BRPI0611535A2 - métodos para processar células de microorganismos e células de levedura, composição, suplemento alimentar, produto farmacêutico, cosmético ou produto nutracêutico e ração animal - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA PROCESSAR CéLULAS DE MICROORGANISMOS E CéLULAS DE LEVEDURA, COMPOSIçãO, SUPLEMENTO ALIMENTAR, PRODUTO FARMACêUTICO, COSMéTICO OU PROUTO NUTRACêUTICO E RAçãO ANIMAL. A presente invenção refere-se a métodos para produzir preparações de glucanos e mananas de leveduras. Os métodos empregam um processo de autólise, e em seguida, um tratamento enzímático usando uma protease de pH alto ou uma protease de pH alto e em seguida um tratamento com uma enzima que compreende pelo menos uma entre uma amilase, uma lipase e uma combinação das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARAPROCESSAR CÉLULAS DE MICROORGANISMOS E CÉLULAS DE LEVEDU-RA, COMPOSIÇÃO, SUPLEMENTO ALIMENTAR, PRODUTO FARMACÊUTI-CO, COSMÉTICO OU PRODUTO NUTRACÊUTICO E RAÇÃO ANIMAL".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de pa-tente provisório na US 60/677.973, depositado em 5 de maio de 2005, cujoteor é aqui inteiramente incorporado como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a preparações de β-glucanos emananas e métodos para sua preparação. Particularmente, a invenção refe-re-se a preparações, incluindo p-(1,3/1,6)-glucano e manana, produzidos apartir de microorganismos, incluindo, porém sem limitações, leveduras.

"Glucano" é um termo genérico que refere-se a um oligossacarídeo oupolissacarídeo composto predominantemente ou inteiramente do monossacarídeo D-gicose. Os glucanos estão amplamente distribuídos na natureza, e são particularmen-te importantes quanto ao seu papel em manter a integridade estrutural de células debactérias, leveduras e plantas. Por exemplo, o glucano, em combinação com outrospolissacarídeos, tais como manana e quitina, é responsável pelo formato e pela resis-tência mecânica da parede celular. Os glucanos são responsáveis tipicamente poraproximadamente 40% a 50% do peso da parede celular nessas células.

Na qualidade de polímeros de D-glicose, as unidades de D-glicose podem estar ligadas entre si de uma série de maneiras. Por exemplo,os glucanos com ligações (1,3), (1,4), (1,6) e (1,2) (ligações glicosídicas) sãotodos conhecidos. A variedade de ligações possíveis significa que os gluca-nos são normalmente compostos altamente ramificados. Muitas formas sãopossíveis como resultado desta maneira altamente variável na qual as uni-dades individuais de glicose podem ser unidas, bem como o formato estéricoglobal da molécula originária. Um glucano comum é a glicopiranose ligadaem β-(1,3) acoplada à glicopiranose ligada em β-(1,6). Por exemplo, a pare-de celular de Saccharomyces cerevisiae é composta principalmente de glu-cano ligado em β, que é principalmente uma cadeia principal de unidades deglicose ligadas em β-(1,3), com um componente minoritário de ramificaçãointermolecular e intramolecular por intermédio de ligações β-(1,6).

Por causa das suas propriedades químicas, os glucanos encon-traram uma ampla série de usos nas indústrias químicas, alimentícias e far-macêuticas. Por exemplo, eles podem ser úteis como agentes que conferemviscosidade, emulsificantes, fibras, filmes, substâncias de revestimento, su-portes para cromatografia por afinidade e eletroforese em gel, em meios decultura de células, como leitos filtrantes, e em cimento. Eles são tambémamplamente utilizados como espessantes de alimentos e como uma fonte defibra dietética, e como veículos e agentes de revestimento em produtos far-macêuticos. Os glucanos demonstraram ter atividade imunofarmacológicaem humanos e animais. Por exemplo, uma forte imunoestimulação e prote-ção contra microrganismos patogênicos foram demonstradas no camarão,peixes, aves, suínos, gado bovino, coelhos, camundongos, ratos e humanos.Os β-glucanos de leveduras podem estimular a resposta imune inata (ines-pecífica) de vertebrados e invertebrados por intermédio da interação com oreceptor semelhante a Toll, Dectina-I.Essa ligação estimula a produção deespécies oxigenadas ativas em macrófagos e intensifica sua fagocitose eexterminação de microorganismos. Essas células imunes estimuladas pro-duzem também citocinas que podem circular pelo animal inteiro e interagemcom outras células imunes para intensificar o estado imunológico do animal.

A purificação de β-glucanos a partir de levedura e outros orga-nismos foi investigada exaustivamente, e uma série de métodos é conheci-da. A maioria deles se baseia na insolubilidade de β-(1,3)-glucano em álcalisou em solventes orgânicos. Os principais métodos conhecidos são: (a) ex-tração em alta temperatura com hidróxido de sódio concentrado, e em se-guida, extração em alta temperatura com ácido e precipitação com etanol(vide, por exemplo, Manners, D.J. et al., Biochem. J. 135:19-30 (1973); Ja-mas, S. et al., patentes n22 US 4.810.646, 5.028.703 e 5.250.436). Muitosdestes protocolos requerem uma homogeneização preliminar das células delevedura, e muitos requerem repetição múltipla de cada uma das etapas deextração; (b) extração de preparações de paredes celulares de levedura re-sultantes de autólise ou degradação enzimática de levedura com um a mis-tura de fenol conecntrado:água 1:1 (vide, por exemplo, patente n- US4.138.479, expedida para Truscheit, E. et al.); e (c) extração com solventesorgânicos, tais como isopropanol, etanol, acetona ou metanol, isoladamenteou na presente de álcali (vide, por exemplo, pedido de patente europeu n2515216). O tratamento com ácido reconhecidamente reduz o número de li-gações β-(1,6) no material de glucano, o que resulta em um aumento na vis-cosidade.

A manana é um polímero constituído de unidades de manose.Em leveduras a manana está associada com proteína na superfície externada parede celular da levedura, como um polissacarídeo musgoso, e tambémna membrana celular interna. Ela é responsável genericamente por cerca de20-50% em peso seco da parede celular. A manana está ligada a uma ca-deia peptídica nuclear como um oligômero ou polímero. O complexo contémcerca de 5-50% de proteínas. A manana oligomérica está ligada diretamenteà serina e treonina, enquanto que a manana polimérica está ligada à aspa-ragina por intermédio de N-acetilglicosamina. No complexo mano-proteína,as unidades de manose estão ligadas por ligações a-1,6, a-1,2 e a-1,3.

Os oligossacarídeos de manana (MOS) podem ser liberados dasparedes celulares de leveduras por ação proteolítica. Os MOS liberados po-dem se ligar eficazmente a patógenos bacterianos do trato intestinal e blo-queiam sua capacidade de colonizar o trato intestinal. Por exemplo, E. coli,Salmonella spp. e Vibrio cholera têm proteínas sobre sua superfície (lecti-nas) que se ligam especificamente aos resíduos do açúcar manose do MOS.

Considerando os muitos usos e aplicações de glucanos, há umaclara necessidade nessas técnicas de se obter um método de extração de β-glucanos/mananas, que evita o uso de altas concentrações de álcali ou áci-do e o uso de altas temperaturas, que tem melhor recuperação de glucanose mananas, e que resulta em uma preparação biologicamente útil.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um fluxograma de uma modalidade de um processopara a produção de preparações de β-glucanos/mananas, de acordo com apresente invenção.A figura 2 é um fluxograma de outra modalidade do processopara a produção de preparações de β-glucanos/mananas, de acordo com apresente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método paraprocessar células de leveduras, usando as etapas de efetuar a autólise dascélulas de levedura para liberar paredes celulares da levedura, incubar asparedes celulares da levedura com uma protease exógena, separar as pare-des celulares da levedura em um componente enriquecido em glucanos eum componente enriquecido em mananas, e efetuar a ultrafiltração do com-ponente enriquecido em manana, para formar um filtrado e um material reti-do no filtro.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para proces-sar células de leveduras, usando as etapas de efetuar a autólise das célulasde levedura em uma temperatura de 40°C a 65°C, para liberar paredes celu-lares da levedura, incubar as paredes celulares da levedura com uma prote-ase exógena em um pH de 9 a 10, e incubar as paredes celulares tratadascom protease com uma enzima, tal como uma amilase, lipase, ou uma com-binação delas.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição quecompreende α-mananas, onde pelo menos 85% (p/p) das α-mananas totaistêm um peso molecular de 10.000 Da ou mais. 1

Outras modalidades da invenção incluem rações animais, su-plementos alimentares, produtos farmacêuticos, cosméticos e produtos nu-tracêuticos que compreendem glucanos ou mananas produzidas pelos mé-todos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, a invenção fornece um processo que pro-duz preparações de paredes celulares insolúveis enriquecidas em β(1,3)- eP(1,6)-glucanos e uma fração solúvel enriquecida em mananas. O processode acordo com a presente invenção inclui uma etapa de autólise de uma fon-te de paredes celulares, como por exemplo, uma levedura, tal como levedurados cervejeiros ou levedura dos padeiros, e em seguida, uma etapa de di-gestão enzimática. Em um aspecto, a digestão enzimática é conduzida u-sando uma protease de pH alto. Em outro aspecto, a digestão enzimática éconduzida usando uma combinação de enzimas, tal como uma protease,uma amilase, uma glicoamilase e/ou uma lipase, de pH alto. Em uma moda-lidade, a digestão enzimática é conduzida usando uma protease de alto pH,e em seguida, uma ou mais outras enzimas, tais como uma amilase, umaglicoamilase e/ou uma lipase.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação deparedes celulares, que é enriquecida em β-(1,3)- e β-(1,6)-glucanos, e emoutra modalidade, uma fração solúvel enriquecida em mananas.

Outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes levando emconsideração a descrição detalhada que se segue e os desenhos que a a-companham.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes que quaisquer modalidades da invenção sejam explicadasdetalhadamente, deve-se entender que a invenção não está limitada em suaaplicação aos detalhes dos componentes e ao arranjo dos componentes e-nunciados na descrição que se segue ou ilustrados nos desenhos. A inven-ção tem outras modalidades e é capaz de ser praticada ou ser conduzida devárias maneiras. Além disso, deve-se entender que a fraseologia e a termi-nologia aqui utilizadas são com o propósito descritivo e não devem ser con-sideradas como limitativas. O uso dos termos "incluindo", "compreendendo"ou "tendo" e suas variações, pretende englobar os itens listados depois de-les e seus equivalentes, bem como itens adicionais.

Deve-se entender também que qualquer faixa numérica aqui e-nunciada inclui todos valores desde o valor inferior até o valor superior. Porexemplo, se uma faixa de concentração é enunciada como 1% a 50%, pre-tende-se que os valores, tais como 2% a 40%, 10% a 30%, ou 1% a 3%,etc., estejam expressamente enumerados neste relatório descritivo. Eles sãoapenas exemplos do que é especificamente pretendido, e todas combina-ções de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enu-merados são considerados como sendo expressamente enunciados nestepedido de patente.

A menos que diferentemente indicado, todos números que ex-pressam quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por di-ante, utilizados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser en-tendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de".Conseqüentemente, a menos que diferentemente indicado, os parâmetrosnuméricos enunciados no relatório descritivo e nas reivindicações apensa-das são aproximações que podem variar dependendo das propriedades de-sejadas buscadas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma ten-tativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das rei-vindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado àluz do número de dígitos significantes relatados e aplicando técnicas usuaisde arredondamento.

Não obstante o fato de que as faixas e parâmetros numéricosque enunciam o amplo âmbito da invenção sejam uma aproximação, os va-lores numéricos enunciados nos exemplos específicos estão relatados tãoprecisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contéminerentemente certos erros resultantes necessariamente de um desvio-padrão encontrado nas suas respectivas medições dos testes.

As preparações de β-glucanos/mananas podem ser preparadasa partir de microorganismos, tais como leveduras, usando um simples pro-cesso de autólise, em pH ligeiramente ácido perto de neutro e temperaturaapenas moderadamente elevada. A autólise é seguida de uma digestão en-zimática. Em uma modalidade, a etapa enzimática utiliza uma protease depH alto (por exemplo, Protex 6L, disponível na Genecore International, ou apartir da fermentação de Bacillus lichenformis), tipicamente cerca de 0,05%-1% em peso, em pH alcalino e temperatura elevada.

As espécies de leveduras apropriadas como uma fonte de β-glucanos/mananas incluem, porém sem limitações, cepas de leveduras deSaccharomyces cerevisiae (incluindo cepas da levedura dos padeiros e ce-pas da levedura dos cervejeiros), Kluyveromyces fragilis, e cepas de Candi-da, tais como Candida utilis, e combinações delas. Outras cepas de levedu-ras apropriadas como fontes de β-glucanos/mananas incluem, porém semlimitações, Saccharomyces delbruekii, Saccharomyces rosei, Saccharomy-ces microelliposodis, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces polysporus, Candida albicans,Candida cloacae, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, Hansenula win-gei, Hansenula arni, Hansenula henricii, Hansenula americana, e combina-ções delas. Estas cepas de leveduras podem ser produzidas usando culturaem nutrientes grau alimentício, por fermentação em batelada ou fermentaçãocontínua.

Muitos outras espécies de microorganismos, incluindo, porémsem limitações, bactérias, fungos e plantas, por exemplo, algas unicelulares,que foram relatadas nessas técnicas como uma fonte de β-glucanos e/oumananas, incluem, porém sem limitações, bactérias tais como Alkaligenes,especialmente Alkaligenes faecalis Var. mixogenes (ATCC-21680), Agrobac-terium, Cellulomonas, tal como ATCC 21399, e Cellulomonas flavigena(ATCC 53703), e Pestalotia; fungos, por exemplo, Aureobasidum, tal como acepa de Aureobasidum pullulans IF0446 e a espécie de Aureobasidum K-1(FERM P1289), Agaricus, Lentinus, Pleurotus ostreatus, Macrophomopsis,tal como a cepa KOB55; Gaoderma, Schizophylla, Fachyma hoelen, Pestalo-tia, Coriolus, e combinações deles. Não-microorganismos, tais como plantas,também podem ser úteis na invenção como fontes de β-glucanos e/ou ma-nanas.

Especificamente, o processo de acordo com a presente inven-ção refere-se à geração de preparações de paredes celulares enriquecidasem teor de β-(1,3)- e β-(1,6)-glucanos e teor de mananas, produzidas partirde microorganismos, incluindo, porém sem limitações, leveduras. Em umamodalidade exemplificada, o processo inclui uma primeira etapa de autóliseda levedura, por exemplo, levedura dos cervejeiros (tipicamente uma pastade sólidos a 7% a 18%, particularmente 10% a 17%, e mais particularmente,8% a 12% ou 13% a 16%). A autólise pode ser conduzida adequadamenteem um pH de pelo menos 4, particularmente pelo menos 4,5, e mais particu-larmente, pelo menos 5. A autólise pode ser conduzida adequadamente emum pH menor do que 8, particularmente menor do que 7, e ainda mais parti-cularmente menor do que 6. A temperatura para conduzir a autólise pode seradequadamente pelo menos 30 0C, particularmente pelo menos 35 0C, maisparticularmente pelo menos 40 0C1 e ainda maiç particularmente, pelo menos45 0C. A temperatura para conduzir a autólise pode ser adequadamente me-nor do que 55 0C1 particularmente menor do que 52 0C1 e ainda mais particu-larmente, menor do que 50 0C. A autólise pode ser conduzida adequada-mente por pelo menos 10 horas, particularmente pelo menos 16 horas, emais particularmente, pelo menos 24 horas. A autólise pode ser conduzidaadequadamente por menos de 100 horas, particularmente menos de 48 ho-ras, e mais particularmente, menos de 36 horas. A levedura pode ser entãoseparada, adequadamente por centrifugação, para produzir um extrato, euma corrente de paredes celulares com baixo teor de β-glucano. Uma outraetapa trata a corrente de paredes celulares com uma enzima, incluindo, po-rém sem limitações, uma protease, por exemplo, uma protease alcalina, emum pH de pelo menos 8,5, particularmente pelo menos 9, e mais particular-mente pelo menos 9,2. O pH pode ser também adequadamente menor doque 10,5, particularmente menor do que 10, e ainda mais particularmente,menor do que 9,8. O tratamento com protease pode ser conduzido adequa-damente em uma temperatura de pelo menos 45 0C, particularmente pelomenos 50 0C, e mais particularmente, pelo menos 53 0C. O tratamento comprotease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura menordo que 70 0G, particularmente menor do que 65 0C, mais particularmente,menor do que 60 0C, e ainda mais particularmente, menor do que 57°C. Otratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por pelo me-nos 5 horas, particularmente pelo menos 8 horas, mais particularmente pelomenos 10 horas, e ainda mais particularmente, pelo menos 12 horas. O tra-tamento com protease pode ser conduzido adequadamente por um tempomenor do que 48 horas, particularmente menor do que 36 horas, mais parti-cularmente menor do que 24 horas, e ainda mais particularmente, menor doque 18 horas. O segundo produto é então separado por centrifugação paraproduzir um extrato enriquecido com manana (α-manana), e um produto deparedes celulares enriquecido em β-glucano. Este produto de paredes celu-lares β-(1,3/1,6) é então secado, por exemplo, atomizado, o que resulta naagregação do produto em partículas de cerca de 100-300 mícrons ou mais.

O extrato de manana é então submetido a uma ultrafiltração de peso mole-cular de 10.000, para produzir um material retido no filtro de alto peso mole-cular, que é enriquecido em manana.

Este processo exemplificado descrito acima está ilustrado nofluxograma da figura 1. As células de levedura vivas são submetidas à autó-lise em um processo no qual enzimas de levedura endógenas degradam esolubilizam algumas moléculas da levedura. O extrato solúvel é separadodas paredes celulares da levedura insolúveis por centrifugação. As paredescelulares são então tratadas com uma protease de alto pH para remover a-inda mais a proteína das paredes celulares, e subseqüentemente, removertambém a manana que está anexada à proteína da parede celular. As pare-des celulares enriquecidas com β-glucano são então separadas do extratosecundário por centrifugação. A manana, que tem um alto peso molecular,pode ser purificada ainda mais e concentrada passando o extrato secundárioatravés de um ultrafiltro de 10.000 Da.

Em outra modalidade, o processo inclui uma primeira etapa deautólise de levedura, por exemplo, levedura dos cervejeiros (tipicamente,uma pasta com 8%-12% de sólidos). A autólise é conduzida adequadamenteem um pH de pelo menos 4, particularmente pelo menos 4,5, e mais particu-larmente, pelo menos 5. O pH pode ser também adequadamente menor doque 8, particularmente menor do que 7, e ainda mais particularmente menordo que 6. A temperatura para conduzir a autólise pode ser adequadamentepelo menos 30 0C, particularmente pelo menos 40 0C, e mais particularmen-te pelo menos 45 0C. A temperatura pode ser também adequadamente me-nor do que 55 0C, particularmente menor do que 53 0C, e ainda mais particu-larmente, menor do que 50 0C. A autólise pode ser conduzida adequada-mente por pelo menos 10 horas, particularmente pelo menos 16 horas, emais particularmente, pelo menos 24 horas. A autólise pode ser conduzidaadequadamente por menos de 100 horas, particularmente menos de 48 ho-ras, e mais particularmente, menos de 36 horas. A levedura é então separa-da, adequadamente por centrifugação, para produzir um extrato, e uma cor-rente de paredes celulares com baixo teor de β-glucano. Uma outra etapatrata a corrente de paredes celulares com enzirjias. A etapa enzimática utili-za primeiramente uma protease de pH alto em um ph alcalino, por exemplo,em um pH de pelo menos 8,5, particularmente pelo menos 9, e mais particu-larmente pelo menos 9,2. O pH pode ser também adequadamente menor doque 10,5, particularmente menor do que 10, e ainda mais particularmente,menor do que 9,8. O tratamento com protease pode ser conduzido adequa-damente em uma temperatura de pelo menos 45 0C, particularmente pelomenos 50 0C, e mais particularmente, pelo menos 53 0C. O tratamento comprotease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura menordo que 70 0C1 particularmente menor do que 65 0C, mais particularmente,menor do que 60 0C, e ainda mais particularmente, menor do que 57 0C. Otratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por pelo me-nos 5 horas, particularmente pelo menos 8 horas, mais particularmente pelomenos 10 horas, e ainda mais particularmente, pelo menos 12 horas. O tra-tamento com protease pode ser conduzido adequadamente por um tempomenor do que 48 horas, particularmente menor do que 36 horas, mais parti-cularmente menor do que 24 horas, e ainda mais particularmente, menor doque 18 horas. A etapa enzimática com protease é seguida de incubação comglicoamilase (por exemplo, da espécie Aspergillus), uma amilase (por exem-plo, α-amilases de Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae; amiloglicosidases deAspergillus Niger ou do mofo Rhizopus) e/ou Iipase (por exemplo, Iipase dePseudomonas cepacia, Candida rugosa e Mucor javanicus; tipicamente0,05%-1% em peso). A incubação com glicoamilase, amilase e/ou Iipase éconduzida adequadamente em pH neutro a ligeiramente ácido e temperaturaelevada. Por exemplo, o pH pode ficar adequadamente na faixa de pelo me-nos 3,5, particularmente pelo menos 4, e ainda mais particularmente pelomenos 4,5. O pH pode ficar adequadamente na faixa de menos do que 7,particularmente menos do que 6, e ainda mais particularmente menos doque 5,5. A temperatura para conduzir a incubação com glicoamilase, amilasee/ou Iipase pode ser na faixa de pelo menos 40 0C, particularmente pelo me-nos 45 0C1 mais particularmente pelo menos 50 0C, e ainda mais preferivel-mente, pelo menos 53 0C. A temperatura pode ficar também adequadamentena faixa de menos do que 70 0C, particularmente menos do que 65 0C, maisparticularmente menos do que 60 0C, e ainda mais particularmente, menosdo que 58 0C. Temperaturas de pelos menos 60 0C, pelo menos 65 0C1 pelomenos 70 0C, pelo menos 75 0C, pelo menos 80 0C, pelo menos 85 0C oupelo menos 90 °C, podem ser usadas adequadamente, particularmente se aprotease, amilase e/ou Iipase é uma enzima termoestável. A incubação coma protease alcalina pode ser também seguida de incubação com uma com-binação de uma glicoamilase e uma lipase, uma combinação de uma amila-se e uma lipase, ou uma combinação de uma glicoamilase, uma amilase euma lipase.

O processo exemplificado descrito acima está ilustrado no fluxo-grama da figura 2. No processo representado na figura 2, a levedura viva ésubmetida à autólise em um processo no qual enzimas de levedura endóge-nas degradam e solubilizam algumas macromoléculas da levedura. As pare-des celulares da autólise são primeiramente tratadas com uma protease depH alto. A incubação com a protease de pH alto é conduzida adequadamen-te em uma temperatura de 50 0C a 65 0C por aproximadamente 10 a 16 ho-ras. As paredes celulares são então tratadas com uma amilase (ou outraglicanase) ou lipase, ou uma combinação de amilase e lipase. A incubaçãocom a amilase e/ou uma lipase é conduzida adequadamente em um pH de 4a 7 e uma temperatura de 50 0C a 65 0C por aproximadamente 4 a 10 horas.A amilase pode digerir os alfa-glucanos residuais, tal como glicogênio, quepode ainda existir na parede celular. A lipase pode degradar a membranasdas paredes celulares enriquecidas com lipídeos e gorduras. A corrente deparedes celulares pode ser então separada por centrifugação, para produzirum extrato secundário enriquecido com manana, e um produto de paredescelulares enriquecido em β-glucanos. O produto de paredes celulares podeser secado, por exemplo, atomizado. O extrato secundário de manana podeser passado através de um ultrafiltro, tal como um ultrafiltro de 10.000 Da,um ultrafiltro de 50.000 Da, ou um ultrafiltro de 100.000 Da, para enriquecero teor de manana do material retido no filtro.

As preparações da invenção podem ser secadas por qualquerprocesso apropriado, incluindo, porém sem limitações, atomização, secagemcom cilindros e rolos, secagem em forno, secagem por aspersão, secagemem anel, e combinações deles e/ou secadas usando um equipamento for-mador de película, e podem ser usadas sem processamento adicional, oupodem ser moídas usando qualquer técnica apropriada.

Adequadamente, a protease de pH alto pode ter uma atividadeproteolítica ótima em um pH acima de 7. As proteases apropriadas incluem,porém sem limitações, aquelas obtidas a partir de Actinidia chinensis, Ana-nas comosus, Aspergillus spp. (por exemplo, A.niger, A. niger var. awamori,A. oryzae, A. sojae, A, melleus), Bacillus spp. (por exemplo, Bacillus subtilis,B. alcalophilus. B. amyloliquefaciens, B. halodurans, B. Ientus1B. Iichenifor-mis, B. stearothermophilus, B. thermoprotolyticus), Carica papya, Crypho-nectria parasitica, Endothia parasitica, Ficus glabrata, Kluyveromyces lactis,Penicillum citrinum, Rhizomucor miehei, Rhizopus niveus de estômagos debezerro, caprino ou boi, ou pancreases porcinas, e combinações deles. Asproteases apropriadas podem incluir, porém sem limitações, enzimas dispo-níveis comercialmente, tais como subtilisina Carlsberg, subtilisina BPN', sub-tilisina Novo, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168, Alcalase®, Sa-vinase®, Primase®, Duralase®, Durazym®, Esperase®, e Kannase® (disponí-veis na Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Optimase®,Properase®, Purafect®, Prafect OxP®, FN2®, e FN3® (disponíveis na GenecorInternational, Inc.); e Validase® AFP, Validase® FP Concentrado, Bromelaína(disponíveis na Valley Research, South Bend, IN), e combinações delas.

As amilases apropriadas incluem as de origem vegetal, animal,bacteriana ou fúngica, e combinações delas. As amilases incluem, porémsem limitações, glicoamilases ou α-amilases obtidas a partir de Bacillus spp.(por exemplo, B. Iicheniformis1B. amyloliquefaciens,Bacillus subtilis, B. stea-rothermophilus), Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asprgillus niger var.awamori, Microbacterium imperiale, Termomnospora viridis, malte de cevada(Hordeum spp.), pâncreas porcino (Sus spp.), e combinações delas. Os e-xemplos de amilases úteis incluem, porém sem limitações, as amilases dis-poníveis comercialmente, tais como Concentrado de Glicoamilase, Duram-yl®, Termamyl®, Fungamyl®, e ΒΑΝ® (disponíveis na Novo Nordisk A/S); Ra-pidase® e Purastar® (disponíveis na Genencor International, Inc.); e Valida-se® BAA, Validase® HT340L, Validase® FAA, Validase® AGS, Validase® GA,Validase® RGA (disponíveis na Valley Research, South Bend, IN); e combi-nações delas. A amilase pode ser usada adequadamente em uma concen-tração final de pelo menos 0,001%, particularmente pelo menos 0,01%, eainda mais particularmente, pelo menos 0,02%. A amilase pode ser usadaadequadamente em uma concentração final de menos do que 0,1%, particu-larmente menos do que 0,05%, e ainda mais particularmente, menos do que 0,1%.

As lipases úteis na invenção incluem, porém sem limitações, Ii-pases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo de H. Ianuginosa(T. lanuginosus), H. insolens, uma Iipase de Pseudomonas, por exemplo, deP. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluores-cens, Pseudomonas sp. cepa SD 705, P. wisconsinensis, uma Iipase de Ba-cillus, por exemplo, de Bacillus subtilis, B. stearothermophilus ou B. pumilus(documento n2 WO 91/16422); Aspergillus oryzae, Aspergillus niger,Candidalipolytica, Candida rugosa, Mucor javanicus, Penicillum roqueforti, Rhizomu-cor miehei, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Rhizopusoryzae, Rhizopusarrhizus, e combinações delas. As enzimas Iipase disponíveis comercialmen-te incluem, porém sem limitações, Lipolase®, Lipolase Ultra® (Novo NordiskA/S), e Lipase Fúngica 8000 e Lipase Pancreática 250 (disponíveis na ValleyResearch, South Bend, IN).

O produto resultante da autólise das células de levedura com-preende também adequadamente pelo menos 20%, particularmente pelomenos 23% e mais particularmente pelo menos 25% de proteína do produtototal em base de sólidos secos. O produto compreende também adequada-mente menos do que 45%, particularmente menos do que 40%, e mais parti-cularmente, menos do que 35% de proteína do produto total em base de só-lidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura com-preende também adequadamente pelo menos 20%, particularmente pelomenos 23% e mais particularmente pelo menos 25% de glucanos do produtototal em base de sólidos secos. O produto corppreende também adequada-mente menos do que 45%, particularmente menos do que 40%, e mais parti-cularmente, menos do que 35% de glucanos do produto total em base desólidos totais.

O produto resultante da autólise das células de levedura com-preende adequadamente pelo menos 5%, particularmente pelo menos 7% emais particularmente pelo menos 10% de alfa-glucanos do produto total embase de sólidos secos. O produto compreende também adequadamentemenos do que 20%, particularmente menos do que 18%, e mais particular-mente, menos do que 15% de alfa-glucanos do produto total em base desólidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura com-preende adequadamente pelo menos 7%, particularmente pelo menos 10%e mais particularmente pelo menos 12% de beta-glucanos do produto totalem base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamentemenos do que 22%, particularmente menos do que 20%, e mais particular-mente, menos do que 18% de beta-glucanos do produto total em base desólidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura com-preende adequadamente pelo menos 5%, particularmente pelo menos 7% emais particularmente pelo menos 10% de mananas do produto total em basede sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menosdo que 20%, particularmente menos do que 18%, e mais particularmente,menos do que 15% de mananas do produto total em base de sólidos totais.

O produto de paredes celulares com produto enriquecido em β-(1,3/1,6)-glucano caracteriza-se, por exemplo, como pelo menos 50%, pelomenos 55%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de β-(1,3/1,6)-glucano,com um teor de proteína de menos do que 20%, menos do que 15%, ou me-nos do que 10%. O produto enriquecido em manana (extrato secundário demanana) pode ser caracterizar por conter pelo menos 50%, particularmentepelo menos 55%, e ainda mais particularmente, pelo menos 57% de mana-na. O produto enriquecido em manana pode se caracterizar também porconter menos do que 70%, particularmente menos do que 68%, e ainda maisparticularmente, menos do que 65% de manana. O produto enriquecido emmanana (extrato secundário de manana) pode ser caracterizar por conterpelo menos 25%, particularmente pelo menos 27%, e ainda mais particular-mente, pelo menos 29% de proteína. O produto enriquecido em manana po-de se caracterizar também por conter menos do que 35%, particularmentemenos do que 32%, e mais particularmente, menos do que 30% de proteína.

A etapa de ultrafiltração pode ser conduzida forçando um extratoproduzido a partir do processo aqui descrito, tal como um extrato secundáriode manana, através de um ultrafiltro sob pressão. Adequadamente, o ultrafil-tro compreende uma ou mais membranas semipermeáveis. A membranasemipermeável ou o ultrafiltro pode ter um corte de peso molecular, por e-xemplo, de pelo menos 8.000 Da, particularmente pelo menos 10.000 Da,mais particularmente pelo menos 25.000 Da, e ainda mais particularmentepelo menos 50.000 Da. Deve-se entender que o ultrafiltro por ter um corte depeso molecular de qualquer valor entre aqueles aqui enunciados, incluindo,porém sem limitações, um corte de peso molecular de pelo menos 15.000Da, 20.000 Da, 30.000 Da, 40.000 Da, 60.000 Da, 70.000 Da, 80.000 Da,90.000 Da1 110.000 Da, 120.000 Da, 130.000 Da e 140.000 Da. As mem-branas apropriadas do ultrafiltro incluem, porém sem limitações, membranasde fibras ocas disponíveis na A/G Technology Corp., Needham, MA.

Pelo menos 80% em peso, particularmente pelo menos 85% empeso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas se-cundárias totais no matéria retido no filtro após a filtração de um extrato demananas secundárias podem ter um peso molecular acima do corte de pesomolecular do filtro usado. Por exemplo, se um corte de 10.000 Da é usadocom um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelos menos 80% empeso, particularmente pelo menos 85% em peso, e mais particularmente pe-lo menos 90% em peso das mananas totais no material retido no filtro po-dem ter um peso molecular acima de 10.000 Da. Se um corte de 50.000 Daé usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelos menos80% em peso, particularmente pelo menos 85% em peso, e mais particular-mente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material retido nofiltro podem ter um peso molecular acima de 50.000 Da. Se um corte de100.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamentepelos menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% em peso, emais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no ma-terial retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 100.000 Da. Seum corte de 150.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias,tipicamente pelo menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% empeso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totaisno material retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 150.000Da.

A etapa de ultrafiltração pode incluir opcionalmente passar o ex-trato de mananas através de dois ou mais ultrafiltros com cortes de pesomolecular diferentes. O material final retido no filtro compreende enriquecidoem mananas, onde a maior parte das mananas tem um peso molecular quecai dentro da faixa entre os cortes de peso molecular dos ultrafiltros. Nestamodalidade, pelo menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% empeso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totaisno material final retido no filtro podem ter um peso molecular entre os cortesde peso molecular dos ultrafiltros.

O extrato de mananas secundárias que resulta da separação doproduto enriquecido em glucanos depois do tratamento enzimático de pare-des celulares que sofreram autólise caracteriza-se, por exemplo, por 15% a50% de manana, 20% a 30% de proteína, e 20% a 25% de outros compo-nentes. Quando o extrato de mananas secundárias é ultrafiltrado de acordocom os métodos da invenção, o material retido no filtro pode compreenderpelo menos 50%, particularmente pelo menos 52%, mais particularmentepelo menos 55%, e ainda mais particularmente, pelo menos 60% de mana-na. O material retido no filtro pode compreender menos do que 70%, particu-larmente menos do que 65%, e mais particularmente, menos do que 62% demanana. O material retido no filtro pode compreender pelo menos 10%, par-ticularmente pelo menos 12%, mais particularmente pelo menos 15%, e ain-da mais particularmente, pelo menos 17% de proteína. O material retido nofiltro pode compreender ainda menos do que 33%, particularmente menosdo que 30%, e mais particularmente, menos do que 22% de proteína.

As preparações de acordo com a presente invenção são consi-deradas como sendo de valor, por exemplo, com suplementos alimentares,produtos farmacêuticos (por exemplo, para melhorar a resposta imunológica,cosméticos, rações animais e produtos nutracêuticos. Por exemplo, uma ra-ção animal pode conter adequadamente 1 a 10 g de preparação/kg de ra-ção. Adequadamente, a preparação pode compreender pelo menos 0,01%,particularmente pelo menos 0,02%, mais particularmente pelo menos 0,05%,e ainda mais particularmente, pelo menos 0,1%, e menos do que 5%, parti-cularmente menos do que 2%, mais particularmente, menos do que 0,5%, eainda mais preferivelmente, menos do que 0,3% do peso total da ração, ba-seado em peso/peso. As rações animais apropriadas incluem, porém semlimitações, rações para gado bovino, eqüinos, suínos, aves, peixes (por e-xemplo, crustáceos, moluscos), pássaros e animais de estimação (por e-xemplo, gatos, cães). Uma composição líquida pode conter 0,1-1% em pesoda preparação de acordo com a presente invenção. As preparações de a-cordo com a presente invenção podem ser usadas também em uma compo-sição para proteção de plantas, junto com um veículo de uso agrícola, e op-cionalmente, um nutriente, herbicida ou pesticida de uso agrícola.

Por exemplo, as frações enriquecidas em beta-glucano, fabrica-das de acordo com a presente invenção, podem ser usadas adequadamentecomo estimuladores imunológicos em rações animais e alimentos para con-sumo humano, produtos farmacêuticos ou emolientes, gentes para reduzircolesterol e agentes espessantes em alimentos e bebidas. Caso adicionadoa um emoliente, loção ou creme, e usado para tratar uma condição, o beta-glucano pode estar presente adequadamente em uma concentração (p/p) depelo menos 0,05%, particularmente pelo menos 0,1%, e mais particularmen-te, pelo menos 0,5%, e menos do que 10%, particularmente menos do que5%, e mais particularmente, menos do que 2%. Adequadamente, as fraçõesde beta-glucano, fabricadas de acordo com a presente invenção, podem serusadas para tratar eczema, por exemplo, pela incorporação em um creme,loção ou emoliente. O eczema engloba várias condições de pele inflamada,incluindo dermatite atópica ("eczema atópico"), β afeta cerca de 10% a cercade 20% da população mundial durante a infância. O eczema parece ser umaresposta anormal do sistema imunológico do corpo.

Existem também inúmeros usos para os produtos enriquecidosem mananas, fabricados de acordo com a presente invenção. Por exemplo,os produtos de mananas podem ser usados na indústria de rações animais,tendo vantajosamente a capacidade de se ligarem a micotoxinas e tambémàs bactérias patogênicas, impedindo as bactérias de colonizarem o trato in-testinal.

Resumindo, a invenção fornece, dentre outras coisas, repara-ções enriquecidas de β-glucanos e mananas, utilizando processos em con-dições relativamente brandas do processo.

Várias características e aspectos da invenção estão enunciadosnos exemplos que se seguem.

EXEMPLO 1: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH Alto

31,1 kg da fração de paredes celulares de uma autólise comer-cial de levedura dos cervejeiros (Saccharomyces cerevisiae) foram aqueci-dos até 55 0C em um vaso de aço inoxidável encamisado. Os sólidos totaiseram de 10,7% e a proporção total de proteína nos sólidos era de 24,5%. OpH foi elevado até 9,5 com hidróxido de sódio e adicionou-se 0,1% (baseadono peso total) de Protex 6L (uma protease alcalina disponível na Genencor,Palo Alto, CA1 EUA). As paredes celulares foram agitadas a 55 0C por 16horas. O Protex 6L foi inativado por calor a 85 0C por 30 min, e as paredescelulares foram separadas com uma centrífuga de caneca modelo Alpha La-vai Gyro, usando um processo de decantação contínua. A fração de paredescelulares insolúveis foi condensada até 15,4% de sólidos, o pH foi ajustadopara 7,0 com ácido clorídrico e a fração foi atomizada. Uma parte do extratodo tratamento com Protex 6L (correspondente ao 2- extrato ilustrado na figu-ra 1) foi condensada até 28,3% de sólidos, o pH foi ajustado até 7,0, e o ex-trato foi atomizado. O restante do 2- extrato foi ultrafiltrado usando umamembrana de fibras ocas UFP-10-C-6A 10.000 NMWC (disponível na A/GTechnology Corp., Needham, MA, EUA). O material retido no filtro, enrique-cido em mananas, e de alto peso molecular, teve seu pH ajustado para 7,0 eatomizado. O 32 extrato (filtrado) teve seu pH ajustado para 7,0, condensadoe atomizado.

A composição dos produtos resultantes deste processo foi anali-sada usando as seguintes técnicas: a proteína foi determinada usando umdeterminador de proteínas LECO (LECO Corp., St. Joseph, Ml, EUA); osglucanos, alfa-glucanos e beta-glucanos totais foram medidos usando um kitde Beta-glucanos de Cogumelo e Levedura Megazyme International (dispo-nível na Megazyme International, Wicklow, Irlanda); as mananas foram de-terminada por hidrólise ácida de carboidratos e ensaio espectrofotométricoligado para manose livre, usando hexocinase, glicose-6-fosfato desidrogena-se, fosfoglicose isomerase e fosfomanose isomerase; a gordura foi determi-nada usando o método de extração com metanol/clorofórmio de Blich1 E.G, eDyer, W.J., Can. J. Biochem. Physiol. 37:911 (1959); a glicose livre foi medi-da usando o Analisador de Bioquímica Yellow Springs Instruments (disponí-vel na YSI lncorporated, Yellow Springs, OH. EUA). Os resultados destasanálises estão indicados na Tabela 1.Tabela 1

Caracterização de Produtos

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ND significa não-determinado

EXEMPLO 2: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH Altoe Glicoamilase A

60.560 litros (16.000 gal) de cremes de paredes celulares deuma produção de extrato de levedura dos cervejeiros foram aquecidos até55 0C e o pH foi ajustado para 9,5 com hidróxido de sódio. Adicionou-se Pro-tex 6L a 0,1% em volume, e a mistura foi mantida a 55 0C por 14 horas. OpH foi baixado até pH 5,0 com HCI. No pH 5, o Protex 6L é inativo e nãodestruirá as enzimas adicionadas. Adicionou-se Concentrado de Glicoamila-se (disponível na Valley Research, South Bend, IN, EUA) a 0,0175% (pe-so:peso total). A temperatura foi mantida em 55 0C por 4 horas, e depois e-levada até 88 0C para inativar as enzimas. O material aquecido foi separadocom um separador de caneca Westfalia (disponível a Westfalia Separator,Inc., Northvale, NJ, EUA). A maior parte do extrato (ilustrada como 2- extratona figura 2) foi condensada e atomizada. Uma parte do 2- extrato foi ultrafil-trada usando uma membrana de fibras ocas UFP-10-C-6A 10.000 NMWC(disponível na A/G Technology Corp., Needham, MA, EUA). O material retidono filtro e o filtrado foram condensados e atomizados. Os produtos atomiza-dos foram analisados de acordo com as técnicas descritas no Exemplo 1. Osresultados estão apresentados na Tabela 2. A fração de paredes celularesfoi lavada com água por centrifugação, condensada e atomizada.

Tabela 2

Caracterização de Produtos Fabricados de Acordo com o Processo Repre-sentado na figura 2

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ND significa não-determinado

A eficácia da glicoamilase adicionada no processo do Exemplo 2pode ser observada quando se compara os dados das Tabelas 1 e 2. Noprocesso do Exemplo 2, os alfa-glucanos não foram detectáveis no materialretido no filtro e no filtrado depois da ultrafiltração. Além disso, o 2- e o 32extratos do processo do Exemplo 2 têm um nível muito mais alto de glicoselivre, como indicado na Tabela 2, do que o 2- e o 32 extratos do processo doExemplo 1, como indicado na Tabela 1.

EXEMPLO 3: Processamento de Levedura Usando Glicoamilase e uma Pro-tease de pH Alto Adicionadas às Paredes Celulares de Levedura que Sofre-ram Autólise em Ordens Diferentes

Foram adicionados 25 kg de paredes celulares a cada um dosdois vasos de aço inoxidável encamisados, a partir de uma corrida industrialde um extrato de levedura dos cervejeiros, na qual as células de leveduratinham sido submetidas à autólise. Os soídos eram de 11,8%. Ambos vasosforam aquecidos até 55 0C. O pH do Vaso 1 foi ajustado para 5,0 e adicio-nou-se Concentrado de Glicoamilase (disponível na Valley Research, SouthBend, IN, EUA) a 0,1% (peso.peso total). A incgbação foi continuada por 14horas antes de elevar o pH até 9,5. Depois, adicionou-se Protex 6L a 0,10%e a incubação foi continuada por 4 horas. Amostras foram retiradas em vá-rios pontos no tempo e testadas quanto à glicose livre liberada pela ação daglicoamilase.

O pH do Vaso 2 no início foi elevado até 9,5 e adicionou-se Pro-tex 6L a 0,1% (peso:peso total). O foi então reduzido 5,0 e adicionou-seConcentrado de Glicoamilase a 0,1%. A incubação foi continuada por mais 4horas. Amostras foram retiradas em vários pontos no tempo e testadasquanto à glicose livre liberada pela ação da glicoamilase. A Tabela 3 indica onível de glicose livre em ambos vasos em vários tempos.

Tabela 3

Liberação de Glicose a Partir de α-Glucanos Paredes Celulares de Levedurados Cervejeiros (g/L de glicose livre)

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Os dados da Tabela 3 indicam que, quando a glicoamilase é a-dicionada antes do Protex 6L, como no Vaso 1, então as paredes celularessão alteradas suficientemente para permitir que a glicoamilase acesse e digi-ra o α-glucano (glicogênio) de alto peso molecular que fica entranhado den-tro das paredes celulares após a autólise da levedura dos cervejeiros. Emcontraste, no Vaso 2, adicionando a protease antes da glicoamilase, permite-se que a glicoamilase acesse e digira o α-glucano, e libere substancialmentemais glicose. Este é o caso, muito embora a glicoamilase no Vaso 1 tivesseum tempo mais longo (14 horas) para funcionar em pH 5,0 do que a glicoa-milase do Vaso 2 (4 horas). Portanto, para a remoção ótima de glicogênio/a-glucano das paredes celulares da levedura dos cervejeiros, a protease alca-lina Protex 6L deve ser adicionada antes da glicoamilase.

EXEMPLO 4: Processamento da Levedura dos Cervejeiros e da Levedurados Padeiros de Acordo com o Processo Ilustrado na figura 2

220 g das paredes celulares de uma autólise comercial de leve-dura dos cervejeiros primária (a 15% de sólidos) ou da levedura dos padei-ros (a 11,8% de sólidos) foram aquecidos até 55°C e os pHs foram ajustadospara 9,5. As paredes celulares foram então tratadas por 14 horas com Pro-tex 6L a 0,1% (peso:peso total). Depois de 14 horas, os pHs foram baixadospara 5,0 e adicionou-se Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% a cada umdos vasos. Os frascos foram incubados a 55 0C por mais 4 horas. A glicoselivre foi monitorada com um Analisador de Bioquímica YSI. Os resultadosestão indicados na Tabela 4.

Tabela 4

Comparação de Glicose Liberada a Partir das Paredes Celulares da Levedu-ra dos Padeiros e da Levedura dos Cervejeiros, Usando o Processo Ilustra-do na figura 2

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As paredes celulares resultantes da autólise da levedura dospadeiros contêm níveis mais baixos de glicogênio do que as paredes celula-res da levedura dos cervejeiros porque a levedura dos cervejeiros desenvol-vida principalmente de forma aeróbica tende a acumular menos beta-glucano do que a levedura dos cervejeiros desenvolvida de forma anaeróbi-ca. Mais glicose foi liberada a partir das paredes celulares da levedura doscervejeiros depois da incubação com glicoamilase do que a partir das pare-des celulares da levedura dos padeiros. O processo da figura 2 é, portanto,extremamente eficaz para processar beta-glucano a partir de paredes celula-res da levedura dos cervejeiros.EXEMPLO 5: Uso de Extratos em Ração Animal

Uma mistura 50:50 (na base de sólidos secos) de células de le-vedura dos cervejeiros submetidas à autólise:2s extrato do processo da figu-ra 2, fabricada de acordo com o Exemplo 2 (isto é, mananas obtidas depoisdo tratamento com protease e amilase), foi formulada misturando a seco osdois componentes entre si. Esta mistura foi usada para suplementar as die-tas de leitões por 28 dias depois do desmame. A mistura foi adicionada emuma taxa de 1,36 kg/t (3 Ib/t) da dieta durante a Fase 1 (0-7 dias), 0,907 kg/t(2 Ib/t) da dieta durante a Fase 2 (7-14 dias) e 0,907 kg/t (2 Ib/t) da dieta du-rante a Fase 3 (14-28 dias). As dietas do controle e do tratamento continhamantibióticos. Os leitões pós-desmame (17-22 dias de idade) foram alocadosaleatoriamente à dieta do controle ou do tratamento baseado no peso corpo-ral. Havia 6 chiqueiros com treze porcos para cada dieta. Os resultados es-tão indicados na Tabela 5.

Tabela 5

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a'bSignificam que diferem significantemente

Os porcos alimentados com a dieta de tratamento ficaram signi-ficantemente mais pesados no Dia 14 e houve uma tendência de os porcosapresentarem aumentos de peso durante os 28 dias.

EXEMPLO 6: Uso de Extratos de Levedura como Intensificador de Palatabi-lidade em Rações Animais

Grânulos (kibbles) para caninos foram revestidos com óleo, edepois adicionou-se 1,0% do 32 extrato do processo ilustrado na figura 2,fabricado de acordo com o Exemplo 2 (isto é, o filtrado depois da ultrafiltra-ção), ou 1,0% de um intensificador de palatabilidade aceito, por aspersãosobre a superfície dos grânulos revestidos com óleo. 1.000 g de cada raçãoforam oferecidos a um grupo de 20 cães por dois dias. As posições das tige-las foram invertidas para impedir permutação "esquerda-direita".

A quantidade de ração comida por cada cão durante o períodode dois dias está indicada na Tabela 6. A Tabela 6 indica que o 3- extrato doprocesso da figura 2, fabricado de acordo com o Exemplo 2, intensificou apalatabilidade de uma ração seca para cães tanto quanto, senão mais doque o palatabilizante-padrão.

Tabela 6

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EXEMPLO 7 (hipotético): Características de Parede Celular de Levedura - Pó Atomizado

Um produto de paredes celulares de levedura, altamente purifi-cado, de Saccaromyces cerevisiae, é produzido de acordo com o processodescrito no Exemplo 2. Ele em uma alta concentração de (P-1.31,6)-glucano.O produto é G.R.A.S. (Generalmente Reconhecido como Seguro) pela FDA.O produto pode ser usado para suplementar uma ampla série de alimentoscom uma fonte natural de alta qualidade de (p-1.31,6)-glucano. Este materialbiologicamente ativo demonstrou estimular o çistema imunológico de umaampla série de animais. A composição e as características do produto estãoindicadas na Tabela 7.

Tabela 7

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EXEMPLO 8 (hipotético)

Um creme de paredes celulares da levedura dos cervejeiros éaquecido até 55°C (1310F). O pH é elevado para 9,5 com hidróxido de sódioa 50% (cerca de 5 mL/kg de creme de paredes celulares). Adicionou-se Pro-tex 6L (Genencore) a 0,1% (volume:peso total de creme de paredes celula-res). A mistura e mantida a 55°C (131 0F) por 14 horas. O pH é baixado até5,0 com HCI a 28% (ácido muriático) e adiciona-se Concentrado de Glicoa-milase a 0,0175% (peso:peso total) (Valley Research). A mistura é mantida a55 0C por 4 horas, antes de inativar por calor as enzimas aquecendo até 85-90 0C (185-195 0F). As frações são separadas. Antes de atomizar a fraçãoinsolúvel enriquecida em beta-glucano, o pH é ajustado para 6,5. A fraçãoinsolúvel enriquecida em beta-glucano é atomizada.

Um produto de paredes celulares de levedura, altamente purifi-cado, de Saccaromyces cerevisiae, é produzido. Ele tem uma alta concen-tração de (P-1.31,6)-glucano. O produto é G.R.A.S. (Genericamente Reco-nhecido como Seguro) pela FDA. O produto pode ser usado para suplemen-tar uma ampla série de alimentos com uma fonte natural de alta qualidadede (P-1.31,6)-glucano. Este material biòlogicamente ativo demonstrou esti-mular o sistema imunológico de uma ampla série de animais. A composiçãoe as características do produto estão indicadas na Tabela 7.

EXEMPLO 9: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH AltoLipase A

220 g das paredes celulares (a 15% de sólidos) de uma autólisecomercial de levedura dos padeiros foram colocados em um frasco de vidroe agitados. A temperatura foi elevada até 55 0C e o pH foi ajustados para 9,5com HCI. Adicionou-se Protex 6L a 0,1% e a amostra foi incubada por 14horas. Nesta hora, alíquotas de 30 g foram colocadas dentro de tubos decentrífuga de 50 mL (disponíveis na Nalgene), apropriados para uso em umrotor de centrífuga Sorvall SS34. Uma barra de agitador magnético foi adi-cionada a cada tubo. As seguintes adições, A, B ou C foram feitas aos tubosde centrífuga:

A - Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% (disponível na Val-Iey Research)

B - Lipase CR a 0,1% (uma triglicerol-lipase dispoível na ValleyResearch)

C - Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% + Lipase CR a 0,1%

Cada tubo foi incubado a 55 0C por 4 horas sob agitação. As en-zimas foram exterminadas com calor a 85 0C por 15 min, e as paredes celu-lares foram peletizadas usando uma centrífuga Sorvall® com um rotor SS34(a 12.000 rpm por 10 min). Os péletes foram então lavados três vezes comum volume de água igual ao volume do extrato solúvel removido. As paredescelulares foram recolocadas em suspensão até 15% de sólidos e atomizadascom um miniatomizador Buchi B-191. As paredes celulares secas foram ana-lisadas quanto ao teor de proteína (nitrogênio X 6.25; determinador de prote-ína LECO, disponível na LECO Corp., St. Joseph, Ml, EUA) e o beta-glucanofoi medido usando o kit de Beta-glucanos de Cogumelo e Levedura Me-gazyme International (disponível na Megazyme International, Wicklow, Irlan-da). Os resultados estão indicados na Tabela 8.

Tabela 8

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EXEMPLO 10 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido em Beta-qlucano doExemplo 2 em Ração para Frangos para Assar na Grelha

Uma ração-padrão para frangos (sem antibiótico), contendo 1g/kg de produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 2, ou não con-tendo qualquer beta-glucano (controle), é dada diariamente para galetosdesde a idade de 1 dia. Depois de 7 dias, os galetos alimentados com o con-trole e com beta-glucano recebem um desafio respiratório com uma cepa deE. coli patogênica para frangos. Os galetos continuam a receber sua dietarespectiva, e a mortalidade é registrada por 1 mês.

Espera-se que mortalidade dos frangos alimentados com beta-glucano seja significativamente mais baixa do que a daqueles que recebe-ram a dieta-padrão. A estimulação do sistema imunológico dos frangos évaliosa para diminuir as perdas de produção em virtude da infecção respira-tória.

EXEMPLO 11 (hipotético): Uso do Material Retido no Ultrafiltrado Enrigueci-do em Mananas do Exemplo 1 em Ração para Frangos para Assar na Grelha

Uma ração-padrão para frangos (sem antibiótico), contendo 1g/kg de produto enriquecido com manana dodo material retido a ultrafiltraçãodo Exemplo 1, ou não contendo qualquer manana (controle), é dada diaria-mente para galetos por 2 semanas. Os galetos (grupo de controle e alimen-tado com manana) recebem uma inoculação oral de uma cepa de Salmonel-la patogênica para frangos. Os galetos continuam a receber sua dieta res-pectiva, e a mortalidade e a morbidez são monitoradas por 1 mês.

A manana se liga à Salonella e impede que ela se ligue ao tratointestinal dos frangos na ração com manana. Espera-se que isto resulte emuma redução significativa a morbidez e mortalidade dos frangos alimentadoscom manana.

EXEMPLO 12 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido em Beta-qlicana dosExemplos 1 ou 2 no Cultivo de Camarão-tiqre

Um grupo de camarões-tigre (Penaeus monodon) é imergido emuma solução que não contém produto enriquecido com beta-glucano (grupode controle). Este grupo é alimentado com um péIete comercial que não con-tém produto enriquecido com beta-glucano durante o curso do estudo. Umsegundo grupo de camarões-tigre é imergido em uma solução que contém0,1% do produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 1, e depois ali-mentado com um pélete de produto enriquecido com beta-glucano do Exem-plo 1. Um terceiro grupo de camarões-tigre é imergido em uma solução quecontém 0,1% de produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 2, e de-pois alimentado com um pélete comercial que contém 0,1% do produto enri-quecido com beta-glucano do Exemplo 2. A mortalidade de cada grupo émonitorada durante vários meses.

Existe historicamente um alto índice de mortalidade na criaçãode camarões. Espera-se que os beta-1,3/1,6-glucanos de levedura dos E-xemplos 1 e 2 estimulem a resposta imune do camarão quando o camarão éimergido em soluções que contêm beta-glucano, e quando o camarão é sub-seqüentemente alimentado com ma ração que contém beta-glucano, emcomparação com o grupo de controle. Espera-se que os grupos de cama-rões-tigre imergidos e alimentados com as dietas de beta-glucano cresçammais rapidamente e tenham mortalidade reduzida em comparação com ogrupo de controle, em virtude da estimulação de seu sistema imunológicoinato.

EXEMPLO 13 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido com Beta-glucano doExemplo 2 no Tratamento de Eczema

Um seleto grupo de crianças sofrendo de eczema, não-responsivo aos tratamentos atuais aceitos com loção para a pele, é tratadocom uma loção que contém 1% de uma suspensão do produto enriquecidoem β-glucano do Exemplo 2. A loção é aplicada duas vezes ao dia. A pele éavaliada semanalmente por um dermatologista quanto à melhora das lesõese da dor. Espera-se que a loção de β-glucano diminua a dor associada àslesões e acelere a cicatrização das lesões.

EXEMPLO 14 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido com Beta-alucano doExemplo 2 na Produção de Guloseimas Saudáveis

O extrato de beta-glucano de levedura do Exemplo 2 é adiciona-do a um sorvete a 1% em peso como uma substituição parcial da gordura. Obeta-glucano aumenta a firmeza e o corpo do sorvete sem afetar a textura. Osorvete suplementado com beta-glucano contém menos calorias do que osorvete que não contém beta-glucano. Depois da ingestão do sorvete su-plementado, espera-se que os beta-glucanos estimulem o sistema imunoló-gico inato do trato intestinal e beneficiem o estado imunológico do consumidor.

O extrato de beta-glucano de levedura do Exemplo 2 é adiciona-do em uma quantidade de 0,5% em peso e 1% em peso a bolinhos, barrasde guloseimas e itens de confeitaria que não contêm beta-glucano. Depoisda ingestão dos bolinhos, barras de guloseimas e itens de confeitaria, su-plementados, espera-se que os beta-glucanos estimulem o sistema imuno-lógico inato do trato intestinal e beneficiem o estado imunológico do consu-midor.

Embora a presente invenção tenha sido descrita e exemplificadacom alguma especificidade, os versados nessas técnicas devem avaliar quevárias modificações, incluindo variações, adições e omissões que podem serfeitas no relatório descritivo apresentado. Conseqüentemente, pretende-seque estas modificações também estejam englobadas pela presente invençãoe que o âmbito da presente invenção esteja limitado unicamente pela inter-pretação mais ampla que legalmente possa estar consoante com as reivindi-cações apensadas.

Todas patentes, publicações e referências aqui citadas são aquiinteiramente incorporadas como referência. No caso de conflito entre o pre-sente relatório descritivo e as patentes, publicações e referência incorpora-das, o presente relatório descritivo deve prevalecer.

Claims (30)

1. Método para processar células de microorganismos, caracte-rizado pelo fato de que compreende:(a) efetuar a autólise das células dos microorganismos, para Ii-berar paredes celulares de microorganismos;(b) incubar as paredes celulares dos microorganismos com umaprotease exógena;(c) separar as paredes celulares dos microorganismos em umcomponente enriquecido em glucanos e um componente enriquecido emmananas; e(d) ultrafiltrar o componente enriquecido em mananas da etapa(c) para formar um filtrado e um material retido no filtro.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o microorganismo compreende pelo menos um entre uma Ieve-dura, fungos, bactérias ou plantas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as células de microorganismo compreendem células de levedura.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a protease da etapa (b) é inativada antes da etapa (c).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a incubação da etapa (b) é conduzida em um pH de 9 a 10, euma temperatura de 50°C a 65°C.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o material retido no filtro compreende mananas, e em que pelomenos 85% em peso das mananas têm um peso molecular de pelo menos 10.000 Da.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a etapa (a) é conduzida em um pH de 4 a 8.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a etapa (a) é conduzida por 24 a 36 horas.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a etapa (a) é conduzida em uma temperatura de 35°C a 55°C.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em glucanosda etapa (c) em uma ração animal.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar as paredes celulares tratadas com pro-tease da etapa (d) em uma ração animal.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (d) em uma raçãoanimal.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em glucanosda etapa (c) em um produto selecionado entre um suplemento alimentar, umproduto farmacêutico, um cosmético e um produto neutracêutico.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar as paredes celulares tratadas com pro-tease da etapa (b) em um produto selecionado entre um suplemento alimen-tar, um produto farmacêutico, um cosmético e um produto neutracêutico.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (d) e usar o compo-nente enriquecido em glucanos da etapa (c) em um produto selecionado en-tre um suplemento alimentar, um produto farmacêutico, um cosmético e umproduto neutracêutico.

16. Método para processar células de levedura, caracterizadopelo fato de que compreende:(a) efetuar a autólise de células de leveduras em uma tempera-tura de 50°C a 65°C, para liberar paredes celulares da levedura;(b) incubar as paredes celulares de levedura com uma proteaseexógena em um pH de 9 a 10;(c) incubar as paredes celulares de levedura tratadas com prote-ase da etapa (b) com uma enzima que compreende pelo menos uma amila-se, lipase, e uma combinação das mesmas; e(d) separar as paredes celulares tratadas com enzima da etapa(c) em um componente enriquecido em glucanos e um componente enrique-cido em mananas.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que as células de levedura compreendem células da levedura doscervejeiros.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar as paredes celulares tratadas com aenzima da etapa (c) em uma ração animal.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar as paredes celulares tratadas com aenzima da etapa (c) em um produto selecionado entre um suplemento ali-mentar, um produto farmacêutico, um cosmético e um produto neutracêutico.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que a etapa (c) é conduzida em um pH de 4 a 6.

21. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em gluca-nos da etapa (d) em uma ração animal.

22. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em gluca-nos da etapa (d) em um produto selecionado entre um suplemento alimentar,um produto farmacêutico, um cosmético e um produto nutracêutico.

23. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda(e) ultrafiltrar o componente enriquecido em mananas da etapa(d) para formar um filtrado e um material retido no filtro.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que o material retido no filtro compreende mananas, e em que pelomenos 85% em peso das mananas têm um peso molecular de pelo menos 10.000 Da.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (e) e uma raçãoanimal.

26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (e) em um produtoselecionado entre um suplemento alimentar, um produto farmacêutico, umcosmético e um produto nutracêutico.

27. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a-mananas, em que pelo menos 85% em peso das α-mananas totais têm umpeso molecular de 10.000 Da ou mais.

28. Suplemento alimentar, produto farmacêutico, cosmético ouproduto nutracêutico, caracterizado pelo fato de que compreende a compo-sição como definida na reivindicação 27.

29. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende acomposição como definida na reivindicação 27.

30. Ração animal de acordo com a reivindicação 29, caracteri-zada pelo fato de que a referida ração animal é uma ração para cães, gatos,porcos, peixes ou gado bovino.