CN111406105A - 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 - Google Patents
具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111406105A CN111406105A CN201980002230.2A CN201980002230A CN111406105A CN 111406105 A CN111406105 A CN 111406105A CN 201980002230 A CN201980002230 A CN 201980002230A CN 111406105 A CN111406105 A CN 111406105A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- cells
- medium
- day
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 title claims abstract description 124
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 315
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 256
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 208
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 58
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 47
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 26
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 20
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 15
- 238000005276 aerator Methods 0.000 claims description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 15
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- WUNMAQLRUBXKIL-PCIXLOPBSA-N Ins-1-P-Cer(d20:0/24:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H]([C@H](O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WUNMAQLRUBXKIL-PCIXLOPBSA-N 0.000 description 12
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 10
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 9
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 9
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 6
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 5
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 5
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- -1 cells Substances 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WVSMEHKNDSWLEM-LGDJGHNWSA-N Ins-1-P-Cer(t20:0/2,3-OH-26:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WVSMEHKNDSWLEM-LGDJGHNWSA-N 0.000 description 3
- DLOWKEKJLORCGV-VQIWZBOASA-N Ins-1-P-Cer(t20:0/2-OH-24:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O DLOWKEKJLORCGV-VQIWZBOASA-N 0.000 description 3
- MPWLRUHDXQRDFI-BBKCMACZSA-N Ins-1-P-Cer(t20:0/26:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H]([C@H](O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O MPWLRUHDXQRDFI-BBKCMACZSA-N 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- KSQGJUORFCVRTI-UHFFFAOYSA-M sodium 7H-purin-6-olate Chemical compound [Na+].[O-]C1=NC=NC2=C1NC=N2 KSQGJUORFCVRTI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- RKISUIUJZGSLEV-UHFFFAOYSA-N n-[2-(octadecanoylamino)ethyl]octadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCNC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC RKISUIUJZGSLEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 1
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 1
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 1
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004185 countercurrent chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002806 daclizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012787 harvest procedure Methods 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006088 interferon alfa-n1 Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 235000019809 paraffin wax Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010025139 recombinant factor VIII SQ Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
- C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本公开涉及用于培养细胞和收获生物制剂的方法和***。更具体地，本公开涉及无细胞排出的强化灌流进行细胞培养和连续收获产品的方法。
Description
【交叉引用】
本申请要求于2018年11月2日提交的国际专利申请PCT/CN2018/113776和于2019年6月4日提交的国际专利申请PCT/CN2019/089993的优先权。两个申请的全部内容是通过引用并入本文。
【发明领域】
本公开涉及用于培养细胞和收获生物制剂的方法和***。更具体地，本公开涉及通过具有连续收获而无细胞排出的强化灌流进行细胞培养的方法。
【发明背景】
自1980年代开始从事生物制药生产以来，对大量治疗性重组蛋白的需求持续增长。开发用于生产重组蛋白或其他生物制品的生产工艺是一项复杂的工作，其中必须平衡许多变量。
在典型的灌流工艺中，通过连续向细胞补充新鲜培养基并排出细胞以维持高细胞活力，可以长时间培养细胞。通常需要在连续生产中定期从生物反应器中排出细胞，这是比较低效的，因为这会导致细胞和目标生物产物的损失。
在典型的细胞培养工艺中，由细胞分泌的生物产物在细胞培养期间被保留或收获，这取决于所使用的保留***。在某些情况下，细胞和生物产物在培养工艺中保留在生物反应器中。例如，美国专利号9,469,865公开了一种灌流方法，其中将包含生物物质和细胞培养物的细胞培养物在分离***上循环，其中将生物物质保留在反应器中或反馈到反应器中，并在培养终止时收获产物。收获时，超高的固含量导致很难澄清细胞和生物产物的混合物，并且收率超低。在某些其他情况下，细胞和生物产物在培养过程中从生物反应器中分离。
仍需要改进细胞培养工艺，以提高产品产量，提高产品质量并降低成本。本公开通过提供用于通过连续灌流而没有细胞排出的强化灌流进行细胞培养的方法和***来满足这些需求中的至少一个。
【发明概述】
本公开内容涉及通过在生物反应器中灌流培养细胞培养物来生产生物物质的方法，其中基础培养基(basal medium)和补料培养基(feed medium)以不同的速率补给到细胞培养物中，并且其中细胞培养物通过分离***，不断收获生物物质。在培养工艺过程中，细胞会保留在生物反应器中而不会排出。就峰值活细胞密度和Qp(单位细胞产量)而言，本发明的方法提供了相当大的优势。结果，本方法可导致所需生物物质的生产率提高。
已经发现，通过以不同的速率向细胞培养物中加入基础培养基和补料培养基，通过在培养期间改变温度，并且通过不排出细胞培养物，可以实现在早期阶段获得大量的生物质并在后期阶段获得高生产率。而且，连续收获生物物质的协调分离***有助于实现高Qp，更好的生物物质质量和/或高纯化产率。本公开的方法被称为强化灌流培养(intensified perfusion culture，IPC)工艺，其中灌流工艺与连续收获工艺协调，并且培养过程中不用排出细胞。
具体地，本公开提供了一种用于生产生物物质的方法，该方法包括：(a)培养包含细胞培养基和细胞的细胞培养物；(b)在生物反应器中以基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物，和(c)收获生物物质，其中基础培养基和补给培养基以不同的速率补给到细胞培养物中，细胞培养物连续通过分离***，并且在整个培养过程中将细胞保留在生物反应器中而不排出。
在至少一个实施方式中，通过在生物反应器中接种表达目的生物物质的细胞来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过在生物反应器中接种至少0.1×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过接种约0.7～0.8×106个活细胞/mL，约0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～4.0×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。在另一个实施方式中，通过接种约0.1～4.0×106个活细胞/mL、0.1～0.5×106个活细胞/mL，约0.5～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.5×106个活细胞/mL，约1.5～2.0×106个活细胞/mL，约2.0～2.5×106个活细胞/mL，约2.5～3.0×106个活细胞/mL，约3.0～3.5×106个活细胞/mL约3.5～4.0×106个活细胞/mL，约0.2～0.4×106个活细胞/mL，约0.4～0.6×106个活细胞/mL，约0.6～0.8×106个活细胞/mL，约0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.2×106个活细胞/mL，约1.2～1.4×106个活细胞/mL，约1.4～1.6×106个活细胞/mL，约1.6～1.8×106个活细胞/mL约1.8～2.0×106个活细胞/mL来建立细胞培养物。
通过以不同的速率灌流基础培养基和补料培养基来维持细胞培养物。在本公开的至少一个实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约0.1～20％，例如为基础培养基的灌流速率的约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％或约20％。根据细胞密度，活率和重量摩尔渗透压浓度调节补料培养基的灌流速率。在一些实施方式中，以不高于2.0VVD的灌流速率补给基础培养基，例如约0.1～不高于2.0VVD，约0.1～1.5VVD，约0.3～1.2VVD或约0.5～1.0VVD。在一些实施方式中，以不高于2.0VVD的灌流速率补给基础培养基，例如约0.1～2.0VVD，约0.1～0.3VVD，约0.3～0.6VVD，约0.6～0.9VVD，约0.9～1.2VVD，约1.2～1.5VVD，约1.5～1.8VVD，约1.8～2.0VVD或约0.5～1.0VVD，约0.7～1.2VVD，或约1.0～1.5VVD。在一些实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1～15％，优选为约1～10％，更优选为约1～9％。在一些实施方式中，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1～15％，约1～14％，约1～13％，约1～12％，约1～11％，约1～10％，约1～9％，约1～8％，约1～7％，约1～6％，约1～5％，约1～4％，约1～3％，约1～2％，约2～9％，约3～9％，约4～9％，约5～9％，约6～9％或约7～9％。基础培养基的补给速率可以随着细胞密度的增加而增加，并且可以在细胞密度达到峰值之前达到目标补给速率(例如，在第3天到第6天)，然后目标补给速率可固定直到培养终止。在本公开的至少一个实施方式中，在培养工艺的第1、2、3、4、5、6、7或8天增加基础培养基的补给速率。补料培养基的补给速率可能会随着细胞密度的增加而增加，以提供足够的营养，通常从第2天到第4天开始，并且可能在第6天到第10天达到峰值，有时在细胞培养工艺中会随着细胞密度或活率下降而降低。在本公开的至少一个实施方式中，在培养工艺的第1、2、3、4、5、6、7或8天增加补料培养基的补给速率。在另一个实施方式中，补料培养基的补给速率在第3天，第4天，第5天，第6天，第7天，第8天，第9天，第10天，第11天，第12天，第13天或第14天达到峰值。
在至少一个实施方式中，本公开的方法还包括使细胞培养物经历温度变化。温度变化的目的是在活细胞密度达到峰值之前抑制细胞的过度生长。在本公开的至少一个实施方式中，温度变化是响应于诸如峰值活细胞密度的预定参数。在另一个实施方式中，温度变化发生在第3天，第4天，第5天，第6天，第7天，第8天，第9天，第10天，第11天，第12天，第13天或第14天。在一个实施方式中，温度变化可以是例如从约35～37℃到约28～33℃，或者从约34～36℃到约27～34℃，或者从约36～38℃至约29～34℃，或从约36～39℃至约30～35℃，或从约33～35℃至约26～31℃的温度变化。
在至少一个实施方式中，通过具有中空纤维过滤器的分离***连续收获产生的生物物质。在至少一个实施方式中，选择中空纤维过滤器的孔径或截留分子量，以使中空纤维过滤器不保留目的生物物质而是保留细胞。因此，收获由细胞产生的生物物质并将细胞保留在培养物中。在一些实施方式中，中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约0.5μm，优选为约0.1μm～约0.5μm，更优选为约0.2μm或约0.45μm。在至少一个实施方式中，中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约1.0μm，例如约0.1μm～约0.8μm，约0.1μm～约0.6μm，约0.1μm～约0.5μm，0.1μm～约0.4μm，约0.1μm～约0.3μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.3μm～约0.8μm，约0.4μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.6μm，约0.2μm～约0.5μm。在至少一个实施方式中，中空纤维过滤器为约0.2μm或约0.45μm。
在至少一个实施方式中，具有中空纤维过滤器的分离***是交替切向流(ATF)或切向流过滤(TFF)装置。
在至少一个实施方式中，细胞在整个培养工艺中被保留在生物反应器中而没有排出。发现通过省略排出***可以获得高水平的细胞密度。
在至少一个实施方式中，通过层析步骤对收获的材料进行连续的产物捕获。令人惊讶地发现，通过采用连续产物捕获方法，可以实现高生产率(例如，超高生产率)的细胞培养。
本文还提供了一种用于生产生物物质的***，该***包括：(a)用于以不同的速率将基础培养基和补料培养基灌流生物反应器中的细胞培养物的模块；(b)用于连续收获生物物质的模块，其包括中空纤维过滤器，该中空纤维过滤器的孔径或分子量截留值(MWCO)大于生物物质的分子量，从而其不保留目的生物物质但保留细胞，优选地，用于连续收获生物物质的模块是交替切向流(ATF)装置；(c)可选地，用于从收获的材料中连续捕获生物物质的模块。在一些实施方式中，该***还包括用于细胞培养的生物反应器和/或微泡通气装置(microsparger)。
【附图简述】
图1a是根据本公开的至少一个实施方式的培养***的示意图。图1b是根据本公开的至少一个实施方式的连续产品捕获***的示意图。
图2显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的活细胞密度(106/mL)与工艺时间(天)的关系图。
图3显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的存活率(％)与工艺时间(天)的关系图。
图4显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的累积体积生产率(Pv)(g/L)与培养时间(天)的关系图。
图5显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的葡萄糖浓度。
图6显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的乳酸产生或积累。
图7显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的cIEF(毛细管等电聚焦)结果。
图8显示了实施例1中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(浓缩补料批次培养)的SEC和SDS_caliper_NR结果。
图9显示了实施例2中实验IPC-1～IPC-8的活细胞密度(106/mL)与工艺时间(天)的关系图。
图10显示了实施例2中用于实验IPC-1～IPC-8的细胞的活力。
图11显示了实施例2中实验IPC-1～IPC-8的累积体积生产率(Pv)。
图12显示了实施例2中实验IPC-1～IPC-8的葡萄糖浓度。
图13显示了实施例2中实验IPC-1～IPC-8的乳酸浓度。
图14显示了实施例3中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(灌流细胞培养)的活细胞密度(106/mL)与培养时间(天)的关系图。
图15显示了实施例3中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(灌流细胞培养)的存活率(％)与培养时间(天)的关系图。
图16显示了实施例3中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(灌注细胞培养)的累积体积生产率(Pv)(g/L)与培养时间(天)的关系图。
图17显示了实施例3中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(灌流培养)的葡萄糖浓度。
图18显示了实施例3中工艺A(传统补料批次培养)，工艺B(强化灌流培养)和工艺C(灌流培养)的乳酸产生或积累。
图19显示了实施例4中工艺A和B的活细胞密度(106/mL)与培养时间(天)的关系图。
图20显示了实施例4中工艺A和B的活率(％)与培养时间(天)的关系图。
图21显示了实施例4中工艺A和工艺B的累积Pv(g/L)与培养时间(天)的关系。
图22显示了实施例4中工艺A和B的葡萄糖浓度。
图23显示了实施例4中工艺A和B的乳酸盐浓度。
图24显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的活细胞密度(106/mL)与培养时间(天)的关系图。
图25显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的活率(％)与培养时间(天)的关系图。
图26显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的细胞平均直径与培养时间(天)的关系。
图27显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的葡萄糖浓度与培养时间(天)的关系。
图28显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的乳酸浓度与培养时间(天)的关系。
图29显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的铵浓度与培养时间(天)的关系。
图30显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的在线pH值与培养时间(天)的关系。
图31显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的离线pH与培养时间(天)的关系。
图32显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的pCO2培养水平与培养时间(天)的关系。
图33显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)的培养物的重量摩尔渗透压浓度与培养时间(天)的关系。
图34显示了在不同规模下，工艺A(传统补料批次培养)和工艺B(强化灌流培养)相对于培养时间(天)绘制的累积Pv(克/升)。
图35显示了实施例4中15L和250L规模的工艺B(强化灌流培养)的捕获步骤的SEC结果和收率。
图36显示了实施例4在15L和250L规模下工艺B(强化灌流培养)的cIEF(毛细管等电聚焦)结果。
【发明详述】
【I.定义】
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利，申请，公开的申请和其他出版物均通过引用全文并入。如果本节中提出的定义与通过引用并入本文的专利，申请，公开的申请和其他出版物中提出的定义相反或相反，则本节中提出的定义优先于以下部分：通过引用并入本文。
如本文所用，除非另外指出，否则单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数形式。例如，“一种”生物物质包括一种或多种生物物质。
本文所用的“生物反应器”是可包括细胞培养物的***，该细胞培养物又包括细胞和细胞培养基。在一些实施方式中，其提供无菌屏障，例如空气过滤器，以防止其他细胞污染所需细胞。在一些实施方式中，它通过提供合适的培养条件如混合，温度，pH，氧浓度等为细胞维持了有利的环境。
“细胞培养物”或“培养物”是指细胞在多细胞生物或组织外部的生长和繁殖。“细胞培养物”包括包含细胞培养基，细胞和生物物质的液体，该液体是在反应器中在细胞培养基中培养细胞的过程的结果，其中细胞产生生物物质。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的(参见例如Animal cell culture:A Practical Approach,D.Rickwood,ed.,Oxford University Press,New York(1992))。哺乳动物细胞可以悬浮培养或附着在固体基质上培养。
“细胞”是指产生感兴趣的生物物质的细胞，例如能够表达编码产物的基因的细胞。例如，可以通过用含有编码细胞产物的基因和编码合适的选择标记的基因的质粒转染细胞来制备能够表达编码产物的基因的细胞。原则上，可用于产生产物的细胞是本领域技术人员已知的所有具有产生生物产物能力的细胞。所述细胞可以是动物细胞，特别是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的例子包括CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，杂交瘤，BHK(Baby HamsterKidney)细胞，骨髓瘤细胞，人细胞，例如HEK-293细胞，人淋巴母细胞，E1永生化HER细胞，小鼠细胞，例如NS0细胞。
如本文所用，术语“细胞培养基”(也称为“培养基”“细胞培养基”)是指用于生长细胞(例如动物或哺乳动物细胞)的任何营养液，并且通常提供至少一种或多种下列成分：能源(通常为碳水化合物，如葡萄糖的形式)；所有必需氨基酸中的一种或多种，通常是二十种基础氨基酸，再加上半胱氨酸；通常需要低浓度的维生素和/或其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸；痕量元素，例如无机化合物或天然存在的元素，通常以极低的浓度(通常在微摩尔范围内)需要。
“基础细胞培养基”是指通常用于起始细胞培养并且足够完整以支持细胞培养的细胞培养基。可以利用市售的基础培养基，包括但不限于CD OptiCHO AGT(Invitrogen)，CDCHO AGT(Invitrogen)，Dynamis AGT培养基(Invitrogen)，SFM4CHO ADCF(Hyclone)，HyCell CHO培养基(Hyclone)，CDM4MAB(Hyclone)，DPM Hyclone ActiPro(Hyclone)，Advanced CHO Fed-batch Medium(Sigma)。
“补给细胞培养基”或“补料培养基”是指通常在指数生长的时期(“生长阶段”)中用于细胞培养的细胞培养基，并且在该阶段中足够完整以支持细胞培养。生长细胞培养基还可以包含赋予结合到宿主细胞系中的选择标记抗性或存活性的一种或多种选择剂。这样的选择剂包括但不限于遗传霉素(G4118)，新霉素，潮霉素B，嘌呤霉素，zeocin，蛋氨酸亚磺酰亚胺，甲氨蝶呤，无谷氨酰胺的细胞培养基，缺少甘氨酸的细胞培养基，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，或单独的胸苷。可以利用市售的补料培养基，包括但不限于CHO CD EfficientFeedA(Invitrogen)，CHO CD Efficient FeedB(Invitrogen)，CHO CD Efficient FeedC(Invitrogen)，Sheff-CHO PLUS PF ACF(FM012)(Kerry)，CHO CD Efficient FeedA+(Invitrogen)，CHO CD Efficient FeedB+(Invitrogen)，CHO CD Efficient FeedC+(Invitrogen)，DPM-Cell Boost7a(Hyclone)，DPM-Cell Boost 7b(Hyclone)或FAA01A(Hyclone)。
在某些实施方式中，细胞培养基是无血清的和/或无动物来源的产品或成分。在某些实施方式中，化学定义细胞培养基，其中所有化学成分都是已知的。如本领域技术人员使用常规技术所公知和实践的那样，可以利用可商购的培养基，并且可以根据需要或期望以适当的浓度或量添加补充组分或成分，包括任选的组分。
在本公开的上下文中，术语“产品”、“生物产品”和“生物物质”是可互换的。细胞可以产生的产物，例如通过表达编码(重组)基因的产物，因此是(重组)蛋白质，特别是受体，酶，融合蛋白，血蛋白质，例如来自凝血级联的蛋白质，多功能用于疫苗的蛋白质，例如***，病毒或细菌蛋白质；免疫球蛋白，例如抗体，例如IgG或IgM，多特异性抗体，例如双特异性抗体等。细胞优选产生蛋白质，更优选产生抗体。
术语“抗体”包括指任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化的免疫球蛋白，或与完整抗体竞争特异性结合的其抗原结合区，除非另有说明，包括人，人源化，嵌合，多特异性，单克隆，多克隆和寡聚体或其抗原结合片段。还包括具有抗原结合片段或区域的蛋白质，例如Fab，Fab'，F(ab')2，Fv，双抗体，Fd，dAb，maxibody，单链抗体分子，互补决定区(CDR)片段，scFv，包含至少一部分免疫球蛋白的双抗体，三抗体，四抗体和多肽，所述免疫球蛋白足以赋予特异性抗原结合至靶多肽。术语“抗体”包括但不限于通过重组方式制备，表达，产生或分离的那些，例如从转染以表达该抗体的宿主细胞中分离的抗体。
抗体的实例包括但不限于识别任何一种蛋白质或蛋白质组合的抗体，包括但不限于上述蛋白质和/或以下抗原：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚基，FGL2，PDGF-β及其类似物(请参阅美国专利5,272,064和5,149,792)，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-β1，EGF受体(请参阅美国专利6,235,883)VEGF受体，肝细胞生长因子，骨保护素配体，干扰素γ，B淋巴细胞刺激物(BlyS，也称为BAFF，THANK，TALL-1和zTNF4(请参阅Do和Chen-Kiang(2002)，Cytokine Growth Factor Rev.13(1):19-25)，C5补体，IgE，肿瘤抗原CA125，肿瘤抗原MUC1，PEM抗原，LCG(与肺相关的基因产物癌)，HER-2，HER-3，肿瘤相关糖蛋白TAG-72，SK-1抗原，肿瘤相关表位在结肠癌和/或胰腺癌患者的血清中水平升高-相关抗原决定簇或蛋白在乳腺癌，结肠癌，鳞状细胞癌，***癌，胰腺癌，肺癌和/或肾癌细胞和/或黑色素瘤，神经胶质瘤或神经母细胞瘤细胞(肿瘤的坏死核心)中表达，整合素α4beta 7，整合素VLA-4，B2整合素，TRAIL受体1、2、3和4，RANK，RANK配体，TNF-α，黏附分子VAP-1，上皮细胞黏附分子(EpCAM)，细胞间黏附分子-3(ICAM-3)，白细胞整合素粘附素，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，心肌肌球蛋白重链，甲状旁腺激素，rNAPc2(是VIIa因子组织因子的抑制剂)，MHC I，癌胚抗原(CEA)，α-甲胎蛋白(AFP)，肿瘤坏死因子(TNF)，CTLA-4(一种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)，Fc-γ-1受体或HLA-DR 10beta，HLA-DR抗原，硬化蛋白，L-选择素，呼吸道神经炎病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)，乙型肝炎病毒(HBV)，变形链球菌(Streptococcusmutans)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。可以使用本公开内容的方法产生的已知抗体的具体实例包括但不限于阿达木单抗，贝伐单抗，英夫利昔单抗，阿昔单抗，阿来珠单抗，巴比单抗，巴利西单抗，贝利单抗，briakinumab，canakinumab，聚乙二醇结合赛妥珠单抗，西妥昔单抗，conatumumab，狄诺塞麦，依库珠单抗，吉妥珠单抗单抗奥佐米星，戈利木单抗，替伊莫单抗，labetuzumab，马帕木单抗，马妥珠单抗，美泊利单抗，莫维珠单抗，莫罗单抗-CD3，那他珠单抗，尼妥珠单抗，奥法木单抗，奥马珠单抗，奥戈伏单抗，帕利珠单抗，帕尼单抗，pemtumomab，帕妥珠单抗，雷珠单抗，利妥昔单抗，rovelizumab，托珠单抗，托西莫单抗，曲妥珠单抗，ustekinumab，vedolizomab，zalutumumab和zanolimumab。
在一些实施方式中，细胞产生的产物例如蛋白质或疫苗可用作药物制剂中的活性成分。产品的非限制性实例包括：抗hTNFα(Adalimumab(HumiraTM))，靶向VEGF的融合蛋白(Aflibercept(EYLEATM))，***α
淋巴母细胞干扰素α-n1(WellferonTM)，(重组)凝血因子(NovoSevenTM)，Etanercept(EnbrelTM)，曲妥珠单抗(HerceptinTM)，Infliximab(RemicadeTM)，Basiliximab(SimulectTM)，Daclizumab(ZenapazTM)，(重组)凝血因子IX(BenefixTM)，葡萄糖脑苷脂酶(CerezymeTM)，干扰素β1b
G-CSF(
Filgrastim)，干扰素α-2b
重组胰岛素
干扰素beta 1a
凝血因子VIII
替奈普酶(TNK酶TM)，(重组)抗血友病因子(ReFactoTM)，TNFα受体
促卵泡激素
单克隆抗体abcixmab
单克隆抗体ritiximab
组织纤溶酶原激活剂(活化酶010)66046709，
)，人类生长激素(
GenoTropinTM)。此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价，二价和多重价/多价构建体，因此，仅与两个抗原结构特异性结合的双特异性构建体，以及与两种以上，例如三个，四个或更多抗原结构通过不同的结合域特异性结合的多重特异性/多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由多于一条多肽链组成的分子，这些链可以相同(同二聚体，同三聚体或同低聚体)或不同(异二聚体，异三聚体或杂聚体)。上述鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例在Harlow and Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)and UsingAntibodies:a laboratory manual,CSHL Press(1999),Kontermann and Dubel,AntibodyEngineering,Springer,2nd ed.2010和Little,Recombinant Antibodies forImmunotherapy,Cambridge University Press 2009中有描述。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何链，并不指产物的特定长度。因此，在“多肽”的定义中包括肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白质”，“氨基酸链”或用于指代两个或多个氨基酸链的任何其他术语，且可以使用“多肽”代替这些术语中的任何术语或与它们互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/封闭基团衍生化，蛋白水解切割或通过非天然修饰出现的氨基酸。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3或更多，5或更多，10或更多，20或更多，25或更多，50或更多，75或更多，100或更多，200或更多，500或更多，1,000或更多或2,000或更多的氨基酸。多肽可以具有定义的三维结构，尽管它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的，不具有确定的三维结构但可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。
术语“聚集”通常是指分子之间例如通过范德华力或化学键的分子之间的直接相互吸引。特别地，聚集被理解为蛋白质聚集并聚集在一起，即“聚集物”和“片段”。聚集物可包括无定形聚集物，低聚物和淀粉样原纤维，并且通常被称为高分子量(HMW)物质，即分子具有比非聚集分子的纯产物分子更高的分子量，纯产物分子在本文中通常也称为低分子量(LMW)物质或单体。
术语“微泡通气装置”通常是指被配置为向生物反应器罐内的细胞培养物提供氧气和/或其他气体的通气装置。曝气器或微泡通气装置可以与氧气或其他气体源耦合，并且可以将气体引导至细胞培养物，从而使细胞培养物中的气泡充气，从而使细胞培养物充气。在一些例中，微泡通气可以与钻孔空气分布器结合使用。
如本文所述制备的生物制剂可以通过本领域已知的技术纯化，例如高效液相层析法，离子交换层析法，凝胶电泳，亲和层析法，尺寸排阻层析法(SEC)等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷，疏水性，亲水性等因素，并且对本领域技术人员而言是显而易见的。为了亲和层析纯化，可以使用生物产品结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本公开的生物产品(例如免疫缀合物)的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实施例中所述，顺序蛋白A或G亲和层析和尺寸排阻层析可用于分离免疫缀合物。免疫缀合物的纯度可以通过各种众所周知的分析方法中的任一种来确定，包括凝胶电泳，高压液相层析法及相似方法。
【II.灌流培养工艺】
本领域技术人员将理解“灌流”培养工艺是其中细胞培养物接受新鲜培养基的添加并且用过的培养基从生物反应器中去除的工艺。灌注可以是连续的，逐步的，间断的或任何这些或全部的组合。
在各种实施方式中，通过在生物反应器中接种表达感兴趣的生物物质的细胞来建立细胞培养物，例如至少0.1×106个活细胞/mL，例如约0.7～0.8×106个活细胞/mL，0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～4.0×106个活细胞/mL。在至少一个实施方式中，通过在生物反应器中用例如至少0.1×106个活细胞/mL，例如约0.1～4.0×106个活细胞/mL、0.1～0.5×106个活细胞/mL，约0.5～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.5×106个活细胞/mL，约1.5～2.0×106个活细胞/mL，约2.0～2.5×106个活细胞/mL，约2.5～3.0×106个活细胞/mL，约3.0～3.5×106个活细胞/mL，约3.5～4.0×106个活细胞/mL，约0.2～0.4×106个活细胞/mL，约0.4～0.6×106个活细胞/mL，约0.6～0.8×106个活细胞/mL，约0.8～1.0×106个活细胞/mL，约1.0～1.2×106个活细胞/mL，约1.2～1.4×106个活细胞/mL，约1.4～1.6×106个活细胞/mL，约1.6～1.8×106个活细胞/mL或约1.8～2.0×106个活细胞/mL接种表达感兴趣的生物物质的细胞来建立细胞培养物。
通过补给基础培养基和补料培养基来维持细胞培养。在补料培养基之前，可以在基础培养基中将细胞培养一天。例如，基础培养基的灌流可以从第2天开始，而补料培养基的灌流从第3天开始。或者，可以从第1天开始灌流基础培养基。作为另一个例，可以从第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天或第6天开始灌流基础培养基，从第2天，第3天，第4天，第5天，第6天或第7天开始灌流补料培养基。
术语“灌流速率”是在给定时间内从生物反应器通过(添加和除去)的培养基的量，通常表示为工作体积的一部分或倍数。“工作体积”是指用于细胞培养的生物反应器体积的量。在至少一个实施方式中，基础培养基的灌流速率可以不高于每天2.0工作体积(VVD)，例如约0.1～1.5VVD，约0.3～1.2VVD或约0.5～1.0VVD。
细胞培养基向培养物中的添加速率可影响细胞的活力和密度。令人惊讶地发现，通过调节基础培养基和补料培养基的补给速率并在不同阶段补给，可以实现高活细胞密度和活率。术语“活细胞密度”是指在给定体积的培养基中的活细胞数量，通过标准活率测定法(例如台盼蓝染色法)确定。
在各种实施方式中，基础培养基和补料培养基以不同的灌流速率补给到细胞培养物中，条件是补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约0～20％，例如，补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约0.1～20％，例如，基础培养基的灌流速率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％。在本公开的至少一个实施方式中，基础培养基的灌流速率不高于约2.0VVD，例如约0.1～1.5VVD，约0.3～1.2VVD或约0.5～1.0VVD。例如，可以从第1天开始以约0.4VVD的速率开始基础培养基的灌流，并且可以在第3天将该速率增加到约1.5VVD，并保持在约1.5VVD直到培养结束。补料培养基的灌流可以从第4天开始，以基础培养基的约2.0％的速率开始，并在第7天增加到基础培养基的约4.0％，然后从第8天逐渐减少到第17天的约1％。在另一个实施方式中，可以从第1天开始以约0.4VVD的速率开始基础培养基的灌流，并且可以在第4天将该速率增加到约1.5VVD，并保持在约1.5VVD直到培养结束。可以从第5天开始以基础培养基的约2.0％的速率开始灌流培养基，在第12天将其增加到基础培养基的约9％，在第18天减少到约7％，并从第19天维持在约6％直至终止。在另一个实施方式中，可以从第2天开始以约0.6VVD的速率灌流基础培养基，并且可以在第6天将该速率增加至约0.88VVD，并保持在约0.88VVD直至培养结束。可以从第2天开始以基础培养基的约6.7％的速率灌流补料培养基，并在第12天增加到基础培养基的约16％，并保持在约16％直至终止。
【III.细胞培养对照】
适用于本公开内容的方法的细胞培养条件是通常用于细胞的灌流培养并且已知用于细胞的灌流培养的条件或这些方法的任意组合，并注意pH，溶解氧(O2)和二氧化碳(CO2)，搅拌，曝气和温度。
在重组蛋白或生物产品生产期间，可能需要具有一个受控***，在该***中，细胞生长所需的时间或所需的密度，然后将细胞的生理状态切换为生长受限或停滞的高生产率状态，在此状态下，细胞利用能量和底物来生产重组蛋白，从而有利于增加细胞密度。对于商业规模的细胞培养和生物治疗剂的制造，非常需要在生产阶段限制或阻止细胞生长并能够将细胞维持在生长受限或阻止状态的能力。这样的方法包括例如温度变化。
这种限制或阻止生长的一个机制是在细胞培养工艺中改变温度。例如，生长期可以在较高的温度下发生，转变为较低的温度可以启动和/或维持生产阶段。例如，生长阶段可以在约35℃～约37℃的第一温度设定点处发生，而生产阶段可以在约28℃～约33℃的第二温度设定点处发生。在相关的实施方式中，温度变化是响应于诸如峰值活细胞密度的预定参数。在至少一个实施方式中，温度变化可以是例如从约35～37℃到约28～33℃的温度变化。在至少一个实施方式中，生长期可以在约30℃～约38℃，例如约31℃～约37℃，约32℃～约36℃，约33℃～约35℃，约33℃～约34℃，约32℃～约35℃或约31℃～约34℃的第一温度设定点处发生。在至少一个实施方式中，生产阶段可以在第二温度设定点发生，该第二温度设定点为约25℃～约35℃，例如25℃～约30℃，30℃～约35℃，26℃～约31℃，27℃～约32℃，28℃～约33℃或29℃～约34℃。在另一个实施方式中，温度变化是响应于诸如峰值活细胞密度的预定参数。在至少一个实施方式中，温度变化可以是例如从约35～37℃到约28～33℃的温度变化，诸如从约34～36℃到约27～34℃，从约36～38℃到约29～34℃，从约36～39℃到约30～35℃，或从约33～35℃到约26～31℃的温度变化。
温度设置点的切换可以手动完成，也可以通过使用生物反应器控制***自动完成。可以在预定时间或响应于一种或多种细胞培养参数，例如细胞密度，滴度或一种或多种培养基组分的浓度，来切换温度设定点。
本公开的方法的一个优点是其不需要排出步骤。令人惊讶地发现，通过以不同的速率向细胞培养物中加入基础培养基和补料培养基，并采用温度变化策略并通过省略细胞排出，可以在早期阶段获得大量的生物质，并在后期阶段获得高生产率。通过省略排出***，细胞保持非稳定状态，细胞密度被推至很高的水平。为了维持高活细胞密度和可行性，本公开内容的方法利用温度变化和基础和补料培养基的差异补给速率。
在本公开的至少一个实施方式中，在接种细胞之前将消泡剂添加到生物反应器中。在本公开的至少一个实施方式中，在接种细胞之前，将约5～20ppm，约8～15ppm，约9～12ppm或约10ppm的消泡剂添加至生物反应器。在本公开的至少一个实施方式中，在培养期间，向培养基中添加约5～200ppm，约8～150ppm，约9～120ppm，约10～100ppm的消泡剂。所述消泡剂可每天、每2天、每3天或每4天或一次性添加。
在本公开的上下文中，术语“消泡剂”和“灭泡剂”可互换使用。在本公开的至少一个实施方式中，消泡剂可以是减少和阻碍培养物中泡沫形成的任何试剂。在本公开中，在接种前添加消泡剂减轻了由培养期间气泡破裂引起的细胞损伤。在本公开的至少一个实施方式中，可以使用能够获得本申请的技术效果的任何消泡剂。在本公开的至少一个实施方式中，消泡剂包括但不限于油基消泡剂，粉末消泡剂，水基消泡剂，硅氧烷基消泡剂，EO/PO基消泡剂或聚丙烯酸酯烷基。在本发明的另一个实施方式中，油基消泡剂中的油可以是矿物油，植物油，白油或除硅油以外的任何不溶于泡沫介质的其他油。在本公开的另一个实施方式中，油基消泡剂还包含蜡和/或疏水性二氧化硅以提高性能。典型的蜡是亚乙基双硬脂酰胺(EBS)，石蜡，酯蜡和脂肪醇蜡。在本发明的至少一个实施方式中，粉末消泡剂原则上是在颗粒载体如二氧化硅上的油基消泡剂。将它们添加到粉状产品中，例如水泥，灰泥和清洁剂。在本公开的至少一个实施方式中，水基消泡剂是分散在水基中的不同类型的油和蜡，其中油通常是矿物油或植物油，并且蜡是长链脂肪醇，脂肪酸皂或酯。在本公开的至少一个实施方式中，基于有机硅的消泡剂是具有硅骨架的聚合物，其中有机硅化合物由分散在有机硅油中的疏水性二氧化硅组成，并且还可以包含有机硅二醇和其他改性的有机硅流体。在本公开的至少一个实施方式中，基于EO/PO的消泡剂包含聚乙二醇和聚丙二醇共聚物，所述聚乙二醇和聚丙二醇共聚物具有良好的分散性能，并且在存在沉积问题时通常非常适合。在本公开的至少一个实施方式中，聚丙烯酸酯烷基酯适合在非水***中用作消泡剂，在该非水***中，空气的释放比表面泡沫的破坏更重要。
在本公开的至少一个实施方式中，在本公开的方法中使用微泡通气装置。在本公开的另一个实施方式中，当所需氧气流速达到约0.2VVM时使用微泡通气装置。在本公开中，微泡通气装置的实施减轻了由培养期间气泡破裂引起的细胞损伤。
【IV.连续收获】
在各种实施方式中，将细胞保留在培养物中，同时从细胞培养物中连续收获由细胞产生的目标产物。在这方面，将具有中空纤维过滤器的分离***连接到灌流***。选择合适孔径或截留分子量的中空纤维过滤器，以使中空纤维过滤器保留细胞而不保留目标产物。当将含有细胞培养基、细胞(例如全细胞和裂解的细胞)、可溶性表达的重组蛋白、宿主细胞蛋白，和废物等的细胞培养液引入过滤器时，中空纤维膜材料可以在过滤器的中空纤维柱内径中保留细胞，并允许目标产物即可溶性表达的重组蛋白随着培养基一起通过过滤器被连续收获。被保留的细胞随后返回到生物反应器。
在各种实施方式中，任何过滤器都可以用作分离***，只要选择合适的孔径或截留分子量(MWCO)以保留细胞而不保留目标产物即可。适用于本公开的过滤器的非限制性示例包括膜过滤器，陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形状使用。过滤器可以例如是螺旋缠绕的或管状的，或者可以以片的形式使用。在各种实施方式中，所使用的过滤器是膜过滤器。在一个实施方式中，过滤器是中空纤维过滤器。在一个实施方式中，中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～0.5μm，约0.1μm～0.5μm，约0.2μm或约0.45μm。在至少一个实施方式中，中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约1.0μm，例如约0.1μm～约0.8μm，约0.1μm～约0.6μm，约0.1μm～约0.5μm，0.1μm～约0.4μm，约0.1μm～约0.3μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.3μm～约0.8μm，约0.4μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.6μm，或约0.2μm～约0.5μm。在至少一个实施方式中，中空纤维过滤器为约0.2μm或约0.45μm。包含中空纤维的过滤器模块可从例如Refine Technology商业获得。
通过在分离***上循环包含生物物质，细胞和细胞培养基的细胞培养物，将细胞保留在反应器中，并收集感兴趣的生物物质。细胞培养物的循环可以在灌流工艺开始时开始，例如在第2天或第3天。
细胞培养物在过滤器上的循环可以是相对于过滤器表面基本上垂直的流，也称为死端流，或者可以是基本上平行于过滤器表面的流，也称为切向流，例如单向切向流(TFF)或错流。交叉流的一个优选例是交替切向流(ATF)，发现使用ATF时即使在非常高的细胞密度下，也不会(迅速)发生过滤器堵塞。
“交替的切向流”是指在与过滤器表面相同的方向上(即成切线的方向)来回流动，而在基本上垂直于所述过滤器表面的方向上存在另一种流动。可以根据本领域技术人员已知的方法(例如，如美国专利No.6,544,424所描述的那样来实现交替的切向流)，其全部内容通过引用并入本文。
在至少一个实施方式中，由细胞产生的生物物质通过具有孔径为约0.08μm～0.5μm，约0.1μm～0.5μm，约0.2μm或约0.45μm的中空纤维过滤器的分离***连续收获。在至少一个实施方式中，由细胞产生的生物物质通过具有中空纤维过滤器的分离***连续收获，所述中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约1.0μm，例如约0.1μm～约0.8μm，约0.1μm～约0.6μm，约0.1μm～约0.5μm，约0.1μm～约0.4μm，约0.1μm～约0.3μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.8μm，约0.3μm～约0.8μm，约0.4μm～约0.8μm，约0.2μm～约0.6μm，或约0.2μm～约0.5μm。在至少一个实施方式中，中空纤维过滤器为约0.2μm或约0.45μm。
【V.下游纯化】
在本公开的方法中产生的包含目标产物的收获液可以进一步在下游工艺中中被捕获。下游工艺通常包括以不同组合和顺序进行的几个纯化步骤。下游工中纯化步骤的非限制性实例是分离步骤(例如通过亲和层析法和/或离子交换层析法和/或通过含水两相***萃取和/或通过例如硫酸铵沉淀)，生物物质的浓缩步骤(例如通过超滤或渗滤)，交换缓冲液的步骤和/或去除或灭活病毒的步骤(例如通过病毒过滤，pH改变或溶剂去污剂处理)。
在本公开的至少一个实施方式中，通过层析步骤使从ATF装置收获的材料经受连续的产物捕获。模拟移动床(SMB)、周期性逆流层析(PCC)和两柱层析(TCC)等多柱层析***可用于连续产品捕获。在本公开的一些实施方式中，使用例如2～16个柱，优选3～8个柱，更优选3个柱，基于被捕获产品的性质和操作条件，装填适当的树脂(具有不同的功能性配体例如蛋白A，IEX，HIC，混合模式，IMAC等)。在上样阶段和上样后淋洗阶段，两个或更多个(2～15)层析柱串联连接，而在其他阶段，层析柱则单独使用不同的缓冲区进行处理。特别地，对于2柱工艺，一个层析柱用于在开始时收集收获物，而第二层析柱用于非上样阶段。当完成非上样阶段时，第二个层析柱连接到第一个层析柱的出口，以捕获第一个层析柱上样和上样后淋洗阶段的流穿组分。所有这些步骤均在连续层析***上并行处理，例如BioSMB(Pall)，AKTA pcc(GE Healthcare)，BioSC(Novasep)，Contichrom(ChromaCon)等。在本公开的至少一个实施方式中，使用三个装有MabSelect PrismA树脂的例如1.1/5cm(内径/床高)层析柱对ATF装置进行连续的产品捕获工艺。在上样阶段和上样后淋洗阶段，串联连接了两个层析柱，而在其他阶段，仅处理一个层析柱。这两条流路在BioSMB PD***上并行处理，并在三个层析柱之间自动切换。连续直接产品捕获工艺比传统的批次处理工艺能达到更高的生产效率。
【VI.实施例】
通过参考以下实施例，将更容易地理解如此总体上描述的本公开，这些实施例是通过举例的方式提供的，并且不旨在限制本公开。
【A.细胞系和培养条件】
对于克隆X：从ATCC购买CHO-K1宿主细胞(ATCC编号：CCL61)，将冻存管解冻并产生100冻存管主细胞库(MCB)，随后产生136冻存管工作细胞库(WCB)。然后将WCB冻存管解冻，并用无血清培养基进行悬浮培养。用适合悬浮液的克隆CHO-K1-A4生成60瓶PCB，170瓶MCB和230瓶WCB。解冻一个CHO-K1宿主细胞CHO-K1-A4的WCB冻存管以稳定转染。
如美国专利号：6,090,382中公开的表达抗-hTNFα的cDNA序列被克隆到两个载体中，其分别包含Blasticidin和Zeocin抗性标记。使用脂质体进行稳定的转染。转染后，将细胞传给选择性培养基(含有9μg/mLBlasticidin和400μg/mL Zeocin的CD CHO培养基)进行细胞群选择。在细胞群选择约2周后，通过FACS分选细胞群。通过在离心管中补料批次培养筛选克隆。选择了一个高产克隆，名为CloneX。
对于克隆Y：从ATCC(ATCC编号：CCL 61)购买CHO-K1宿主细胞，将冻存管解冻并产生100冻存管MCB，随后产生136冻存管的WCB。然后将WCB冻存管解冻，并用无血清培养基进行悬浮培养。用适合悬浮液的克隆CHO-K1-A4生成60瓶PCB，170瓶MCB和230瓶WCB。解冻一个CHO-K1宿主细胞CHO-K1-A4)的WCB冻存管以稳定转染。
将美国专利号：7,070,959B1中公开的表达靶向VEGF的融合蛋白的cDNA序列克隆到两个载体中，分别包含Blasticidin和Zeocin抗性标记。使用脂质体进行稳定的转染。转染后，将细胞接种到96孔板中的选择性培养基(含有9μg/mLBlasticidin和400μg/mLZeocin的CD CHO培养基)中以进行细胞群选择。在细胞群选择约2周后，扩大并混合了高产量的细胞群。通过两轮ClonePix从混合的细胞群中挑选单克隆，并通过在离心管中补料批次培养筛选克隆。选择了一个高产克隆，名为CloneY。
对于克隆Z：从ATCC购买CHO-K1宿主细胞(ATCC编号：CCL61)，将冻存管解冻并产生100冻存管MCB，随后产生136冻存管WCB。然后将WCB冻存管解冻，并用无血清培养基进行悬浮培养。用适合悬浮液的克隆CHO-K1-A4生成60瓶PCB，170瓶MCB和230瓶WCB。解冻一个CHO-K1宿主细胞CHO-K1-A4)的WCB冻存管以稳定转染。
将WO 2019/057124A1中公开的表达双特异性抗CD3x CD19抗体的cDNA序列克隆到两个载体中，所述载体分别包含Blasticidin和Zeocin抗性标记。使用脂质体进行稳定的转染。转染后，将细胞接种到96孔板中的选择性培养基(含有9μg/mLBlasticidin和400μg/mLZeocin的CD CHO培养基)中以进行细胞群选择。在细胞群选择约2周后，对高产量的细胞群分别进行了扩增。通过一轮FACS从细胞群中挑选单克隆，通过在离心管中补料批次培养筛选克隆。选择了一个高产克隆，名为CloneZ。
【B.实施例1】
在该实施例中，使用克隆X，将强化灌流培养工艺(B)的性能与传统补料批次培养工艺(A)和浓缩补料批次培养工艺(C)的性能进行了直接比较。
传统补料批次培养工艺A：
工艺A在摇瓶中进行。传统补料批次培养工艺A在250mL容器体积中以50mL初始工作体积执行。在补充有4.0mM L-谷氨酰胺的CDM4培养基(Hyclone)中以0.40×106个细胞/mL接种细胞，然后培养14天。在培养工艺中，在第3天，第6天，第8天和第10天分别补给3.00％的补料培养基CB7a和0.30％的补料培养基CB7b。在第5天将温度从36.5℃转变为31.0℃。通过在整个培养工艺中加入400g/kg葡萄糖储备溶液，将葡萄糖浓度维持在4.0g/L。
强化灌流培养工艺B：
工艺B在3L Applikon容器中使用delta V控制器进行，以将温度控制在36.5℃，pH值范围在约7.2～6.8之间以及在DO在40％的空气饱和度下。使用ATF-2H***(RefineTechnology)在ATF流动模式下运行的0.2μm中空纤维过滤(Spectrum实验室)用于保留细胞。
在补充有4.0mM L-谷氨酰胺的CDM4培养基(Hyclone)中以0.80～1.00×106个细胞/mL开始培养。从第3天开始每天添加约10～100ppm的消泡剂。从第1天开始灌流基础培养基(CDM4，Hyclone)，第3天将0.4VVD的速率增加至1.5VVD。从第4天起以基础培养基的2.0％的速度起始补料培养基(CB7a/CB7b)的灌流，且灌流速度在第7天增加到基础培养基的4.0％。由于细胞密度和细胞活率的降低，从第8天起，补料培养基的灌流速度逐渐降低，在第17天下降到1％。
从第3天到培养结束，将CDM4培养基的灌流速率保持在1.5VVD。使用微泡通气装置以0.5VVM的流速输送氧气。在第5天将温度从36.5℃转变为31.0℃，并保持在31.0℃直到培养终止。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养工艺中，细胞保留在生物反应器中而不排出。
浓缩补料批次工艺C：
使用delta V控制器进行工艺C，以控制温度在36.5℃，pH在7.2和6.8之间的范围，且DO设定为40％空气饱和度。浓缩补料批次培养工艺的操作与工艺B一致，不同之处在于中空纤维过滤(Spectrum labs)的孔径为50KD，以将细胞和生物产物都保留在培养液中。
工艺之间的比较：
图2显示，在工艺B和C中获得了更高的峰值活细胞密度，与传统的补料批次工艺A相比几乎为其三倍。
图3显示，由于工艺B和工艺C在操作中维持了19天的时间，因此用工艺B和工艺C可以使细胞的存活时间更长。
图4显示，与工艺A和工艺C相比，工艺B的累积Pv最高。工艺B的累积Pv约为传统补料批次工艺A和浓缩补料批次培养工艺C中最终浓度的9.41倍和1.29倍。在这里，浓缩补料批次培养工艺C中的最终产量是根据细胞固含量调整过的值。
图5显示，与传统的补料批次工艺A相比，在工艺B和浓缩补料批次培养工艺C中实现了更平滑的葡萄糖浓度控制。
图6显示，在工艺B和工艺C中没有观察到明显的乳酸产生或积累问题，而工艺A中的乳酸浓度从第10天开始呈上升趋势。
图7显示，与工艺A和工艺C相比，工艺B中实现了cIEF主峰的增加以及酸性峰的减少。
图8显示了工艺B和其他两个工艺A，C产生的聚集体和碎片的比较。工艺B的SEC主峰与浓缩补料批次培养工艺C相当，并且两者均高于传统的补料批次工艺A。与工艺A和工艺C相比，工艺B的SDS_Caliper_NR的纯度没有明显差异。
从工艺B收获的材料从第9天到第21天收集，并分别存储在三个袋子中，分别为第9天到第13天，第13天到第17天以及第17天到第21天。对于每个收集池，约100mL样品在小柱上进行批处理模式评估，其余部分由BioSMB***以连续模式进行处理。比较了传统批式和连续工艺的产量和生产率，同时还评估了产品质量属性，SEC纯度和HCP含量。
传统的批式直接产品捕获工艺：
批次模式层析法是在AKTA pure***上进行的，其中0.5/5.6厘米(内径/床高)层析柱装有MabSelect PrismA树脂。表1显示了层析中每个步骤的工艺参数。
上样量为65g/L树脂，上样的保留时间为5分钟。层析步骤在室温(18℃～26℃)下进行。上样体积由层析***的体积累加器确定，而洗脱产物体积由所收集样品的净重确定。根据洗脱产物中的产物量除以上样样品中的产物量来计算收率。洗脱产物的浓度由280nm波长处的UV吸光度确定，而上样样品的浓度由Protein A HPLC测定。基于上样样品的量除以工艺时间和树脂的体积来计算生产效率。
将洗脱产物中和至pH5.5，然后用0.2μm PES注射器过滤器过滤。通过SEC HPLC和商业ELISA试剂盒分别测定中和产物的SEC纯度和HCP含量。
连续的直接产品捕获工艺：
连续模式层析法是在BioSMB PD***上进行的，其中三个层析柱装有填充MabSelect PrismA树脂的1.1/5cm(内径/床高)层析柱。表3显示了层析中每个步骤的详细工艺参数。在上样阶段和上样后清洗阶段，串联连接了两个层析柱，而在其他阶段，仅处理一个层析柱。这两条流程在BioSMB PD***上并行处理，并在三个层析柱之间自动切换。
根据在不同保留时间和上样浓度下的穿透曲线计算连续工艺的上样量和保留时间，对于不同上样浓度的物料，其上样条件的差异如表4所示。其他未指定的操作条件与上述批处理工艺相似。
分批和连续工艺的收率，生产效率，SEC纯度和HCP含量分别如表2和表4所示。整个培养时间内一致的产量和产品质量属性数据表明，强化灌流培养工艺B中起始原料的变化对下游工艺影响较小，在收率和纯度上连续产品捕获工艺可与传统的批次工艺相媲美，而生产效率提高了77％，表明连续的直接产品捕获工艺与传统的批处理工艺相比可以显著提高捕获步骤的生产效率，经下游工艺后，强化灌流培养工艺B被认为是稳定的，连续的直接产品捕获工艺比传统的分批工艺效率高得多。
表1：批次处理模式层析的工艺参数
表2：批次处理模式工艺总结
表3：连续模式层析法的工艺参数
表4：连续模式工艺总结
【C.实施例2】
在该实施例中，使用克隆X，评估了强化灌流培养工艺(B)的性能。
【强化灌流培养工艺】
使用delta V控制器进行实验IPC-1～IPC-8，以将温度控制在约36.5℃，pH范围在7.2和6.8之间以及DO控制在约40％的空气饱和度下。使用ATF-2H***(RefineTechnology)以ATF流模式运行的所有工艺(除工艺5的截留的中空纤维过滤孔径为0.45μm的孔)均使用0.2μm截留中空纤维过滤(Refine Technology)来保留细胞。
实验IPC-1，IPC-2和IPC-3在7L Applikon容器中进行，实验IPC-4，IPC-5，IPC-6，IPC-7和IPC-8在3L Applikon容器中进行。
从IPC-1到IPC-8的实验培养始于在补充有4.0mM L-谷氨酰胺的CDM4培养基(Hyclone)中约0.90～1.10×106个细胞/mL，并且从第0天起每天添加约10～100ppm消泡剂。
在实验IPC-1，IPC-4和IPC-5中，基础培养基(CDM4，Hyclone)的灌注在第2天开始，速率为0.4VVD，在第4天增加到1.0VVD。在实验IPC-2以及IPC-3中，从第1天开始以0.4VVD的速率灌流基础培养基(CDM4，Hyclone)，并在第2天将速率提高至1.0VVD。在实验IPC-6中，基础培养基的灌流(CDM4，Hyclone)从第2天开始以0.4VVD的速率开始，并在第4天增加到1.5VVD。在实验IPC-7和IPC-8中，基础培养基(CDM4，Hyclone)的灌流从第1天开始用0.4VVD的速率，并在第3天将速率增加到1.5VVD。在实验IPC-1～IPC-5中，从培养的第5天到培养结束，CDM4培养基的灌流速率保持在1.0VVD。在实验IPC-6～IPC-8中，从培养的第5天到培养结束，CDM4培养基的灌流速率保持在1.5VVD。
在实验IPC-1，IPC-2，IPC-3，IPC-4，IPC-5，IPC-6和IPC-8中，在第6天温度从约36.5℃转变为约31.0℃，并保持在约31.0℃直至培养结束。在实验IPC-7中，在第6天将温度从约36.5℃更改至约33.0℃，并保持在约33.0℃直至培养结束。
在实验IPC-1～IPC-8中，补料培养基(CB7a/CB7b)的灌流从第3天开始，并根据前一天的葡萄糖利用率每天进行调整，以使葡萄糖浓度保持在2.0g/L以上，并且维持最低补料率。使用微泡通气装置以0.5VVM的流速输送氧气。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养过程中，细胞保留在生物反应器中而不排出。
图9显示所有工艺均达到高峰值活细胞密度(高于30×106个细胞/mL)，并且可以保持高水平维持5～6天，工艺7除外，工艺7在第6天后温度保持在33.0℃。
图10显示，在整个培养工艺中，在将近20天的所有培养工艺中，细胞的活率都可以维持在50％以上，工艺7除外，工艺7的终点活率是40％。
图11显示，所有工艺的累积体积生产率(Pv)均高于12g/L，最高为23g/L。
图12显示，在整个培养期间，大多数工艺的葡萄糖浓度控制在2g/L以上。
图13显示了在所有工艺中都观察到了指数生长期的典型乳酸生产期，随后是乳酸消耗。
【D.实施例3】
在此实施例中，使用克隆Y，将强化灌流培养工艺(B)的性能与传统的传统补料批次培养工艺(A)和灌流培养工艺(C)的性能进行了直接比较。
传统补料批次培养工艺A：
在摇瓶中以250mL容器体积中的50mL初始工作体积执行工艺A。在补充有6mM L-谷氨酰胺的Excell Advanced CHO培养基(Sigma)中以0.40×106个细胞/mL接种细胞，然后培养14天。在培养工艺中，在第3天，第6天，第8天和第10天分别补给3.00％的基础培养基CB7a和0.30％的补料培养基CB7b。在第5天将温度从36.5℃转变为33.0℃。通过补给400g/kg葡萄糖原液，将葡萄糖浓度控制在2.0g/L以上。
强化灌流培养工艺B
使用delta V控制器执行工艺B以将温度控制在约36.5℃，在约7.2～6.8之间的pH范围内，并且将DO控制在约40％的空气饱和度下。工艺B是在3L Applikon容器中进行的，该容器具有0.2μm截留中空纤维过滤功能(Spectrum labs)，以ATF-2H***(RefineTechnology)在ATF流动模式下运行，用于保留细胞。在补充有6.0mM L-谷氨酰胺的ExcellAdvanced CHO培养基(Sigma)中以0.70～0.80×106个细胞/mL开始培养。从第5天开始直至培养工艺结束，每天添加约10～100ppm的消泡剂。从第1天开始以0.4VVD的速率开始灌注基础培养基(Excell Advanced CHO培养基，Sigma)，并在第4天将速率提高至1.5VVD。从第5天开始以基础培养基速率的2％的速率灌流补料培养基(CB7a/CB7b)，并在第12天增加到基础培养基的速率的9.0％。在第18天，补料培养基的灌流速率降低到7％，从培养的第19天到培养结束，保持在6％。从第4天到培养结束，基础培养基的灌流速率保持在1.5VVD。使用微量喷雾器以0.5VVM的流速输送氧气。在第5天将温度从约36.5℃转变至约33.0℃，并保持在33.0℃直至培养终止。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养工艺中，细胞保留在生物反应器中而不会排出。
灌流培养工艺C：
使用delta V控制器探索灌流培养工艺C，以控制温度在34.5℃，pH在7.1和6.7之间以及溶解氧在40％的空气饱和度下。工艺C是在7L Applikon容器中进行的，该容器具有0.2μm截留中空纤维过滤(Spectrum labs)，以ATF-2H***(Refine Technology)在ATF流动模式下运行，用于保留细胞。在补充有6.0mM L-谷氨酰胺和额外的2.5g/L葡萄糖的ExcellAdvanced CHO培养基(Sigma)中，以约0.50～0.60×106个细胞/mL的浓度开始培养。从第4天开始每天添加约10～100ppm的消泡剂。从第2天开始以0.5VVD的速率灌流基础培养基(Excell Advanced CHO培养基，Sigma)，并在第5天将速率提高至1.5VVD。从第37天开始以基础培养基的2.0％的比率开始灌流补料培养基(CB7a/CB7b)，并保持该比率直至培养终止。从第5天到培养结束，基础培养基的灌流速率保持在1.5VVD。使用微量喷雾器以0.5VVM的流速输送氧气。在整个培养工艺中温度设定为34.5℃。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养工艺中，通过排出除去多余的细胞，将活细胞密度的目标定位为50.00×106个细胞/mL。
图14显示，在工艺B中达到了更高的峰值活细胞密度，与传统补料批次培养工艺A相比，几乎达到了七倍。在相同的培养期间，工艺B与灌流工艺C相比可以获得更多的生物量。
图15显示，与传统补料批次培养工艺A(14天)相比，工艺B可以在21天的更长时间内保持较高的生存能力。
图16显示，来自工艺B的累积Pv分别比工艺A和工艺C中的最终浓度高约18.49倍和1.39倍。考虑到由每天每工作量的生产率所定义的容量，工艺B(2.48g/L/天)几乎是灌流工艺C(0.83g/L/天)的三倍。
图17显示，在不同的工艺中使用不同的葡萄糖控制策略呈现出不同的葡萄糖曲线。
图18显示，与工艺A和C相比，在工艺B中观察到了指数生长期中典型的乳酸生产期，随后是乳酸的消耗，随着培养后期乳酸浓度的增加，而工艺A和工艺C均在培养后期观察到乳酸浓度升高。
【E.实施例4】
在此实施例中，使用克隆Z，将强化灌流培养工艺(B)的性能与传统补料批次培养工艺(A)的性能直接进行了比较。
传统补料批次培养工艺A：
传统补料批次培养工艺是在3L规模上开发的，并扩大到15L。传统补料批次培养工艺A在3L的Applikon容器中以2.0L的初始工作体积执行。在补充有4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)次黄嘌呤单钠和1％(v/v)胸苷的Actipro培养基(Hyclone)中以0.60×106个细胞/mL接种细胞，然后培养14天。在培养期间，分别在第3天，第5天，第7天和第10天分别补给3.00％，5.00％，5.00％和5.00％的补料培养基CB7a与0.30％，0.50％，0.50％和0.50％的补料培养基CB7b。在第5天将其从36.5℃转变为31.0℃。通过加入400g/kg葡萄糖储备溶液使葡萄糖浓度保持在1g/L以上。
强化灌流培养工艺B：
工艺B以3L规模开发，并按15L和250L放大。对于3L规模的工艺，在3L Applikon容器中培养1.5L工作体积。对于15升规模的工艺，在15升Applikon容器中培养10升工作体积。对于250L规模，在SUB 250L一次性生物反应器中培养150L工作体积。使用ATF***(RefineTechnology)以ATF流动模式运行的0.2μm中空纤维过滤(Spectrumlabs/RefineTechnology)用于保留细胞。使用delta V控制器执行工艺B以将温度控制在约36.5℃，pH值在约7.2～6.8之间，并且将DO控制在约40％的空气饱和度下。
对于3L规模的实验，在添加有4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)次黄嘌呤单钠和1％(v/v)的Actipro培养基(Hyclone)中以1.10～1.30×106个细胞/mL的浓度开始培养胸苷。从第2天开始每天添加约10～100ppm消泡剂。从第2天开始以0.6VVD的速率灌流基础培养基(Actipro，Hyclone)，并在第6天将其速率提高至0.88VVD。从第2天开始以基础培养基的6.7％的速率开始灌流补料培养基CB7a，然后增加到基础培养基的15.9％。从第2天开始灌输补料培养基CB7b，并将速率保持在0.005VVD，直到培养终止。从第6天到培养结束，基础培养基的灌流速率保持在0.88VVD。使用微量喷雾器以0.33VVM的流量输送氧气。在第5天将温度从36.5℃转变为31.0℃，并保持在31.0℃直到培养终止。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养工艺中，细胞保留在生物反应器中而不排出。
对于250L规模的实验，以0.80～1.40×106个细胞/mL的培养液开始，在Actipro培养基(Hyclone)中添加4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)次黄嘌呤单钠和1％(v/v))胸苷。第2天后每天添加约10～100ppm消泡剂。从第2天开始以0.6VVD的速率开始灌流基础培养基(Actipro，Hyclone)，并在第6天将速率提高至0.88VVD。从第2天开始以基础培养基的6.7％的速率开始灌流补料培养基CB7a，并增加到基础培养基的15.9％。从第2天开始灌输补料培养基CB7b，并将速率保持在0.005VVD，直到培养终止。从第6天到培养结束，基础培养基的灌流速率保持在0.88VVD。从第4天开始使用微量喷雾器输送氧气。第5天将温度从36.5℃转移到31.0℃，并保持在31.0℃直至培养结束。通过ATF连续收获细胞培养物。在整个培养工艺中，细胞保留在生物反应器中而不排出。
相同的工艺分别放大到15L生物反应器和250L生物反应器。为了在15L生物反应器中进行培养，使用了带有两个ATF-2H***(Refine Technology)，以ATF流动模式运行的0.2μm截止中空纤维过滤(Spectrum labs)。对于在250L生物反应器中的培养，使用0.2μm截留中空纤维过滤(Spectrumlabs)在ATF流式模式下使用两个ATF-6***(Refine Technology)来保留细胞。
图19显示，与相同的3L规模的补料批次培养工艺工艺A相比，工艺B展示了更长的指数生长期和几乎两倍的峰值活细胞密度。
图20显示，在第14天之前，工艺B可以以相同的3L规模维持与工艺A相当的细胞活力。
图21显示，在相同的3L规模下，工艺B的累积Pv约为传统分批补给工艺A中最终浓度的6.56倍。
图22显示，在相同的3L规模下，工艺A和工艺B的葡萄糖浓度控制相当。
图23显示了在相同的3L规模下，在工艺A和B中都观察到了指数生长期的典型乳酸生产期，随后是乳酸消耗。
图24显示，与传统补料批次培养工艺A相比，工艺B展示了更长的指数生长期和几乎两倍的峰值活细胞密度。放大到15L和250L规模时，工艺B的活细胞密度结果为可与3L相媲美。
图25显示，工艺B可以维持与工艺A相当的细胞活力。当工艺B放大至15L和250L规模时，工艺B的活力结果与3L规模相当。
图26显示，工艺B的细胞平均直径大于传统补料批次培养工艺。
图27显示，由于不同的葡萄糖控制策略，不同工艺之间的葡萄糖曲线也不同。
图28显示了在工艺A和工艺B中都观察到了指数生长期的典型乳酸生产期，随后是乳酸消耗。
图29显示，工艺B的铵含量高于传统的分批补给工艺。
图30和31显示，在工艺A和工艺B中，pH都得到了很好的控制，并且随着工艺的扩大，pH值略低。
图32显示，在相同规模下，工艺B的pCO2曲线与工艺A相当。随着工艺规模的扩大，pCO2水平也随之增加。
图33显示了工艺B的重量摩尔渗透压浓度略高于工艺A，但在400mOsm/Kg以下已得到很好的控制。
图34显示，工艺B的累积Pv约为传统补料批次培养工艺A中最终浓度的4.5倍。不同规模的工艺B的累积Pv均超过20g/L。
图35显示了由工艺B在15L规模和250L规模下产生的聚集体和片段的比较。来自工艺B的SEC主峰在两个规模上都是相当的。
图36显示了与工艺A和工艺C相比，在工艺B中实现了cIEF主峰以及酸性峰的减少。
接下来，对强化灌流培养工艺B中物料的直接产品捕获工艺进行了连续工艺评估。从工艺B中收获的物料在第7天～第18天进行收集，并用四个袋子存储，分别是第7天～第10天，第10天到第13天，第13天到第16天，第16天到第18天。计算了连续工艺的产量和生产率，同时还评估了产品质量属性，SEC纯度和HCP含量。
连续的直接产品捕获工艺：
连续模式层析法分别是在有三个1.1/5.0cm(内径/床高)层析柱的BioSMB PD***(15L规模)和有三个10.0/5.2cm(内径/床高)层析柱的BioSMB工艺***(250L规模)上进行的。上述两个柱均填充有MabSelect PrismA树脂。在上样阶段和上样后淋洗阶段，串联连接了两个层析柱，而在其他阶段，仅处理一个层析柱。这两条流路在BioSMB PD***上并行处理，并在三个层析柱之间自动切换。
根据不同保留时间和上样浓度下的穿透曲线计算连续工艺的上样量和保留时间。层析步骤在室温下进行(18～26℃)。根据洗脱产物中的产物量除以上样样品中的产物量来计算收率。洗脱产物的浓度由280nm波长处的UV吸光度确定，而上样样品的浓度由ProteinA HPLC测定。上样体积由层析***的体积累加器确定，而洗脱产物体积由所收集样品的净重确定。基于上样样品的量除以工艺时间和树脂的体积来计算生产效率。
将洗脱液中和至pH5.5，然后在洗脱后用0.2μm PES注射器过滤器过滤。通过SECHPLC和用于CHO细胞的商业ELISA试剂盒分别测定中和产物的SEC纯度和HCP含量。这2轮运行的收量和产品质量属性(包括SEC纯度、clEF纯度和HCP含量)总结于表6。在不同规模下整个培养时间内一致的收量和产品质量属性数据表明强化灌流培养工艺B是稳健的。
表5：15L规模的连续捕获工艺的总结
表6：250L规模的连续捕获工艺的总结
Claims (50)
1.生产生物物质的方法，其包括：
(a)培养包含细胞培养基和细胞的细胞培养物，
(b)在生物反应器中用基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物，以及
(c)收获生物物质，
其中将基础培养基和补料培养基以不同的速率补给到细胞培养物中，使细胞培养物连续通过分离***，并且将细胞保留在生物反应器中而不排出。
2.权利要求1的方法，其中所述分离***是交替切向流过滤(ATF)装置或切向流过滤(TFF)装置。
3.权利要求1的方法，其中所述分离***包括中空纤维过滤器。
4.权利要求3的方法，其中所述中空纤维过滤器的分子量截留值(MWCO)大于所述生物物质的分子量。
5.权利要求4的方法，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～约0.5μm。
6.权利要求4的方法，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.1μm～约0.5μm。
7.权利要求4的方法，其中所述孔径为约0.2μm或约0.45μm。
8.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以每天约0.1～不高于约2.0工作体积(VVD)的灌流速率补给。
9.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.1～约1.5(VVD)的灌流速率补给。
10.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.3～约1.2(VVD)的灌流速率补给。
11.权利要求1～7任一项的方法，其中所述基础培养基以约0.5～约1.0(VVD)的灌流速率补给。
12.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流的速率为基础培养基的灌流速率的约0.1％～约20％。
13.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约15％。
14.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约10％。
15.权利要求1～7任一项的方法，其中所述补料培养基的灌流速率为基础培养基的灌流速率的约1％～约9％。
16.权利要求1～15任一项的方法，其中所述细胞在约35℃～约37℃的范围内培养。
17.权利要求1～16任一项的方法，其还包括使所述细胞培养物经历温度转变至约28℃～约33℃范围内的温度。
18.权利要求1～17任一项的方法，其中所述温度转变是响应于预定的峰值活细胞密度(活细胞密度)。
19.权利要求1～18任一项的方法，其中在达到峰值活细胞密度之前降低温度。
20.权利要求1～19任一项的方法，其中将消泡剂添加到所述生物反应器中。
21.权利要求20的方法，其中所述消泡剂选自：油基消泡剂，粉末消泡剂，水基消泡剂，硅氧烷基消泡剂，EO/PO基消泡剂，聚丙烯酸酯烷基酯及其任意组合。
22.权利要求1～21任一项的方法，其中使用微泡通气装置。
23.权利要求22的方法，其中所述微泡通气装置以在约0.2～约0.5VVM的范围内的流速输送氧气。
24.权利要求1～23任一项的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述哺乳动物细胞包括：CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，杂交瘤，BHK(幼仓鼠肾)细胞或骨髓瘤细胞。
26.权利要求1～25任一项的方法，其中所述生物物质选自：受体，酶，融合蛋白，血蛋白，多功能蛋白，病毒或细菌蛋白及免疫球蛋白。
27.权利要求26的方法，其中所述血蛋白来自凝血级联。
28.权利要求26的方法，其中所述多功能蛋白是***。
29.权利要求26的方法，其中所述病毒或细菌蛋白用于疫苗中。
30.权利要求26的方法，其中所述免疫球蛋白是抗体或多特异性抗体。
31.权利要求30的方法，其中所述抗体是IgG或IgM。
32.权利要求30的方法，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
33.权利要求1～32任一项的方法，其中所述方法实现了约10g/L或更高的累积体积生产率(Pv)。
34.权利要求1～33任一项的方法，其中所述方法实现了约15g/L或更高的累积体积生产率(Pv)。
35.权利要求1～34任一项的方法，其中所述方法实现了约20g/L或更高的累积体积生产率(Pv)。
36.权利要求1～35任一项的方法，其还包括通过至少一个层析步骤使收获的生物物质经历连续的产物捕获工艺。
37.权利要求1～36任一项的方法，其还包括使用至少2个层析柱对收获的生物物质进行连续的产物捕获工艺。
38.权利要求1～37任一项的方法，其还包括使用2～16个层析柱对所收获的生物物质进行连续的产物捕获工艺。
39.权利要求1～38任一项的方法，其还包括使用3～8个层析柱对所收获的生物物质进行连续的产物捕获工艺。
40.权利要求1～39任一项的方法，其还包括使用至少3个层析柱对收获的生物物质进行连续的产物捕获工艺。
41.生物物质，其由权利要求1～40任一项的方法产生。
42.生产生物物质的***，其包括：
(a)用于在生物反应器中用基础培养基和补料培养基灌流细胞培养物的模块；和
(b)用于连续收获生物物质的模块，其包括中空纤维过滤器，其孔径或分子量截留值(MWCO)大于生物物质的分子量。
43.权利要求42的***，其还包括用于从所收获的材料中连续捕获生物物质的模块。
44.权利要求42的***，其中用于连续收获生物物质的模块是交替切向流(ATF)装置或切向流过滤(TFF)装置。
45.权利要求42的***，其中基础培养基和补料培养基以不同的速率补给。
46.权利要求42的***，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.08μm～0.5μm。
47.权利要求42的***，其中所述中空纤维过滤器的孔径为约0.1μm～0.5μm。
48.权利要求42的***，其中所述孔径为约0.2μm。
49.权利要求42的***，其中所述孔径为约0.45μm。
50.权利要求42的***，其还包括用于细胞培养的生物反应器和/或微泡通气装置。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2018113776 | 2018-11-02 | ||
| CNPCT/CN2018/113776 | 2018-11-02 | ||
| CN2019089993 | 2019-06-04 | ||
| CNPCT/CN2019/089993 | 2019-06-04 | ||
| PCT/CN2019/108921 WO2020088180A1 (en) | 2018-11-02 | 2019-09-29 | Cell culture process by intensified perfusion with continuous harvest and without cell bleeding |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111406105A true CN111406105A (zh) | 2020-07-10 |
Family
ID=70463469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980002230.2A Pending CN111406105A (zh) | 2018-11-02 | 2019-09-29 | 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220364034A1 (zh) |
| EP (1) | EP3874023A4 (zh) |
| JP (2) | JP2022506413A (zh) |
| KR (1) | KR102597919B1 (zh) |
| CN (1) | CN111406105A (zh) |
| CA (1) | CA3118398A1 (zh) |
| MA (1) | MA54093A (zh) |
| SG (1) | SG11202104417UA (zh) |
| TW (1) | TW202035681A (zh) |
| WO (1) | WO2020088180A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112592948A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-02 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 动物细胞的灌流培养方法 |
| CN114230669A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-03-25 | 天士力生物医药股份有限公司 | 一种双特异性抗体的生产方法 |
| WO2024040519A1 (en) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Wuxi Biologics Co., Ltd. | Intermittent perfusion fed-batch culture |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022007897A1 (zh) * | 2020-07-10 | 2022-01-13 | 青岛卓云海智医疗科技有限公司 | 小分子化合物用于激活卵泡的方法及其制剂 |
| JP2023546736A (ja) * | 2020-10-15 | 2023-11-07 | エージーシー バイオロジクス，インコーポレーテッド | 二重容器接線流濾過による連続的高細胞密度培養 |
| AU2022226422A1 (en) * | 2021-02-25 | 2023-09-14 | Securecell Ag | Fluid sampling system for biotechnological applications, operating method and use thereof |
| US20240002770A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Genentech, Inc. | Systems, apparatus, and methods for cell culture |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0265778A (ja) * | 1988-08-29 | 1990-03-06 | Nissho Corp | 細胞培養産生物の取出しおよび培地の交換方法 |
| WO2008006494A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved process for the culturing of cells |
| US20090042253A1 (en) * | 2007-08-09 | 2009-02-12 | Wyeth | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| CN105722967A (zh) * | 2013-09-16 | 2016-06-29 | 建新公司 | 用于处理细胞培养物的方法和*** |
| US20170114381A1 (en) * | 2014-06-04 | 2017-04-27 | Amgen Inc. | Methods for harvesting mammalian cell cultures |
| US20170166942A1 (en) * | 2014-01-29 | 2017-06-15 | Amgen Inc. | Overexpression of n-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins |
| CN106987559A (zh) * | 2017-03-22 | 2017-07-28 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用 |
| WO2018116198A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Serum Institute Of India Private Limited | Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200902708A (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
| DE102008064279A1 (de) * | 2008-12-20 | 2010-06-24 | Bayer Technology Services Gmbh | Bioreaktor |
| CN103305417A (zh) * | 2012-03-07 | 2013-09-18 | 无锡药明康德生物技术有限公司 | 进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用 |
| WO2015075070A1 (en) * | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Cmc Biologics A/S | A bioreactor system and method for producing a biopolymer |
| US20160312168A1 (en) * | 2013-12-30 | 2016-10-27 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Apparatus for cell cultivation |
| TW202340452A (zh) * | 2015-08-04 | 2023-10-16 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
| EP3374636B1 (en) * | 2015-11-10 | 2020-06-03 | Repligen Corporation | Disposable alternating tangential flow filtration units |
| WO2018178063A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Perfusion medium |
| EP3601586A1 (en) * | 2017-03-31 | 2020-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Perfusion medium |
| CN108504562A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-09-07 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一种发酵生产l-苏氨酸的***及其应用 |
-
2019
- 2019-09-29 CA CA3118398A patent/CA3118398A1/en active Pending
- 2019-09-29 KR KR1020217015264A patent/KR102597919B1/ko active IP Right Grant
- 2019-09-29 JP JP2021523777A patent/JP2022506413A/ja active Pending
- 2019-09-29 WO PCT/CN2019/108921 patent/WO2020088180A1/en unknown
- 2019-09-29 SG SG11202104417UA patent/SG11202104417UA/en unknown
- 2019-09-29 US US17/289,332 patent/US20220364034A1/en active Pending
- 2019-09-29 MA MA054093A patent/MA54093A/fr unknown
- 2019-09-29 CN CN201980002230.2A patent/CN111406105A/zh active Pending
- 2019-09-29 EP EP19878905.9A patent/EP3874023A4/en active Pending
- 2019-10-31 TW TW108139590A patent/TW202035681A/zh unknown
-
2023
- 2023-05-09 JP JP2023077345A patent/JP2023109835A/ja active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0265778A (ja) * | 1988-08-29 | 1990-03-06 | Nissho Corp | 細胞培養産生物の取出しおよび培地の交換方法 |
| WO2008006494A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved process for the culturing of cells |
| US20090042253A1 (en) * | 2007-08-09 | 2009-02-12 | Wyeth | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| CN105722967A (zh) * | 2013-09-16 | 2016-06-29 | 建新公司 | 用于处理细胞培养物的方法和*** |
| US20170166942A1 (en) * | 2014-01-29 | 2017-06-15 | Amgen Inc. | Overexpression of n-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins |
| US20170114381A1 (en) * | 2014-06-04 | 2017-04-27 | Amgen Inc. | Methods for harvesting mammalian cell cultures |
| WO2018116198A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Serum Institute Of India Private Limited | Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof |
| CN106987559A (zh) * | 2017-03-22 | 2017-07-28 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SEN XU: "Bioreactor Productivity and Media Cost Comparison for Different Intensified Cell Culture Processes", 《BIOTECHNOL. PROG.》, pages 867 - 878 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112592948A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-02 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 动物细胞的灌流培养方法 |
| CN112592948B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-05-09 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 动物细胞的灌流培养方法 |
| CN114230669A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-03-25 | 天士力生物医药股份有限公司 | 一种双特异性抗体的生产方法 |
| CN114230669B (zh) * | 2021-12-24 | 2024-01-30 | 天士力生物医药股份有限公司 | 一种双特异性抗体的生产方法 |
| WO2024040519A1 (en) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Wuxi Biologics Co., Ltd. | Intermittent perfusion fed-batch culture |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MA54093A (fr) | 2021-09-08 |
| TW202035681A (zh) | 2020-10-01 |
| WO2020088180A1 (en) | 2020-05-07 |
| SG11202104417UA (en) | 2021-05-28 |
| KR102597919B1 (ko) | 2023-11-06 |
| US20220364034A1 (en) | 2022-11-17 |
| CA3118398A1 (en) | 2020-05-07 |
| JP2022506413A (ja) | 2022-01-17 |
| EP3874023A4 (en) | 2022-08-17 |
| JP2023109835A (ja) | 2023-08-08 |
| KR20210086655A (ko) | 2021-07-08 |
| EP3874023A1 (en) | 2021-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111406105A (zh) | 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法 | |
| JP7227406B2 (ja) | 細胞培養物を処理する方法およびシステム | |
| EP2501822B1 (en) | Methods for enhanced protein production | |
| KR101050585B1 (ko) | 연속식 살포 및 교호 접선 흐름에 의한 세포 배양 방법 | |
| EA016451B1 (ru) | Способ суспензионного культивирования клеток | |
| TWI777364B (zh) | 連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法 | |
| KR102604988B1 (ko) | 관류 배지 | |
| US20200332248A1 (en) | Staged-retention method for upstream production of biomacromolecules, production module used therein and application thereof in production | |
| JPWO2019181234A1 (ja) | 生産物の製造方法 | |
| AU2004235017A1 (en) | Process for the production of biological substances by perfusion culturing of suspended animal cells | |
| WO2019117136A1 (ja) | 動物細胞、動物細胞の製造方法および目的タンパク質の製造方法 | |
| CN112592948A (zh) | 动物细胞的灌流培养方法 | |
| EA047099B1 (ru) | Кондиционирование с высокой солевой нагрузкой в ходе катионообменной хроматографии для удаления связанных с продуктом примесей | |
| CN114746441A (zh) | 阳离子交换色谱期间的高盐加载调节以去除产物相关杂质 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |