CN104263700A - 改进的细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进的细胞培养方法。具体地，本发明涉及在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞，优选E1-永生化的HER细胞，更优选PER.C6细胞的工艺，其中，细胞产生生物物质，优选产生抗体，其中，向细胞培养物补料至少一种细胞培养基组分，并且，其中，包含细胞、生物物质和细胞培养基的细胞培养物在分离***上循环，并且，其中，所述分离***将生物物质与比所述生物物质分子量更低的物质分开，并且，其中，所述生物物质保留在反应器中或被回送进反应器。优选地，更低分子量的物质的一部分持续从细胞培养物中移出。

Description

改进的细胞培养方法
本申请是中国发明专利申请No.200780026810.2的分案申请。母案申请日为2007年7月4日，发明题目为“改进的细胞培养方法”。 
技术领域
本发明涉及在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞的工艺。 
背景技术
此类工艺例如从WO04/099396已知。该文中描述了如何通过优化补料分批工艺中的生长条件来提高细胞培养物的细胞密度和想要的生物材料的产率。 
此外，WO05/095578公开了一种培养细胞的工艺，其通过对包含细胞培养基和细胞的细胞培养物进行连续灌注培养来实现，其中，向细胞培养物中加入细胞培养基，细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上循环，导致产生比细胞培养物细胞密度更低的液体流出物，并且过滤器模块内部的流是交互切向流(alternating tangential flow)，其中，所述细胞产生生物物质。在WO05/095578的实施例中显示，生产了0.9g/L/天的产物，这对应于流出物中大约0.3g/L的产物浓度。 
含生物物质的液体体积越大，对生物物质的纯化就越费力。WO04/099396和WO05/095578公开的工艺中，获得的生物物质的浓度并不高。因此，对该生物物质的下游加工是麻烦的，因为需要在应用后续纯化步骤之前对生物物质加以浓缩，或者需要对大体积、低浓度的生物物质加以纯化。因此，以较低的细胞密度培养细胞导致体积生产力(productivity)较低，因此对给定的生产水平需要更大和/或更多的培养容器以及由此需要在装备上投入更多。 
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种工艺，其中，以更高的浓度从细胞培养物获得产物。 
本发明的另一目的是使得能够在延长的时间段内培养细胞和生产生物材料。 
这些目的通过在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞的如下工艺来实现，其中，所述细胞产生生物物质，其中，向细胞培养物补料至少一种细胞培养基组分，并且，其中，包含细胞、生物物质和细胞培养基的细胞培养物在分离***上循环，并且，其中，所述分离***将生物物质与比所述生物物质分子量更低的物质分开，并且，其中，所述生物物质保留在反应器中或被回送进反应器。 
具体实施方式
例如，本发明涉及在反应器中于细胞培养基中培养细胞的工艺，其中，所述细胞产生生物物质，其中，向所述反应器补料营养物和/或细胞培养基，并且，其中，包含细胞和细胞培养基的细胞培养物在孔径或分子量分离点在5至500kD之间的过滤器上循环。 
已经发现，通过使用将生物物质与分子量比生物物质低的物质相分离的分离***，可以在细胞培养物中以更高浓度积累生物物质。 
因此，本发明不同于现有技术描述的细胞培养，其允许想要的生物材料与细胞物质一起积累。 
在本发明的一种优选的实施方式中，更低分子量的物质的一部分持续从细胞培养物中移出。 
本发明的工艺的另一优点在于，较之例如分批或补料分批工艺，可以达到更高的存活细胞浓度。此外，较之例如分批或补料分批工艺，生产时间(即细胞产生生物物质的时间段)可被延长。此外，较之分批或补料分批工艺，有可能使用更小的反应器。使用更小的反应器是有益的，因为这降低了装备和设施相关的投入。 
此外，可在更短的时间内获得更高浓度的生物物质。 
我们发现，可在反应器内获得高浓度的生物物质，而不会显著减少细胞存活性以及因此不需限制生产时间。本领域技术人员将能预计到，将可能发生产物抑制，即，生物物质自身对生物物质生产的抑制，或者细胞产生的其它大分子(例如，宿主细胞蛋白、酶或细胞残骸)造成的抑制。此外，我们发现，想要的生物材料的积累不会损害分离***的功能。 
本发明的工艺在细胞密度、细胞培养物中产物浓度以及延长的培养时间等方面，较之根据WO05/095578和WO04/099396的工艺提供了相当大的好处。由此，本发明的工艺导致了对想要的生物材料的改进的生产。 
可用于生产生物物质的细胞原则上是本领域技术人员已知的能生产生物产物的所有细胞。所述细胞可以是真核的，例如，有丝真菌，例如，Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Penicillium chrysogenum，酵母，例如Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Phaffia rhodozyma，来自Pichia属的酵母，例如，Pichia pastoris，或原核的，例如，Escherichia coli、Bacillus sp，例如，B.licheniformis、B.subtilis、B.amylolipuefaciens、B.alkalophilus、Streptomycessp.、Corynebacterium glutamicum、Pseudomonassp。真核细胞的例子还例如描述于Chu，L.，Robinson，D.K.，(2001)Curr.Opinion Biotechn.，vol.12，p.180-187中。优选地，用于本发明工艺中的细胞是动物细胞，特别是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的例子包括CHO(中华仓鼠卵巢)细胞、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞、人淋巴母细胞)、E1永生化的HER细胞、小鼠细胞(例如NS0细胞)。更优选地，使用E1永生化的HER细胞，最优选使用PER.C6细胞。 
可从胎儿分离初级人胚视网膜(HER)细胞(Byrd P，Brown KW，Gallimore PH.1982.Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA.Nature 298：69-71，Byrd PJ，Grand RJA，Gallimore PH.1988.Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A+ras.Oncogene 2：477-484)。培养若干传代后，初级细胞将死亡。就本发明的目的而言，E1永生化的HER细胞得自初级HER细胞，这是通过在其中表达编码腺病毒 E1A和E1B蛋白的DNA，来获得永生化细胞的。这类经永生化的细胞可培养超过100次传代。用于获得E1永生化HER细胞的方法例如已被描述于美国专利5,994,128，描述于Byrd P，Brown KW，Gallimore PH.1982 Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA.Nature 298：69-71，描述于Byrd PJ，Grand RJA，Gallimore PH.1988.Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A+ras.Oncogene 2：477-484，且描述于Gallimore，P.H.，Grand，R.J.A.and Byrd，P.J.(1986).Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40，adenovirus and ras oncogenes.AntiCancer Res.6，p499-508中。例如，通过用含腺病毒血清型5(Ad5)E1A-和E1B-编码序列(Ad5核苷酸459-3510)的质粒(处于人磷酸甘油酸激酶(“PGK”)启动子控制下)转染初级HER细胞，来产生永生化的HER细胞，包括PER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8和PER.C9细胞(见，美国专利5,994,128)。 
在一种优选的实施方式中，本发明工艺中的细胞是E1-永生化的HER细胞，更优选地，是PER.C6细胞(见美国专利5,994,128)。PER.C6细胞的例子是以ECACC No.96022940保藏的细胞(见，例如，美国专利5,994,128、EP 0833934 B1)。 
在本发明的工艺中，可以在悬浮液中对任何形式的细胞进行培养，例如，作为被固定的细胞、单个细胞或在细胞簇中或者作为其组合。优选地，细胞作为单个细胞和/或作为不超过100个细胞(更优选不超过20个细胞)的小细胞簇被培养。细胞例如可被固定到微载体上，例如，可从例如GE Healthcare商业获得的微载体(Cytodex)。 
反应器在本文中被定义为包含细胞培养物的***，所述细胞培养物进而包含细胞和细胞培养基。其优选提供无菌屏障，例如空气过滤器，以防止其它细胞污染想要的细胞，并且，其通过提供正确的培养条件(例如，混合、温度、pH、氧浓度等)来保持对细胞有利的环境。 
反应器例如可以是更为永久的性质的，例如，反应器可以是不锈钢或玻璃的，或者例如可以是可弃置的，例如，反应器可以是塑料瓶或塑料 袋。适合用于本发明的反应器的例子包括但不限于：搅拌槽容器、空运用(airlift)容器和可弃置容器，它们可通过摇动、振荡运动或搅拌来进行混合。优选使用可弃置(生物)反应器，因为它们仅需要相对低的投资成本，具有强大的操作灵活性、短的周转时间，并且易于针对工艺对其加以配置。可弃置(生物)反应器可商业获得，例如从Hyclone、Sartorius、Applikon或Wave获得。 
术语“分离***”在本发明上下文中被定义为能基于分子量进行分离的***。用于本发明工艺中的分离***能将生物物质与分子量比所述生物物质低的物质分开。换句话说，分子量分离点被选择为：使得所述分子量分离点(MWCO)小于所述生物物质的分子量，更优选以至少2的因子，最优选以至少3的因子小于所述生物物质的分子量。典型地，分离***的MWCO优选为至少5kDa，更优选至少10kDa，最优选至少30kDa，优选至多500kDa，更优选至多300kDa，最优选至多100kDa，但是当然这将取决于本发明的工艺所生产的生物物质的分子量。例如，对于分子量为150kDa的IgG来说，具有至多50kDa的MWCO的分离***是最优选的。 
分离***的例子包括但不限于：过滤器、离心机和水性两相萃取***。 
术语“过滤器”在本文中使用时表示包括具有基于分子量或大小来分离颗粒的能力的所有设备。原则上，在本发明的工艺中，任何过滤器都可使用，只要选用的孔径或MWCO能使得生物物质与分子量比生物物质低的物质分开即可，典型地，这将是5至500kDa之间的MWCO或孔径。适合用于本发明的过滤器的例子包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形式来使用，过滤器可以例如是螺旋卷绕状(spiral wound)或管状的，或者可以以片状形式使用。优选地，在本发明的工艺中，所用的过滤器是膜过滤器，优选地，中空纤维过滤器。术语“中空纤维”表示管状的膜。所述管的内径为至少0.1mm，更优选为至少0.5mm，最优选为至少0.75mm，优选地，管的内径至多10mm，更优选至多6mm，最优选至多1mm。包含中空纤维的过滤器模块可从例如 General Electric(GE，以前的Amersham)商业获得。 
通过将包含生物物质、细胞和细胞培养基的细胞培养物在分离***上循环，生物物质和细胞留在反应器中，液体流出物因此比具有比细胞培养物更低的生物物质含量和更低的细胞密度。通常，在本发明的工艺中，液体流出物不含或很少含任何生物物质和细胞。通常，液体流出物基本上仅含分子量比所述生物物质低的组分。因此，基本上所有细胞和基本上所有生物物质通常都留在反应器中。 
优选地，过滤器的孔径或MWCO被选择为：使得过滤器的孔径或MWCO比产物的直径或分子量要小，更优选以至少2的因子，最优选至少3的因子小，以确保产物的高驻留。典型地，分离***的孔径或MWCO优选为至少5kDa，更优选至少10kDa，最优选至少30kDa，和/或所述过滤器/膜的孔径或MWCO优选至多500kDa，更优选至多300kDa，最优选至多100kDa，但是当然这将取决于本发明的工艺所生产的生物物质的分子量。 
分子量分离点(MWCO)表示：分子量大于其的颗粒中至少90％都留在分离***中。 
将细胞培养物在分离***(例如过滤器)上循环表示：细胞培养物经过分离***(例如过滤器)，产生液体流出物和其中内含物被保持在反应器中或回送进反应器的流。其中内含物被保持在反应器中或回送进反应器的流通常基本上仅含分子量至少等于生物物质或分子量更高的组分，因此所述的流将比液体流出物包含更多的生物物质。 
原则上，在本发明的工艺期间，细胞培养物何时在分离***上循环并非关键。细胞培养物的循环可例如从工艺开始时直接开始，或者当细胞的存活细胞密度达到某个水平时才开始。 
细胞培养物在过滤器上的循环可以是相对过滤器表面来说基本垂直的流，这也被称为尽头(dead-end)流，或其可以是与过滤器表面基本平行的流，这也被称为切向流，例如单向切向流(TFF)或交叉流(cross-flow)。交叉流的一种优选例子是交互切向流(ATF)，因为采用ATF时发现，不会(迅速)发生过滤器阻塞，即使是在非常高的细胞密度下。通 常公知，在深度过滤中，需要通过渐进的前过滤器来保护最后的小孔径过滤器免受阻塞。该实践基于下述公知常识：具有较小孔或较小MWCO的的过滤器更容易阻塞，由此限制了生产时间。如果使用ATF，那么就不必要使用前过滤器了。 
可通过移动细胞培养物，或者通过移动过滤器，或者移动两者，来引导流。例如可通过旋转(旋转式过滤器)或振动(振动式过滤器)来移动过滤器。或者，如果仅通过移动细胞培养物来引导流，那么过滤器是静止的，例如可以通过泵或压力来移动细胞培养物。 
“交互切向流”表示，有一条与过滤器表面同样方向(即，与其切向)的流，所述的流往复运动，并且，还有一条与所述过滤器表面方向基本垂直的流。交互切向流可根据本领域技术人员已知的方法来获得(例如，如US 6,544,424所述)。 
在对细胞的培养期间，至少一种细胞培养基组分，例如，一种或多种营养物和/或细胞培养基，可被补料给细胞。在根据本发明的工艺中，部分补充，或者优选地，全部补充消耗的营养物中的至少一种是有好处的，这通过将该营养物或这些营养物补料至反应器来实现。例如，可向反应器补料完全细胞培养基，这是有好处的，因为这样就无须再分别制备单独的补料了。细胞培养基例如还可以更浓缩的形式补料给细胞，这是有好处的，因为较小的体积更易于操作。此外，可向反应器补料一种或多种营养物。例如，碳水化合物，例如葡萄糖或果糖；氨基酸，例如谷氨酰胺；和/或肽可有利地补料至反应器。 
在本发明的一种优选的实施方式中，选用这样的细胞培养条件，使得细胞生长速率和/或细胞的比生产力不受限制，更优选地，使得细胞培养基组分中的至少一种的浓度保持基本上恒定。限制细胞培养条件的例子是营养物限制和抑制性代谢物(例如氨、二氧化碳和乳酸盐)的形成。例如，细胞培养条件(例如，补料)可被选择为：使得细胞生长速率不受限制，这例如通过提供足够的营养物以补偿消耗和/或避免抑制性代谢物(例如如酸盐或氨)的产生来实现。例如，可选用通气条件，使得二氧化碳形成不会限制细胞生长速率。从Good Manufacturing Practice(GMP)的观点来 看，在非限制性条件下培养细胞是高度有好处的，因为，1)这能提供恒定的细胞培养环境，在很多情况下还会提供恒定、良好的产物品质，以及2)这可导致高的细胞存活率，在一些情况下，导致细胞存活率超过98％。高细胞存活率降低了细胞相关污染物(例如宿主细胞蛋白)的释放，这有助于对产物的纯化。此外，以不受限制的细胞培养速率和/或不受限制的比生产力来培养细胞具有商业优点，从而得以在进一步更短的时间内生产出更多的生物物质，因为，在所述工艺中可更早达到更高的细胞密度。 
细胞的“比生产力”是每时间单位每个细胞产生的给定生物物质的量，其通常被表示为pg.细胞-1天-1。 
向细胞培养物添加至少一种细胞培养基组分(例如营养物和/或细胞培养基)的速率(流入速率或灌注速率)影响细胞的存活性和密度。在本发明的工艺中，细胞培养基组分(例如营养物和/或细胞培养基)可例如以连续的流、半连续的流(例如分步的流)或间隔的(staggered)流来补料。优选地，细胞培养基组分(例如营养物和/或细胞培养基)以连续的流添加。 
细胞培养基组分，例如完全细胞培养基和/或营养物，原则上可以在所述工艺期间的任何时候补料至反应器。优选地，补料在谷氨酰胺和葡萄糖等底物达到低至导致细胞停止生长的水平前启动，或在抑制性代谢物(例如乳酸盐或氨)达到高至生长将停止的水平前启动。从该时起，细胞培养基组分(例如营养物和/或完全细胞培养基)优选以使得达到底物需求的速率补料至反应器。 
在本发明的一种实施方式中，细胞培养基以根据式(1)的补料速率添加： 
补料速率＝SFR×(总细胞培养物体积)×(存活细胞密度)   (1) 
其中，补料速率以每天的升数表示，其中，SFR是比补料速率，即，以每时间单位相对于每个存活细胞添加的培养基体积表示的细胞培养基补料至细胞培养物的速率，其中，存活细胞密度是每体积单位存活细胞的数量。存活细胞的数量可由本领域技术人员来测定，例如，通过台盼蓝 (Trypan Blue)排除方法。比补料速率优选被选择为0.01至0.3nL/细胞/天之间，更优选在0.01至0.2nL/细胞/天之间。 
调节补料速率时考虑到其它参数可能是有好处的，例如，向培养物补料的葡萄糖的量和/或氧吸收速率。例如，对于PER.C6而言，细胞培养基和/或营养物的补料速率优选被选择为：使得葡萄糖浓度保持在3至20mmol/L之间，更优选在5至15mmol/L之间。优选地，葡萄糖浓度为至少3mmol/L，更优选至少5mmol/L，优选至多20mmol/L，更优选至多15mmol/L。 
在本发明的一种特别的实施方式中，至少一次从反应器移出细胞培养物(包含细胞、生物物质和细胞培养基)，并向反应器中加入液体(例如，细胞培养基或营养物补料)，以补偿细胞培养物的移出。细胞培养物的移出可导致更高细胞密度下进行更长的处理时间，并且组合高的细胞存活率，这导致了更高的生产力。细胞培养物可连续或分步移出。 
在本发明的一种优选的实施方式中，只要达到想要的细胞密度，例如，至少10×106个存活细胞/ml，优选至少20×106个存活细胞/ml，更优选至少30×106个存活细胞/ml，例如，至多200×106个存活细胞/ml的细胞密度，就从反应器中移出细胞培养物(包含细胞、生物物质和细胞培养基)，并且向反应器中加入液体(例如细胞培养基或营养物补料)，以补偿细胞培养物的移出。优选地，以使得细胞密度保持在想要的细胞密度范围内的速率来移出细胞培养物。较之传统的分批或补料分批工艺，本发明的该实施方式是高度有利的，因为其将本发明工艺的优点与可被保持更长时间的高存活率组合起来，使得得以实现进一步更高的总体积生产力。“体积生产力”表示每单位时间每单位反应器体积产生的生物物质的量，其通常被表示为g.L-1.天-1。较之传统灌注工艺，本发明的该实施方式是高度有好处的，因为其将本发明工艺的优点和具有高浓度生物物质的细胞培养物移出流组合到一起。细胞培养物移出流中高浓度的生物物质使得从其中收获生物物质具有商业价值。在其中移出细胞培养物的传统灌注工艺中，细胞培养物移出流含有的生物物质并不足以使得收获所述生物物质具有商业价值，因此细胞培养物移出流通常被认为是废料。因此，本发明的 该实施方式中，理论上可以以直接、经济可行且简单的方式收获产生的所有生物物质。 
在本发明的一种特别优选的实施方式中，选用这样的细胞培养条件，使得细胞的细胞生长速率和/或比生产力不受限制，更优选地，还使得细胞培养基的至少一种组分(例如葡萄糖或谷氨酰胺)的浓度保持恒定，并且，只要达到想要的细胞密度，至少进行一次从反应器移出细胞培养物的操作，并且，向反应器加入液体(例如细胞培养基)，以补偿细胞培养物的移出。 
优选地，流出物的速率被选择为：使得其与至少一种细胞培养基组分(例如营养物和/或细胞培养基)的添加速率减去任选的细胞培养基移出速率基本等同。 
产生生物物质的细胞例如是能表达编码生物物质的基因的细胞。可例如通过用含有编码生物物质的基因和编码合适的选择标记的基因(例如，编码新霉素抗性的基因(Neo标记基因))的质粒转染细胞，从而制备能表达编码生物物质的基因的细胞。然后可通过选择压力来选出经稳定转染的细胞，例如，在Neo标记基因的情况下，通过在存在G418(genericin)的情况下培养经转染的细胞以及针对展示出生物物质高水平表达的细胞对细胞加以立即筛选。用于制备表达蛋白的E1-永生化HER细胞的克隆的方法以及用于培养此类细胞以生产所述蛋白的方法都是技术人员公知的，例如可在US 6,855,544中找到。 
可通过细胞产生的生物物质，例如通过表达编码(重组)基因编码来产生的生物物质，因此例如是(重组)蛋白，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白(例如来自凝血级联的蛋白)、多功能蛋白(例如***)、病毒或细菌蛋白(例如用于疫苗的)、免疫球蛋白(例如抗体，例如IgG或IgM)等；优选地，通过细胞产生蛋白，更优选地，产生抗体。优选地，通过细胞产生的生物物质，例如蛋白或疫苗可用作为药物制剂中的活性成分。在本发明的上下文中，术语“产物”和“生物物质”可交换使用。 
在本发明的上下文中，药物制剂表示可用作为药品(特别是用于人的 药品)的任何制剂。此类药品可以例如用于诊断或用于预防目的(例如，疫苗)和/或用于治疗目的，例如患者缺乏的酶或蛋白，或者用于杀死不想要的细胞的抗体。药物制剂还可含有可药用载体或赋形剂，它们的例子是本领域技术人员公知的。 
PER.C6细胞系可用于生产生物物质，例如E1-缺失的腺病毒(见，例如美国专利6,994,128；Nichols et al，2002，Propagation of adenoviral vectors：use of PER.C6 cells.In：Curiel D，Douglas JT，editors.Adenoviral vectors for gene therapy.San Diego：Elsevier.p 129-167)、其它病毒(见，例如，WO 01/38362)或重组蛋白(见，例如美国专利6,855,544；Yallop et al，2005，PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins，Modern Biopharmaceuticals：Design，Development and Optimization，4Volumes，779-807，(编辑))。 
可用作为药物制剂中活性成分的蛋白的例子包括(括号内是商品名)：Tenecteplase(TN KaseTM)、(重组)抗血友病因子(ReFactoTM)、淋巴母细胞干扰素α-n1(WellferonTM)、(重组)凝血因子(NovoSevenTM)、Etanercept(EnbrelTM)、Trastuzumab(HerceptinTM)、Infliximab(RemicadeTM)、Palivizumab(SynagisTM)、Basiliximab(SimulectTM)、Daclizumab(ZenapazTM)、Rituximab(RituxanTM)，(重组)凝血因子IX(BenefixTM)和干扰素β-1a(AvonexTM)。 
可用作为药物制剂中活性成分的疫苗的例子包括：经分离的蛋白抗原，其例子包括但不限于活的、口服的、四价的轮状病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、流感疫苗和灭活甲肝疫苗(VAQTATM)。 
细胞培养基的pH、温度、溶解氧浓度和同渗容摩(osmolarity)原则上并非关键，它们取决于所选用的细胞的类型。优选地，pH、温度、溶解氧浓度和同渗容摩被选择为：使得对于细胞的生长和生产力来说是最佳的。本领域技术人员知道如何找到培养物的最佳pH、温度、溶解氧浓度和同渗容摩(见，例如WO 2004/099396)。优选地，对于本发明的工艺 而言，当使用E1永生化的HER细胞时，选用6.6至7.6之间的pH，和/或选用30至39℃之间的温度和/或选用260至400mOsm/kg之间的同渗容摩。为保持最佳工艺条件，对工艺条件控制的自动化是人们想要的。为了对工艺条件进行优化，例如为了获得生长阻碍用于增加细胞生产力，在培养期间，可应用培养条件的变更。这可例如通过温度变更(例如从37至32℃)、pH变更或同渗容摩变更来实现。 
本发明的工艺原则上可以在适于培养细胞的任何类型的细胞培养基上进行。选择细胞培养基和细胞培养条件的指导是公知的，例如被提供于Freshney，R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques)，4th edition 2000，Wiley-Liss and in Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&Tissue culture：Laboratory Procedures 1993，John Wiley&Sons的第8和9章中。 
例如，细胞培养基可例如包含碳水化合物来源、盐和/或氨基酸和/或维生素和/或脂类和/或去垢剂和/或缓冲剂和/或生长因子和/或激素和/或细胞因子和/或痕量元素作为细胞培养基组分。碳水化合物来源的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和丙酮酸盐。盐的例子包括：镁盐，例如MgCl2.6H2O、MgSO4和MgSO4.7H2O，铁盐，例如FeSO4.7H2O，钾盐，例如KH2PO4、KCl；钠盐，例如NaH2PO4、Na2HPO4，和钙盐，例如CaCl2.2H2O。氨基酸的例子包括所有已知的形成蛋白质的氨基酸，例如组氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甲硫氨酸。维生素的例子包括：抗坏血酸盐、生物素、胆碱氯、肌醇、D-泛酸盐、核黄素。脂类的例子包括：脂肪酸，例如，亚油酸和油酸；去垢剂的例子包括和缓冲剂的例子包括HEPES和Na2CO3。生长因子/激素/细胞因子的例子包括IGF(***)、肾上腺皮质素和(重组)胰岛素。痕量元素的例子是本领域技术人员已知的，其包括Zn、Mg和Se。细胞培养基还可例如包含其它细胞培养基组分，例如大豆蛋白胨或乙醇胺。 
为按照本发明来生产生物物质，特别是如果生物物质将要用作为药物制剂中的活性成分的话，不含血清的培养基相对含血清来源的培养基是优选的。其理由是：血清来源的培养基可能被病毒污染，存在朊性 (prionic)感染的风险，并且可能对生物药物产品的下游加工(即，从细胞培养物中对生物物质的进一步纯化)造成大的障碍。因此，本发明的工艺优选在不包含来自动物(包括人)来源的血清的细胞培养基中进行。鉴于来自哺乳动物来源的化合物也存在感染风险，因此，优选地，细胞培养基是非哺乳动物来源的，即，细胞培养基不包含来自哺乳动物来源的血清或组分。更优选地，细胞培养基是非动物来源的，即，细胞培养基不包含来自动物(包括人)来源的血清或组分。可用于培养PER.C6细胞的不含血清的培养基的例子包括可商业获得的培养基，例如，EX CellTM VPRO培养基(SAFC)、CDM4RetinoTM(HyClone)、IS ProVec CD(Irvine scientific)、293-SFM II(invitrogen)。 
在一些优选实施方式中，从其中内含物被保持在反应器中或优选被回送进反应器的流来收获本发明的工艺中产生的生物物质，或从由反应器移出的细胞培养物中收获，或者从两者中收获。还可在所谓的下游加工中使用取决于生物物质的方法(所述方法是技术人员公知的)，从细胞培养物中收获本发明工艺中产生的生物物质。下游加工通常包含以各种组合和顺序进行的若干纯化步骤。下游加工中纯化步骤的例子是分离步骤(例如，通过亲和色谱和/或离子交换色谱和/或通过水性两相***萃取和/或通过例如硫酸铵沉淀)、用于浓缩生物物质的步骤(例如通过超滤或渗滤)、用于更换缓冲液的步骤和/或用于移出或灭活病毒的步骤(例如，通过病毒过滤、pH变更或溶剂去垢剂处理)。 
在一个方面，本发明涉及包含哺乳动物细胞，优选E1-永生化的HER细胞，更优选PER.C6细胞的细胞培养物，其具有至少50×106个细胞/mL，优选至少60×106个细胞/mL，特别是至少90×106个细胞/mL的存活细胞密度以及至少5g/L，更优选至少10g/L，特别是至少11g/L的生物物质浓度。原则上生物物质的浓度可高达至生物物质的溶解度所允许的程度。存活细胞的浓度典型地不超过200×106个细胞/mL，优选在80-150×106个细胞/mL的范围内。 
存活细胞密度例如可这样来测定：使用台盼蓝排除方法，例如通过使用细胞计数器(可从例如Innovatis(Cedex细胞计数器)商业获得)来进 行。 
细胞培养物表示包含细胞培养基、细胞和生物物质的液体，所述液体是在反应器中在细胞培养基中培养细胞的工艺的结果，其中，所述细胞产生所述生物物质。 
现在将通过下述实施例来阐述本发明，但下述实施例并不对本发明加以限制。 
附图说明
图1显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C1(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图2显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C1(本发明的工艺)的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
图3显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C2(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图4显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C2(本发明的工艺)的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
图5显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C3(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图6显示了针对工艺A和C3的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A3中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
图7显示了针对工艺A、B和C3的累积产率Q(相对于工艺A中的产率的％，每升反应器体积)对工艺时间X(天)的作图。 
图8显示了针对工艺C4(本发明的工艺)的细胞数量Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图9显示了针对工艺C4(本发明的工艺的一种实施方式)的反应器Z中的IgG浓度(相对于达到的最大IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
实施例
实施例1：对分批工艺、补料分批工艺和根据本发明的工艺之间的比较
在该实施例中，将根据本发明的工艺的表现与分批和补料分批工艺相比较。 
图1显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和Cl(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图2显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C1(本发明的工艺)的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
所有发酵都采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为36.5℃，pH控制为7.2至6.8之间，在DO为50％空气饱和度以及200rpm条件下进行。在所有实验中都使用相同的产生IgG的PER.C6细胞系(见WO 2004/099396)。 
分批工艺A
分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以3×10e5个细胞/mL接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中，随后培养17天。 
补料分批工艺B
补料分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以3×10e5个细胞/mL接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中。在培养期间，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持浓度分别超过15mM和1mM。从第5天起添加氨基酸和肽，以补充消耗的氨基酸。 
本发明的工艺C1
本发明的工艺在2L Applikon容器中进行。用ATF-2***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有100kDa分子量分离点(MWCO) 的中空纤维膜(从General Electric(GE)获得)被用于保留细胞和IgG产物。培养以补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中的3×10e5个细胞/mL开始。使用0.05至0.2nL/细胞/天之间的比流速(SFR)，经由悬浮细胞培养物灌注补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)。获得的最高产物浓度为1.4g/L。 
本发明的工艺较之前文提到的培养模式而言，以较少的时间产生了增加的存活细胞密度以及增加的产物浓度，这可从图1和图2中看到。 
实施例2：对分批工艺、补料分批工艺和根据本发明的工艺之间的比较
在该实施例中，再次将根据本发明的工艺的表现与分批和补料分批工艺相比较；在工艺C2中，CO2压力被控制，并且使用50kDa的分离***。 
图3显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C2(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图4显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C2(本发明的工艺)的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
所有发酵都采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为36.5℃，pH控制为7.2至6.8之间，在DO为50％空气饱和度以及200rpm条件下进行。在所有实验中都使用相同的产生IgG(大约150kDa)的PER.C6细胞系(见WO 2004/099396)。 
分批工艺A
分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以3×105个细胞.mL-1接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中，随后培养17天。 
补料分批工艺B
补料分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以 3×105个细胞.mL-1接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中。在培养期间，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持浓度分别超过15mM和1mM。从第5天起添加氨基酸和肽，以补充消耗的氨基酸。 
本发明的工艺C2
本发明的工艺在2L Applikon容器中进行。用ATF-2***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有50kDa分子量分离点(MWCO)的中空纤维膜(GE)被用于保留细胞和IgG产物。培养以补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中的3×10e5个细胞/mL开始。使用0.05至0.2nL.细胞-1.天-1之间的SPR，经由悬浮细胞培养物灌注补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)。CO2压力被控制为低于15％。 
结果
如从图3和图4可见，根据本发明的工艺在相等或更短的时间(分批时间的100％；补料分批时间的81％)内产生了显著增加的存活细胞密度和增加的产物浓度(2415％x分批的产率；690％x补料分批的产率)。 
本发明工艺总生产力(以g.L-1.天-1)的增加是分批生产力(以g.L-1.天 -1)的23.9倍，是补料分批生产力(以g.L-1.天-1)的8.5倍。在本发明的工艺C2中，产生了11.1g产物/L。17天期间没有发生驻留设备的阻塞，即使是非常高细胞密度的情况下。 
实施例3：对分批工艺、补料分批工艺和根据本发明的工艺之间的比较
在该实施例中，再次将根据本发明的采用细胞培养物移出的工艺的表现与分批和补料分批工艺相比较；在工艺C3中，移出了细胞培养物。 
图5显示了针对工艺A(分批)、B(补料分批)和C3(本发明的工艺)的存活细胞密度Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图6显示了针对工艺A和C3的反应器Z中的IgG浓度(相对于工艺A3中的IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
图7显示了针对工艺A、B和C3的累积产率Q(相对于工艺A中的产率的％，每升反应器体积)对工艺时间X(天)的作图。 
所有发酵都采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为36.5℃，pH控制为7.2至6.8之间，在DO为50％空气饱和度以及200rpm条件下进行。在所有实验中都使用相同的产生IgG(大约150kDa)的PER.C6细胞系(见WO 2004/099396)。 
分批工艺A
分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以3×105个细胞.mL-1接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中，随后培养17天。 
补料分批工艺B
补料分批工艺以4L的工作体积在Sartorius B5容器中进行。将细胞以3×105个细胞.mL-1接种于补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中。在培养期间，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持浓度分别超过15mM和1mM。从第5天起添加氨基酸和肽，以补充消耗的氨基酸。 
本发明的工艺C3
本发明的工艺在2L Applikon容器中进行。用ATF-2***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有100kDa分子量分离点(MWCO)的中空纤维膜(GE)被用于保留细胞和IgG产物。培养以补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)中的3×10e5个细胞/mL开始。使用0.05至0.2nL.细胞-1.天-1之间的SPR，经由悬浮细胞培养物灌注补充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培养基(SAFC)。当存活细胞密度大于10×106个细胞.mL-1时，每天以工作体积的10％移出细胞培养物，当存活细胞密度超过30×106个细胞.mL-1时，每天以工作体积的30％移出细胞培养物。 
结果
如可从图5看到的，采用本发明的工艺，快速达到了更高的存活细胞密度。此外，图5还显示，采用本发明的工艺细胞的存活性可保持更长时间，例如工艺C3保持运行了接近40天，因为即使在高细胞密度的情况下也不会发生对驻留设备的阻塞。 
图6显示，本发明工艺的产物浓度要比分批工艺中的产物浓度高得多。以分批工艺A中终浓度的大约200％至250％倍从工艺C3收获了含有产物的产物流。 
图7显示，本发明的工艺形成了最多的产物，并且本发明的工艺能比分批工艺A和补料分批工艺B保持更长的时间。在第17天，工艺C3的累积产率为分批工艺(A3)累积产率的8.1倍，是补料分批工艺(B)累积产率的2.1倍。此外，在第17天，分批工艺终止。在第21天，工艺C3的累积产率是补料分批工艺B的累积产率的3.0倍。在第21天，补料分批工艺终止。39天后，工艺C3的总累积产率是分批工艺A累积产率的25倍，是补料分批工艺B产率的6倍。 
从该实验可以推断出，在根据本发明的工艺中，当细胞密度超过一定高水平后，可通过应用细胞培养物的移除，来进一步提高想要的生物材料的总产率。 
实施例4：培养和生产CHO细胞
在该实施例中，采用生产IgG的CHO细胞系来进行了根据本发明的工艺，其中包括温度降低以减少细胞生长。 
图8显示了针对工艺C4(本发明的工艺)的细胞数量Y(106.ml-1)对工艺时间X(天)的作图。 
图9显示了针对工艺C4(本发明的工艺的一种实施方式)的反应器Z中的IgG浓度(相对于达到的最大IgG浓度的％)对工艺时间X(天)的作图。 
发酵采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为36.5℃，pH控制为7.1至6.9之间，在DO为40％空气饱和度以及100rpm条件下进行。温度在第5天降低至32℃。 
本发明的工艺C4
本发明的工艺在2L Applikon容器中进行。用ATF-2***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有50kD分子量分离点(MWCO)的中空纤维膜(General Electric)被用于保留细胞和IgG产物。培养以MTCM-49培养基(Hyclone)中的5×106个细胞/mL开始。使用0.1至0.4nL.细胞-1.天-1之间的SPR，经由悬浮细胞培养物灌注培养基。CO2压力被控制为低于15％。 
结果
数据显示，使用产生蛋白的CHO细胞系时，本发明的工艺同样能够工作。获得的细胞密度和产物浓度较之分批培养有所增加。数据还显示，在根据本发明的工艺中，细胞生长可被阻碍(例如，通过温度降低)，而培养***中的产物积累能够继续。 
实施例5：采用骨髓瘤细胞系进行的本发明的工艺
根据本发明的工艺还可应用到骨髓瘤细胞系上。为达到此目的，发酵采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为36.5℃，pH控制为7.2至6.8之间，在DO为40％空气饱和度以及100rpm条件下进行。培养以在5L Sartorius容器中的SFM4Mab培养基(Hyclone)中以3×10e5个细胞/mL接种骨髓瘤细胞开始。细胞和产物驻留设备是用ATF-4***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子量分离点(MWCO)的中空纤维膜(General Electric)。使用0.1至0.4nL.细胞-1.天-1之间的SPR，经由悬浮细胞培养物灌注SFM4Mab培养基(Hyclone)。CO2压力被控制为低于15％。 
实施例6：采用MDCK细胞系进行的本发明的工艺
根据本发明的工艺还可应用到悬浮液中的经转化的MDCK细胞系上。为达到此目的，发酵采用Sartorius Biostat B控制器，将温度控制为 36.5℃，pH控制为7.2至6.8之间，在DO为40％空气饱和度以及100rpm条件下进行。培养以在5L Sartorius容器中的VP-SFM培养基(Invitrogen)中以3×10e5个细胞/mL接种经转化的MDCK细胞开始。细胞和产物驻留设备是用ATF-4***(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子量分离点(MWCO)的中空纤维膜(General Electric)。使用0.1至0.4nL.细胞-1.天-1之间的SPR，经由悬浮细胞培养物灌注VP-SFM培养基(Invitrogen)。CO2压力被控制为低于15％。 

Claims (18)

1.在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养真核细胞的工艺，
其中，所述细胞能产生由转染进所述细胞的至少一种基因编码的生物物质，
其中，向细胞培养物补料至少一种细胞培养基组分，并且，
其中，包含所述细胞、所述生物物质和所述细胞培养基的所述细胞培养物在包括过滤器的分离***上以与所述分离***表面基本平行的流循环，产生液体流出物和其中细胞培养物内含物被保持在反应器中或被回送进反应器的流，
其中，所述过滤器具有孔径，孔径的特征在于分子量分离点小于所述生物物质的分子量，以便使所述生物物质与比所述生物物质分子量更低的物质分开，并且
其中，所述液体流出物基本上由分子量比所述生物物质分子量低的组分组成，并且，其中细胞培养物内含物被保持在反应器中或被回送进反应器的所述流基本上由分子量与所述生物物质分子量相同或分子量更高的组分组成。
2.根据权利要求1的工艺，其中，所想要的生物物质的分子量比所述分子量分离点大至少2倍。
3.根据权利要求1或2的工艺，其中，所想要的生物物质的分子量比所述分子量分离点大至少3倍。
4.根据权利要求1-3中任一项的工艺，其中，所述分子量更低的物质的一部分持续从所述细胞培养物中移出。
5.根据权利要求1-4中任一项的工艺，其中，所述养真核细胞是哺乳动物细胞。
6.根据权利要求5的工艺，其中，所述哺乳动物细胞是CHO(中华仓鼠卵巢)细胞、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞或小鼠细胞。
7.根据权利要求6的工艺，其中，所述人细胞是E1永生化的HER细胞。
8.根据权利要求6的工艺，其中，所述人细胞是PER.C6细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项的工艺，其中，所述生物物质是重组蛋白
10.根据权利要求9的工艺，其中，所述生物物质是抗体。
11.根据权利要求1-10中任一项的工艺，其中，所述分离***是膜过滤器。
12.根据权利要求11的工艺，其中，所述分离***是中空纤维过滤器。
13.根据权利要求1-12中任一项的工艺，其中，所述细胞培养物在所述过滤器上以交互切向流循环。
14.根据权利要求1-13中任一项的工艺，其中，所述细胞培养基组分被补料到所述反应器中的细胞培养物中。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的工艺，其中，至少进行一次从所述反应器移出细胞培养物的操作，并且，向所述反应器添加液体以补偿所述细胞培养物的移出。
16.根据权利要求15的工艺，其中，所述液体是细胞培养基。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的工艺，其中，从所述细胞培养物收获所述生物物质。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的工艺，其中，从所述至少一次被从所述反应器移出的细胞培养物收获所述生物物质。
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