ES2625062T3 - Proceso mejorado para el cultivo de células - Google Patents
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Abstract
Cultivo celular que comprende una suspensión de células de mamífero que producen una sustancia biológica deseada que tiene una densidad de células viables de al menos 50 x 106 células/ml y una concentración de la sustancia biológica de al menos 5 g/l, que puede o btenerse por un proceso para el cultivo de las células en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en el que las células producen la sustancia biológica deseada, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, y en el que el cultivo celular que comprende las células, la sustancia biológica deseada y el medio de cultivo celular se hace circular a través de un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamaño de poro caracterizado por un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la sustancia biológica deseada para separar la sustancia biológica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biológica deseada, en el que el flujo de salida de líquido del filtro contiene esencialmente sólo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biológica deseada, y en el que la sustancia biológica deseada se retiene en o se retroalimenta al reactor.
Description
Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
5 Esta invencion se refiere a un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en suspension en un medio de cultivo celular.
Un proceso de este tipo se conoce, por ejemplo, a partir del documento WO04/099396. En el presente documento, se describe como la densidad celular del cultivo celular y el rendimiento del material biologico deseado se pueden 10 mejorar mediante la optimizacidn de las condiciones de crecimiento en un proceso por lotes alimentado.
Ademas, el documento WO05/095578 desvela un proceso para el cultivo de celulas mediante el cultivo de perfusion continua de un cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular y celulas, en el que se anade medio de cultivo celular al cultivo celular, el cultivo celular se hace circular a lo largo de un modulo de filtro que comprende 15 fibras huecas que da como resullado un flujo de salida de liquido que tiene una densidad celular m£s baja que la del cultivo celular, y el flujo dentro del modulo de filtro es un flujo tangencial altemo, en el que las c6lulas producen una sustancia biologica. En los ejemplos del documento WO05/095578 se muestra que se producen 0,9 g/l/dia de producto, correspondiente a una concentracion de producto en el flujo de salida de aproximadamente 0,3 g/l.
20 Cuanto mayor sea el volumen de liquido que contiene la sustancia bioldgica, mas laboriosa se volver£ la purificacion de la sustancia biologica. La concentracion de la sustancia biologica obtenida no es tan alta en los procesos como se desvela en los documentos WO04/099396 y WO05/095578. Por lo tanto, el procesamiento aguas abajo de esta sustancia biologica es engorroso, ya que la sustancia biologica necesita cancentrarse antes de aplicar las etapas de purificacion adicionales o han de purificarse grandes volumenes de sustancia biologica menos concentrada. 25 Adem£s, el cultivo de celulas a menores densidades celulares da como resultado una menor productividad volumetrica y, por lo tanto, requiere mayores y/o mas cantidad de recipientes de cultivo y, por lo tanto, mayores inversiones en equipos para un nivel de produccion dado.
Por lo tanto, es el objeto de la invencion proporcionar un proceso en el que el producto se obtiene a partir del cultivo 30 celular en concentraciones mas altas.
Un objeto adicional de la presente invencion es permitir el cultivo de las celulas y la produccion del material biologico durante un periodo prolongado.
35 Por consiguiente, la presente invencion proporciona un cultivo celular que comprende una suspension de celulas de mamifero que producen una sustancia biologica deseada que tiene una densidad de celulas viables de al menos 50 x 106 celulas/ml y una concentracidn de la sustancia biologica de al menos 5 g7l, que puede obtenerse por un proceso para el cultivo de las celulas en un reactor en suspension en un medio de cultivo celular, en el que las celulas producen la sustancia biologica deseada,
40 en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, y en el que el cultivo celular que comprende las celulas, la sustancia biologica deseada y el medio de cultivo celular se hace circular por un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamano de poro caracterizado por un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la sustancia biologica deseada para separar la sustancia biologica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biologica deseada,
45 en el que el flujo de salida de liquido del filtro contiene esencialmente solo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biologica deseada, y en el que la sustancia biologica deseada se retiene en o se retroalimenta al reactor.
Por ejemplo, la invencion se refiere a un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en un medio de cultivo 50 celular, en el que las celulas producen una sustancia biologica, en el que los nutrientes y/o el medio de cultivo celular se administra/se suministran al reactor, y en el que el cultivo celular que comprende las celulas y el medio de cultivo celular se hace circular por un filtro que tiene un tamano de poro o un corte de peso molecular de entre 5 y 500 kD.
Se ha encontrado que usando un sistema de separacion que separa la sustancia biologica de sustancias que tienen 55 un peso molecular m^s bajo que la sustancia biologica, la sustancia bioldgica se puede acumular en el cultivo celular en mayores concentraciones.
Por lo tanto, la presente invencion difiere del cultivo de celulas descrito en la t£cnica anterior, debido a que permite la acumulacion del material biologico deseado junto con la masa celular.
En una realizacidn preferida de la presente invencidn, parte de las sustancias de menor peso molecular se eliminan contlnuamente del cultivo celular.
5 Una ventaja adlcional del proceso de la presente Invencidn es que se puede alcanzar una mayor concentracidn de cdlulas viables en comparacidn, por ejemplo, con los procesos por lotes o por lotes alimentados. Ademds, el tlempo de produccion - el periodo durante el cual las celulas producen la sustancia bioldgica - se puede ampliar en comparacidn con los procesos por lotes o por lotes alimentados. Ademas, en comparacidn con un proceso por lotes o por lotes alimentado, es posible utillzar un reactor mds pequefio. El uso de reactores mas pequefios es ventajoso, 10 ya que esto reduce las Inversiones en equlpos e instalaciones relacionadas.
Ademas, se pueden obtener concentraciones mas altas de la sustancia bioldgica en tiempos mas cortos.
Se encontrd que era posible obtener altas concentraciones de sustancia biologica dentro del reactor sin disminuir 15 bruscamente la viabilidad celular y, por lo tanto, sin limitar el tiempo de produccidn. El experto en la tdcnica hubiera esperado que se produjera la inhibicidn del producto, es decir, la inhibicion de la produccion de la sustancia biologica por la propia sustancia biologica o la inhibicidn por otras macromoldculas producidas por la cdlula (tales como, por ejemplo, proteinas de celulas huesped, enzimas o desechos celulares). Ademds, se encontrd que la acumulacidn del material bioldgico deseado no afecta a la funcidn del sistema de separacidn.
20
El proceso de la presente invencidn proporciona una ventaja considerable en cuando a la densidad celular, concentracidn de producto en el cultivo celular y periodo de cultivo prolongado en comparacidn con los procesos de acuerdo con los documentos W005/095578 y WO04/099396. Como resultado, el presente proceso da como resultado una produccidn mejorada del material biologica deseado.
25
Las cdlulas que pueden usarse para producir la sustancia biologica son, en principio, todas las cdlulas conocidas por el experto en la tecnica, que tienen la capacidad de proporcionar un producto bioldgico. Las celulas pueden ser eucariotas, por ejemplo, hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Phaffia 30 rhodozyma, levadura del genero Pichia, por ejemplo, Pichia pastoris, o procariotas, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus sp, por ejemplo, 8. licheniformis, B subtilis, B. amyloliquefaciens, B. alkalophilus, Streptomyces sp., Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas sp. Los ejemplos de celulas eucariotas se describen tambidn, por ejemplo, en Chu, L., Robinson, D. K., (2001) Curr. Opinion Biotechn., vol. 12, pdg. 180-187. Preferiblemente, las celulas que se utilizan en el proceso de la presente invencidn son celulas animales, en particular celulas de 35 mamifero. Los ejemplos de cdlulas de mamifero incluyen celulas CHO (ovario de hdmster chino), hibridomas, celulas BHK (rindn de hamster recien nacido), cdlulas de mieloma, cdlulas humanas, por ejemplo, celulas HEK-293, cdlulas linfoblastoides humanas, cdlulas HER inmortalizadas por E1, celulas de ratdn, por ejemplo, celulas NSO. Mas preferiblemente, se utilizan cdlulas HER inmortalizadas por E1, mucho rods preferiblemente celulas PER.C6.
40 Las celulas de retina embrionaria humana (HER) primarias pueden aislarse de fetos (Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484). Las celulas primarias morirdn en cultivo durante varios pases. Las celulas HER inmortalizadas por E1 para el fin de la presente invencion se derivan 45 de las celulas HER primarias mediante la expresion de ADN que codifica las proteinas adenovirales E1A y E1B en la misma, para obtener celulas inmortalizadas. Dichas celulas inmortalizadas pueden cultivarse durante mds de 100 pases. Los metodos para obtener celulas HER inmortalizadas por E1 se han descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.994.128, en Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, en Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH, 1988. 50 Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484, y en Gallimore, P.H., Grand, R.J.A. y Byrd, P.J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. AntiCancer Res. 6, pag. 499-508. Por ejemplo, las cdlulas HER inmortalizadas, incluyendo celulas PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 y PER.C9, se generaron por transfeccidn de celulas HER primarias utilizando un pldsmido que contenia las 55 secuencias codificantes de (Ad5) E1A y E1B de adenovirus serotipo 5 (nucledtidos Ad5 459-3510) bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa ("PGK") humana (vease la patente de Estados Unidos 5.994.128).
En una realizacion preferida, las cdlulas en el proceso de la presente invencidn son celulas HER inmortalizadas por E1, mds preferiblemente celulas PER.C6 (vease la Patente de Estados Unidos 5.994.128). Las celulas PER.C6 se
ilustran por celulas segun se depositan bajo ECACC n.“ 96022940 (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.994.128, documento EP 0833934 B1).
En el proceso de la invencion, las celulas pueden cultivarse en suspensibn en cualquier forma, por ejemplo, en forma 5 de celulas inmovilizadas, celulas individuales o en grupos de celulas o en forma de una combinacibn de las mismas. Preferiblemente, las celulas se cultivan como celulas individuales y/o grupos de celulas pequefios de no mas de 100 celulas, mas preferiblemente de no mas de 20 celulas. Las cblulas pueden inmovilizarse, por ejemplo, sobre microsoportes, tal como estbn comercialmente disponibles en, por ejemplo, GE Healthcare (Cytodex).
10 Un reactor como se define en el presente documento, es un sistema que comprende el cultivo celular, cultivo celular que a su vez comprende celulas y un medio de cultivo celular. Se proporcionan preferiblemente barreras esteriles, tales como filtros de aire, para evitar que otras celulas contaminen las celulas deseadas y mantiene preferiblemente un entorno favorable para las celulas, proporcionando las condiciones de cultivo adecuadas, tales como mezcla, temperatura, pH, concentration de oxlgeno, etc.
15 '
El reactor puede ser, por ejemplo, de una naturaleza mas permanente, por ejemplo, el reactor puede ser de acero inoxidable o vidrio o puede ser, por ejemplo, de naturaleza desechable, por ejemplo, el reactor puede ser un matraz o bolsa de plastico. Los ejemplos de reactores adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, los recipientes de tanque agitado, recipientes neumaticos y bolsas desechables que se pueden mezclar por 20 balanceo, movimiento por sacudida o agitacibn. Se utilizan (bio)reactores preferiblemente desechables, ya que son favorables porque requieren costes de inversion relativamente bajos, tienen una gran flexibilidad operativa, cortos tiempos de respuesta, y son facilmente configurables para el proceso. Los (bio)reactores desechables estan disponibles en el mercado, por ejemplo, en Hyclone, Sartorius, Applikon o Wave.
25 La expresion "sistema de separacibn" se define en el marco de la invencion como un sistema capaz de separar en base al peso molecular. El sistema de separacibn utilizado en el proceso de la invencion es capaz de separar la sustancia biolbgica de sustancias que tienen un peso molecular mbs bajo que la sustancia biolbgica. En otras palabras, el corte del peso molecular se elige de tal forma que el corte del peso molecular (MWCO) es menor de, mbs preferiblemente, al menos un factor de 2, mucho mas preferiblemente al menos un factor de 3 menor que el 30 peso molecular de la sustancia biolbgica. Tipicamente, pero por supuesto dependiendo del peso molecular de la sustancia biolbgica producida en el proceso de la presente invencion, el MWCO del sistema de separacibn es preferiblemente al menos 5, mbs preferiblemente al menos 10, mucho mbs preferiblemente al menos 30 kDa y preferiblemente como mucho 500 kDa, mbs preferiblemente como mucho 300 kDa, mucho mbs preferiblemente a lo sumo 100 kDa. Por ejemplo, para una IgG con un peso molecular de 150 kDa, es el mas preferido un sistema de 35 separacibn que tenga un MWCO de como mucho 50 kDa.
Los ejemplos de sistemas de separacibn incluyen, pero no se limitan a, filtros, centrifugas y sistemas de extraccibn bifbsica acuosos.
40 El termino "filtro", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los dispositivos con la capacidad de separar las particulas en funcion de su tamafio o peso molecular. En principio, en el proceso de la presente invencion, se puede utilizar cualquier filtro siempre y cuando el tamafio de poro o el MWCO se elijan de tal forma que la sustancia biolbgica se separe de sustancias que tengan un peso molecular mbs bajo que la sustancia biolbgica, tipicamente este serb una tamafio de poro o un MWCO de entre 5 y 500 kDa. Los ejemplos de filtros adecuados 45 para su uso en la presente invencion incluyen filtros de membrana, filtros de material ceramico y filtros metalicos. El filtro puede usarse en cualquier forma; el filtro puede ser, por ejemplo, enrollado en espiral o tubular o puede utilizarse en la forma de una hoja. Preferiblemente, en el proceso de la invencion, el filtro utilizado es un filtro de membrana, preferiblemente un filtro de fibra hueca. Con la expresion "fibra hueca" se refiere a una membrana tubular. El dibmetro interno del tubo es de al menos 0,1 mm, mbs preferiblemente al menos 0,5 mm, mucho mas 50 preferiblemente al menos 0,75 mm y preferiblemente el diametro interno del tubo es como mucho de 10 mm, mbs preferiblemente como mucho de 6 mm, mucho mbs preferiblemente como mucho de 1 mm. Los modulos de filtro que comprenden fibras huecas estbn disponibles en el mercado, por ejemplo, en General Electric (GE, anteriormente Amersham).
55 Haciendo circular el cultivo celular que comprende la sustancia biolbgica, las celulas y el medio de cultivo celular por un sistema de separacibn, la sustancia biolbgica y las celulas quedan retenidas en el reactor y, por lo tanto, el flujo de salida de liquido tiene una menor concentracion de sustancia biolbgica y una densidad celular inferior que el cultivo celular. Habitualmente, en el proceso de la invencibn, el flujo de salida de liquido no contiene o apenas contiene cualquier sustancia biolbgica y celulas. Normalmente, el flujo de salida de liquido contendra bbsicamente
solo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia bioldgica. Esencialmente todas las celulas y esencialmente toda sustancia bioldgica quedan por lo tanto, normalmente retenidas en el reactor.
Preferiblemente, el tamafio de los poros o el MWCO del filtro se elige de manera que el tamafio de los poros o el 5 MWCO del filtro es menor que, mas preferiblemente al menos un factor de 2, mds preferiblemente al menos un factor de 3 menor que el didmetro o el peso molecular del producto, asegurando una alta retencidn de producto. Tlpicamente, pero, por supuesto, dependiendo del tamafio o del peso molecular del producto, es decir, la sustancia bioldgica producida en el proceso de la presente invencidn, el tamafio de poro o MWCO del filtro es preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 10, mucho mds preferiblemente al menos 30 kDa, y/o el tamafio de poro 10 o el MWCO del filtro/membrana es preferiblemente a lo sumo 500 kDa, mds preferiblemente a lo sumo 300 kDa, mucho mas preferiblemente a lo sumo 100 kDa.
Con el code del peso molecular (MWCO) se refiere al peso molecular por encima del cual al menos el 90 % de las particulas quedan retenidas por el sistema de separacidn.
15
Haciendo circular el cultivo celular por un sistema de separacidn, por ejemplo un filtro, significa que el cultivo celular se hace pasar a traves de un sistema de separacidn, por ejemplo un filtro que da como resultado un flujo de salida de liquido y un flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retroalimenta al reactor. El flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retroalimenta al reactor, contendra normalmente en esencia sdlo componentes que tienen un peso 20 molecular al menos igual al de la sustancia bioldgica o superior y, por lo tanto, dicho flujo comprendera mas sustancia bioldgica que el flujo de salida de liquido.
En principio, no es critico cuando se inicie la circulacidn del cultivo celular por el sistema de separacidn durante el proceso de la invencidn. La circulacidn del cultivo celular puede iniciarse, por ejemplo, directamente desde el inicio 25 del proceso o cuando la densidad de celulas viables de las celulas ha alcanzado un cierto nivel.
La circulacidn del cultivo celular por un filtro puede ser un flujo sustancialmente perpendicular con respecto a la superficie del filtro, tambidn conocido como flujo de extremo muerto, o un flujo sustancialmente paralelo a la superficie del filtro, tambidn conocido como flujo tangencial, por ejemplo flujo tangencial unidireccional (TFF) o flujo 30 transversal. Un ejemplo preferido de flujo transversal es un flujo tangencial altemo (ATF), ya que con un ATF se encontrd que no se produce (rdpidamente) la obstruccidn del filtro, incluso a densidades celulares muy altas. Es de conocimiento general comun que en la filtracidn de profundidad, el filtro final de poros pequefios necesita ser protegido de la obstruccidn por prefiltros gruesos. Esta practica se basa en el conocimiento general comun de que filtros con poros mds pequefios o con un MWCO menor se obstruyen mds facilmente, limitando asi el tiempo de 35 produccidn. Si se utiliza un ATF, el uso de un prefiltro se convierte en superfluo.
El flujo puede ser dirigido moviendo el cultivo celular, moviendo el filtro, o ambos. El filtro puede moverse, por ejemplo, por rotacidn (filtro rotatorio) o vibracidn (filtro vibratorio). Como alternativa, si el flujo se dirige moviendo el cultivo celular solamente, el filtro es estdtico y el cultivo celular puede moverse, por ejemplo por medio de bombas o 40 presion.
Con "flujo tangencial alterno" se refiere a que existe un flujo en la misma direccion que (es decir, tangencial a) la o las superficies del filtro, flujo que va hacia atras y adelante, y que existe otro flujo en una direccidn sustancialmente perpendicular a dicha superficie de filtro. El flujo tangencial alterno se puede lograr de acuerdo con metodos 45 conocidos por el experto en la tecnica (por ejemplo como se describe en el documento US 6.544.424).
Durante el cultivo de las cdlulas, al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo, uno o mas nutrientes y/o medio de cultivo celular se puede suministrar a las cdlulas. En el procedimiento de acuerdo con la invencidn, es ventajoso complementar en parte, o preferiblemente en su totalidad, al menos uno de los nutrientes 50 agotados por medio de una alimentacidn de este nutriente o estos nutrientes al reactor. Por ejemplo, se puede alimentar al reactor medio de cultivo celular completo, lo cual es ventajoso ya que entonces no se necesita preparar por separado una alimentacidn separada. El medio de cultivo celular tambien se puede, por ejemplo, alimentar a las celulas en una forma mas concentrada; esto es ventajoso, ya que volumenes mds pequefios son mds faciles de manejar. Tambidn uno o mds nutrientes pueden ser alimentados al reactor. Por ejemplo, hidratos de carbono, por 55 ejemplo, glucosa o fructosa; aminoacidos, tales como glutamina y/o pdptidos, pueden ser ventajosamente alimentados al reactor.
En una realizacidn preferida de la invencidn, las condiciones del cultivo celular se eligen de tal forma que no este limitada la tasa de crecimiento celular y/o la productividad especifica de las celulas, y mds preferiblemente, de tal
forma que la concentration de al menos uno de los componentes del medio de cultivo celular siga siendo esencialmente constante. Los ejemplos de condiciones de cultivo celular limitanles son limitaciones de nutrientes y la formacidn de metabolitos inhibidores tales como amoniaco, didxido de carbono y lactato. Por ejemplo, las condiciones de cultivo celular tales como la alimentacidn, se pueden elegir de tal forma que la tasa de crecimiento 5 celular no est6 limilada, por ejemplo, mediante el suministro de nutrientes suficientes como para compensar el agotamiento y/o para evitar la produccidn de metabolitos inhibidores tales como lactato o amoniaco. Por ejemplo, las condiciones de aireacidn pueden elegirse de tal forma que la formation de didxido de carbono no limite la tasa de crecimiento celular. El cultivo de la celula en condiciones no limitantes es muy ventajoso desde un punto de vista de las Buenas Pr^cticas de Fabrication (BPF), ya que 1) esto puede dar un entorno de cultivo celular constante que en 10 muchos casos tambien da una calidad del producto constante y buena y, 2) esto puede conducir a una viabilidad celular alta, en algunos casos a una viabilidad celular de mas del 98 %. La viabilidad celular alta reduce la liberacidn de contaminantes celulares relacionados, tales como proteinas de la c6lula huesped, lo que facilita la purificacion del producto. Adem£s, el cultivo de las celulas a una tasa de crecimiento celular ilimitada y/o una productividad especifica ilimitada tiene la ventaja comercial de que es posible producir mas sustancia bioldgica en un tiempo 15 incluso meis corto dado que se alcanzar£ antes una mayor densidad celular en el proceso.
"Productividad especifica" de las celulas es la cantidad de una sustancia biologies dada producida por celula por unidad de tiempo y, por lo general, se expresa en pg.celula'1dia_1.
20 La tasa de adicion de al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular al cultivo celular (la tasa de entrada o tasa de perfusion), influye sobre la viabilidad y la densidad de las celulas. En el proceso de la invention, el componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como nutrientes y/o medio de cultivo celular, pueden ser alimentados, por ejemplo, en un flujo continuo, un flujo semi- continuo, por ejemplo de flujo por etapas o flujo escalonado. Preferiblemente, el componente o componentes del 25 medio de cultivo celular, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular, se anaden en un flujo continuo.
El componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como medio de cultivo celular completo y/o nutrientes, pueden alimentarse al reactor, en principio, en cualquier momento durante el proceso. Preferiblemente, la alimentacion se inicia antes de que los sustratos, tales como glutamina y glucosa, hayan alcanzado niveles tan bajos 30 como para provocar el crecimiento de las celulas a cesar o antes de que los metabolitos inhibitorios, por ejemplo, lactato o amoniaco, alcancen niveles tan altos que cesen el crecimiento. Desde este punto en adelante, el componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como nutrientes y/o medio de cultivo celular completo, se alimentan preferiblemente al reactor a una velocidad tal que se satisface la demanda de sustrato.
35 En una realizacion de la invencidn, se anade medio de cultivo celular a una tasa de alimentacion de acuerdo con la formula (1):
Tasa de alimentacion = SFR x (volumen total de cultivo celular) x (densidad de celulas viables) (1)
40 en la que la tasa de alimentacidn se expresa en litros por dia, en la que la SFR es la tasa de alimentacion especifica, es decir, la tasa a la que el medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, expresada como el volumen del medio anadido por celula viable por unidad de tiempo, y en la que la densidad de celulas viables es el numero de celulas viables por unidad de volumen. El numero de celulas viables puede ser determinado por el experto en la t6cnica, por ejemplo, a trav£s del m6todo de exclusidn con azul de tripano. La tasa de alimentacion especifica se 45 elige preferiblemente entre 0,01 y 0,3 nl/c6lula/dia, mas preferiblemente entre 0,01 y 0,2 nl/c6lula/dia.
Puede ser ventajoso tener en cuenta parametros adicionales cuando se ajusta la velocidad de alimentacidn, por ejemplo, la cantidad de glucosa que se ha de alimentar al cultivo y/o la tasa de absorcion de oxigeno. Por ejemplo, para PER.C6, la tasa de alimentacidn del medio de cultivo celular y/o los nutrientes se elige preferiblemente de tal 50 forma que la concentration de glucosa se mantiene entre 3 y 20 mmol/l, mas preferiblemente entre 5 y 15 mmol/l. Preferiblemente, la concentracion de glucosa es de al menos 3 mmol/l, mas preferiblemente al menos 5 mmol/l y preferiblemente a lo sumo 20 mmol/l, mOs preferiblemente a lo sumo 15 mmol/l.
En una realizacion especial de la invencion, el cultivo celular (que comprende celulas, sustancia biologica y medio de 55 cultivo celular) se retira al menos una vez del reactor y el liquido, por ejemplo, el medio de cultivo celular o una alimentacion de nutrientes se afiade al reactor para compensar la retirada del cultivo celular. La retirada de cultivo celular puede conducir a tiempos de proceso mds largos a altas densidades celulares en combinacion con alias viabilidades celulares lo que da como resultado una mayor productividad. El cultivo celular se puede eliminar de forma continua o por etapas.
En una realizaci6n preferida de la invention, el cultivo celular (que comprende celulas, medio de cultivo celular y sustancia biologica) se retira del reactor tan pronto como se alcance la densidad celular deseada, por ejemplo, una densidad celular de al menos 10.106 celulas viables/ml, preferiblemente de al menos 20.10® celulas viables/ml, mas 5 preferiblemente de al menos 30.10s celulas viables/ml, por ejemplo una densidad celular de a lo sumo 200. 10s celulas viables/ml, y se anade liquido, por ejemplo, medio de cultivo celular o alimentation de nutrientes, al reactor para compensar la retirada de cultivo celular. Preferiblemente, el cultivo celular se retira a tal velocidad que la densidad celular se mantiene en el intervalo de densidades celulares deseado. Esta realization de la invention es muy ventajosa en comparacion con un proceso por lotes o por lotes alimentado conventional, ya que combina las 10 ventajas del proceso de la invention con alta viabilidad que se puede mantener mas tiempo, haciendo posible realizar una aim mayor productividad volumetrica global. Con "productividad volumetrica" se refiere a la cantidad de sustancia biologica producida por unidad de volumen de reactor por unidad de tiempo y habitualmente se expresa en g.M.dia'1. En comparacion con un proceso de perfusion conventional, esta realization de la invention tambien es muy ventajosa, ya que combina las ventajas del proceso de la invencibn con una corriente de elimination de cultivo 15 celular que tiene una alta concentracibn de sustancia biologica. La alta concentration de sustancia biologica en la corriente de elimination de cultivo celular hace que sea comercialmente interesante para recolectar la sustancia biologica de la misma. En un proceso de perfusibn convencional. en el que se elimina cultivo celular, la corriente de elimination de cultivo celular no contiene suficiente sustancia biolbgica como para hacerla comercialmente interesante para recolectar la sustancia biologica, y la corriente de separacibn de cultivo celular se considera, por lo 20 tanto, habitualmente como un desecho. Por lo tanto, en esta realization de la invencibn, en teoria toda sustancia biologica producida se puede recolectar de una manera directa, econbmicamente viable y sencilla.
En una realizacibn particularmente preferida de la invencibn, las condiciones de cultivo celular se eligen de tal forma que la tasa de crecimiento celular y/o la productividad especifica de las cblulas no se limita y, mas preferiblemente, 25 de tal forma que tambibn la concentracibn de al menos uno de los componentes del medio del cultivo celular, tal como glucosa o glutamina, permanezca constante y el cultivo celular se elimina al menos una vez del reactor tan pronto como se alcanza la densidad celular deseada, y se afiade liquido, por ejemplo, medio de cultivo celular, al reactor para compensar la elimination de cultivo celular.
30 Preferiblemente, la tasa del flujo de sallda se elige de tal forma que sea sustancialmente igual a la velocidad de adicibn de al menos un componente de medio de cultivo, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular menos la tasa de la elimination de cultivo celular optional.
Las celulas que producen una sustancia biologica son, por ejemplo, cblulas capaces de expresar un gen que codifica 35 la sustancia biologica. Las cblulas capaces de expresar un gen que codifica la sustancia biologica se pueden preparar, por ejemplo, mediante transfection de las celulas con un plasmido que contiene el gen que codifica la sustancia biologica y un gen que codifica un marcador de seleccion adecuado, por ejemplo un gen que codifica una resistencia a la neomicina (gen marcador Neo). Las cblulas transfectadas de manera estable pueden entonces seleccionarse por la presion de seleccibn, por ejemplo - en el caso de un gen marcador Neo - mediante el cultivo de 40 las celulas transfectadas en presencia de G418 (genericina) y el cribado inmediato de las cblulas en cuanto a cblulas que exhiban una expresibn de alto nivel de la sustancia biologica. Los metodos para preparar clones de celulas HER inmortalizadas por E1 que expresan una proteina, y metodos para cultivar este tipo de celulas para producir la protelna, se conocen bien por el experto, y pueden encontrarse, por ejemplo, en el documento US 6.855.544.
45 Por lo tanto, las sustancias biologicas que pueden producirse por las cblulas, por ejemplo, mediante la expresion de un gen (recombinante) que codifican las mismas, son, por ejemplo, proteinas (recombinantes), en particular, receptores, enzimas, proteinas de fusibn, proteinas de la sangre tales como proteinas de la cascada de coagulation de la sangre, proteinas multifuncionales, tales como, por ejemplo, eritropoyetina, virus o proteinas bacterianas, por ejemplo, para su uso en vacunas; inmunoglobulinas tales como anticuerpos, por ejemplo, IgG o IgM, y similares; 50 preferiblemente una proteina, mas preferiblemente un anticuerpo se produce por parte de las celulas. Preferiblemente, las sustancias biolbgicas tales como proteinas o vacunas producidas par las celulas, se pueden utilizar como un principio activo en una preparacion farmacbutica. En el contexto de la presente invencibn, el tbrmino "producto" y la expresibn "sustancia biolbgica" son intercambiables.
55 En el marco de la presente invencibn, con preparacibn farmaceutica se refiere a cualquier preparacibn, que puede ser utilizada como un medicamento, en particular, como un medicamento en seres humanos. Un medicamento de este tipo, por ejemplo, puede ser utilizado para el diagnbstico, o para el propbsito profilactico, tal como, por ejemplo, una vacuna, y/o para fines terapeuticos, tal como, por ejemplo, una enzima o proteina para la cual un paciente es deficiente, o un anticuerpo para matar celulas indeseadas. Una preparacibn farmaceutica puede contener ademas
un vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable, cuyos ejemplos se conocen bien por el experto en la tecnica.
La linea celular PER.C6 se puede utilizar para la produccibn de sustanclas biolbgicas, tales como adenovirus con delecibn de E1 (vbase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.994.128; Nichols et al, 2002, Propagation of 5 adenoviral vectors: use of PER.C6 cells. En: Curiel D, Douglas JT, editores. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier, pag. 129-167), otros virus (vease, por ejemplo, el documento WO 01/38362), o proteinas recombinantes (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.855.544; Yallop et al, 2005, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volumenes, 779-807, Jbrg Knablein (Editor)).
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Los ejemplos de proteinas que se pueden utilizar como un principio activo en preparaciones farmaceuticas (con el nombre de la marca entre parentesis) incluyen tenecteplasa (TN Kase™), factor antihemofllico (recombinante) (ReFacto™), interferon linfoblastoide a-n1 (Wellferon™), factor de coagulacibn (recombinante) (NovoSeven™), etanercept, (Enbrel™), trastuzumab (Herceptin™), infliximab (Remicade™), palivizumab (Synagis™), basiliximab 15 (Simulect™), daclizumab (Zenapaz™), rituximab (Rituxan™), factor de coagulacibn (recombinante) IX (Benefix™) e interferon p-1a (Avonex™).
Los ejemplos de vacunas que se pueden utilizar como un principio activo en la preparacibn farmaceutica incluyen antigenos de proteinas aislados, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vacuna contra el rotavirus viva, oral y 20 tetravalente (RotaShield™), vacuna contra la rabia (RanAvert™), vacunas contra la gripe, y vacuna contra la hepatitis A inactivada (VAQTA™).
El pH, la temperatura, la concentracibn de oxigeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo celular son, en principio, no criticos y dependen del tipo de celula elegida. Preferiblemente el pH, la temperatura, la concentracibn 25 de oxigeno disuelto y la osmolaridad se eligen de tal forma que sean bptimos para el crecimiento y la productividad de las celulas. El experto en la tecnica sabe cbmo encontrar el pH, la temperatura, la concentracibn de oxigeno disuelto y la osmolaridad bptimos para el cultivo (vease, por ejemplo, el documento WO 2004/099396). Preferiblemente, para el proceso de la invencion cuando se utilizan celulas HER inmortalizadas por E1, el pH se elige entre 6,6 y 7,6, y/o la temperatura se elige entre 30 y 39 °C, y/o la osmolaridad se elige entre 260 y 30 400 mOsm/kg. Para mantener condiciones del proceso bptimas se desea la automatizacion para controlar las condiciones del proceso. Con el fin de optimizar las condiciones del proceso, por ejemplo, para obtener la detencion del crecimiento para una productividad celular aumentada, durante el cultivo se puede aplicar un cambio en las condiciones de cultivo. Esto se puede establecer, por ejemplo, mediante un cambio de temperatura (tal como, de 37 a 32 °C), un cambio del pH o un cambio de la osmolaridad.
35
El proceso de la presente invencion puede realizarse, en principio, en cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de celulas. Las directrices para la eleccibn de un medio de cultivo celular y condiciones del cultivo celular se conocen bien y se proporcionan, por ejemplo, en los Capitulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4" edicion 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. 40 Cell &Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, como un componente del medio de cultivo celular, una fuente de hidratos de carbono, sales y/o aminoacidos y/o vitaminas y/o lipidos y/o detergentes y/o tampones y/o factores de crecimiento y/u hormonas y/o citocinas y/u oligoelementos. Los ejemplos de fuentes de 45 hidratos de carbono incluyen glucosa, fructosa, galadosa y piruvato. Los ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo, MgCh.6H20, MgSO< y MgSCLi.7H20, sales de hierro, por ejemplo, FeS04.7H20, sales potasicas, por ejemplo, KH2PO4, KCI; sales sodicas, por ejemplo NaH^PCU, Na2HP04, y sales cblcicas, por ejemplo, CaCl2.2H20. Los ejemplos de aminoacidos incluyen todos los aminoicidos proteinogenicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina.CI, 50 mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Los ejemplos de lipidos incluyen: acidos grasos, por ejemplo, bcido linoleico y acido oleico; los ejemplos de detergentes incluyen Tween® 80 y Pluronic® F68. Los ejemplos de tampones incluyen HEPES y Na2C03. Los ejemplos de factores de crecimiento/hormonas/citocinas incluyen IGF (factor de crecimiento de tipo insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Los ejemplos de elementos traza se conocen por el experto en la tecnica e incluyen Zn, Mg y Se. El medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, 55 tambien otros componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, peptona de soja o etanol amina.
Para la produccion de sustancias biolbgicas de acuerdo con la invencibn, en particular, si las sustancias biologicas se van a utilizar como un principio activo en preparaciones farmaceuticas, se prefiere medio libre de suero para medics que contienen una fuente de suero. La razon de esto es que los medios de fuente de suero pueden estar
contaminados con virus, presentan el riesgo de infecciones pridnicas, y pueden crear un obstciculo importante en el procesamiento aguas abajo del producto biofarmacdutico (es declr, la purification adicional de la sustancia bloldgica del cultivo celular). Por lo tanto, el proceso de la invention se realiza preferiblemente en un medio de cultivo celular que no comprende suero de una fuente animal, incluyendo el ser humano. Puesto que los compuestos de una fuente 5 de mamifero tambidn presentan un riesgo de infeccidn, preferiblemente el medio de cultivo celular estd libre de una fuente de mamifero (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente de mamifero). Mds preferiblemente, el medio de cultivo celular estd libre de una fuente animal (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente animal, incluyendo el ser humano). Los ejemplos de medio libre de suero que se pueden utilizar para el cultivo de cdlulas PER.C6 incluyen medios disponibles en el 10 mercado tales como, por ejemplo, medio EX Cell™ VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino™ (HyClone), IS ProVec CD (Irvine scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
En realizaciones preferidas, la sustancia biologica producida en el proceso de la presente invencion se recolecta a partir del flujo cuyo contenido se mantiene en o preferiblemente se retroalimenta al reactor, o a partir del cultivo de 15 celulas que se retira del reactor o de ambos. La sustancia o sustancias bioldgicas producidas en el proceso de la presente invencidn se pueden cosechar adicionalmente del cultivo celular en el denominado procesamiento aguas abajo, utilizando metodos que dependen de la sustancia bioldgica, mdtodos que, como tales, se conocen bien por el experto. El procesamiento aguas abajo comprende habitualmente varias etapas de purification en combinaciones y orden variables. Los ejemplos de etapas de purificacidn en el procesamiento de aguas abajo son etapas de 20 separation (por ejemplo, mediante cromatografia de afinidad y/o cromatografia de intercambio ionico y/o extraccion mediante sistemas acuosos bifasicos y/o precipitation mediante, por ejemplo, sulfato de amonio), etapas para la concentration de la sustancia biologica (por ejemplo, mediante ultrafiltracidn o diafiltracidn) etapas para intercambiar tampones y/o etapas para eliminar o inactivar virus (por ejemplo, mediante la filtration de virus, cambio del pH o tratamiento con detergente disolvente).
25
En un aspecto, la invencion se refiere a un cultivo celular que comprende cdlulas de mamifero, preferiblemente celulas HER inmortalizadas por E1, mas preferiblemente celulas PER.C6, con una densidad de celulas viables de al menos 50.10s cdlulas/ml, preferiblemente al menos 60.10s cdlulas/ml, en particular al menos 90.106 cdlulas/ml y una concentracion de sustancia biologica de al menos 5 g/l, mds preferiblemente al menos 10 g/l, en particular al menos 30 11 g/l. En principio, la concentracidn de la sustancia biologica puede ser tan alta como lo permita la solubilidad de la sustancia biologica. La concentracidn de cdlulas viables es tipicamente no mayor de 200.10® cdlulas/ml, y preferiblemente dentro del intervalo de 80-150.10® cdlulas/ml.
La densidad de cdlulas viables se puede determinar, por ejemplo, usando el mdtodo de exclusion con azul de 35 tripano, por ejemplo, mediante el uso de un contador de cdlulas tal como estd comercialmente disponible, por ejemplo, en Innovatis (contador de cdlulas Cedex).
Con cultivo celular se refiere al liquido que comprende medio de cultivo celular. celulas y sustancia biologica, cuyo liquido es el resultado de un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en un medio de cultivo celular, en el que 40 las cdlulas producen la sustancia biologica.
La invencion se explicard ahora por medio de los siguientes ejemplos. sin embargo sin estar limitada a los mismos.
Descriocidn de las fiauras 45
La figura 1/9 muestra la densidad de cdlulas viables Y (10®.ml'1) representada grdficamente frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
La figura 2/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dlas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes 50 alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
La figura 3/9 muestra la densidad de celulas viables Y (10®.ml-1) representada grdficamente frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencidn).
La figura 4/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes 55 alimentado) y C2 (proceso de la invencion).
La figura 5/9 muestra la densidad de cdlulas viables Y (10®.ml'1) representada graficamente frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C3 (proceso de la invencidn).
La figura 6/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacidn con la concentracion de IgG en el proceso A3) frente al tiempo del proceso X (dias) para los procesos A y C3.
La figura 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparacidn con el rendimiento en el proceso A, por L de volumen de reactor) representado graficamente frente el tiempo del proceso X (dias) para los procesos A, B y C3.
La figura 8/9 muestra el numero de celulas Y (106.mM) representado graficamente frente el tiempo del 5 proceso X (dias) para C4 (proceso de la invencidn).
La figura 9/9 muestra la concentracidn de IgG en el reactor Z (% en comparaci6n con la concentracidn maxima de IgG alcanzada frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso C4 (una realizacidn del proceso de la invencidn)
10 Eiemplos
Eiemplo 1: Comparacidn entre un proceso por lotes. un proceso por lotes alimentado v el proceso de acuerdo con la invencidn
15 En este ejemplo, el rendimiento del proceso de acuerdo con la presente invencidn se comparo con los procesos por lotes y por lotes alimentado.
La figura 1/9 muestra la densidad de celulas viables Y (10s.ml'1) representada graficamente frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencidn).
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La figura 2/9 muestra la concentracidn de IgG en el reactor Z (% en comparacidn con la concentracidn de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencidn).
25 Todas las fermentaciones se realizaron ulilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacidn del aire del 50 % y a 200 rpm. Se utilizd en todos los experimentos la misma linea cdlulas PER.C6 productora de IgG (vdase el documento WO 2004/099396).
Proceso por lotes A 30
El proceso por lotes se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razdn de 3 x 10e5 cdlulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivaron durante 17 dias.
35 Proceso por lotes alimentado B
El proceso por lotes alimentado se ejecutd a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las cdlulas se inocularon a razon de 3 x 10e5 celulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se anadieron glucosa y glutamina para mantener la concentracidn por encima de, 40 respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminodcidos y pdptidos se afiadieron a partir del dia 5 para reponer los aminodcidos consumidos.
Proceso de la invencidn C1
45 El proceso de la invencidn se realizd en un recipiente Applikon de 2 I. Se utilizd una membrana de fibra hueca con un corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa obtenida de General Electric (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las cdlulas y el producto de IgG. El cultivo se inicid con 3 x 10e5 cdlulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM se perfundid a traves del cultivo celular en suspensidn utilizando una tasa de 50 flujo especifica (SFR) de entre 0,05 y 0,2 nl/celula/dia. La concentracidn de producto mds elevada obtenida fue de 1,4 g/l.
El proceso de la invencidn dio como resultado un aumento de las densidades de cdlulas viables y un aumento de las concentraciones de productos en comparacidn con los modos de cultivo mencionados en menos tiempo, como 55 puede verse en la figura 1 y la figura 2 a continuacidn.
Eiemplo 2: Comparacidn entre un proceso por lotes un proceso por lotes alimentado v el proceso de acuerdo con la invencidn
En este ejemplo, el proceso de acuerdo con la presente invencibn se compara de nuevo con los procesos por lotes y por lotes alimentado; en el proceso C2 se controla la presibn de CO2 y se utilizb un sistema de separacibn de 50 kDa.
5 La figura 3/9 muestra la densidad de cblulas viables Y (106.mb1) representada graficamente frente al tiempo de proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencibn).
La figura 4/9 muestra la concenlracibn de IgG en el reactor Z (% en comparacibn con la concenlracibn de IgG en el proceso A) frente al tiempo de proceso X (dlas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso 10 de la invencibn).
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sariorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturation del aire del 50% y a 200 rpm. Se utilize en todos los experiments la misma llnea celulas PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (vease el 15 documento WO 2004/099396).
Proceso oor lotes A
El proceso por lotes se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se 20 inocularon a razbn de 3 x 10s cblulas.mb1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivaron durante 17 dias.
Proceso por lotes alimentado B
25 El proceso por lotes alimentado se ejecutb a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razbn de 3 x 10s celulas.mb1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se afiadieron glucosa y glutamina para mantener la concentration por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminobcidos y peptidos se afiadieron a partir del dia 5 para reponer los aminoacidos consumidos.
30
Proceso de la invencion C2
El proceso de la invencion se realizb en un recipiente Applikon de 2 I. Se utilizb una membrana de fibra hueca con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kDa (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine
35 Technology) para retener las celulas y el product de IgG. El cultivo se inicib con 3 x 10e5 c6lulas/ml en medio
VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L- glutamina 6 mM se perfunde a travbs del cultivo celular en suspension utilizando una SFR de entre 0,05 y
0,2 nl.celula ’.dia-1. La presibn de CO2 se controlb por debajo del 15 %.
40 Resultado
Como puede verse en la figura 3/9 y en la figura 4/9, el proceso de acuerdo con la invencion da como resultado densidades de cblulas viables significativamente aumentadas y concentraciones de product aumentadas (2415 % x rendimiento por lotes; 690 % x rendimiento por lotes alimentado) en tiempo igual 0 inferior (tiempo por lotes al 45 100 %; tiempo por lotes alimentado al 81 %).
El aumento de la productividad global en g.b'.dla1 del proceso de la invencion es 23,9 veces la productividad por lotes en g.b'.dia1 y 8,5 veces la productividad por lotes alimentada en g.|-1.dla'1. En el proceso de la invencion C2, se produjeron 11,1 g de producto/l. La obstruccibn del dispositivo de retencion no se produjo durante 17 dias, incluso 50 con muy alta densidad celular.
Eiemplo 3: Comoaracion entre un proceso por lotes, un proceso oor lotes alimentado v el proceso de acuerdo con la invencion
55 En este ejemplo, el rendimiento del proceso de acuerdo con la presente invencion con eliminacion del cultivo celular se compara de nuevo con los procesos por lotes y por lotes alimentado; en el proceso C3 se ha eliminado el cultivo celular.
La figura 5/9 muestra la densidad de celulas viables Y (10s.mb1) representada graficamente frente al tiempo de
proceso X (dias) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C3 (proceso de la invencion).
La figura 6/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracidn de IgG en el proceso A3) frente al tiempo de proceso X (dias) para los procesos A y C3.
5
La figura 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparacidn con el rendimiento en el proceso A, por L de volumen de reactor) representado graficamente frente al tiempo de proceso X (dias) para los procesos A, B y C3.
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 10 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacidn del aire del 50% y a 200 rpm, Se utilizo en todos los experimentos la misma linea celulas PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (vdase el documento WO 2004/099396).
Proceso por lotes A 15
El proceso por lotes se ejecutd a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razdn de 3 x 105 celulas.ml'1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivaron durante 17 dias.
20 Proceso oor lotes alimentado B
El proceso por lotes alimentado se ejecutd a un volumen de trabajo de 4 I en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razdn de 3 x 10s celulas.ml"1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se afiadieron glucosa y glutamina para mantener la concentracion por encima de, 25 respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoacidos y peptidos se afiadieron a partir del dia 5 para reponer los aminoacidos consumidos.
Proceso de la invencidn C3
30 El proceso de la invencidn se realizd en un recipiente Applikon de 2 I. Se utilizd una membrana de fibra hueca con un code de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las cdlulas y el producto de IgG. El cultivo se inicio con 3 x 10e5 cdlulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L- glutamina 6 mM se perfunde a traves del cultivo celular en suspension utilizando una SFR de entre 0,05 y 35 0,2 nl.celula'Ldia'1. El cultivo celular se retira al 10 % del volumen de trabajo por dia por encima de 10.106 celulas.ml' 1 y al 30 % del volumen de trabajo por dia cuando la densidad de celulas viables excede de 30.10s celulas.ml'1 y en adelante.
Resultado
40
Como puede verse en la figura 5/9, con el proceso de la Invencion se alcanzan rapidamente densidades de celulas viables superiores. Ademas, la figura 5/9 tambien muestra que la viabilidad de las celulas se puede mantener durante mas tiempo con el proceso de la invencidn, dado que el proceso C3 se mantuvo en funcionamiento a lo largo de un periodo de casi 40 dias, porque no se produjo obstruccidn del dispositivo de retencion, incluso con altas 45 densidades de cdlulas.
La figura 6/9 muestra que las concentraciones de producto para el procedimiento de la presente invencion son mucho mas altas que la concentracidn del producto en el proceso por lotes. El flujo de producto que contenia el producto se recogio del proceso C3 en aproximadamente de un 200 % a 250 % veces la concentracion final en el 50 proceso por lotes A.
La figura 7/9 muestra que la mayoria del producto se forma por el proceso de la presente invencion y que el proceso de la invencion se puede mantener mas tiempo que el proceso por lotes A o por lotes alimentado B. El dia 17, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 8,1 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes (A3) y 2,1 55 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes alimentado (B). Ademas, el dia 17, finalizo el proceso por lotes. El dia 21, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 3,0 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes alimentado B. El dia 21, finalizo el proceso por lotes alimentado. Despues de 39 dias, el rendimiento acumulativo global del proceso C3 es 25 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes A y 6 veces el rendimiento del proceso por lotes alimentado B.
Se puede concluir a partir de este experimented que el rendimiento global de un material biologico deseado en el proceso de acuerdo con la presente invencibn puede mejorarse adicionalmente mediante la aplicacibn de una sangria del cultivo celular cuando la densidad celular excede un cierta nivel alto.
Eiemplo 4: Cultivo de v production con celulas CHO.
En este ejemplo el proceso de acuerdo con la presente invencibn se ha realizado con una linea celular CHO productora de IgG e incluye una caida de temperatura para disminuir el crecimiento celular.
10
La figura 8/9 muestra el numero de cblulas V (10s.ml-1) representado grbficamente frente el tiempo de proceso X (dlas) para C4 (proceso de la invencion).
La figura 9/9 muestra la concentracibn de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracibn maxima de 15 IgG alcanzada frente al tiempo de proceso X (dias) para ei proceso C4 (una realization del proceso de la invencion).
La fermentation se realizb utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,1 y 6,9 y la DO a una saturacion del aire del 40 % y a 100 rpm. La temperatura se hizo descender a 32 °C el dia 5.
20
Proceso de la invencion C4
El proceso de la invencion se realizd en un recipiente Applikon de 2 I. El dispositivo de retencion de celulas y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kD 25 operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology). El cultivo se inicid con 5.10s celulas.ml'1 en medio de cultivo MTCM-49 (Hyclone). El medio se perfundio a traves del cultivo celular en suspension utilizando una SFR entre 0,1 y 0,4 nl.cblula-1.dia'1. La presidn de CO2 se controlo por debajo del 15 %.
Resultado
30
Los datos muestran que el proceso de la invencion tambien funciona cuando se utiliza una linea celular CHO productora de proteinas. La densidad celular lograda y las concentraciones de los productos estbn aumentadas en comparacion con el cultivo por lotes. Los datos tambien demuestran que en el proceso de acuerdo con la presente invencidn se puede detener el crecimiento celular (por ejemplo, mediante una caida de la temperatura), mientras que 35 continua la acumulacion de producto en el sistema de cultivo.
Eiemplo 5: Proceso de la invencion realizado con una linea celular de mieloma.
El proceso de acuerdo con la presente invencibn tambibn puede aplicarse a lineas celulares de mieloma. Para este 40 fin, la fermentacion se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacibn del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las cblulas comienza con la inoculacibn de las cblulas de mieloma a razon de 3 x 10e5 cblulas/ml en medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) en un recipiente Sartorius de 5 I. El dispositivo de retencion de cblulas y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema 45 ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) se perfunde a travbs del cultivo celular en suspension utilizando una SFR entre 0,1 y 0,4 nl.cblula'Ldia'1. La presibn de CO2 se controlo por debajo del 15 %.
Eiemplo 6: Proceso de la invencibn realizado con una linea celular MDCK.
50 El procedimiento de acuerdo con la presente invencibn tambibn puede aplicarse a lineas celulares MDCK. Para este fin, la fermentacion se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacibn del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las cblulas comienza con la inoculacibn de las celulas MCDK transformadas a razon de 3 x 10e5 cblulas/ml en medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) en un recipiente Sartorius de 5 I. El dispositivo de retencion de cblulas y producto es una membrana de 55 fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) se perfunde a travbs del cultivo celular en suspensibn usando una SPR de entre 0,1 y 0,4 nl.celula'Ldia'1. La presibn de CO2 se controlo por debajo del 15 %.
Claims (8)
1. Cultivo celular que comprende una suspension de celulas de mamifero que producen una sustancia biolbgica deseada que tiene una densidad de celulas viables de al menos 50 x 106 celulas/ml y una concentracibn de
5 la sustancia biolbgica de al menos 5 g/l, que puede obtenerse por un proceso para el cultivo de las celulas en un reactor en suspensibn en un medio de cultivo celular, en el que las cblulas producen la sustancia biologica deseada,
en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, y
en el que el cultivo celular que comprende las cblulas, la sustancia biologica deseada y el medio de cultivo celular se
10 hace circular a traves de un filtro usando un flujo tangencial, y
en el que el filtro tiene un tamano de poro caracterizado por un corte de peso molecular menor que el peso
molecular de la sustancia biolbgica deseada para separar la sustancia biolbgica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biolbgica deseada,
en el que el flujo de salida de liquido del filtro contiene esencialmente sblo componentes que tienen un peso 15 molecular menor que el de la sustancia biolbgica deseada, y en el que la sustancia biolbgica deseada se retiene en o se retroalimenta al reactor.
2. Cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la sustancia biolbgica deseada estb codificada por al menos un gen transfectado en las cblulas.
20
3. Cultivo celular de acuerdo con la reivindicacibn 1 o 2, en el que la concentracibn de la sustancia biolbgica deseada es de al menos 10 g/l.
4. Cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que la concentracibn 25 de la sustancia biolbgica deseada es de al menos 11 g/l.
5. Cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que la sustancia biolbgica deseada es una IgG.
30 6. Cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que las cblulas de
mamifero son celulas HER inmortalizadas por E1.
7. Cultivo celular de acuerdo con la reivindicacibn 6, en el que las cblulas de mamifero son cblulas PER.C6.
35
8. Cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 cblulas viables estb dentro del intervalo de 50 x 10s celulas/ml a 200 x 10e cblulas/ml.
9. Cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 40 cblulas viables esta dentro del intervalo de 80 x 106 cblulas/ml a 200 x 106 cblulas/ml.
- 7, en el que la densidad de
- 8, en el que la densidad de
fifl.i/9
x
Fig .2/9
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Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL1720972T3 (pl) | 2004-03-05 | 2014-06-30 | Dpx Holdings Bv | Proces hodowli komórek poprzez ciągłą perfuzję i zmienny przepływ styczny |
US8585594B2 (en) * | 2006-05-24 | 2013-11-19 | Phoenix Biomedical, Inc. | Methods of assessing inner surfaces of body lumens or organs |
EP2041259B1 (en) | 2006-07-14 | 2015-10-14 | DPx Holdings B.V. | Improved process for the culturing of cells |
US9109193B2 (en) * | 2007-07-30 | 2015-08-18 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Continuous perfusion bioreactor system |
US8623650B2 (en) | 2007-10-19 | 2014-01-07 | Viacyte, Inc. | Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum |
US9238792B2 (en) * | 2009-09-15 | 2016-01-19 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compartmentalized simultaneous saccharification and fermentation of biomass |
CN102791852B (zh) | 2009-10-15 | 2014-05-07 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 纯化腺病毒颗粒的方法 |
MX2012004221A (es) | 2009-10-15 | 2012-06-08 | Crucell Holland Bv | Proceso para purificacion de adenovirus de cultivos de alta densidad celular. |
WO2012030512A1 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Percivia Llc. | Flow-through protein purification process |
ES2556454T3 (es) * | 2010-10-05 | 2016-01-18 | Novo Nordisk Health Care Ag | Proceso para producción de proteínas |
WO2012107436A1 (en) | 2011-02-10 | 2012-08-16 | Crucell Holland B.V. | Pneumatic alternating pressure membrane cell separation system |
DK2702164T3 (en) * | 2011-04-29 | 2016-02-01 | Biocon Res Ltd | METHOD FOR REDUCING heterogeneity OF ANTIBODIES AND METHOD OF PRODUCING THESE ANTIBODIES |
EP3626737B1 (en) | 2011-05-13 | 2023-11-29 | Octapharma AG | A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant fviii |
WO2013006479A2 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Amgen Inc. | Mammalian cell culture |
TWI637057B (zh) | 2012-11-09 | 2018-10-01 | 拜爾沙納有限公司 | 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程 |
CN104968424B (zh) | 2012-11-29 | 2018-03-27 | Emd密理博公司 | 具有带有罩的磁性叶轮组件的容器 |
EP2970843B1 (en) * | 2013-03-15 | 2021-09-01 | Genzyme Corporation | High-density cell banking methods |
US10316282B2 (en) | 2013-03-19 | 2019-06-11 | Cmc Biologics A/S | Method for producing a product (e.g. polypeptide) in a continuous cell culture fermentation process |
CN113444620B (zh) * | 2013-09-16 | 2024-03-29 | 建新公司 | 用于处理细胞培养物的方法和*** |
SG10201808061WA (en) * | 2013-09-30 | 2018-10-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Method for the clarification of high density crude cell culture harvest |
JP6695814B2 (ja) | 2014-06-04 | 2020-05-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | 哺乳類細胞培養物を回収するための方法 |
CN106414719B (zh) * | 2014-06-13 | 2020-02-14 | 杰特有限公司 | 生物反应器中重组von Willebrand因子的改进生产 |
JP6385559B2 (ja) | 2014-07-24 | 2018-09-05 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | 細胞培養体からのポリオウイルスの精製プロセス |
JP6530171B2 (ja) * | 2014-09-09 | 2019-06-12 | 旭化成メディカル株式会社 | 培養産生物の回収方法 |
WO2017147536A1 (en) | 2016-02-24 | 2017-08-31 | The Rockefeller University | Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof |
AU2017249402A1 (en) * | 2016-04-12 | 2018-10-04 | Artemis Biosystems, Inc. | Perfusion filtration systems |
CN110268043A (zh) * | 2017-03-03 | 2019-09-20 | 富士胶片株式会社 | 细胞培养装置及细胞培养方法 |
WO2019071076A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Lonza Ltd. | AUTOMATED CONTROL OF CELL CULTURE BY SPECTROSCOPY RAMAN |
CN111212899B (zh) | 2017-10-16 | 2024-07-02 | 里珍纳龙药品有限公司 | 灌注生物反应器及相关使用方法 |
EP3700505A4 (en) | 2017-10-26 | 2021-01-06 | Repligen Corporation | MICRO-ALTERNATIVE TANGENTIAL FLOW INFUSION FILTER, PROCESSING CONTAINER, AND METHODS OF USE THEREOF |
EA202091422A1 (ru) * | 2017-12-11 | 2020-08-28 | Эмджен Инк. | Способ непрерывного производства продуктов на основе биспецифических антител |
JP7432511B2 (ja) * | 2018-03-08 | 2024-02-16 | レプリゲン・コーポレイション | 接線流深層濾過システムおよびそれを使用する濾過方法 |
CN111868249B (zh) * | 2018-03-19 | 2024-06-18 | 富士胶片株式会社 | 生产物的制造方法 |
CN109157690A (zh) * | 2018-06-15 | 2019-01-08 | 翁炳焕 | 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备 |
EP3647405A1 (en) * | 2018-11-02 | 2020-05-06 | Microfluidx | Cell culture device and method of using the same |
CA3118398A1 (en) * | 2018-11-02 | 2020-05-07 | WuXi Biologics Ireland Limited | Cell culture process by intensified perfusion with continuous harvest and without cell bleeding |
EP3976753A4 (en) | 2019-05-28 | 2023-07-19 | Wuxi Biologics Ireland Limited | INTEGRATED RAMAN SPECTROSCOPY PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM FOR AUTOMATICALLY MONITORING AND CONTROL OF PERFUSION CELL CULTURE |
CN115667491A (zh) | 2020-03-10 | 2023-01-31 | 赛阿瑞斯公司 | 用于细胞处理的***、装置及方法 |
WO2024072444A1 (en) * | 2022-09-26 | 2024-04-04 | Upside Foods, Inc. | Harvesting cell-based meat |
US11898127B1 (en) | 2022-09-26 | 2024-02-13 | Upside Foods, Inc. | Harvesting cell-based meat |
Family Cites Families (71)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4477342A (en) | 1982-08-31 | 1984-10-16 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for controlling ultrafiltration during hemodialysis |
EP0205404B1 (en) * | 1985-06-11 | 1992-07-15 | Ciba-Geigy Ag | Hybrid interferons |
US5286646A (en) * | 1985-11-25 | 1994-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for mammalian cell culture |
IL82746A (en) * | 1986-06-06 | 1994-10-07 | Genentech Inc | A process for producing a biologically active tissue plasminogen activator |
JPH0642905B2 (ja) | 1986-06-13 | 1994-06-08 | 東レ株式会社 | 血液透析膜 |
GB8617646D0 (en) | 1986-07-18 | 1986-08-28 | Manchester Inst Science Tech | Recovery of biological material |
US6022742A (en) * | 1986-11-26 | 2000-02-08 | Kopf; Henry B. | Culture device and method |
US4806484A (en) | 1987-08-07 | 1989-02-21 | Igb Products, Ltd. | Perfusion airlift bioreactor |
JPH0797982B2 (ja) * | 1987-09-24 | 1995-10-25 | 東洋紡績株式会社 | 細胞培養装置 |
US4921792A (en) | 1987-11-27 | 1990-05-01 | Miles Inc. | Continuous cell dispersion, cultivation and substance recovery process |
JPH01243985A (ja) | 1988-03-25 | 1989-09-28 | P C C Technol:Kk | 植物器官の培養法及びその培養槽 |
US5595909A (en) * | 1988-05-23 | 1997-01-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Filter device |
JPH02119772A (ja) * | 1988-10-29 | 1990-05-07 | Shimadzu Corp | 細胞培養装置 |
JP2625990B2 (ja) * | 1988-11-19 | 1997-07-02 | 株式会社島津製作所 | 細胞培養装置 |
US5019512A (en) * | 1989-03-17 | 1991-05-28 | Baxter International Inc. | Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system |
JP2690144B2 (ja) * | 1989-04-24 | 1997-12-10 | 哲哉 峠 | 膜型細胞培養装置 |
JPH0793874B2 (ja) * | 1989-04-27 | 1995-10-11 | 日本碍子株式会社 | バイオリアクタ |
US5256294A (en) | 1990-09-17 | 1993-10-26 | Genentech, Inc. | Tangential flow filtration process and apparatus |
JP2948675B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1999-09-13 | 日本碍子株式会社 | 発酵液中の有価物を回収するクロスフロー濾過方法 |
JPH0531332A (ja) * | 1991-07-30 | 1993-02-09 | Toto Ltd | 微生物の膜分離方法 |
GB9118664D0 (en) | 1991-08-30 | 1991-10-16 | Celltech Ltd | Cell culture |
JPH07123972A (ja) * | 1993-11-01 | 1995-05-16 | Fumio Yamauchi | 膜型バイオリアクター |
JPH07298871A (ja) * | 1994-05-06 | 1995-11-14 | Fumio Yamauchi | 膜型バイオリアクター |
US6204000B1 (en) | 1995-04-28 | 2001-03-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1 |
SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
US5994728A (en) * | 1995-11-15 | 1999-11-30 | Matsushita Electronics Corporation | Field effect transistor and method for producing the same |
JPH1015357A (ja) * | 1996-07-01 | 1998-01-20 | Nitto Denko Corp | 排水の処理方法 |
JPH1033671A (ja) * | 1996-07-24 | 1998-02-10 | Jms Co Ltd | 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム |
JP3346996B2 (ja) | 1996-09-18 | 2002-11-18 | 金剛株式会社 | 免震自立棚 |
JPH10108673A (ja) * | 1996-10-04 | 1998-04-28 | Asahi Medical Co Ltd | 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法 |
JPH10108666A (ja) * | 1996-10-04 | 1998-04-28 | Asahi Medical Co Ltd | 中空糸型培養器 |
US6001585A (en) | 1997-11-14 | 1999-12-14 | Cellex Biosciences, Inc. | Micro hollow fiber bioreactor |
US8026096B1 (en) | 1998-10-08 | 2011-09-27 | Protein Sciences Corporation | In vivo active erythropoietin produced in insect cells |
CA2359256C (en) | 1999-01-26 | 2009-04-14 | Schering-Plough Ltd. | Propagation of bovine coronavirus in chinese hamster ovary cells |
US6855544B1 (en) * | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
SI1533380T1 (sl) | 1999-04-15 | 2010-03-31 | Crucell Holland Bv | Proizvajanje rekombinantnega proteina v človeški celici ki obsega vsaj en protein E adenovirusa |
JP2001149099A (ja) | 1999-11-26 | 2001-06-05 | Olympus Optical Co Ltd | 染色体異常解析のための有核細胞の標本作製方法 |
EP1103610A1 (en) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Introgene B.V. | Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines |
US6544424B1 (en) * | 1999-12-03 | 2003-04-08 | Refined Technology Company | Fluid filtration system |
US6168941B1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-01-02 | Genvec, Inc. | Method of producing adenoviral vector stocks |
JP4138209B2 (ja) | 2000-06-29 | 2008-08-27 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | プラバスタチン含有組成物 |
JP2002113896A (ja) | 2000-10-05 | 2002-04-16 | Seiko Epson Corp | 画像形成装置 |
CA2476614A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-09-19 | V.A.I. Ltd. | Methods and apparatus for biological treatment of waste waters |
JP3547715B2 (ja) * | 2001-03-06 | 2004-07-28 | 榮 新垣 | ベクター精製用装置及び方法 |
US6716354B2 (en) | 2001-03-08 | 2004-04-06 | Cdg Technology, Inc. | Methods of treating water using combinations of chlorine dioxide, chlorine and ammonia |
DE60231074D1 (de) * | 2001-04-17 | 2009-03-19 | Seiren K K | Mediumzusätze und medien für tierzellkulturen |
DE10120838A1 (de) | 2001-04-27 | 2002-10-31 | Basf Ag | Stoffmischung zur UV-Stabilisierung von Kunststoffen und Herstellung davon |
DE10120835C2 (de) | 2001-04-27 | 2003-04-10 | Sifin Inst Fuer Immunpraeparat | Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern |
DE60238863D1 (de) | 2001-08-31 | 2011-02-17 | Bayer Schering Pharma Ag | Vorrichtung und verfahren zur fermentation in hohen zelldichten |
KR100740079B1 (ko) | 2001-09-05 | 2007-07-18 | 야마사 쇼유 가부시키가이샤 | 당뇨병성 신경 장해용 의약 조성물 |
WO2003025158A1 (en) | 2001-09-14 | 2003-03-27 | Medcell Biologics, Inc. | Oxygen enriched bioreactor and method of culturing cells |
GB0123098D0 (en) * | 2001-09-26 | 2001-11-14 | Lonza Biologics Plc | Use of aminoglycoside resistance gene |
ATE298255T1 (de) * | 2001-11-15 | 2005-07-15 | Aesculap Ag & Co Kg | Sterilbehälter |
JP2003219873A (ja) | 2002-01-24 | 2003-08-05 | Japan Science & Technology Corp | サケ科キングサーモン由来の不死化細胞 |
US20030186335A1 (en) | 2002-03-28 | 2003-10-02 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method |
US6902909B2 (en) | 2002-07-09 | 2005-06-07 | Synthecon, Inc. | Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins |
DE10237082B4 (de) * | 2002-08-09 | 2014-12-31 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen |
KR20060015568A (ko) * | 2003-05-01 | 2006-02-17 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 현탁된 동물 세포의 관류 배양에 의한 생물학적 물질의제조방법 |
ATE414144T1 (de) | 2003-05-09 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | Kulturen von e1-immortalisierten zellen und verfahren zu deren kultivierung zur erhöhung der produktausbeuten davon |
CA2532754A1 (en) * | 2003-07-17 | 2005-02-03 | Global Cell Solutions, Llc | Automated cell culture system and process |
JP2005041984A (ja) | 2003-07-22 | 2005-02-17 | Shin Kobe Electric Mach Co Ltd | 水架橋ポリオレフィン製シートの製造法 |
PL1720972T3 (pl) | 2004-03-05 | 2014-06-30 | Dpx Holdings Bv | Proces hodowli komórek poprzez ciągłą perfuzję i zmienny przepływ styczny |
US20080230488A1 (en) * | 2004-03-29 | 2008-09-25 | Pall Corporation | Pleated, Crossflow Fluid Treatment Elements, Methods for Making Them, and Methods for Treating Cellular Solutions |
EP1835022B1 (en) * | 2005-01-05 | 2015-02-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell culture method and utilization of the same |
CN100354408C (zh) * | 2005-10-09 | 2007-12-12 | 南京工业大学 | 一种高密度细胞培养方法及其生物反应装置 |
WO2007070704A2 (en) * | 2005-12-17 | 2007-06-21 | Airinspace B.V. | Air purification devices |
JP5031332B2 (ja) | 2006-03-31 | 2012-09-19 | 旭化成ホームズ株式会社 | 線切断具 |
EP2041259B1 (en) * | 2006-07-14 | 2015-10-14 | DPx Holdings B.V. | Improved process for the culturing of cells |
EP2014760A1 (en) | 2007-06-13 | 2009-01-14 | CMC Biopharmaceuticals A/S | A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process |
JP2008308560A (ja) | 2007-06-13 | 2008-12-25 | Tohcello Co Ltd | 表面防汚性複合フィルムの製造方法 |
JP5426937B2 (ja) * | 2009-06-19 | 2014-02-26 | 興和株式会社 | 光学的反応測定装置および光学的反応測定方法 |
-
2007
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