ES2559308T3 - Procedimiento mejorado para el cultivo de células - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para el cultivo de células eucariotas en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en el que las células producen una sustancia biológica, en el que la sustancia biológica es una IgG, en el que el cultivo celular que comprende las células, la sustancia biológica y el medio de cultivo celular se hace circular sobre un filtro utilizando un flujo tangencial que resulta en un flujo de salida de líquido y un flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retro-alimenta al reactor, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, en el que el filtro tiene un tamaño de poros caracterizado por un corte de peso molecular de a lo sumo 50 kDa, adecuado para separar la sustancia biológica de sustancias que tienen un peso molecular más bajo que la sustancia biológica, en el que el flujo de salida de líquido del filtro contiene esencialmente sólo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biológica, y en el que la sustancia biológica es retenida en o retro-alimentada al reactor.

Description

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habitualmente se expresa en g.L-1.día-1. En comparación con un proceso de perfusión convencional, esta realización de la invención también es muy ventajosa, ya que combina las ventajas del procedimiento de la invención con una corriente de separación de cultivo celular que tiene una alta concentración de sustancia biológica. La alta concentración de sustancia biológica en la corriente de separación de cultivo celular hace que sea comercialmente interesante para recolectar la sustancia biológica de la misma. En un proceso de perfusión convencional, en el que se separa cultivo celular, la corriente de separación de cultivo celular no contiene suficiente sustancia biológica como para hacerla comercialmente interesante para recolectar la sustancia biológica y la corriente de separación de cultivo celular se considera, por lo tanto, habitualmente como un desecho. Por lo tanto, en esta realización de la invención, en teoría toda sustancia biológica producida se puede recolectar de una manera directa, económicamente viable y sencilla.
En una realización particularmente preferida de la invención, las condiciones de cultivo celular se eligen de manera que la tasa de crecimiento celular y/o la productividad específica de las células no está limitado y más preferiblemente de tal manera que también la concentración de al menos uno de los componentes del medio del cultivo celular tal como glucosa o glutamina permanezca constante y el cultivo celular se separa al menos una vez del reactor tan pronto como se alcanza la densidad celular deseada, y líquido, por ejemplo medio de cultivo celular se añade al reactor para compensar la separación de cultivo celular.
Preferiblemente, la tasa del flujo de salida se elige de manera que sea sustancialmente igual a la tasa de adición de al menos un componente de medio de cultivo, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular menos la tasa de la separación de cultivo celular opcional.
Células que producen una sustancia biológica son, por ejemplo, células capaces de expresar un gen que codifica la sustancia biológica. Células capaces de expresar un gen que codifica la sustancia biológica se pueden preparar, por ejemplo, mediante transfección de las células con un plásmido que contiene el gen que codifica la sustancia biológica y un gen que codifica un marcador de selección adecuado, por ejemplo un gen que codifica una resistencia a neomicina (gen marcador Neo). Células transfectadas de manera estable pueden entonces ser seleccionadas por la presión de selección, por ejemplo -en el caso de un gen marcador Neo -mediante el cultivo de las células transfectadas en presencia de G418 (genericina) y el rastreo inmediato de las células en cuanto a células que exhiban una expresión de alto nivel de la sustancia biológica. Métodos para preparar clones de células HER inmortalizadas por E1 que expresan una proteína, y métodos para cultivar este tipo de células para producir la proteína, son bien conocidos para el experto, y pueden encontrarse, por ejemplo, en el documento US 6.855.544.
Sustancias biológicas que pueden ser producidas por las células, por ejemplo mediante la expresión de un gen (recombinante) que codifican las mismas, son, por ejemplo, proteínas (recombinantes), en particular receptores, enzimas, proteínas de fusión, proteínas de la sangre tales como proteínas de la cascada de coagulación de la sangre, proteínas multifuncionales tales como, por ejemplo, eritropoyetina, virus o proteínas bacterianas, por ejemplo para su uso en vacunas; inmunoglobulinas tales como anticuerpos, por ejemplo IgG o IgM, y similares; preferiblemente una proteína, más preferiblemente un anticuerpo se produce por parte de las células. Preferiblemente, las sustancias biológicas tales como proteínas o vacunas producidas por las células se pueden utilizar como un ingrediente activo en una preparación farmacéutica. En el contexto de la presente invención, el término ‘producto’ y la expresión ‘sustancia biológica' son intercambiables.
En el marco de la presente invención, con preparación farmacéutica se quiere dar a entender cualquier preparación, que puede ser utilizada como un medicamento, en particular como un medicamento en seres humanos. Un medicamento de este tipo, por ejemplo, puede ser utilizado para el diagnóstico, o para el propósito profiláctico tal como, por ejemplo, una vacuna, y/o para fines terapéuticos tal como, por ejemplo, una enzima o proteína para la cual un paciente es deficiente, o un anticuerpo para matar células indeseadas. Una preparación farmacéutica puede contener, además, un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable, ejemplos de los cuales son bien conocidos por la persona experta en la técnica.
La línea celular PER.C6 se puede utilizar para la producción de sustancias biológicas tales como adenovirus con deleción de E1 (véase, p. ej., la patente de EE.UU. 6.994.128; Nichols et al, 2002, Propagation of adenoviral vectors: use of PER.C6 cells. En: Curiel D, Douglas JT, compiladores. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier. págs. 129-167), otros virus (véase, p. ej., el documento WO 01/38362), o proteínas recombinantes (véase,
p. ej., la patente de EE.UU. 6.855.544; Yallop et al, 2005, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volúmenes, 779-807, Jörg Knäblein (Compilador)).
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Ejemplos de proteínas que se pueden utilizar como un ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas (con el nombre de marca entre paréntesis) incluyen tenecteplasa (TN Kase™), factor antihemofílico (recombinante) (ReFacto™), interferón linfoblastoide α-n1 (Wellferon™), factor de coagulación (recombinante) (NovoSeven™), etanercept, (Enbrel™), trastuzumab (Herceptin™), infliximab (Remicade™), palivizumab (Synagis™), basiliximab (Simulect™), daclizumab (Zenapaz™), rituximab (Rituxan™), factor de coagulación (recombinante) IX (Benefix™) e interferón β-1a (Avonex™).
Ejemplos de vacunas que se pueden utilizar como un ingrediente activo en la preparación farmacéutica incluyen antígenos de proteínas aislados, ejemplos de los cuales incluyen pero no se limitan a vacuna contra el rotavirus viva, oral y tetravalente (RotaShield™), vacuna contra la rabia (RanAvert™), vacunas contra la gripe y vacuna contra la hepatitis A inactivada (VAQTA™).
El pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto y osmolaridad del medio de cultivo celular son, en principio, no críticos y dependen del tipo de célula elegida. Preferiblemente, el pH, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad se eligen de manera que sean óptimos para el crecimiento y la productividad de las células. La persona experta en la técnica sabe cómo encontrar el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad óptimos para el cultivo (véase. p. ej., el documento WO 2004/099396). Preferiblemente, para el procedimiento de la invención cuando se utilizan células HER inmortalizadas por E1, el pH se elige entre 6,6 y 7,6 y/o la temperatura se elige entre 30 y 39ºC y/o la osmolaridad se elige entre 260 y 400 mOsm/kg. Para mantener condiciones del procedimiento óptimas se desea la automatización para controlar las condiciones del procedimiento. Con el fin de optimizar las condiciones del procedimiento, por ejemplo, para obtener la detención del crecimiento para una productividad celular incrementada, durante el cultivo se puede aplicar un cambio en las condiciones de cultivo. Esto se puede establecer, por ejemplo, mediante un cambio de temperatura (tal como de 37 a 32ºC), un cambio del pH o un cambio de la osmolaridad.
El procedimiento de la presente invención puede realizarse, en principio, en cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de células. Directrices para la elección de un medio de cultivo celular y condiciones del cultivo celular son bien conocidas y se proporcionan, por ejemplo dispuesto en los Capítulos 8 y 9 de Freshney, R.I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4ª edición 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell &Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, como un componente del medio de cultivo celular una fuente de hidratos de carbono, sales y/o aminoácidos y/o vitaminas y/o lípidos y/o detergentes y/o tampones y/o factores de crecimiento y/u hormonas y/o citoquinas y/u oligoelementos. Ejemplos de fuentes de hidratos de carbono incluyen glucosa, fructosa, galactosa y piruvato. Ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo MgCI2.6H2O, MgSO4 y MgSO4.7H2O, sales de hierro, por ejemplo FeSO4.7H2O, sales de potasio, por ejemplo KH2PO4, KCI; sales de sodio, por ejemplo NaH2PO4, Na2HPO4, y sales de calcio, por ejemplo CaCI2.2H2O. Ejemplos de aminoácidos incluyen todos los aminoácidos proteinogénicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, Dpantotenato, riboflavina. Ejemplos de lípidos incluyen: ácidos grasos, por ejemplo ácido linoleico y ácido oleico. Ejemplos de detergentes incluyen Tween® 80 y Pluronic® F68. Ejemplos de tampones incluyen HEPES y Na2CO3. Ejemplos de factores de crecimiento/hormonas/citoquinas incluyen IGF (factor de crecimiento de tipo insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Ejemplos de oligoelementos son conocidos por la persona experta en la técnica e incluyen Zn, Mg y Se. El medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, también otros componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, peptona de soja o etanol amina.
Para la producción de sustancias biológicas de acuerdo con la invención, en particular si las sustancias biológicas se han de utilizar como un ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas, se prefiere medio libre de suero para medios que contienen una fuente de suero. La razón de esto es que los medios de fuente de suero pueden estar contaminados con virus, presentan el riesgo de infecciones priónicas y pueden constituir un obstáculo importante en el procesamiento aguas abajo del producto biofarmacéutico (es decir, la purificación adicional de la sustancia biológica del cultivo celular). Por lo tanto, el procedimiento de la invención se realiza preferiblemente en un medio de cultivo celular que no comprende suero de una fuente animal, incluyendo el ser humano. Puesto que los compuestos de una fuente de mamífero también presentan un riesgo de infección, preferiblemente el medio de cultivo celular está libre de una fuente de mamífero (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente de mamífero). Más preferiblemente, el medio de cultivo celular está libre de una fuente animal (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de un animal, incluyendo una fuente de ser humano). Ejemplos de medio libre de suero que se pueden utilizar para el cultivo de células PER.C6 incluyen medios comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, medio EX Cell™ VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino™ (Hyclone), IS Provec CD (Irvine Scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
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EP07002571 2007-02-06
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