ES2650042T3 - Proceso mejorado para el cultivo de células - Google Patents
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Abstract
Proceso para el cultivo de células eucariotas en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en el que las células producen una sustancia biológica deseada seleccionada de proteínas y vacunas, que puede usarse como principio activo en una preparación farmacéutica, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, la sustancia biológica deseada y el medio de cultivo celular circula sobre un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamaño de poro caracterizado por un corte de peso molecular de al menos 30 kDa y como máximo 100 kDa, adecuado para separar la sustancia biológica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biológica deseada, en el que el flujo de salida de líquido del filtro esencialmente solamente contiene componentes que tienen un peso molecular inferior al de la sustancia biológica deseada, y en el que la sustancia biológica deseada se retiene o retroalimenta al reactor.
Description
(ReFacto™), interferón linfoblastoide α-n1 (Wellferon™), factor de coagulación (recombinante) (NovoSeven™), etanercept, (Enbrel™), trastuzumab (Herceptin™), infliximab (Remicade™), palivizumab (Synagis™), basiliximab (Simulect™), daclizumab (Zenapaz™), rituximab (Rituxan™), factor de coagulación (recombinante) IX (Benefix™) e interferón β-1a (Avonex™).
5 Los ejemplos de vacunas que se pueden utilizar como un principio activo en la preparación farmacéutica incluyen antígenos de proteínas aislados, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vacuna contra el rotavirus viva, oral y tetravalente (RotaShield™), vacuna contra la rabia (RanAvert™), vacunas contra la gripe, y vacuna contra la hepatitis A inactivada (VAQTA™).
10 El pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo celular son, en principio, no críticos y dependen del tipo de célula elegida. Preferiblemente, el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad se eligen de tal forma que sean óptimos para el crecimiento y la productividad de las células. El experto en la técnica sabe cómo encontrar el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno
15 disuelto y la osmolaridad óptimos para el cultivo (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/099396). Preferiblemente, para el proceso de la invención cuando se utilizan células HER inmortalizadas por E1, el pH se elige entre 6,6 y 7,6, y/o la temperatura se elige entre 30 y 39 ºC, y/o la osmolaridad se elige entre 260 y 400 mOsm/kg. Para mantener condiciones del proceso óptimas se desea la automatización para controlar las condiciones del proceso. Con el fin de optimizar las condiciones del proceso, por ejemplo, para obtener la detención
20 del crecimiento para una productividad celular aumentada, durante el cultivo se puede aplicar un cambio en las condiciones de cultivo. Esto se puede establecer, por ejemplo, mediante un cambio de temperatura (tal como, de 37 a 32 ºC), un cambio del pH o un cambio de la osmolaridad.
El proceso de la presente invención puede realizarse, en principio, en cualquier tipo de medio de cultivo celular
25 adecuado para el cultivo de células. Las directrices para la elección de un medio de cultivo celular y condiciones del cultivo celular se conocen bien y se proporcionan, por ejemplo, en los Capítulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4ª edición 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell &Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
30 Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, como un componente del medio de cultivo celular, una fuente de hidratos de carbono, sales y/o aminoácidos y/o vitaminas y/o lípidos y/o detergentes y/o tampones y/o factores de crecimiento y/u hormonas y/o citocinas y/u oligoelementos. Los ejemplos de fuentes de hidratos de carbono incluyen glucosa, fructosa, galactosa y piruvato. Los ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo, MgCl2.6H2O, MgSO4 y MgSO4.7H2O, sales de hierro, por ejemplo, FeSO4.7H2O, sales
35 potásicas, por ejemplo, KH2PO4, KCl; sales sódicas, por ejemplo NaH2PO4, Na2HPO4, y sales cálcicas, por ejemplo, CaCl2.2H2O. Los ejemplos de aminoácidos incluyen todos los aminoácidos proteinogénicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Los ejemplos de lípidos incluyen: ácidos grasos, por ejemplo, ácido linoleico y ácido oleico; los ejemplos de detergentes incluyen Tween® 80 y Pluronic® F68. Los ejemplos de tampones
40 incluyen HEPES y Na2CO3. Los ejemplos de factores de crecimiento/hormonas/citocinas incluyen IGF (factor de crecimiento de tipo insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Los ejemplos de elementos traza se conocen por el experto en la técnica e incluyen Zn, Mg y Se. El medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, también otros componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, peptona de soja o etanol amina.
45 Para la producción de sustancias biológicas de acuerdo con la invención, en particular, si las sustancias biológicas se van a utilizar como un principio activo en preparaciones farmacéuticas, se prefiere medio libre de suero para medios que contienen una fuente de suero. La razón de esto es que los medios de fuente de suero pueden estar contaminados con virus, presentan el riesgo de infecciones priónicas, y pueden crear un obstáculo importante en el procesamiento aguas abajo del producto biofarmacéutico (es decir, la purificación adicional de la sustancia biológica
50 del cultivo celular). Por lo tanto, el proceso de la invención se realiza preferiblemente en un medio de cultivo celular que no comprende suero de una fuente animal, incluyendo el ser humano. Puesto que los compuestos de una fuente de mamífero también presentan un riesgo de infección, preferiblemente el medio de cultivo celular está libre de una fuente de mamífero (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente de mamífero). Más preferiblemente, el medio de cultivo celular está libre de una fuente animal (es decir, el medio de
55 cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente animal, incluyendo el ser humano). Los ejemplos de medio libre de suero que se pueden utilizar para el cultivo de células PER.C6 incluyen medios disponibles en el mercado tales como, por ejemplo, medio EX Cell™ VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino™ (HyClone), IS ProVec CD (Irvine scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
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En realizaciones preferidas, la sustancia biológica producida en el proceso de la presente invención se recolecta a partir del flujo cuyo contenido se mantiene en o preferiblemente se retroalimenta al reactor, o a partir del cultivo de células que se retira del reactor o de ambos. La sustancia o sustancias biológicas producidas en el proceso de la presente invención se pueden cosechar adicionalmente del cultivo celular en el denominado procesamiento aguas 5 abajo, utilizando métodos que dependen de la sustancia biológica, métodos que, como tales, se conocen bien por el experto. El procesamiento aguas abajo comprende habitualmente varias etapas de purificación en combinaciones y orden variables. Los ejemplos de etapas de purificación en el procesamiento de aguas abajo son etapas de separación (por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de intercambio iónico y/o extracción mediante sistemas acuosos bifásicos y/o precipitación mediante, por ejemplo, sulfato de amonio), etapas para la
10 concentración de la sustancia biológica (por ejemplo, mediante ultrafiltración o diafiltración), etapas para intercambiar tampones y/o etapas para eliminar o inactivar virus (por ejemplo, mediante la filtración de virus, cambio del pH o tratamiento con detergente disolvente).
En un aspecto, la invención se refiere a un cultivo celular que comprende células de mamífero, preferiblemente
15 células HER inmortalizadas por E1, más preferiblemente células PER.C6, con una densidad de células viables de al menos 50.106 células/ml, preferiblemente al menos 60.106 células/ml, en particular al menos 90.106 células/ml y una concentración de sustancia biológica de al menos 5 g/l, más preferiblemente al menos 10 g/l, en particular al menos 11 g/l. En principio, la concentración de la sustancia biológica puede ser tan alta como lo permita la solubilidad de la sustancia biológica. La concentración de células viables es típicamente no mayor de 200.106 células/ml, y
20 preferiblemente dentro del intervalo de 80-150.106 células/ml.
La densidad de células viables se puede determinar, por ejemplo, usando el método de exclusión con azul de tripano, por ejemplo, mediante el uso de un contador de células tal como está comercialmente disponible, por ejemplo, en Innovatis (contador de células Cedex).
25 Con cultivo celular se refiere al líquido que comprende medio de cultivo celular, células y sustancia biológica, cuyo líquido es el resultado de un proceso para el cultivo de células en un reactor en un medio de cultivo celular, en el que las células producen la sustancia biológica.
30 La invención se explicará ahora por medio de los siguientes ejemplos, sin embargo sin estar limitada a los mismos.
Descripción de las figuras
La figura 1/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo
35 del proceso X (días) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invención). La figura 2/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (días) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invención). La figura 3/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo
40 del proceso X (días) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invención). La figura 4/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (días) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invención). La figura 5/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo
45 del proceso X (días) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C3 (proceso de la invención). La figura 6/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A3) frente al tiempo del proceso X (días) para los procesos A y C3. La figura 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparación con el rendimiento en el proceso A, por L de volumen de reactor) representado gráficamente frente el tiempo del proceso X (días) para los
50 procesos A, B y C3. La figura 8/9 muestra el número de células Y (106.ml-1) representado gráficamente frente el tiempo del proceso X (días) para C4 (proceso de la invención). La figura 9/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración máxima de IgG alcanzada frente al tiempo del proceso X (días) para el proceso C4 (una realización del
55 proceso de la invención)
Ejemplos
Ejemplo 1: Comparación entre un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentado y el proceso de acuerdo con la
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La figura 9/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración máxima de IgG alcanzada frente al tiempo de proceso X (días) para el proceso C4 (una realización del proceso de la invención).
5 La fermentación se realizó utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 ºC, el pH entre 7,1 y 6,9 y la DO a una saturación del aire del 40 % y a 100 rpm. La temperatura se hizo descender a 32 ºC el día 5.
Proceso de la invención C4
10 El proceso de la invención se realizó en un recipiente Applikon de 2 l. El dispositivo de retención de células y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology). El cultivo se inició con 5.106 células.ml-1 en medio de cultivo MTCM-49 (Hyclone). El medio se perfundió a través del cultivo celular en suspensión utilizando
15 una SFR entre 0,1 y 0,4 nl.célula-1.día-1. La presión de CO2 se controló por debajo del 15 %.
Resultado
Los datos muestran que el proceso de la invención también funciona cuando se utiliza una línea celular CHO
20 productora de proteínas. La densidad celular lograda y las concentraciones de los productos están aumentadas en comparación con el cultivo por lotes. Los datos también demuestran que en el proceso de acuerdo con la presente invención se puede detener el crecimiento celular (por ejemplo, mediante una caída de la temperatura), mientras que continúa la acumulación de producto en el sistema de cultivo.
25 Ejemplo 5: Proceso de la invención realizado con una línea celular de mieloma.
El proceso de acuerdo con la presente invención también puede aplicarse a líneas celulares de mieloma. Para este fin, la fermentación se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 ºC, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturación del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las células comienza con la
30 inoculación de las células de mieloma a razón de 3 x 10e5 células/ml en medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) en un recipiente Sartorius de 5 l. El dispositivo de retención de células y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) se perfunde a través del cultivo celular en suspensión utilizando una SFR entre 0,1 y 0,4 nl.célula-1.día-1. La presión de CO2 se controló por debajo del 15 %.
35 Ejemplo 6: Proceso de la invención realizado con una línea celular MDCK.
El procedimiento de acuerdo con la presente invención también puede aplicarse a líneas celulares MDCK. Para este fin, la fermentación se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 ºC, el
40 pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturación del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las células comienza con la inoculación de las células MCDK transformadas a razón de 3 x 10e5 células/ml en medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) en un recipiente Sartorius de 5 l. El dispositivo de retención de células y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) se perfunde a través del cultivo
45 celular en suspensión usando una SPR de entre 0,1 y 0,4 nl.célula-1.día-1. La presión de CO2 se controló por debajo del 15 %.
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