invenção visto que o processo C3 foi mantido em operação durante um período de quase 4 0 dias, porque nenhuma obstrução do dispositivo de retenção ocorreu mesmo com densidades de célula elevadas.
A figura 6/9 mostra que as concentrações do produto para o processo da presente invenção são muito mais elevadas do que a concentração de produto no processo de batelada. 0 fluxo de produto contendo o produto foi colhido a partir do processo C3 em aproximadamente 200% a 250% vezes a concentração final no processo de batelada A.
A figura 7/9 mostra que grande parte do produto é
formada pelo processo da presente invenção e que o processo da invenção pode ser mantido por mais tempo do que o processo de batelada A ou a batelada alimentada B. No 17° dia, o rendimento cumulativo do processo C3 é 8,1 vezes o rendimento cumulativo do processo de batelada (A3) e 2,1 vezes o rendimento cumulativo do processo de batelada alimentada (B). Também, no 17° dia, o processo de batelada terminou. No 21° dia, o rendimento cumulativo do processo C3 é 3,0 vezes o rendimento cumulativo do processo de batelada alimentada B. No 21° dia, o processo de batelada alimentada terminou. Após 3 9 dias, o rendimento cumulativo geral do processo C3 é 25 vezes o rendimento cumulativo do processo de batelada A e 6 vezes o rendimento do processo de batelada alimentada B. Pode ser concluído a partir desse experimento que o
rendimento geral de um material biológico desejado no processo, de acordo com a presente invenção, pode ser adicionalmente aperfeiçoado por aplicar uma sangria da cultura de células quando a densidade de células excede certo nível elevado.
Exemplo 4: cultivo de e produção com células CHO Nesse exemplo o processo, de acordo com a presente invenção, foi executado com um IgG produzindo linhagem de célula CHO e inclui uma queda de temperatura para diminuir o crescimento de células. A figura 8/9 mostra o número de célula Y (IO6.ml"1) traçado versus o tempo de processo X (dias) para C4 (processo da invenção).
A figura 9/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração IgG máxima atingida) versus o tempo de processo X (dias) para o processo C4 (uma modalidade do processo da invenção).
A fermentação foi executada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 3 6,5°C, pH entre 7,1 e 6,9 e DO em 40% de saturação de ar e em 10 0 rpm. A temperatura caiu para 3 2°C no 5o dia.
Processo da invenção C4
0 processo da invenção foi executado em um recipiente Applikon de 2 L. 0 dispositivo de retenção de produto e célula é uma membrana de fibra oca de Corte de peso molecular 50 kD (MWCO) (General Electric) operado em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) . A cultura foi iniciada com 5. IO6 células.mL"1 em meio de cultura MTCM-49 (Hyclone). 0 meio foi perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL. célula"1. dia"1. A pressão de CO2 foi controlada abaixo de 15%.
Resultado
Os dados mostram que o processo da invenção também funciona ao utilizar uma proteína produzindo linhagem de células CHO. A densidade de células e as concentrações de produto obtidas são aumentadas em comparação com a cultura de batelada. Os dados também mostram que no processo, de acordo com a presente invenção, o crescimento de células pode ser detido (por exemplo, por uma queda de temperatura), ao passo que o acúmulo de produto no sistema de cultura continua.
Exemplo 5: Processo da invenção executado com uma linhagem de células de mieloma
0 processo, de acordo com a presente invenção, também pode ser aplicado a linhagens de célula de mieloma. Para essa finalidade, a fermentação é executada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36, 5 °C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 40% de saturação de ar e a 100 rpm. 0 cultivo de células inicia com inoculação das células de mieloma a 3xl0e5 células/ml em meio de cultura SFM4Mb (Hyclone) em um recipiente Sartorius de 5 L. 0 dispositivo de retenção de produto e célula é uma membrana de fibra oca de Corte de peso molecular de 3 0 kD (MWCO) (General Electric) operado no modo de fluxo ATF com um sistema ATF-4 (Refine Technology) . 0 meio de cultura SFM4Mab (Hyclone) é perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL. célula-1. dia-1. A pressão de C02 é controlada abaixo de 15%.
Exemplo 6: Processo da invenção executado com uma linhagem de célula MDCK
0 processo, de acordo com a presente invenção, também pode ser aplicado a linhagens de célula MDCK transformadas em suspensão. Para essa finalidade, a fermentação é executada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36, 5 °C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 40% de saturação de ar e a 10 0 rpm. O cultivo de células inicia com inoculação das células MDCK transformadas a 3xl0e5 células/ml em meio de cultura VP-SFM (Invitrogen) em um recipiente Sartorius de 5 L. O dispositivo de retenção de produto e célula é uma membrana de fibra oca de Corte de peso molecular de 3 0 kD (MWCO) (General Electric) operado no modo de fluxo ATF com um sistema ATF-4 (Refine Technology). 0 meio de cultura VP-SFM (Invitrogen) é perfundido através da cultura de células de suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL.célula- l.dia-1. A pressão de C02 é controlada abaixo de 15%.

Claims (14)

1. Processo para o cultivo de células em um reator em suspensão em um meio de cultura de células, caracterizado pelo fato de que as células produzem uma substância biológica, em que pelo menos um componente de meio de cultura de células é alimentado para a cultura de células e a cultura de células compreende as células, a substância biológica e meio de cultura de células é circunda sobre um sistema de separação e o sistema de separação separa a substância biológica a partir de substâncias tendo um peso molecular mais baixo do que a substância biológica e a substância biológica é retida em ou realimentada para o reator.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que parte das substâncias de peso molecular mais baixo é continuamente removida a partir da cultura de células.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as células são células de mamífero, preferivelmente células HER imortalizadas-El, mais preferivelmente células PER.C6.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a substância biológica é proteína recombinante, preferivelmente um anticorpo.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o sistema de separação é um filtro, preferivelmente um filtro de membrana, mais preferivelmente um filtro de fibras ocas.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cultura de células é circulada sobre o filtro em fluxo transversal, preferivelmente um fluxo tangencial alternado.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a cultura de célula é removida pelo menos uma vez a partir do reator e líquido, preferivelmente o meio de cultura de células é adicionado ao reator para compensar pela remoção de cultura de células.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura de célula são escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento de células e/ou produtividade específica das células não é limitada.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura de célula são escolhidas de tal modo que a concentração de pelo menos um dos componentes do meio de cultura de célula permanece constante.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos os nutrientes esgotados são parcial ou preferivelmente suplementados integralmente por alimentação desses nutrientes ao reator.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que opcionalmente a substância biológica é colhida a partir das células e/ou a partir da cultura de células.
12. Cultura de células caracterizada por compreender células de mamíferos tendo uma densidade de células viável de pelo menos 50xl06 células/mL e uma concentração de substânc ia biológica de pelo menos 5 g/L.
13. Cultura de células, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a concentração de substância biológica é pelo menos 10 g/L, preferivelmente pelo menos 11 g/L.
14. Cultura de células, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que as células de mamífero são células HER imortalizadas-El, preferivelmente células PER.C6.
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