PT1451290E - Uma unidade e um processo para levar a cabo a fermentação com elevada densidade celular - Google Patents

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DESCRIÇÃO "UMA UNIDADE E UM PROCESSO PARA LEVAR A CABO A FERMENTAÇÃO COM ELEVADA DENSIDADE CELULAR" A presente invenção refere-se a um processo contínuo para a cultura de linhas de células vegetais ou animais suspensas com o objectivo de produzir eficientemente produtos biológicos. A invenção também refere-se a unidades e aparelhos em que o processo de acordo com a invenção para a cultura de linhas de células vegetais ou animais suspensas pode ser levado a cabo.

As culturas celulares são altamente importantes para a produção de substâncias biologicamente activas e produtos farmaceuticamente activos. Em particular, a cultura das células, que são utilizadas frequentemente e são livremente suspensas no meio nutriente, é difícil e complicada desde então, em contraste com microrganismos ou células aderentes, são muito sensíveis a tensão mecânica e um fornecimento insuficiente de substrato. Por esta razão, as unidades e os aparelhos de acordo com a invenção e o processo técnico utilizado são crucialmente importantes para um método de produção efectivo.

Na maioria dos processos técnicos para a cultura de linhas de células vegetais ou animais suspensas, processos descontínuos são utilizados. Tais processos têm a desvantagem de que a contagem de células e as concentrações do meio nutriente e os metabólitos mudam continuamente ao longo do ciclo descontínuo em dias ou semanas e que células mortas se acumulam na última fase da fermentação e os produtos formados sofrem degradação espontânea ou enzimática. Assim processos contínuos de fermentação são recomendáveis particularmente para a produção de compostos activos instáveis. 2

Os processos contínuos são económicos e competitivos se elevadas densidades celulares puderem ser alcançadas no fermentador e correspondentemente alta produtividade é obtida. Isto requer (1) um suficiente fornecimento de oxigénio no fermentador para cobrir os elevados requisitos de oxigénio das células a elevadas densidades celulares, (2) um sistema de retenção de células que permita a retenção efectiva das células no sistema de reactor, (3) a operação a longo prazo mais fiável em termos de condições de operação estacionárias (concentrações de células, substrato, metabólito e produto) e a esterilidade de longo prazo de todo o sistema de reactor e (4) um processo robusto, simples e fácil de gerir. 0 processo precisa também levar em conta a alta sensibilidade das células em relação à tensão mecânica e um insuficiente fornecimento de substrato e a instabilidade dos produtos. A técnica anterior descreve um grande número de aparelhos, unidades e processos para a cultura de linhas celulares. As seguintes variantes de aparelhos e unidades são já conhecidas: 1. Fermentadores 0 fornecimento livre de bolhas de oxigénio por meio de membranas porosas ou de difusão é o método de fornecimento de oxigénio frequentemente seleccionado para fermentadores de cultura celular uma vez que a formação, ascensão e estouro de bolhas na superfície do líquido submete as células a graus elevados de tensão. Os agitadores recomendados para este propósito são agitadores de transporte axialmente de alta velocidade relativamente pequenos que são dispostos centralmente em estatores de membrana (por exemplo, Fenge, Fraune, Maier, 1992. BioTec, 4: 52-54). Tal desenho de reactor é desvantajoso, tanto 3 devido aos agitadores de transporte axialmente de alta velocidade que causam graus muito elevados de tensão como devido ao facto de que uma velocidade relativamente baixa e uma taxa correspondentemente baixa de transporte de oxigénio ocorre nas membranas localizadas entre a parede do recipiente e o agitador.

Um desenho de reactor é mais adequado em que o transporte de oxigénio é intensificado por grandes agitadores dispostos a uma ligeira distância desde e sobre toda a altura das membranas, embora devido aos deflectores utilizados neste desenho de reactor somente um estator de membrana relativamente pequeno e uma correspondentemente superfície de transferência de massa pequena pode ser utilizada.

Desde então, quando aumenta-se a escala do processo, a razão entre a área superficial de membrana e o volume do reactor muda de uma maneira inversamente proporcional ao diâmetro do reactor, o método mencionado anteriormente de fornecimento de oxigénio é somente adequado para pequenos reactores ou baixas densidades celulares.

Também, o fornecimento de oxigénio por meio de arejamento de bolha grande e a dispersão de bolhas por meio de agitação limita a densidade celular e a viabilidade da cultura celular devido ao grande grau de tensão mecânica envolvido. 2. Retenção de células

No passado, um número de diferentes sistemas de retenção de células foram propostos para processos contínuos de fermentação, que são apropriadamente dispostos do lado de fora do fermentador a fim de permitir o manuseio flexível. A fim de minimizar o dano as células que ocorre quando aparelhos externos são utilizados em particular como um resultado do insuficiente fornecimento de oxigénio às células e a insuficiente retirada de C02 do lado de fora do 4 fermentador, os sistemas de retenção de células com pequenos volumes de trabalho e um correspondentemente curto tempo de residência das células no sistema de retenção de células são particularmente desejáveis.

Além de filtros de membrana e unidades de filtração de fluxo cruzado com membranas estacionárias e móveis, centrífugas especiais e aparelhos de sedimentação têm sido utilizados.

Onde a retenção de células ocorre por meio de filtros de membrana, efeitos de entupimento são, contudo, observados o que torna impossível a robusta operação de longo prazo de baixa manutenção dos mesmos. Uma redução no entupimento pode ser obtida por uma alta taxa de fluxo nas membranas. Uma vez que altas velocidades nas bombas, tubagens e canais das unidades de membrana realmente, contudo, produzem tensão aumentada, a necessidade de altas velocidades é combatida pelo requisito de tratamento com baixo cisalhamento das células.

Para a retirada de células por meio de centrifugação, centrífugas especiais foram desenvolvidas as quais têm a desvantagem de submeter as células à tensão mecânica aumentada, uma vez que acelerações de mais de duzentas vezes que a da aceleração gravitacional são utilizadas para a sua retirada. Além disso, as centrífugas não operam de maneira confiável ao longo de várias semanas ou meses sem manutenção e também causam custos de operação aumentados.

Um método adicional de retirada de células de sobrenadantes de cultura celular é a utilização de unidades de sedimentação gravitacionais. As unidades de sedimentação gravitacionais predominantemente utilizadas em cultura celular são tanques de sedimentação e sistemas de canais oblíquos. Em comparação com recipientes de sedimentação simples, os sistemas de canais oblíquos têm a vantagem de um volume consideravelmente menor. 5

Os sistemas descritos até ao momento (J. Stevens, u. a. : Preprint Esact-Meeting 1993 Wurzburg; K. j. Thompson, J. S. Wilson: Preprint Esact-Meeting 1993 Wurzburg; J. a. Searles, u. a. Biotechnol. Prog. 1994, 10, 188-206; documento WO 94/26384) são sistemas contra-corrente com áreas de decantação muito pequenas (Ath = z bx L cosa < 0,2 m2; z : número de placas; bi : largura; L: comprimento de canais; a: inclinação em relação à horizontal) e podem portanto não ser utilizados para a escala de produção. O documento US 5 817 505 descreve a utilização de um separador de sedimentação para separar células de hibridoma do meio que contém anticorpos. O aumento de escala é um problema em sistemas de canais oblíquos contra-corrente, uma vez que o volume do concentrado requerido e câmaras de colecta de fase limpa do separador de sedimentação, VSf, aumenta proporcionalmente em excesso à medida que o volume de fermentador V aumenta (VSF « V1'5 à taxa de perfusão constante) e aumenta ainda mais com o aumento da taxa de perfusão q/V (VSF « (qN)2'15 a volume de fermentador constante) . A geometria da maioria dos sistemas de canais oblíquos proposta para a cultura de células realmente, contudo, previne a sua utilização numa larga escala devido à geometria não vantajosa (secções de fluxo de entrada e de fluxo de saída e comprimento do canal) e grandes volumes de trabalho resultantes. O concentrado e as câmaras de colecta de fase limpa e os canais de corrente de fluxo de entrada e saída incorporados nas mesmas são desenhados desvantajosamente nas variantes propostas. Os comprimentos do canal dos sistemas de canais oblíquos utilizados, que estão no intervalo desde 100 até 300 mm, são de maneira comparável pequenos. O comprimento do canal mais frequentemente proposto é de somente 100 mm. As características das variantes propostas não, contudo, provam ser negativas para aqueles consumidores conhecidos por terem utilizado tais sistemas uma vez que somente 6 testes numa pequena escala (com um volume de fermentador de 1 a 25 1) foram levados a cabo.

Para a fermentação com elevada densidade celular que utiliza concentrações celulares superiores a 1,5 x 107 células vivas por ml de volume do reactor um separador de sedimentação com um volume de 70 a 550 ou 50 a 500 1 seria necessário para um volume de fermentador de 100 a 200 1 (mesmo quando as células BHK de sedimentação relativamente rápida são utilizadas) se um desenho de decantador convencional é utilizado. A desejada densidade celular de 1,5 x 107 células vivas por ml de volume do reactor poderia não ser obtida em tais unidades durante longos períodos de tempo, uma vez que a taxa de crescimento preferida de μ ~ 0,4/d poderia não ser mantida devido ao longo tempo de residência no separador de sedimentação e o correspondente insuficiente fornecimento de oxigénio.

Embora o boletim da Bayer AG (1992, Chemie-Technik, 21 (3), 118) contenha uma referência a sistemas de canais oblíquos longos de 0,2 a 2,5 m, este artigo descreve sistemas de distribuição de líquidos e câmaras de colecta de concentrado que não satisfazem os requisitos que se referem a um volume de trabalho pequeno. Devido ao facto de que nas unidades reveladas o meio é injectado num dispositivo similar a copo (a fim de reduzir a turbulência na câmara receptora (32)) o volume da câmara receptora (32) por si mesmo precisa ser relativamente grande. De facto, é impossível construir tais câmaras receptoras com um dispositivo similar a copo e que têm uma geometria puramente cónica ou piramidal. A fim de colocar o dispositivo similar a copo na câmara receptora, a câmara receptora precisa de ter uma secção cilíndrica além de uma secção cónica ou piramidal, por isso, o volume da câmara receptora é aumentado. No exemplo mencionado anteriormente os volumes de trabalho do separador de sedimentação seria 7

Vs = 50 a 100 1 que é muito maior que o volume de separadores da invenção. 2.1 Arrefecimento A fim de reduzir a actividade metabólica e os depósitos de células no separador de sedimentação o arrefecimento do caldo de cultura celular no separador de sedimentação foi proposto. Devido à formação de gradientes de temperatura (e correspondentes gradientes de densidade) no interior do separador de sedimentação esta proposta fundamentalmente correcta realmente, contudo, leva a correntes de convecção. Estas, por sua vez, têm um efeito negativo sobre a efectividade da separação de células. Isto é particularmente crucial onde separadores com uma razão relativamente baixa de área superficial de separador em relação ao volume de separador são utilizados, uma vez que em tais unidades somente débitos volumétricos relativamente pequenos por volume de separador podem ser obtidos. 2.2 Vibração A fim de reduzir o tempo de residência das células em separadores de sedimentação uma vibração não definida do sistema de canais oblíquos foi proposta (Bayer AG, 1992, Chemie-Technik, 21 (3): 118; Searles, et al. 1994.

Biotechnology Progress, 10: 188- 206). 3. Um fermentador de inoculação

Para a eficiente operação de processos de fermentação uma específica densidade celular de partida é requerida nos fermentadores, uma vez que insuficientes densidades celulares de partida levam ao atraso no crescimento das células devido a uma falta de alomonas. (No caso de células animais a densidade celular de partida deve ser aproximadamente 106 células por ml) . Assim, dependendo do tamanho do fermentador de produção, vários pré-fermentadores são necessários. Para a cultura das células fermentadores operados descontinuamente com os quais densidades celulares de 5 x 106 a 8 x 106 células por ml podem ser obtidas são usualmente empregados devido ao seu modo de operação mais simples. Isto significa que, por exemplo, para inocular um fermentador de produção de 200 1 partindo de células conservadas uma expansão em série de sementes convencional com muitos frascos T e 60 garrafas rotatórias seria necessária. 4. Bombas de baixo cisalhamento e tubagens A operação do processo requer bombas e tubagens que interconectam o tanque de armazenagem, o fermentador, o separador de sedimentação externo e o recipiente de colheita. Na literatura conhecida, nenhum detalhe é dado sobre a selecção e o desenho das bombas e tubagens. Este aspecto é, contudo, altamente importante para cultura de longo prazo sob condições estéreis a altas concentrações celulares e vitalidade. Também deve-se prestar atenção à correcta disposição das bombas na unidade como um todo. A disposição de bombas na corrente de reciclagem de concentrados que leva ao fermentador, como descrito no documento W094/26384, é desvantajosa uma vez que como um resultado a suspensão celular concentrada (isto é, um grande número de células) é exposta a uma tensão mecânica muito alta nas bombas.

Com base nas considerações anteriores o problema técnico surgiu do desenvolvimento de unidades, aparelhos e um processo eficiente para fermentar células sensíveis ao cisalhamento com os quais produtos biológicos podem ser produzidos de maneira económica e com alta qualidade.

Este problema é resolvido de acordo com a invenção por meio de uma unidade de fermentação que consiste em pelo menos um tanque de armazenagem que contém o meio nutriente, bombas e tubagens, um fermentador de produção, pelo menos dois permutadores de calor de fluxo directo e um separador de sedimentação de retenção de células, que é opcionalmente equipado com um vibrador (5) . Um processo contínuo de 9 fermentação com altas taxas de perfusão é também vantajoso para resolver o problema técnico indicado.

Breve descrição da invenção A organização do processo consiste num número de aparelhos, e pelo menos um tanque de armazenagem (1) que contém o meio nutriente, bombas e tubagens (7, 8), o fermentador de produção (2) que é pelo menos intermitentemente continuamente perfundido, pelo menos dois permutadores de calor de fluxo directo (3) e um separador de sedimentação de retenção de células (4) que é opcionalmente equipado com um vibrador, os componentes da unidade sendo desenhados de tal maneira que a cultura de longo prazo em que as células cultivadas são submetidas a baixos graus de tensão mecânica pode ser levada a cabo durante tempos de processo superiores a um mês. Com a ajuda das unidades de acordo com a invenção, culturas que têm estabilidade de longo prazo ao longo de 3-5 meses a densidades celulares superiores a 1,5 x 107 células vivas por ml de volume do reactor e uma viabilidade superior a 80%, preferido 90% são obtidas. No presente contexto, a viabilidade é definida como a percentagem relativa do número total de células na cultura que consiste em células vivas.

As densidades celulares, as viabilidades e os tempos de cultura podem, contudo, ser inferiores/mais curtos dependendo do organismo e do tipo de procedimento de fermentação utilizados.

No processo de acordo com a invenção, é também possível utilizar um fermentador de inoculação especialmente desenhado operado descontinuamente e/ou continuamente (9) cujo volume de carga máxima é inferior a 6% do volume do fermentador de produção e que não obstante permite um aumento de 50 a 150 vezes em contagem de células. 10

Com a ajuda da presente invenção a alta produtividade do processo é obtida apesar da utilização de células sensíveis e produtos propensos à degradação.

Descrição detalhada da invenção A invenção refere-se a uma unidade de fermentação que difere da técnica anterior em variantes vantajosas em vários pontos da unidade. Enquanto as variantes vantajosas podem também mostrar seus efeitos vantajosos em isolamento, uma variante preferida é uma em que várias ou todas das características vantajosas da unidade de acordo com a invenção interagem. Assim, a aumentada capacidade de transferência de oxigénio do fermentador principal pode, por exemplo, ser particularmente efectiva uma vez que uma densidade celular mais alta é estabelecida na cultura devido à reciclagem de células mais efectiva no separador de sedimentação. Os efeitos sinérgicos similares para aumentar a produtividade global do processo de fermentação são também obtidos pela interacção dos outros componentes da unidade de acordo com a invenção. A invenção também refere-se a um vantajoso processo para levar a cabo processos de fermentação com elevada densidade celular em unidades de acordo com a invenção. 0 processo de acordo com a invenção torna possível utilizar efectivamente o efeito positivo das variantes da unidade de fermentação de acordo com a invenção.

No seguinte, as variantes vantajosas da unidade de fermentação são descritas: 1. O fermentador de produção

Devido ao seu desenho óptimo com relação à agitação, o fermentador de produção (2) é distinguido por uma alta taxa de transferência de massa à interface de fase gasosa/líquida e mínima tensão de cisalhamento.

Três tipos variados de fermentadores que produzem os efeitos mencionados acima foram desenvolvidos. 11

No caso do fermentador tipo A (Fig. 3) o fornecimento de oxigénio ocorre por meio de membranas de difusão. As membranas de tubo de silicio empregadas que têm pequenas espessuras de parede são ventiladas axialmente sobre um estator de tubo ao redor do agitador concentricamente (14). É vantajoso que o fermentador e o estator de tubo sejam desenhados de uma maneira delgada uma vez que isto permite que seja obtida uma superfície de transferência de massas específica de grande volume (A/V [m1]). 0 agitador é um agitador de âncora de múltiplas pás de grande área (13) que está somente a uma pequena distância, preferentemente de 5 a 15 mm, longe dos tubos de silício e cujas pás de agitador se estendem sobre todo o comprimento do estator de tubo. Mesmo a baixas velocidades de rotação do agitador e potências de agitador inferiores a 10 ou 20 watts por m3 de volume de fermentador, este tipo de desenho produz uma ligeira vibração dos tubos de silício de modo que uma intensificação adicional da transferência de massa e a limpeza simultânea das membranas ocorre durante a operação.

Para a suspensão satisfatória das células os agitadores empregados são modificados de tal maneira, de acordo com a invenção, que podem estender-se à região próxima da base do recipiente. Isto é possível por meio do afilamento das pás de agitador na região próxima da base (13a). 0 fermentador de acordo com o tipo A não contém nenhum deflector. Como um resultado, o estator de tubo pode ser muito grande e áreas superfície de transferência de massa específicas de A/V > 10/D (A: área de transferência de massa; V: volume de fermentador; D: diâmetro do recipiente) são possíveis. Assim agitadores particularmente grandes com d/D > 0,6 (d: diâmetro externo do agitador) podem ser utilizados, os quais produzem um particularmente baixo grau de cisalhamento. 12 0 movimento periférico que ainda prevalece em contraste com os sistemas que contêm deflectores surpreendentemente produz uma intensificação adicional da transferência de massa e adicional arejamento com bolhas. As bolhas de gás sofrem um movimento tangencial que a um dado tamanho de bolha produz um maior conteúdo de gás no fermentador e assim uma maior interface de fase.

Além do estator de tubo de silicone, um anel de arejamento (17) pode ser adicionalmente incorporado à base do fermentador para o adicional arejamento de bolha, isto permite um transporte adicional de oxigénio e a possivelmente requerida intensificação da retirada de C02.

Onde oxigénio puro e pressões em excesso são utilizados, nos tubos de silicone, densidades celulares muito elevadas de até 2 x 107 células vivas por ml podem ser obtidas com o fermentador do tipo A.

No caso de fermentador tipo B (Fig. 4) o fornecimento de oxigénio ocorre somente via arejamento de bolha fina com oxigénio. 0 arejamento de bolha fina é obtido por meio de corpos sinterizados especiais, placas de filtro, membranas cerâmicas ou placas perfuradas a laser (20) que têm poros ou orifícios de um tamanho muito pequeno de dL < 15 pm. Devido às baixas velocidades gás superficial de v < 0,5 m/h que podem ser utilizadas, bolhas de gás muito pequenas são formadas, o que mostra somente uma ligeira tendência a coalescer durante a agitação moderada com agitadores de baixa velocidade. A demanda de oxigénio de fermentação com elevada densidade celular pode assim ser obtida com menos de 1/10 das velocidades de gás superficial que são necessárias para o arejamento de bolha grande via orifícios mecanicamente perfurados (dL > 0,2 mm), de modo que o crescimento das células não é adversamente afectado pelo processo de arejamento. 13

Além disso, de acordo com a invenção os agitadores de pás de multiestágios de baixa velocidade grandes (18) que têm uma razão de diâmetro externo do agitador em relação ao diâmetro interno do recipiente de d/D > 0,5, preferentemente d/D > 0,6, são utilizados para a agitação, visto que foi surpreendentemente encontrado que agitadores de alta velocidade, e em particular agitadores que transportam axialmente em alta velocidade, produzem a coalescência das bolhas de gás. Estes grandes agitadores produzem distribuição de baixo cisalhamento não coalescente das bolhas de gás finas. Ao mesmo tempo, os agitadores que se estendem próximos à base e os deflectores a uma distância desde a base do recipiente produzem a suspensão e distribuição uniforme da biomassa mesmo a potências de agitador muito baixas de P/V < 5 W/m3 devido ao movimento tangencial produzido à base.

Os deflectores (19) não são incorporados numa radial, mas de uma maneira inclinada, como um resultado disso uma eficiência de transferência de massa 40% mais alta (fluxo de massa por potência de agitador especifica para o volume) e uma correspondente redução adicional na tensão sobre as células são obtidas.

Uma vez que os deflectores (19) não estão localizados na parede e não estão somente a uma distância desde a base, mas também não se estendem à superfície do líquido e são portanto, cobertos no topo pelo líquido, depósitos podem ser substancialmente evitados. Isto cria um importante pré-requisito para limpeza in situ (CIP: "cleaning-in-place").

No caso do fermentador tipo C (Fig. 5) o fornecimento de oxigénio ocorre (como no caso de B) via arejamento de oxigénio de bolha fina. Em contraste com B, um reactor sem deflector com um agitador de pá de multiestágio excentricamente disposto (21) é utilizado. A disposição excêntrica do agitador (21) intensifica a mistura axial, mas contudo, não suprime completamente o 14 componente de fluxo periférico, como é o caso quando deflectores são utilizados, e em particular deflectores de parede. Como já mencionado anteriormente o movimento periférico ainda prevalecente surpreendentemente intensifica a transferência de massa à interface de fase gasosa/liquida. As bolhas de gás sofrem o movimento tangencial que a um dado tamanho de bolha produz um conteúdo de gás mais alto e uma correspondentemente maior interface de fase. A disposição excêntrica do agitador de acordo com a invenção substancialmente previne depósitos de células e cria um pré-requisito ideal para a limpeza CIP dos fermentadores.

De acordo com a invenção, quando é utilizado oxigénio puro, densidades celulares de até 5 x 107 células vivas por ml podem ser alcançadas com o fermentador dos tipos B e C a viabilidades de > 90%. 2. O fermentador de inoculação A fim de simplificar o processo de fermentação a quantidade de semente para o fermentador de produção é produzida numa pré-cultura de estágio único. Isto é inoculado directamente pela utilização de um tubo de cultura stock sem qualquer etapa de cultura adicional. A fim de obter o aumento de 50 a 150 vezes requerido em contagem de células no fermentador de inoculação (9) um tipo especial de geometria de fermentador e um tipo especial de pré-cultura são, contudo, requeridos. Em particular, é necessário que a cultura seja inoculada a um volume de trabalho pequeno que é aumentado em tamanho durante a etapa de pré-cultura pela adição de meio nutriente. A especial geometria de fermentador foi necessária uma vez que uma concentração de células superior a 105 células por ml (preferentemente >5 105 a 106 células por ml) é requerida para a efectiva cultura de células animais. Se a 15 concentração de células é mais baixa, os metabólitos e alomonas requeridos para o rápido crescimento estão presentes numa concentração baixa demais para as requeridas altas taxas de crescimento serem obtidas.

De acordo com a invenção, o fermentador (Fig. 6) tem uma secção transversal que é afilada numa direcção descendente. Uma variante especial é de forma cilíndrica tanto na secção inferior (27a) como na secção superior (27b), a secção inferior tendo um diâmetro menor. A secção inferior assim segura somente aproximadamente 1/6 do volume total. Um encaixe de transição de forma especial conecta a secção inferior à secção superior do recipiente.

Outros reactores de acordo com a invenção têm uma forma cónica que é afilada numa direcção descendente.

Um sistema de agitação de multiestágio que consiste em vários agitadores de pá de área grande (23, 23a) e deflectores imersos próximos aos agitadores é utilizado para a agitação. 0 arejamento ocorre via micro-pulverizadores dispostos próximos à base do recipiente. De acordo com a invenção o sistema agitador é desenhado de tal maneira que a potência introduzida em cada secção transversal do reactor é suficiente para a uniforme distribuição das microbolhas e o movimento das células. Para este propósito, de acordo com a variável secção transversal do reactor, agitadores de pás que têm um diâmetro e altura de pá variáveis e distâncias variando uma da outra são utilizados.

Como uma alternativa ao sistema de reactor que utiliza deflectores, um sistema de reactor sem deflectores e com um sistema de agitador excentricamente disposto (23) é utilizado. A cultura no pré-fermentador (9) pode ser operada sucessivamente como um processo perfusão descontínuo, semicontínuo e contínuo com ou sem retenção de células. A operação contínua de pré-cultura é particularmente 16 vantajosa uma vez que densidades celulares 3-4 vezes mais elevadas são obtidas que em processos descontínuos de fermentação e material de inoculação para os fermentadores de produção pode ser proporcionado durante um período mais longo de tempo, de modo que o rápido arranque de qualquer processo de produção subsequente pode ocorrer.

Na operação contínua do processo de pré-cultura, um processo técnico análogo é utilizado a aquela da cultura de produção. A organização do processo de novo consiste num número de aparelhos e pelo menos um tanque de armazenagem que contém o meio nutriente, bombas e tubagens, o fermentador de inoculação (9) que é então continuamente perfundido, permutadores de calor de fluxo directo e um sistema de retenção de células com ou sem um vibrador, todos os componentes do processo sendo desenhados de tal maneira que cultura de baixo cisalhamento com densidades celulares superiores a 107 células vivas por ml de volume do reactor e uma viabilidade superior a 90% podem ser alcançadas. 3. Separador de sedimentação

Os separadores de sedimentação externos (4) desenvolvidos para o processo são caracterizados por um volume mínimo para uma dada área superficial de separador efectiva, como um resultado disso os tempos de residência das células do lado de fora do fermentador e o correspondente fornecimento insuficiente de oxigénio podem ser reduzidos a um mínimo.

Os separadores de sedimentação utilizados nas unidades de fermentação de acordo com a invenção contêm tubos ou canais que têm uma secção transversal rectangular e dispostos em paralelo. Os aparelhos de acordo com a invenção têm preferentemente diâmetros de tubo ou alturas de canal de 10 mm ou inferior, um comprimento de aproximadamente 0,2 a 2,5 m ou de aproximadamente 0,2 a 1,5 m e um ângulo de inclinação em relação à horizontal de α = 40-65°. 17

No caso do separador com canais paralelos que têm uma secção transversal rectangular o aparelho consiste num módulo rectangular de pressão estável (29) que é aparafusado ao recipiente de retorno de concentrado (32, 44) disposto debaixo do mesmo e a uma placa de cobertura via flanges soldadas. 0 módulo rectangular (29) contém ranhuras que determinam a altura de canal e são dispostas uma oposta à outra nos dois lados a espaçamentos constantes e nas quais placas são inseridas de acordo com a invenção que formam os limites dos canais individuais. A secção transversal do módulo é preferentemente um rectângulo cuja razão altura em relação a largura (a/bi) corresponde ao seno do ângulo de inclinação do módulo (Fig. 15) . Isto permite que a área superficial e o volume do recipiente de retorno de concentrado debaixo do módulo sejam os menores possíveis. 0 módulo é estampado a partir de um bloco sólido de material ou é soldado junto sem costura a partir de secções em forma de U pré-fabricadas ou a partir de quatro placas.

Os vários elementos estruturais são aparafusados juntos de tal maneira que a esterilidade de longo prazo pode ser garantida com a ajuda de juntas em 0.

Os separadores de sedimentação utilizados em unidades de acordo com a invenção podem ser desmontados de tal maneira que podem ser prontamente limpos e mantidos. No que se refere ao separador com canais paralelos que tem uma secção transversal rectangular, isto também aplica-se às placas (30) que formam os canais. Podem ser retirados depois da placa de cobertura ter sido desaparafusada e se for necessário limpos externamente.

De acordo com a invenção, em grandes separadores de sedimentação o módulo é montado de uma maneira rotacionável (4a) ao centro de massa do aparelho como um todo, de modo que as placas podem ser facilmente retiradas numa posição horizontal e reinseridas nas ranhuras do módulo. 18 A fim de reduzir o tempo de residência das células do lado de fora do fermentador as superfícies voltadas para cima do separador de sedimentação são fabricadas com um alto grau de lisura de superfície, e preferentemente com uma rugosidade de superfície de Ra < 0,25 pm, como definido pela norma DIN 4768, que é equivalente às normas ISO 3274 e ASME B46.1-1995.. Como uma alternativa superfícies hidrofobicamente revestidas e superfícies com um efeito de flor de lótus têm provado serem adequadas.

Um efeito de flor de lótus é entendido que seja o efeito repelente de sujeira de certas superfícies devido a uma adequada combinação de uma estrutura de superfície bem definida (rugosidade) e as propriedades do material de que se trate, tal como é observado, por exemplo, em certas plantas, tal como, por exemplo, em flores de lótus. Uma estrutura de superfície com botões microscopicamente pequenos feitos de um material adequado é, por exemplo, considerado responsável pelo efeito de flor de lótus. Um material adequado empregado é frequentemente um material hidrofóbico. 3.1 Separador de sedimentação contra-corrente

Os separadores de sedimentação contra-corrente (Fig. 8 a 12) consistem em três partes: o módulo que contém os canais (31), o recipiente de retorno de concentrado (32) e a placa de cobertura (29). A suspensão que sai do fermentador (2) é introduzida debaixo dos canais inclinados num contentor cónico ou piramidal (32) e a fase limpa é retirada acima dos canais (38) . A saída de reciclagem para o concentrado é incorporada centralmente (36) na câmara receptora no seu ponto mais baixo de modo que os aglomerados celulares escorrendo nas placas numa direcção descendente possam ser colectados na câmara receptora e reciclados no fermentador. Uma vez que na câmara receptora (32) do separador de sedimentação 19 contra-corrente tanto o fluxo de entrada da suspensão celular a ser clarificada como o retorno dos aglomerados celulares separados formados nos canais ocorrem e uma vez que de acordo com a invenção o volume deste recipiente deve ser minimizado, as caracteristicas de fluxo do recipiente e as tubagens de fluxo de entrada têm que ser desenhadas de uma maneira favorável. Em particular, quando a escala é aumentada para a utilização de grandes aparelhos qualquer promoção adicional de flutuações na velocidade (por exemplo, mediante o aparecimento de turbulência) pela corrente de fluxo de entrada precisa ser evitada. Somente neste sentido é possível assegurar que a maior porção de aglomerados separados na câmara receptora não seja ressuspensa e reintroduzida nos canais (31) . Os aparelhos desfavoravelmente desenhados que mostram este fenómeno levam a uma redução em viabilidade celular para abaixo de 80%.

Com base em considerações fundamentais com relação aos princípios de desenho de dinâmica de fluidos, que pareceram ser apropriados para o recipiente de recepção, estes foram seleccionados e optimizados adicionalmente por meio de cálculos de CFD (dinâmica de fluido computacional) e testes de experimentação especiais. Os seguintes princípios de desenho foram consequentemente desenvolvidos de acordo com a invenção: • a disposição simétrica dos canais de fluxo de entrada (34) para evitar movimento potencial cíclico na câmara receptora; • a utilização de grandes secções transversais fluxo de entrada para assegurar que as velocidades de corrente de fluxo de entrada sejam inferiores a 0,1 m/s; • a utilização de difusores de fluxo de entrada com um pequeno ângulo de ápice que produzem uma redução na velocidade com baixa turbulência; 20 • a utilização de difusores cónicos com ângulos de semi-cone inferiores a 4o ou alternativamente inferiores a 6° e onde os difusores planos são utilizados, uma diferencial longitudinal da área de secção transversal dividida pela periferia (1/P dA/ds) inferior a 0,1 (P: periferia [cm]; A: área [cm2]; s: coordenada de comprimento [cm]). • a utilização de duas correntes de fluxo de entrada radiais, preferentemente tangenciais.

No caso da variante da corrente de fluxo de entrada radial (Fig. 8) com duas correntes de fluxo de entrada directamente opostas (35) que produzem somente um fluxo de ponto de estagnação no centro da câmara receptora os pontos de entrada das correntes de fluxo de entrada são dispostos a uma clara distância desde os canais e desde a saída de reciclagem de concentrado. As distâncias são preferentemente maiores que 15 vezes a altura de canal ou preferentemente 10 vezes maiores que o diâmetro da saída de reciclagem de concentrado. O fluxo de entrada ocorre a uma altura geométrica acima da base da câmara receptora que é maior que a metade e menor que 0,8 da altura total da câmara receptora.

As variantes de corrente de fluxo de entrada em que as correntes de fluxo de entrada são dispostas tangencialmente são distinguidas pela disposição de correntes de fluxo de entrada em direcções idênticas (Fig. 9; Fig. 11) ou opostas (Fig. 10; Fig. 12).

No caso de uma corrente de fluxo de entrada tangencial e uma câmara receptora cónica, o fluxo de entrada pode preferentemente ocorrer num canal de anel (40 na Fig. 9) disposto do lado de fora do recipiente. 3.2 Separador de sedimentação de fluxo cruzado

No caso de separadores de sedimentação de fluxo cruzado, os canais são desenhados de acordo com a invenção como canais rectangulares. Os aparelhos consistem num 21 módulo que compreende os canais, a placa de cobertura e o recipiente de retorno de concentrado. No módulo, a corrente de fluxo de entrada do fermentador é disposta a um lado dos canais e a saida de fase limpa no lado oposto. Do lado de dentro das câmaras de fluxo de entrada e fluxo de saida, placas (49) podem ser construídas para a melhora da distribuição de líquidos. As placas podem ser ou placas planas ou com forma. As placas são preferentemente dispostas em proximidade imediata e preferentemente perpendicular aos canais de fluxo de entrada e fluxo de saída. A fim de assegurar uma distribuição uniforme de líquidos sobre todos os canais, o fluxo de entrada ocorre via difusores de fluxo de entrada circulares ou planos numa câmara a montante ou a jusante dos canais. De acordo com a invenção estas regiões de fluxo são desenhadas por meio da utilização de testes de dinâmica de fluido especiais de tal maneira que o fluxo laminar não separado é obtido a velocidades inferiores a 0,1 m/s e a distribuição uniforme ocorre sobre os canais dispostos em paralelo.

Além do fluxo de entrada de meio do canal de fluxo de entrada, pode ser vantajoso fornecer uma certa quantidade de caldo de fermentação directamente à câmara receptora cónica ou piramidal (44) . Este procedimento reduz o tempo de retenção de células na câmara receptora cónica ou piramidal (44).

Debaixo dos canais inclinados um recipiente cónico ou piramidal está localizado em que a saída de reciclagem de concentrado é incorporada centralmente no ponto mais baixo.

Os separadores de fluxo cruzado têm as seguintes propriedades vantajosas: • A separação e reciclagem das células não são prejudicadas, como no caso de sistemas contra-corrente, pelo fluxo contra-corrente. • O fluxo co-direcional do concentrado descendente promove o deslizamento para baixo das células sobre as 22 placas. Isto é particularmente o caso onde a razão da corrente de retorno de concentrado à corrente de fase limpa qR/q é maior que 2. • Dada uma idêntica secção transversal de canal, o recipiente de colecta de concentrado pode ser inferior a no caso do separador contra-corrente, uma vez que de acordo com o desenho do separador de fluxo cruzado, o fluxo de entrada não ocorre no recipiente de colecta de concentrado. • A câmara receptora a montante dos canais de separação e a câmara de fluxo de saida a jusante dos mesmos podem ter tais dimensões que seus volumes quando aumenta-se a escala do processo, não aumentem sobre-proporcionalmente à medida que a área de separador aumenta, que, em comparação com o separador contra-corrente representa uma vantagem crucial do separador de fluxo cruzado. • Neste tipo de separador, o comprimento do canal pode ser menor no separador de sedimentação contra-corrente. 0 menor comprimento do canal, a não existência de fluxo contra-corrente e a corrente de retorno que promove o deslizamento para baixo das células reduzem o tempo de residência das células no separador. 0 separador de fluxo cruzado é portanto preferentemente utilizado para densidades celulares extremamente elevadas. 4. Vibração A fim de acelerar a reciclagem das células e para prevenir o entupimento dos canais, vibradores operados pneumaticamente ou electricamente podem ser utilizados. São preferentemente fixos no topo ou no flange do recipiente de retorno de concentrado. A intensidade, a amplitude e a frequência da vibração é adaptada para as condições de operação e cultura e o 23 sistema de retenção de células de que se trate. A intensidade da vibração é preferentemente de 0,1 a 0,3 g, a amplitude de 0,1 a 1 mm e a frequência de 20 a 50 Hz. 5. Utilização de um ciclone, um sistema de separação ultra-sónico e um segundo aparelho de sedimentação

Para a separação e redução preliminar da massa celular a ser separada no separador de sedimentação, pode ser recomendável dispor um ciclone ou um sistema de separação ultra-sónico a montante do separador de sedimentação. Tal ciclone pode separar até 50% da massa celular e mais a uma mais baixa velocidade de fluxo de entrada, isto é, um grau de tensão mais baixo sobre as células. Um efeito similar pode ser obtido com os sistemas de separação ultra-sónico disponíveis no mercado (por exemplo, Biosep de Applikon, Schiedam, Os Paises Baixos), os quais permitem a separação parcial a taxas de perfusão tecnicamente vantajosas.

Devido à concentração celular mais baixa, uma reciclagem melhorada de células e taxas de perfusão mais altas são obtidas no subsequente processo de separação de células no separador de sedimentação. É assim possível operar o fermentador a densidades celulares mais elevadas e aumentar a produtividade do processo. A separação de grandes aglomerados celulares por um menor aparelho de sedimentação a montante ou preferentemente a jusante do separador de sedimentação tem um efeito similarmente positivo. Visto que os grandes aglomerados abrangem um maior número em percentagem de células mortas devido ao insuficiente fornecimento de substrato (difusão limitada) estas células mortas são retiradas a uma medida maior que as células vivas, a contagem de células total é reduzida e a vitalidade aumentada. 6. Bombas, tubagens e permutadores de calor

Três bombas são requeridas para a operação contínua do processo de fermentação. A primeira bomba é responsável 24 pela introdução do substrato no fermentador, a segunda bomba transporta a suspensão celular do fermentador ao separador de sedimentação e a terceira bomba do separador ao recipiente de colheita. As bombas de baixo cisalhamento têm que ser utilizadas para as duas bombas que transportam a suspensão celular e em particular para a bomba 2, de modo que nenhuma redução em vitalidade celular ocorre. De acordo com a invenção bombas de deslocamento positivo de baixa velocidade que transportam a suspensão com um baixo grau de pulsação são utilizadas. As bombas de mangueira com grandes tubos de bomba e outras bombas de deslocamento positivo sem juntas que produzem tensão de partículas inferior a 0,01 N/m2 ou inferior a 0, 004 N/m2 têm provado ser adequadas para a operação estéril de longo prazo.

Os permutadores de calor espirais que permitem o aquecimento efectivo a tempos de residência baixos são utilizados para o arrefecimento da suspensão celular a temperaturas inferiores à temperatura do fermentador antes que entre no separador e para o aquecimento da mesma até a temperatura do fermentador durante a reciclagem ao fermentador.

As tubagens e os encaixes de conexão aos aparelhos são desenhados de tal maneira que somente baixas velocidades de fluxo acima do limite de deposição das células prevalecem nas tubagens, as curvaturas nos canos são reduzidas a um mínimo e somente um alargamento da secção transversal gradual ocorre. Os encaixes de cotovelo que têm razões de raio de curvatura em relação ao diâmetro do cano de >2 são preferentemente utilizados. O alargamento de secção transversal compreende difusores com ângulos de semi-cone de até 6o, preferentemente até 4o. A redução na secção transversal e a correspondente aceleração de fluxo precisam ser limitadas de modo que as forças de inércia que ocorrem como um resultado da aceleração de fluxo permaneçam pequenas. 25 A invenção refere-se a uma unidade para levar a cabo a fermentação continua com elevada densidade celular que contém um fermentador de pré-cultura (9), um tanque de armazenamento de substrato (1), um fermentador de produção (2), um separador de sedimentação (4) e um recipiente de colheita (6) em que o separador de sedimentação tem uma área de separador com base no volume de separador de Ath/Vs á 30 m2/m3 ou mais preferido de Ath/Vs > 70 m2/m3. Ainda mais preferido são áreas de superfície de separador com base no volume de separador de Ath/Vs = 50 a 100 m2/m3. Preferentemente o separador de sedimentação é um separador de sedimentação contra-corrente. Numa concretização preferida o separador tem uma área superficial absoluta de Ath = 0,5 m2 a 10 m2 e ainda tem a alta Ath/vs como descrito acima. A invenção também refere-se a uma unidade para levar a cabo a fermentação contínua com elevada densidade celular que contém um fermentador de pré-cultura (9), um tanque de armazenamento de substrato (1), um fermentador de produção (2), um separador de sedimentação (4) e um recipiente de colheita (6) em que o separador de sedimentação tem uma câmara receptora cónica (32) ou piramidal (43) e o fluxo de entrada na câmara receptora do separador de sedimentação ocorre via pelo menos dois condutos dispostos radialmente (35), tangencialmente numa direcção idêntica (39, 42) ou tangencialmente em direcções opostas (41, 43), os condutos sendo distribuídos de uma maneira regular ao longo da secção transversal. A invenção também refere-se à unidade mencionada anteriormente em que o fluxo de entrada no separador de sedimentação ocorre via os condutos dispostos tangencialmente numa direcção idêntica num canal de anel (40) disposto do lado de fora da câmara receptora.

Além disso, a invenção refere-se a unidades para a fermentação com elevada densidade celular em que o fluxo de 26 entrada no separador de sedimentação ocorre via difusores circulares (35) que têm um ângulo de semi-cone de no máximo 6°, mais preferido 4o, ou via difusores planos (39) que têm uma diferencial longitudinal da área de secção transversal relacionada à periferia de 0,1 ou inferior, a velocidades de no máximo 0,1 m/s.

Além disso, a invenção refere-se a uma unidade para levar a cabo a fermentação continua com elevada densidade celular que contém pelo menos um aparelho de sedimentação em que a entrada para o fluxo de entrada do fermentador (45, 48) e a saída para a fase limpa (46) são dispostas em ou ao lado dos canais de sedimentação e a câmara de colecta de concentrado (44) consiste num contentor piramidal ou cónico disposto simetricamente debaixo dos canais de sedimentação e em que o fluxo cruzado é gerado nos canais verticalmente à biomassa que desliza para baixo nos canais.

Além disso, a invenção refere-se às unidades anteriores em que a razão da largura (bi) do módulo e o comprimento (L) de canais do separador de sedimentação de corrente cruzada está próxima a 1.

Além disso, a invenção refere-se às unidades anteriores em que o fluxo de entrada (35) na câmara receptora do separador de sedimentação ocorre a uma altura geométrica acima da base da câmara receptora que é superior à metade da altura total da câmara receptora e inferior a 0,8 da altura total da câmara receptora.

Uma variante da invenção contém um separador de sedimentação que consiste num módulo rectangular (29) em que canais individuais (31) são espacialmente separados um do outro por placas (30) e as ditas placas são guiadas e seguradas em ranhuras no módulo e podem, se for necessário, ser montadas ou desmontadas. A invenção também refere-se às unidades acima em que os canais de sedimentação rectangulares ou tubos de sedimentação do separador de sedimentação têm 50 cm em 27 comprimento ou mais e as correspondentes alturas de canal são inferiores a ou iguais a 10 mm.

As alturas de canal mais preferidas são aquelas entre 4 e 6 mm. Encontrou-se que alturas de canal entre 4 e 6 mm representam as alturas óptimas com relação às caracteristicas de decantação e ao volume do decantador. As alturas de canal menores levam a caracteristicas de decantação mais desfavoráveis enquanto grandes alturas de canal levam a um desfavorável alto volume do decantador. Estas alturas de canal muito pequenas são diferentes daquelas conhecidas a partir dos decantadores do estado da técnica, por exemplo, tais decantadores utilizados para a reciclagem de lodo em plantas de tratamento de águas residuais. A invenção também refere-se às unidades anteriores em que os canais de sedimentação rectangulares ou tubos de sedimentação do separador de sedimentação têm 50 cm em comprimento para o separador de contra-corrente e 20 cm em comprimento para o separador de corrente cruzada ou mais e as correspondentes alturas de canal são inferiores a ou iguais a 10 mm.

Além disso, a invenção refere-se à unidade anterior em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação são dispostas do lado de dentro de um módulo rectangular cuja razão da altura de secção transversal (a) em relação à largura de secção transversal (bi) corresponde aproximadamente ao seno do ângulo entre a horizontal e o ângulo de inclinação do módulo (Figura 15) no seu estado montado.

Além disso, a invenção refere-se a uma unidade como descrito anteriormente em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação têm uma rugosidade de superfície inferior a Ra = 0,25 pm nas suas superfícies voltadas para cima ou estas superfícies são 28 hidrofobicamente revestidas ou têm um acabamento de superfície com um efeito de flor de lótus. A invenção também refere-se a uma unidade em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação podem ser submetidos a vibrações de uma amplitude e frequência específica.

Além disso, a invenção refere-se a uma unidade para levar a cabo a fermentação contínua com elevada densidade celular que contém um fermentador de pré-cultura (9), um tanque de armazenamento de substrato (1), um fermentador de produção (2), um separador de sedimentação (4) e um recipiente de colheita (6) em que o separador de sedimentação é operado de acordo com o princípio de fluxo cruzado (Fig. 13, 14). A invenção também refere-se a unidades para levar a cabo os processos de fermentação contínua com elevada densidade celular em que o fermentador de pré-cultura (9) tem uma secção transversal que é afilada numa direcção descendente, o agitador do fermentador de pré-cultura (23) é suspenso de uma maneira excêntrica e o arejamento da pré-cultura é levado a cabo por meio de uma unidade de arejamento por micro-pulverização (25). A invenção também refere-se a unidades para levar a cabo os processos de fermentação contínua com elevada densidade celular em que um agitador de âncora de área grande (13) e um sistema de arejamento livre de bolhas axialmente ventilado (14) são utilizados no fermentador de produção. Uma unidade de arejamento (17) pode ser adicionalmente incorporada nestas unidades e as pás de agitador do agitador de âncora podem ser afiladas na região próxima à base (13a).

Ao invés do agitador de âncora, agitadores de porta também podem ser utilizados. Os agitadores de âncora ou porta têm um diâmetro preferido superior à metade do 29 diâmetro do recipiente, mais preferido 70% do diâmetro do recipiente ou 80% do diâmetro do recipiente. A invenção também refere-se a unidades para levar a cabo os processos de fermentação continua com elevada densidade celular em que um agitador de pá de área grande (18) e deflectores (19) que são inclinados numa direcção periférica e são dispostos a uma distância desde a parede, a base do fermentador e a superfície do líquido e um anel de arejamento para a micro-pulverização (17) são dispostos no fermentador de produção. A invenção finalmente também refere-se a unidades para levar a cabo os processos de fermentação contínua com elevada densidade celular em que um agitador de pá de área grande (21) é disposto de uma maneira excêntrica no fermentador de produção bem como a unidades em que um anel de arejamento para a micro-pulverização (17) é adicionalmente incorporado no fermentador de produção. A invenção também refere-se a unidades em que um hidrociclone (11) ou um sistema de separação ultra-sónico é disposto a montante do separador de sedimentação e a unidades em que um separador de aglomerados (12) é disposto a jusante da saída de reciclagem do separador de sedimentação (36).

Um separador de aglomerados no contexto da invenção é um dispositivo para retirar aglomerados celulares de um meio líquido que opera, por exemplo, de acordo com o princípio de sedimentação. Um separador de aglomerados permite a separação de aglomerados celulares de uma corrente de meios fluindo continuamente. A invenção também refere-se a unidades em que um permutador de calor de fluxo directo (3) é disposto em cada caso entre a saída do tanque de fermentação e a entrada do separador de sedimentação e entre a saída de concentrado do separador de sedimentação (36) e a entrada de reciclagem do tanque de fermentação. 30 A invenção realmente, contudo, também refere-se a um processo para levar a cabo os processos de fermentação continua com elevada densidade celular em que uma unidade de acordo com a invenção é utilizada.

Este processo pode ser levado a cabo por meio da utilização de uma pré-cultura de estágio único em que a pré-cultura é levada a cabo pelo menos intermitentemente como um processo semi-continuo e em que o volume de pré-cultura aumenta a pelo menos 5 vezes o volume inicial devido à alimentação em lotes. A pré-cultura pode também ser levada a cabo intermitentemente como um processo continuo com reciclagem de células.

No processo de acordo com a invenção é também possivel que uma pré-cultura seja levada a cabo como um processo continuo com reciclagem de células juntamente com a cultura de produção a fim de proporcionar a semeadura durante um periodo de tempo relativamente longo para a próxima cultura principal ou culturas principais levadas a cabo em paralelo. (Breve descrição das figuras)

No seguinte, exemplos práticos da invenção são descritos em mais detalhe com a ajuda de desenhos esquemáticos.

Fig. 1: A organização do processo com um tanque de armazenamento de substrato (1), bombas (8), tubagens (7), o fermentador de produção (2), permutadores de calor de fluxo directo (3), um sistema de retenção de células (4) com um vibrador (5) e um recipiente de colheita (6), um fermentador de pré-cultura (9) e um tubo de cultura stock (10).

Fig. 2: Parte da organização do processo que compreende bombas, permutadores de calor de fluxo directo, um ciclone ou sistema de separação ultra-sónico e um sistema de retenção de células montado ao centro de 31 massa e que têm um vibrador e um tanque de sedimentação disposto a jusante.

Fig. 3: Um fermentador agitado de tipo A que compreende um agitador de âncora e uma jaula de arejamento para o arejamento de tubo de silicone.

Fig. 4: Um fermentador agitado de tipo B que compreende agitadores de pá de área grande, imersos, deflectores inclinados próximos aos agitadores e micro-pulverizadores dispostos próximos à base.

Fig. 5: Um fermentador agitado de tipo C que compreende agitadores de pá de área grande que são dispostos de uma maneira excêntrica e micro-pulverizadores disposto próximos à base.

Fig. 6: Um fermentador de inoculação.

Fig. 7: Um separador de sedimentação contra-corrente com tubos dispostos em paralelo e fluxo de entrada radial na câmara receptora cónica.

Fig. 8: Um separador de sedimentação contra-corrente com canais dispostos em paralelo e fluxo de entrada radial na câmara receptora cónica.

Fig. 9: Um separador de sedimentação contra-corrente com canais dispostos em paralelo e fluxo de entrada tangencial numa direcção idêntica num canal de anel (40) disposto no lado de fora da câmara receptora cónica.

Fig. 10: Um separador de sedimentação contra-corrente com canais dispostos em paralelo e fluxo de entrada tangencial em direcções opostas numa câmara receptora cónica.

Fig. 11: Um separador de sedimentação contra-corrente com canais dispostos em paralelo e duas correntes de fluxo de entrada tangenciais direccionadas de maneira oposta separadas numa câmara receptora cónica.

Fig. 12: Um separador de sedimentação contra-corrente com canais dispostos em paralelo e duas correntes de 32 fluxo de entrada tangenciais direccionadas de maneira oposta separadas numa câmara receptora piramidal.

Fig. 13: Um separador de sedimentação de fluxo cruzado com canais dispostos em paralelo e uma entrada (45) para o fluxo de entrada do fermentador e uma saida de fase limpa (46) disposta em ou ao lado dos canais e uma câmara receptora piramidal (44) debaixo dos canais.

Fig. 14: Um separador de sedimentação de fluxo cruzado com canais dispostos em paralelo e uma entrada (48) para o fluxo de entrada do fermentador e uma saida de fase limpa (46) disposta em ou ao lado dos canais e uma câmara receptora cónica ou piramidal (44) debaixo dos canais. As placas (49) dispostas em proximidade imediata do canal de fluxo de entrada (48) e o canal de fluxo de saida (46) que são preferentemente montados perpendiculares aos canais de fluxo de entrada e fluxo de saída.

Fig. 15: Geometria do separador de sedimentação. Exemplos

Exemplo 1

Cultura contínua de células de hibridoma com fornecimento de oxigénio à base de membrana e pulverização adicional e retenção de células de contra-corrente que utiliza um fermentador de 40 litros A organização do processo de acordo com as Figs. 1 e 2 consiste num tanque de armazenagem (1) que contém o meio nutriente com 1 g/L de albumina sérica humana (HSA), três bombas com taxas de bomba de 3-30 1/h, das quais pelo menos aqueles que contactam com a suspensão celular são bombas de tubo de baixo cisalhamento e tubagens (7), o fermentador continuamente perfundido (2) que têm um volume de trabalho de 40 litros, um separador de sedimentação contra-corrente de gravidade (4) de acordo com a Fig. 8 com uma área superficial de separação teórica de Ath = 0,56 m2 (Ath = z bi L cos a; z: número de canais, bi: largura de canal, L: 33 comprimento do canal, a: inclinação de canais em relação à vertical) à um comprimento do canal de L = 630 mm e as dimensões adicionais z = 16; bi = 111 mm; α = 60° e um vibrador operado pneumaticamente (5) que submete o separador à vibração com acelerações de b = 0,1 g. O separador de contra-corrente é de alta eficiência devido à grande área de decantação específica de Ath/Vs 63 m2/m3 com base no volume de separador. O fermentador é um fermentador agitado de acordo com a Fig. 3, que têm um agitador de âncora de baixa velocidade (13) e um estator de tubo de silicone (14) que têm uma área superficial específica de 65 m2/m3. As quatro pás do agitador de âncora (13) estão a uma distância de 8 mm desde os tubos de silicone (16) e estendem-se sobre toda a altura do estator (14) . Além da membrana de silício, um pulverizador de anel (17) de acordo com a Fig. 3 com orifícios de 0,5 mm é disposto próximo ao fundo. Se a concentração celular excede 2 x 107 células/ml, a pulverização de oxigénio adicional até velocidades de gás superficial até 2 m/h é aplicada.

Após a fase de arranque de aproximadamente 12 dias, as concentrações celulares de 30 a 50 χ 107 células viáveis/mL podem ser alcançadas. Esta condição quase estacionária do sistema célula-fermentador-decantador é obtida a taxas de perfusão de 6,9 volumes de fermentador por dia. O separador de células utilizado, a esta taxa de perfusão, tem um grau médio de retenção para células vivas de R = 94,5% e um grau médio de retenção para células mortas de Rd = 92% e é justo capaz de garantir tal concentração celular em operação de longo prazo durante um longo período com viabilidades celulares (razão de número de células viáveis em relação ao número total de células) entre 75 e 85% e concentrações de anticorpos de 100 mg/L. Após 70 dias, a cultura foi interrompida.

Exemplo 2 34

Cultura contínua de células BHK com fornecimento de oxigénio à base de membrana e um sistema de retenção de células contra-corrente que utiliza um fermentador de 100 1. A organização do processo de acordo com as Figs. 1 e 2 consiste num tanque de armazenagem (1) que contém o meio nutriente com 1 g/1 de HSA, três bombas com taxas de bomba de 20 a 100 1/h, das quais pelo menos aquelas que contactam com a suspensão celular são bombas de tubo de baixo cisalhamento e tubagens (7) com diâmetros superiores a 10 mm, o fermentador continuamente perfundido (2) que tem um volume de carga de 100 1, permutadores de calor de fluxo directo (3) com área superficial de permuta de calor especifica superior a 300 m2/m3, um separador de contra-corrente de sedimentação de gravidade (4) com uma área superficial de separação teórica de Ath = 1,4 m2 a um comprimento do canal de L 960 mm e as dimensões adicionais z = 20; bi = 148 mm; α = 60° (cf. Fig. 8) e um vibrador operado pneumaticamente (5) que submete o separador à vibração com acelerações de b = 0,2 g. O separador de contra-corrente é altamente eficiente devido à área de decantação altamente especifica de Ath/Vs =77 m2/m3. O caldo de fermentação com uma temperatura de 37°C que vem do fermentador é arrefecido para entrar no separador de células para baixo pelo permutador de calor até 20°C e aquecido de volta até 37°C antes de entrar no fermentador. O fermentador é um fermentador agitado de acordo com a Fig. 3 que é agitado por um agitador de âncora de baixa velocidade (13) e um estator de tubo de silicone (14) que têm uma superfície de área de transferência de massa específica de 33 m2/m3. As quatro pás do agitador de âncora (13) estão a uma distância de 10 mm desde os tubos de silicone (16) e estendem-se sobre toda a altura do estator (14) . A uma velocidade de rotação do agitador de 20 r.p.m., que corresponde a uma entrada de potência de 15 W/m3 uma 35 entrada de oxigénio que é suficiente para a cultura de 1,5 a 2 x 107 células BHK vivas/ml é obtida quando é utilizado oxigénio puro e uma pressão de tubo interna de 2 bar.

Para o fornecimento de nutrientes para 1,5 a 2 x 107 células BHK vivas/ml, uma taxa de perfusão de 10 volumes de fermentador/d é necessária. O separador de células utilizado tem um grau médio de retenção para células vivas de R = 97% e a uma taxa de crescimento observada de t = 0,4/d é justo capaz de garantir tal concentração celular em operação de longo prazo durante um período de 3 meses com uma viabilidade celular superior a Vi = 90%.

Esta alta viabilidade celular de cultura poderia ser obtida pela temperatura mais baixa do lado de dentro do separador de células. As condições de cultura em estado estacionário são obtidas após aproximadamente 10 dias. Exemplo 3

Cultura contínua de células CHO com micro-pulverização e uma retenção de células de contra-corrente: fermentador de 200 L A organização do processo é de acordo com a Fig. 1 e 2 e consiste num tanque de armazenagem (1) que contém o nutriente com meio 1 g/1 de Pluronic, três bombas (8) com capacidades de transporte de 20 a 100 1/h, das quais pelo menos aquelas que contactam com a suspensão celular são bombas de deslocamento de baixo cisalhamento (8) e tubagens (7) com diâmetros superiores a 15 mm, o fermentador continuamente perfundido (2) que têm um volume de carga de 200 1, o permutador de calor de fluxo directo (3) com área superficial de permuta de calor específica superior a 300 m2/m3, um separador de contra-corrente de sedimentação de gravidade de acordo com a Fig. 14 com uma área superficial de separação teórica de Ath = 2,4 m2 a um comprimento do canal de 960 mm e as dimensões adicionais z = 26; bi = 194 mm; α = 60° de acordo com a Fig. 11 e um vibrador de 36 accionamento eléctrico que submete o separador à vibração com aceleração de 0,2 g. O separador de contra-corrente é de alta eficiência devido à área de decantação altamente especifica de Ath/Vs = 84 m2/m3 com base no volume de separador. O fermentador é um fermentador agitado de acordo com a Fig. 4 que é agitado por um impulsor com pás multi-etapas de grande área (18) com uma razão de diâmetro de 0,6, deflectores inclinados (19) que não contactam com a parede, a superfície do líquido e o fundo. Um pulverizador de anel equipado com oito placas metálicas sinterizadas, 0,5 pm de tamanho de poros e 10 mm em diâmetro, é disposto próximo ao fundo. A uma velocidade de oxigénio superficial de somente 0,2 m/h e uma velocidade rotacional do agitador de 25 r.p.m., que corresponde a uma entrada de potência de 9 W/m3, uma entrada de oxigénio que é suficiente para a cultura de 4 x 107 células BHK vivas/ml é obtida.

Para o fornecimento de nutrientes para 4 x 107 células CHO vivas/ml, uma taxa de perfusão de 4 volumes de fermentador/d é necessária. Para esta taxa de perfusão, o separador de células utilizou um grau médio de retenção para células vivas de R = 90%. Com a taxa de crescimento observada das células de μ = 0,4/d é possível garantir tal concentração celular em operação de longo prazo durante um período de 110 dias. A viabilidade celular permanece superior a 90% ao longo de todo o tempo de cultura. As condições de estado estacionário com elevadas densidades celulares são obtidas após uma fase de início de 15 dias. Exemplo 4:

Cultura contínua de células BHK em meios sem HSA com micro-pulverização e uma retenção de células de corrente cruzada: fermentador de 200 L A organização do processo é de acordo com as Figs. 1 e 2 e consiste num tanque de armazenagem (1) que contém o nutriente com meio 1 g/1 de Pluronic, três bombas (8) com 37 capacidades de transporte de 75 a 300 1/h, das quais pelo menos aquelas que contactam com a suspensão celular são bombas de deslocamento de baixo cisalhamento (8) e tubagens (7) com diâmetros superiores a 15 mm, o fermentador continuamente perfundido (2) que têm um volume de carga de 200 1, o permutador de calor de fluxo directo (3) com área superficial de permuta de calor especifica superior a 200 m2/m3, um separador de sedimentação de corrente cruzada de gravidade de acordo com a Fig. 14 com uma área superficial de separação teórica de Ath = 2,8 m2 a um comprimento do canal de 345 mm e as dimensões adicionais z = 46; bi = 345 mm; α = 60° e um vibrador de accionamento eléctrico que submete o separador à vibração com aceleração de 0,1 g. O separador de corrente cruzada de acordo com a Fig. 14 é de alta eficiência devido à área de decantação altamente especifica de Ath/Vs = 7 5 m2/m3 com base no volume de separador e o comprimento muito mais curto do canal que o sistema de contra-corrente utilizado no exemplo 1-3. O fermentador é um fermentador agitado de acordo com a Fig. 3 que é agitado por um impulsor com pás multi-etapas de grande área (18) com uma razão de diâmetro de 0,6, deflectores inclinados (19) que não contactam com a parede, a superfície do líquido e o fundo. Um pulverizador de anel equipado com oito placas metálicas sinterizadas, 0,5 pm de tamanho de poros e 10 mm em diâmetro, é disposto próximo ao fundo. A uma velocidade de oxigénio superficial de somente 0,15 m/h e uma velocidade de rotação do agitador de 25 r.p.m., que corresponde a uma entrada de potência de 9 W/m3 uma entrada de oxigénio que é suficiente para a cultura de 3 x 107 células BHK vivas/ml é obtida.

Para o fornecimento de nutrientes para 3 x 107 células bhk vivas/ml uma taxa de perfusão de 15 volumes de fermentador/d é necessária. O separador de células utilizado tem um grau médio de retenção para células vivas de R = 96,8% e à taxa de crescimento observada das células 38 de μ = 0,5/d é justo capaz de garantir tal concentração celular em operação de longo prazo durante um período de 100 dias. A viabilidade celular permanece superior a Vi>95% ao longo de todo o tempo de cultura. As condições de cultura em estado estacionário são obtidas após uma fase de início de 12 dias.

Quanto mais alta a taxa de perfusão, mais alta a taxa de crescimento e a viabilidade aumentada da cultura como comparada nos exemplos 1-3 é causada pelo princípio de separador de corrente cruzada que leva um mais curto tempo de residência de células do lado de dentro do separador. O processo inclui um fermentador de inoculação especialmente desenhado e operado de acordo com a Fig. 6, cujo volume de carga é menor que 6% do volume do fermentador de produção e que permite um aumento de aproximadamente 120 ou 150 vezes na contagem de células em duas semanas. A inoculação por si mesma é iniciada pela inoculação com um vial de 50 ml e um volume de partida de 2 L. Após 2 dias, o volume é completado até 5 L e após 4 dias até 12 L. Nos primeiros 4 dias, o fermentador é executado num modo descontínuo e após 5 dias num modo contínuo. A concentração celular final de 2 a 2,5 x 107 células viáveis/mL, suficiente para a inoculação do fermentador de 200 L, é obtida em somente 12 dias. O sistema de retenção de células utilizado para fermentação contínua do fermentador de inoculação é desenhado de acordo com a Fig. 9 com uma área superficial de separação teórica de Ath = 0,12 m2 a um comprimento do canal de 500 mm.

Exemplo 5: Determinação da tensão de cisalhamento turbulento T.

As bombas de baixo cisalhamento são utilizadas no processo. As bombas são seleccionadas por meio de um teste de bomba especial, em que a tensão causada pela bomba é testado numa experiência modelo que utiliza um adequado sistema de partículas modelo de uma conhecida tensão 39 superficial interfacial σ em relação ao meio aquoso de fermentação. 0 diâmetro de partículas de equilíbrio dP que estabelece por si mesmo após longos períodos de bombeamento dá a tensão de cisalhamento turbulento máxima τ = o/dP exercida pela bomba. Se o diâmetro de equilíbrio do sistema de partículas difere daquele das células ou aglomerados celulares utilizados durante a fermentação, a tensão causada pela bomba pode ser determinada pela aplicação das leis da teoria de turbulência isotrópica. A tensão de cisalhamento turbulento é calculada a partir das leis do intervalo de dissipação, de acordo com as quais tcélulas/tpartícuias modelo dcélulas/dparticulas modelo· 40

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo requerente é para a conveniência do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação dos documentos, erros ou omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade em relação a isso.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9426384 A [0017] [0024] • US 5817505 A [0017]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Fenge; Fraune; Maier. BioTec, 1992, vol. 4, 52-54 [0007] • J.A. Searles. u.a. Biotechnol. Prog., 1994, vol. 10, 188-206 [0017] • Chemie-Technik, 1992, vol. 21 (3), 118 [0020] • Bayer AG. Chemie-Technik, 1992, vol. 21 (3), 118 [0022] • Searles et al. Biotechnology Progress, 1994, vol. 10, 188-206 [0022]

Claims (30)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma unidade para levar a cabo a fermentação contínua com elevada densidade celular que contém um fermentador de pré-cultura (9), um tanque de armazenamento de substrato (1), um fermentador de produção (2), um separador de sedimentação (4) e um recipiente de colheita (6), caracterizada por o separador de sedimentação ter uma área superficial de separador de Ath/Vs > 30 m2/m1 com base no volume de separador e o separador de sedimentação ter uma câmara receptora cónica ou piramidal (32, 44) e o fluxo de entrada na câmara receptora do separador de sedimentação ocorrer por meio de pelo menos dois condutos dispostos radialmente (35), tangencialmente numa direcção idêntica (39, 34) ou tangencialmente em direcções opostas (41, 42), os condutos sendo dispostos de uma maneira regular ao longo da secção transversal.

2. Uma unidade para levar a cabo a fermentação contínua com elevada densidade celular de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o separador de sedimentação ter uma área superficial de separador de Ath h 5 m2 e, simultaneamente, uma área superficial específica de Ath/Vs â 30 m2/m1 (com base no volume de separador) ou uma área superficial específica de Ath/V > 5 m2/m1 (com base no volume de fermentador) enquanto a unidade possa ser executada a taxas de perfusão no intervalo de 5 a 15 volumes de fermentador por dia. 1 Uma unidade para levar a cabo a fermentação contínua com elevada densidade celular de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizada por o separador de sedimentação ter uma área superficial de separador de Ath/Vs 50 - 100 m2/m1 com base no volume de separador. 2

4. Uma unidade de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o fluxo de entrada no separador de sedimentação (4) ocorre via os condutos dispostos tangencialmente numa direcção idêntica num canal anular (40) localizado no lado de fora da câmara receptora.

5. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4, em que o fluxo de entrada (35) na câmara receptora do separador de sedimentação (4) ocorre a uma altura geométrica acima da base da câmara receptora que é superior a metade da altura total da câmara receptora e inferior a 0,8 vezes, mais preferido inferior a 0,75 vezes, a altura total da câmara receptora.

6. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4, em que o separador de sedimentação é operado de acordo com o principio de fluxo cruzado.

7. Uma unidade de acordo com a reivindicação 6, em que um canal de fluxo de entrada adicional transporta o meio de fermentação directamente para dentro da câmara receptora (32, 44) desse modo reduzindo o tempo de retenção de células na dita câmara receptora.

8. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 7, em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação são dispostos do lado de dentro de um módulo rectangular cuja proporção da altura da secção transversal em relação à largura da secção transversal corresponde aproximadamente ao seno do ângulo a entre a horizontal e o ângulo de inclinação do módulo no seu estado montado.

9. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 8, em que o fluxo de entrada no 3 separador de sedimentação ocorre via difusores circulares (35) que têm um ângulo de semi-cone de no máximo 6o ou via difusores planos (39) que têm um diferencial longitudinal da área de secção transversal dividido pela periferia (1/P dA/ds) de 0,1 ou inferior, a velocidades de no máximo 0,1 m/s.

10. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 9, em que o dito separador de sedimentação consiste num módulo rectangular (29) em que canais individuais (31) são espacialmente separados um do outro por placas (30) e as ditas placas são guiadas e seguradas em ranhuras no módulo e as ditas placas podem, se for necessário, ser montadas ou desmontadas.

11. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 10, em que os tubos ou canais rectangulares inclinados do separador de sedimentação têm 50 cm de comprimento ou mais e as correspondentes alturas de canal são inferiores a ou iguais a 10 mm.

12. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 10, em que os tubos ou canais rectangulares inclinados do separador de sedimentação têm 50 cm de comprimento ou mais e as alturas de canal têm de 4 a 6 mm.

13. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 6 a 7, em que o separador de sedimentação de corrente cruzada tem canais rectangulares inclinados que têm 20 cm de comprimento ou mais, e os canais têm 10 mm ou menos de altura.

14. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 6 a 7, em que o separador de sedimentação de 4 corrente cruzada tem canais rectangulares inclinados que têm 20 cm de comprimento ou mais, e as alturas dos canais têm de 4 a 6 mm.

15. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 14, em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação têm uma rugosidade de superfície inferior a Ra = 0,25 pm nas suas superfícies voltadas para cima ou estas superfícies são hidrofobicamente revestidas ou têm um acabamento de superfície com um efeito de flor de lótus.

16. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 15, em que as placas paralelas ou tubos do separador de sedimentação podem ser submetidos a vibrações de uma amplitude e frequência específica.

17. Uma unidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o fermentador de pré-cultura (9) ter uma secção transversal que é afilada numa direcção descendente, o agitador do fermentador de pré-cultura (23) é suspenso de uma maneira excêntrica e o arejamento da pré-cultura é levada a cabo por meio de uma unidade de arejamento por micro-pulverização (25).

18. Uma unidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um agitador de âncora de área grande (13) próximo da membrana e um sistema de arejamento livre de bolhas axialmente ventilado (14) são utilizados no fermentador de produção.

19. Uma unidade de acordo com a reivindicação 18, em que as pás de agitador de âncora são afiladas (13a) na área próxima da base (13a, 23a) . 5

20. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 19, em que uma unidade de arejamento (17) é adicionalmente incorporada para o arejamento.

21. Uma unidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um agitador de pá de área grande (21) e deflectores inclinados (19) que estão a uma distância da parede, da base de fermentador, e da superfície do líquido, estarem dispostos no fermentador de produção.

22. Uma unidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um agitador de pá de área grande (21) ser disposto excentricamente no fermentador de produção.

23. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 22, em que um anel de arejamento é adicionalmente incorporado no fermentador de produção para a micro-pulverização (17) .

24. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 23, em que um hidrociclone (11) ou um sistema de separação ultra-sónico é disposto a montante do separador de sedimentação (4).

25. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 24, em que um separador de aglomerados (12) é disposto a jusante da saída de reciclagem do separador de sedimentação (36, 47) .

26. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 25, em que um permutador de calor de fluxo directo (3) é disposto em cada caso entre a saída do tanque de fermentação e a entrada do separador de sedimentação (34, 45, 48) e entre a saída de concentrado do 6 separador de sedimentação (36, 47) e a entrada de reciclagem do tanque de fermentação.

27. Uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 26, em que bombas de baixo cisalhamento (8) são aplicadas as quais levam a uma tensão de cisalhamento turbulento inferior a ou igual a 0,1 N/m2.

28. Um processo para levar a cabo a fermentação continua com elevada densidade celular, caracterlzado por uma unidade de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 28 ser utilizada.

29. Um processo de acordo com a reivindicação 28 que utiliza uma etapa de pré-cultura de estágio único, caracterizado por a pré-cultura ser levada a cabo pelo menos intermitentemente como um processo semi-continuo e o volume de pré-cultura aumenta devido à alimentação em lotes a pelo menos 3 a 6 vezes o seu volume de partida.

30. Um processo de acordo com a reivindicação 29, em que a pré-cultura é levada a cabo pelo menos intermitentemente como um processo contínuo com reciclagem de células.

31. Um processo de acordo com a reivindicação 30, em que juntamente com a cultura de produção, uma pré-cultura é levada a cabo como um processo contínuo com reciclagem de células. 1/15 Fíg. 1

2/15

jJ c Φ s n QJ 3/15

14 4/15

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7/15 FIg. 7 7/15

35 8/15

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