JP3122454B2 - カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 - Google Patents
カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法Info
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- JP3122454B2 JP3122454B2 JP02255201A JP25520190A JP3122454B2 JP 3122454 B2 JP3122454 B2 JP 3122454B2 JP 02255201 A JP02255201 A JP 02255201A JP 25520190 A JP25520190 A JP 25520190A JP 3122454 B2 JP3122454 B2 JP 3122454B2
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- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
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- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法に関
する。
する。
［従来の技術］ カブトガニの血球細胞抽出液（以下、LALと記す。）
が、細菌性発熱物質である内毒素（以下、エンドトキシ
ンと記す。）と反応して凝固することが広く知られてい
る。
が、細菌性発熱物質である内毒素（以下、エンドトキシ
ンと記す。）と反応して凝固することが広く知られてい
る。
この反応を基礎として、種々のエンドトキシン検出方
法が開発されている。
法が開発されている。
最近になつて、第１図に示すような段階的反応でコア
ギユローゲンがコアギユリンとなつて凝固（ゲル化）す
ると言う上記凝固反応の機構が解明された［S.Iwanaga
et al.,The hemolymph coagulation system in inverte
brate animals,J.Protein Chem.,5,255−268（198
6）］。この機構によれば、LALの凝固は、エンドトキシ
ンによつて、開始する系（Ｃ因子系）と、（１→３）−
β−Ｄ−グルカン（例えば、カードラン、部分カルボキ
シメチル化（１→３）−β−Ｄ−グルカンなど）によつ
て開始する系（Ｇ因子系）とが存在することが理解され
る。
ギユローゲンがコアギユリンとなつて凝固（ゲル化）す
ると言う上記凝固反応の機構が解明された［S.Iwanaga
et al.,The hemolymph coagulation system in inverte
brate animals,J.Protein Chem.,5,255−268（198
6）］。この機構によれば、LALの凝固は、エンドトキシ
ンによつて、開始する系（Ｃ因子系）と、（１→３）−
β−Ｄ−グルカン（例えば、カードラン、部分カルボキ
シメチル化（１→３）−β−Ｄ−グルカンなど）によつ
て開始する系（Ｇ因子系）とが存在することが理解され
る。
本発明者等は、先に特定の分子量を有する（１→３）
−β−Ｄ−グルカン構造体は、LALの（１→３）−β−
Ｄ−グルカンによつて反応が開始する系（Ｇ因子系）の
活性化を阻害することを発見し、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセートＧ因子活性化阻害剤として特許出願を
行った（特願昭63−216341号及びWO 90/02951号）。
−β−Ｄ−グルカン構造体は、LALの（１→３）−β−
Ｄ−グルカンによつて反応が開始する系（Ｇ因子系）の
活性化を阻害することを発見し、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセートＧ因子活性化阻害剤として特許出願を
行った（特願昭63−216341号及びWO 90/02951号）。
しかし、エンドトキシンに特異的なLALを得る目的
で、この阻害剤をLALに添加した場合、LAL中には阻害剤
とＧ因子の複合体が残されており、加える検体によつて
は複合体が解離し、遊離したＧ因子がＧ因子活性化物質
によつて活性化される危険性がある。
で、この阻害剤をLALに添加した場合、LAL中には阻害剤
とＧ因子の複合体が残されており、加える検体によつて
は複合体が解離し、遊離したＧ因子がＧ因子活性化物質
によつて活性化される危険性がある。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、LALの凝固機構において、（１→３）−β
−Ｄ−グルカンによつて最初に活性化されるＧ因子を含
まないLALの提供をその目的とするものである。
−Ｄ−グルカンによつて最初に活性化されるＧ因子を含
まないLALの提供をその目的とするものである。
［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明によれば、式［Ｉ］ （式中、ｎは２〜370の数を表す） で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を不
溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、カブ
トガニ・アメボサイト・ライセートを接触させることを
特徴とする、エンドトキシンを特異的に反応する実質的
にＧ因子を含まないカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートの調製法を要旨とするものである。
溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、カブ
トガニ・アメボサイト・ライセートを接触させることを
特徴とする、エンドトキシンを特異的に反応する実質的
にＧ因子を含まないカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートの調製法を要旨とするものである。
本発明において使用される（１→３）−β−Ｄ−グル
コシド構造体は、下記式 で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位
（分子量:162）が連続して２〜370個、好ましくは３〜3
10個、より好ましくは４〜180個結合したポリ−（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分［以下、ポリ（１→
３）グルコシド構造部分という］を１分子中に少なくと
も１つ含有するポリグリコシドである。
コシド構造体は、下記式 で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位
（分子量:162）が連続して２〜370個、好ましくは３〜3
10個、より好ましくは４〜180個結合したポリ−（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分［以下、ポリ（１→
３）グルコシド構造部分という］を１分子中に少なくと
も１つ含有するポリグリコシドである。
かくして、本発明で使用されるポリグリコシドは、ポ
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有することが必要である。例えば、本発明で使
用されるポリグリコシドは、実質的に１つのポリ（１→
３）グルコシド構造部分からなるもの、例えば下記式 式中、 ｎは２〜370、好ましくは３〜310、より好ましくは４〜
180の整数である、 で示されるポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシドであ
ることができ、また１つのポリ（１→３）グルコシド構
造部分に、下記式 で示される（１→４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上又は下記式 で示される（１→６）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上又は下記式 式（IV）、（Ｖ）、（VI）中、 R1、R2及びR3の少くとも１つはメチル基のようなアルキ
ル基、ヒドロキシメチル基などのヒドロキシアルキル
基；カルボキシメチル基などのカルボキシアルキル基；
アセチル基、硫酸基、リン酸基、アリル基等の化学的に
導入しうる基およびそれらの金属塩、アンモニウム塩及
び有機アミン塩から選ばれる残基を表わし、そして残り
は水素原子を表わす、 で示される修飾されたβ−Ｄ−グルコシド構造単位の１
つもしくはそれ以上から構成される糖鎖が結合した［こ
の糖鎖は前記ポリ（１→３）グルコシド構造部分に分岐
鎖として結合していてもよい］構造のものであつてもよ
い。
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有することが必要である。例えば、本発明で使
用されるポリグリコシドは、実質的に１つのポリ（１→
３）グルコシド構造部分からなるもの、例えば下記式 式中、 ｎは２〜370、好ましくは３〜310、より好ましくは４〜
180の整数である、 で示されるポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシドであ
ることができ、また１つのポリ（１→３）グルコシド構
造部分に、下記式 で示される（１→４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上又は下記式 で示される（１→６）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上又は下記式 式（IV）、（Ｖ）、（VI）中、 R1、R2及びR3の少くとも１つはメチル基のようなアルキ
ル基、ヒドロキシメチル基などのヒドロキシアルキル
基；カルボキシメチル基などのカルボキシアルキル基；
アセチル基、硫酸基、リン酸基、アリル基等の化学的に
導入しうる基およびそれらの金属塩、アンモニウム塩及
び有機アミン塩から選ばれる残基を表わし、そして残り
は水素原子を表わす、 で示される修飾されたβ−Ｄ−グルコシド構造単位の１
つもしくはそれ以上から構成される糖鎖が結合した［こ
の糖鎖は前記ポリ（１→３）グルコシド構造部分に分岐
鎖として結合していてもよい］構造のものであつてもよ
い。
さらにまた、本発明で使用するポリグリコシドは、２
つ又はそれ以上の前記ポリ（１→３）グルコシド構造部
分が、他の糖鎖構造部分を狹んで下記式 A1−B1−A2−B2−・・・・・・・ 式中、 A1、A2、・・・・・はそれぞれ前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位が連続して２
〜370個、好ましくは３〜310個、より好ましくは４〜18
0個結合したポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構
造部分を表わし、A1、A2、・・・・・の各構造部分を構
成する式（Ｉ）の単位の数は互に異なっていてもよく、
そしてB1、B2、・・・・・は各々同一もしくは相異なる
他の糖鎖構造部分を表わす、 で示されるように連結した構造のものであつてもよい。
ここで、B1、B2、・・・・・によつて表わされる他の糖
鎖構造部分としては、例えば前記式（II）、（III）、
（IV）、（Ｖ）又は（VI）で示される構造単位の１個又
は２個以上のブロツクからなる構造部分が挙げられる。
つ又はそれ以上の前記ポリ（１→３）グルコシド構造部
分が、他の糖鎖構造部分を狹んで下記式 A1−B1−A2−B2−・・・・・・・ 式中、 A1、A2、・・・・・はそれぞれ前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位が連続して２
〜370個、好ましくは３〜310個、より好ましくは４〜18
0個結合したポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構
造部分を表わし、A1、A2、・・・・・の各構造部分を構
成する式（Ｉ）の単位の数は互に異なっていてもよく、
そしてB1、B2、・・・・・は各々同一もしくは相異なる
他の糖鎖構造部分を表わす、 で示されるように連結した構造のものであつてもよい。
ここで、B1、B2、・・・・・によつて表わされる他の糖
鎖構造部分としては、例えば前記式（II）、（III）、
（IV）、（Ｖ）又は（VI）で示される構造単位の１個又
は２個以上のブロツクからなる構造部分が挙げられる。
さらにまた、本発明で使用するポリグリコシドは、前
記ポリ（１→３）グルコシド構造部分が、上記B1、B2、
・・・・・によつて表わされる如き他の糖鎖構造を狹ん
で前記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコ
シド構造単位が連続して371個以上結合した長鎖のポリ
−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分が連結した
構造のものであつてもよい。
記ポリ（１→３）グルコシド構造部分が、上記B1、B2、
・・・・・によつて表わされる如き他の糖鎖構造を狹ん
で前記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコ
シド構造単位が連続して371個以上結合した長鎖のポリ
−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分が連結した
構造のものであつてもよい。
従つて、本発明で使用されるポリグリコシドは前記ポ
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有するものであることを必須とするものであつ
て、その分子量は特に制約されるものではない。
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有するものであることを必須とするものであつ
て、その分子量は特に制約されるものではない。
また、本発明で使用されるポリグリコシドは前記のポ
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有するものから実質的になることが好ましい
が、しかし必ずしもそうである必要はなく、例えば、前
記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド
構造単位が連続して371個以上結合した高分子量のポリ
−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分を含有する
他のポリグリコシドが混在していてもよい。何んとなれ
ば、本発明によるポリグリコシドは、LALのＧ因子活性
化系の開始因子であるＧ因子に、Ｇ因子活性化物質であ
る高分子量のポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシドよ
りも速く強く結合して活性型Ｇ因子への活性化を阻害
し、かかる高分子量のポリ−（１→３）−β−Ｄ−グル
コシドの存在によってその阻害作用に実質的な影響がな
いからである。
リ（１→３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくと
も１つ含有するものから実質的になることが好ましい
が、しかし必ずしもそうである必要はなく、例えば、前
記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド
構造単位が連続して371個以上結合した高分子量のポリ
−（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分を含有する
他のポリグリコシドが混在していてもよい。何んとなれ
ば、本発明によるポリグリコシドは、LALのＧ因子活性
化系の開始因子であるＧ因子に、Ｇ因子活性化物質であ
る高分子量のポリ−（１→３）−β−Ｄ−グルコシドよ
りも速く強く結合して活性型Ｇ因子への活性化を阻害
し、かかる高分子量のポリ−（１→３）−β−Ｄ−グル
コシドの存在によってその阻害作用に実質的な影響がな
いからである。
なお、本明細書においてポリグリコシドの分子量は、
分子量既知の標準物質を用いて下記の条件でゲルパーミ
エイションクロマトグラフィーを行ない標準曲線を作成
し、次に供試試料について同じ条件でクロマトグラフィ
ーを行ない、その結果を標準曲線と対比することにより
求めた値である。
分子量既知の標準物質を用いて下記の条件でゲルパーミ
エイションクロマトグラフィーを行ない標準曲線を作成
し、次に供試試料について同じ条件でクロマトグラフィ
ーを行ない、その結果を標準曲線と対比することにより
求めた値である。
カラム:TSKgel G−PWXLシリーズ（東ソ−株式会社）7.8
×300mm数種数本 移動相:0.3MNaOH 流 速:0.5ml/min 試料溶液濃度:0.1−5mg/ml 試料溶液注入量:0.1ml カラム温度：室温 検出法：示差屈折計（LKB社）による測定又はフエノー
ル硫酸法による糖定量 標準物質:TSK標準ポリエチレンオキシド（東ソ−株式会
社）およびポリエチレングリコール（半井化学薬品株式
会社）の重量平均分子量が1,000から860,000の10種を使
用。
×300mm数種数本 移動相:0.3MNaOH 流 速:0.5ml/min 試料溶液濃度:0.1−5mg/ml 試料溶液注入量:0.1ml カラム温度：室温 検出法：示差屈折計（LKB社）による測定又はフエノー
ル硫酸法による糖定量 標準物質:TSK標準ポリエチレンオキシド（東ソ−株式会
社）およびポリエチレングリコール（半井化学薬品株式
会社）の重量平均分子量が1,000から860,000の10種を使
用。
本発明において用いられる上記の如き特性をもつポリ
グリコシドは、天然に由来するものであってもよく、或
いは合成されたもの又は前記式（Ｉ）で示される（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位を３個以上含有する
ポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシドの一部を化学的に
修飾したものであつてもよい。通常は天然に由来するも
のの方が入手容易である。そのようなポリグリコシドの
具体例としては以下に記載するものが挙げられる。
グリコシドは、天然に由来するものであってもよく、或
いは合成されたもの又は前記式（Ｉ）で示される（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位を３個以上含有する
ポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシドの一部を化学的に
修飾したものであつてもよい。通常は天然に由来するも
のの方が入手容易である。そのようなポリグリコシドの
具体例としては以下に記載するものが挙げられる。
（１） 前記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−
グルコシド構造単位のみから実質的になる実質的に直鎖
状のポリグルコシド：例えば、アルカリゲネス属（Alca
ligenes）バクテリア由来の（１→３）−β−Ｄ−グル
カン；鞭毛藻（Euglena）由来のパラミロン；高等植物
の繊維組織のβ−グルカン又は篩管から抽出されるカロ
ース；上記（１→３）−β−Ｄ−グルカンやLaminaria
（コンブ属）、Eisenia（アラメ属）等の褐藻類由来の
ラミナラン類等の部分水解物中に含まれる高重合度の
（１→３）−β−結合からなるＤ−グルコース重合体；
ラミナリデキストリン（重合度10〜20のもの）、ラミナ
リオリゴ糖（重合度10以下のもの）、等。
グルコシド構造単位のみから実質的になる実質的に直鎖
状のポリグルコシド：例えば、アルカリゲネス属（Alca
ligenes）バクテリア由来の（１→３）−β−Ｄ−グル
カン；鞭毛藻（Euglena）由来のパラミロン；高等植物
の繊維組織のβ−グルカン又は篩管から抽出されるカロ
ース；上記（１→３）−β−Ｄ−グルカンやLaminaria
（コンブ属）、Eisenia（アラメ属）等の褐藻類由来の
ラミナラン類等の部分水解物中に含まれる高重合度の
（１→３）−β−結合からなるＤ−グルコース重合体；
ラミナリデキストリン（重合度10〜20のもの）、ラミナ
リオリゴ糖（重合度10以下のもの）、等。
（２） 前記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−
グルコシド構造単位と前記式（III）で示される（１→
６）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者を含有するポ
リグリコシド：例えば、 ａ）（１→３）−β−結合からなる主鎖に１〜数個の
（１→６）−β−結合で連鎖したグルコース又はグルコ
ース重合体が組込まれたもの、例えば、Eisenia（アラ
メ属）褐藻類由来のラミナラン類。
グルコシド構造単位と前記式（III）で示される（１→
６）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者を含有するポ
リグリコシド：例えば、 ａ）（１→３）−β−結合からなる主鎖に１〜数個の
（１→６）−β−結合で連鎖したグルコース又はグルコ
ース重合体が組込まれたもの、例えば、Eisenia（アラ
メ属）褐藻類由来のラミナラン類。
ｂ）上記ａ）の（１→３）−β−結合で連鎖したグルコ
ース又はグルコース重合体にさらに（１→３）−β−結
合の糖鎖が（１→６）−β−結合で分岐し、また特に糖
鎖の一部に他の糖部分を含みうるもの、例えば、Lamina
ria（コンブ属）褐藻類由来のラミナラン類、Ochromona
s、Phaeodactylum、Skeletonema、Biddulphia、Coscino
discus、Chaetoceros等の珪藻由来のクリソラミナラン
類、Poria（ブクリヨウ菌）由来のパキマン等。
ース又はグルコース重合体にさらに（１→３）−β−結
合の糖鎖が（１→６）−β−結合で分岐し、また特に糖
鎖の一部に他の糖部分を含みうるもの、例えば、Lamina
ria（コンブ属）褐藻類由来のラミナラン類、Ochromona
s、Phaeodactylum、Skeletonema、Biddulphia、Coscino
discus、Chaetoceros等の珪藻由来のクリソラミナラン
類、Poria（ブクリヨウ菌）由来のパキマン等。
ｃ）さらに多くの分岐をもち、樹状構造を有する子嚢
菌、担子菌、および藻菌類の細胞壁を形成するβ−グル
カン、例えばPhytophthoraの細胞壁由来のグルカン、
等。
菌、担子菌、および藻菌類の細胞壁を形成するβ−グル
カン、例えばPhytophthoraの細胞壁由来のグルカン、
等。
ｄ）（１→３）−β−結合よりなる直鎖状グルカンに
（１→６）−β−結合でグルコースが連結しているも
の、例えばグルコース単位３残基当り１残基の割合で分
岐のあるSclerotinia由来のスクレロタン、Schizophyll
um（スエヒロタケ）のシゾフイラン、Grifola frondosa
（マイタケ）由来のグリフオランLE、Sclerotium、Cort
icium、Stromatinia等に由来するスクレログルカン類
等。また、（１→３）−β−結合よりなる直鎖状グルカ
ンのグルコース単位５残基当り２残基の割合で（１→
６）−β−結合でグルコースが結合しているもの、例え
ば、Lentinus（シイタケ）のレンチナン、等。
（１→６）−β−結合でグルコースが連結しているも
の、例えばグルコース単位３残基当り１残基の割合で分
岐のあるSclerotinia由来のスクレロタン、Schizophyll
um（スエヒロタケ）のシゾフイラン、Grifola frondosa
（マイタケ）由来のグリフオランLE、Sclerotium、Cort
icium、Stromatinia等に由来するスクレログルカン類
等。また、（１→３）−β−結合よりなる直鎖状グルカ
ンのグルコース単位５残基当り２残基の割合で（１→
６）−β−結合でグルコースが結合しているもの、例え
ば、Lentinus（シイタケ）のレンチナン、等。
ｅ）（１→６）−β−結合よりなる直鎖状グルカンのグ
ルコースのＣ−３位から（１→３）−β−結合でグルコ
ース鎖が複数分岐しているもの、例えば、Saccharomyce
s（パン酵母）の細胞壁由来のβ−グルカン、等。
ルコースのＣ−３位から（１→３）−β−結合でグルコ
ース鎖が複数分岐しているもの、例えば、Saccharomyce
s（パン酵母）の細胞壁由来のβ−グルカン、等。
（３） 前記式（Ｉ）で示される（１→３）−β−Ｄ−
グルコシド構造単位と前記式（II）で示される（１→
４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者を含有するポ
リグリコシド：例えば、Cetraria、Usnea、Evernia等に
由来するリヒエナン類、オオムギ胚乳中に含まれるβ−
グルカン。
グルコシド構造単位と前記式（II）で示される（１→
４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者を含有するポ
リグリコシド：例えば、Cetraria、Usnea、Evernia等に
由来するリヒエナン類、オオムギ胚乳中に含まれるβ−
グルカン。
以上に述べたポリグリコシドの或る種のものは市販品
として入手することができ、それらはそのまま利用する
ことができるが、必要に応じて、糖類を部分的に分解し
及び／又は分別処理に付して、前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位を前記特定量
で含有するポリグリコシドに富む画分を調製し、それを
利用してもよい。
として入手することができ、それらはそのまま利用する
ことができるが、必要に応じて、糖類を部分的に分解し
及び／又は分別処理に付して、前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位を前記特定量
で含有するポリグリコシドに富む画分を調製し、それを
利用してもよい。
かかる糖鎖の部分的分解及び分別処理はそれ自体既知
の方法で行なうことができる。例えば、糖鎖の部分分解
は酸またはアルカリ、β−グルカナーゼを用いる加水分
解、加酢分解、音波処理等により行うことができる。ま
た分子量分画は、アルコール、アセトン、エーテル等の
有機溶媒や塩類を用いる分別沈澱法、分子篩剤や分子篩
膜を用いる分画により行うことができる。
の方法で行なうことができる。例えば、糖鎖の部分分解
は酸またはアルカリ、β−グルカナーゼを用いる加水分
解、加酢分解、音波処理等により行うことができる。ま
た分子量分画は、アルコール、アセトン、エーテル等の
有機溶媒や塩類を用いる分別沈澱法、分子篩剤や分子篩
膜を用いる分画により行うことができる。
また、上記（１）〜（３）に例示した如きポリグリコ
シドは、糖鎖の一部を、メチル基のようなアルキル基、
ヒドロキシメチル基のようなヒドロキシアルキル基、カ
ルボキシメチル基の如きカルボキシアルキル基、アセチ
ル基、硫酸基、リン酸基などの酸基、その他の基によつ
て化学的に修飾されていてもよい。それらはそれ自体既
知の方法でかかる基を導入することによつて調製するこ
とができる［例えば、（１）安藤、寺山、西沢、山川
編、生化学研究法Ｉ、284〜303（1967）、朝倉書店、
（２）Whistler,R.L.ed.;Methods in Carbohydrate Che
mistry III,193〜267,271〜331（1964）,Academic Pres
s等参照］。特に、Ｇ因子活性化作用をもつ分子量が約6
0,000以上の（１→３）−β−Ｄ−グルカンは部分的な
化学的修飾によつて、そのポリ−（１→３）−β−Ｄ−
グルコシド構造部分における前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の連続結合数
を370個以下にすることにより、使用できるようにな
る。
シドは、糖鎖の一部を、メチル基のようなアルキル基、
ヒドロキシメチル基のようなヒドロキシアルキル基、カ
ルボキシメチル基の如きカルボキシアルキル基、アセチ
ル基、硫酸基、リン酸基などの酸基、その他の基によつ
て化学的に修飾されていてもよい。それらはそれ自体既
知の方法でかかる基を導入することによつて調製するこ
とができる［例えば、（１）安藤、寺山、西沢、山川
編、生化学研究法Ｉ、284〜303（1967）、朝倉書店、
（２）Whistler,R.L.ed.;Methods in Carbohydrate Che
mistry III,193〜267,271〜331（1964）,Academic Pres
s等参照］。特に、Ｇ因子活性化作用をもつ分子量が約6
0,000以上の（１→３）−β−Ｄ−グルカンは部分的な
化学的修飾によつて、そのポリ−（１→３）−β−Ｄ−
グルコシド構造部分における前記式（Ｉ）で示される
（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の連続結合数
を370個以下にすることにより、使用できるようにな
る。
しかして、本発明において好適に使用しうるポリグリ
コシドの具体例を示せば次のとおりである。
コシドの具体例を示せば次のとおりである。
・分子量342〜1,638のラミナリオリゴ糖、 ・分子量1,800〜3,258のラミナリデキストリン、 ・平均分子量2,000〜60,000（１→３）−β−Ｄ−グル
カン、 ・平均分子量3,000〜23,000のラミナラン、 ・平均分子量3,000〜20,000のスクレロタン、 ・平均分子量500,000以下のシゾフイラン、 ・平均分子量1,100,000以下のレンチナン、 ・平均分子量12,000以下のパン酵母グルカン水可溶物、 ・平均分子量33,000以下のリヒエナン、 ・平均分子量200,000以下の大麦β−グルカン、 ・例えばカードランの部分カルボキシメチル化により得
られる平均分子量40,000〜240,000の部分カルボキシメ
チル化（１→３）−β−Ｄ−グルカンおよびその塩（置
換度:0.003〜1.0）、 ・平均分子量23,000以下の部分カルボキシメチル化ラミ
ナランおよびその塩（置換度:1.0以下）、 ・平均分子量80,000以下の部分メチル化（１→３）−β
−Ｄ−グルカン（置換度:0.003〜1.0）、 ・平均分子量23,000以下の部分硫酸化ラミナランおよび
その塩（置換度:1.0以下）。
カン、 ・平均分子量3,000〜23,000のラミナラン、 ・平均分子量3,000〜20,000のスクレロタン、 ・平均分子量500,000以下のシゾフイラン、 ・平均分子量1,100,000以下のレンチナン、 ・平均分子量12,000以下のパン酵母グルカン水可溶物、 ・平均分子量33,000以下のリヒエナン、 ・平均分子量200,000以下の大麦β−グルカン、 ・例えばカードランの部分カルボキシメチル化により得
られる平均分子量40,000〜240,000の部分カルボキシメ
チル化（１→３）−β−Ｄ−グルカンおよびその塩（置
換度:0.003〜1.0）、 ・平均分子量23,000以下の部分カルボキシメチル化ラミ
ナランおよびその塩（置換度:1.0以下）、 ・平均分子量80,000以下の部分メチル化（１→３）−β
−Ｄ−グルカン（置換度:0.003〜1.0）、 ・平均分子量23,000以下の部分硫酸化ラミナランおよび
その塩（置換度:1.0以下）。
以上に述べたポリ（１→３）グルコシド構造部分を有
する（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を固定化す
るために用いられる不溶性担体としては水酸基やカルバ
モイル基などの親水性の基を有する不溶性担体であれば
何れも使用可能である。これら不溶性担体としてはセル
ロース（例えばセルロースパウダー（アドバンテツク東
洋販売）セルロフアイン（生化学工業販売）、アビセル
（フナコシ薬品販売）、セレツクス（バイオラツド販
売）など）、アガロース（例えばセフアロース（フアル
マシア販売）、バイオゲルＡ（バイオラツド販売）、ク
ロマゲルＡ（同仁化学販売）、サガバツク（セラバツク
ラボラトリーズ販売）、ゲラロース（リテツクス販
売）、Ｐ−Ｌアガロース（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販
売）など）、架橋デキストラン（例えばセフアデツクス
Ｇ、セフアクリル（フアルマシア販売）、Ｐ−Ｌデツク
ス（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売）など）、ポリアクリ
ルアミド（例えばバイオゲルＰ（バイオラツド販売）、
クロマゲルＰ（同仁化学販売）など）、多孔質ガラス
（例えばバイオグラス（バイオラツド販売）など）、親
水性ポリビニル系合成ポリマー（例えばトヨパール（東
ソー販売）など）などが挙げられる。
する（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を固定化す
るために用いられる不溶性担体としては水酸基やカルバ
モイル基などの親水性の基を有する不溶性担体であれば
何れも使用可能である。これら不溶性担体としてはセル
ロース（例えばセルロースパウダー（アドバンテツク東
洋販売）セルロフアイン（生化学工業販売）、アビセル
（フナコシ薬品販売）、セレツクス（バイオラツド販
売）など）、アガロース（例えばセフアロース（フアル
マシア販売）、バイオゲルＡ（バイオラツド販売）、ク
ロマゲルＡ（同仁化学販売）、サガバツク（セラバツク
ラボラトリーズ販売）、ゲラロース（リテツクス販
売）、Ｐ−Ｌアガロース（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販
売）など）、架橋デキストラン（例えばセフアデツクス
Ｇ、セフアクリル（フアルマシア販売）、Ｐ−Ｌデツク
ス（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ販売）など）、ポリアクリ
ルアミド（例えばバイオゲルＰ（バイオラツド販売）、
クロマゲルＰ（同仁化学販売）など）、多孔質ガラス
（例えばバイオグラス（バイオラツド販売）など）、親
水性ポリビニル系合成ポリマー（例えばトヨパール（東
ソー販売）など）などが挙げられる。
これらの不溶性担体に（１→３）−β−Ｄ−グルコシ
ド構造体を固定化するためには不溶性担体を活性化する
必要がある。この方法としては、種々のものがあり、例
えば、水酸基を有する担体に対しては、臭化シアンによ
る方法（R.Axen,J.Porath.,and S.Ernback,Nature,214,
1302（1967））やオキシラン類による方法（J.Porath a
nd N.Fornstedt,J.Chromatogr.,51,479（1970）および
L.Sundberg and J.Porath,J.Chromatogr.,90,87（197
4））、又、カルバモイル基を有する担体に対しては、
アルキルジアミンを用いてアミノアルキルアミン誘導体
とする方法やヒドラジンを用いてヒドラジド誘導体とす
る方法（共に、J.K.Inman and H.M.Dintzis,Biochemist
ry,8,4074（1969））などが挙げられるが、安定でかつ
非特異的吸着の少ない方法としては、エピクロルヒドリ
ンやビスオキシラン類を用いてエポキシ活性化し、得ら
れたエポキシ活性化不溶性担体を更に抱水ヒドラジンあ
るいはジヒドラジド化合物と反応させて得たヒドラジン
誘導体またはヒドラジド誘導体を活性化体として用いる
方法（松本勲武ら、特開昭59−15401）が優れている。
ド構造体を固定化するためには不溶性担体を活性化する
必要がある。この方法としては、種々のものがあり、例
えば、水酸基を有する担体に対しては、臭化シアンによ
る方法（R.Axen,J.Porath.,and S.Ernback,Nature,214,
1302（1967））やオキシラン類による方法（J.Porath a
nd N.Fornstedt,J.Chromatogr.,51,479（1970）および
L.Sundberg and J.Porath,J.Chromatogr.,90,87（197
4））、又、カルバモイル基を有する担体に対しては、
アルキルジアミンを用いてアミノアルキルアミン誘導体
とする方法やヒドラジンを用いてヒドラジド誘導体とす
る方法（共に、J.K.Inman and H.M.Dintzis,Biochemist
ry,8,4074（1969））などが挙げられるが、安定でかつ
非特異的吸着の少ない方法としては、エピクロルヒドリ
ンやビスオキシラン類を用いてエポキシ活性化し、得ら
れたエポキシ活性化不溶性担体を更に抱水ヒドラジンあ
るいはジヒドラジド化合物と反応させて得たヒドラジン
誘導体またはヒドラジド誘導体を活性化体として用いる
方法（松本勲武ら、特開昭59−15401）が優れている。
本発明の調製法において使用するLALとしては、カブ
トガニの血球から抽出されたものでエンドトキシンとの
反応でそのＣ因子系が活性化されるものであれば特に限
定されることなく挙げられる。これには、LALの凍結乾
燥品やLALに合成基質を加えたものの凍結乾燥品などの
市販されているものも挙げることができる。
トガニの血球から抽出されたものでエンドトキシンとの
反応でそのＣ因子系が活性化されるものであれば特に限
定されることなく挙げられる。これには、LALの凍結乾
燥品やLALに合成基質を加えたものの凍結乾燥品などの
市販されているものも挙げることができる。
各種市販のライセートを示せば次のとおりである。プ
レゲル、プレゲル−Ｓ、プレゲル−Ｍ、パイロデイツ
ク、トキシカラー（以上、生化学工業販売）、リムルス
II−テストワコー、リムルスII−シングルテストワコ
ー、リムルスHS II−テストワコー、リムルスHS II−シ
ングルテストワコー、リムルスS II−シングルテストワ
コー、カブトガニ血球抽出物II（凍結乾燥品）、カブト
ガニ血球抽出物−HS II（凍結乾燥品）（以上、和光純
薬販売）、パイロテル（ケープコツド社販売）、パイロ
セート（ヘマケム社販売）、パイロジエント 、パイロ
ジエント プラス、パイロジエント シングルテスト、
パイロジエント マルチテスト、LALシングルテストキ
ツト、QCL−1000、カイネテイツクQCLTM（以上、ウィッ
テーカー・バイオプロダクツ社販売）、コーテスト エ
ンドトキシン（カビービトラム社販売）。
レゲル、プレゲル−Ｓ、プレゲル−Ｍ、パイロデイツ
ク、トキシカラー（以上、生化学工業販売）、リムルス
II−テストワコー、リムルスII−シングルテストワコ
ー、リムルスHS II−テストワコー、リムルスHS II−シ
ングルテストワコー、リムルスS II−シングルテストワ
コー、カブトガニ血球抽出物II（凍結乾燥品）、カブト
ガニ血球抽出物−HS II（凍結乾燥品）（以上、和光純
薬販売）、パイロテル（ケープコツド社販売）、パイロ
セート（ヘマケム社販売）、パイロジエント 、パイロ
ジエント プラス、パイロジエント シングルテスト、
パイロジエント マルチテスト、LALシングルテストキ
ツト、QCL−1000、カイネテイツクQCLTM（以上、ウィッ
テーカー・バイオプロダクツ社販売）、コーテスト エ
ンドトキシン（カビービトラム社販売）。
以下、本発明に使用する（１→３）−β−Ｄ−グルコ
シド構造体の調製法についてさらに詳細に説明する。
シド構造体の調製法についてさらに詳細に説明する。
本発明に使用する（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構
造体は、例えば、以下の調製例に示す方法により調製で
きる。また、市販品の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの
うち、本発明の範囲にあるものは、そのまま使用するこ
とが出来る。
造体は、例えば、以下の調製例に示す方法により調製で
きる。また、市販品の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの
うち、本発明の範囲にあるものは、そのまま使用するこ
とが出来る。
調製例1:市販カードランからの分子篩クロマト分画によ
る調製 カードラン（和光純薬工業、試薬、Lot No.PEQ 908
0、Mn＞136,000、Mw/Mn＞2.76）試料No.101の1gを0.3MN
aOHに5mg/mlの濃度に溶解して、100μづつ、室温下、
以下の条件下でゲルパーミエイシヨンクロマトグラフイ
ー（以下GPC）を行なった。｛カラム:TSKgelG6000PWXL
とG5000PWXL（ともに7.8×300mm）とを直列に連結、移
動相:0.3MNaOH、流速:0.5ml/min｝。溶出してきた低分
子画分（No.44〜46）を採取し、再クラマトグラフイー
にかけ、数平均分子量が3,050、多分散度が1.29の試料
0.015mgを得た（試料No.1）。上記GPC分画パターンを添
付の第２図に示す。更に第２図中No.44〜46画分を再ク
ロマトした分画パターンを添付の第３図に示す。
る調製 カードラン（和光純薬工業、試薬、Lot No.PEQ 908
0、Mn＞136,000、Mw/Mn＞2.76）試料No.101の1gを0.3MN
aOHに5mg/mlの濃度に溶解して、100μづつ、室温下、
以下の条件下でゲルパーミエイシヨンクロマトグラフイ
ー（以下GPC）を行なった。｛カラム:TSKgelG6000PWXL
とG5000PWXL（ともに7.8×300mm）とを直列に連結、移
動相:0.3MNaOH、流速:0.5ml/min｝。溶出してきた低分
子画分（No.44〜46）を採取し、再クラマトグラフイー
にかけ、数平均分子量が3,050、多分散度が1.29の試料
0.015mgを得た（試料No.1）。上記GPC分画パターンを添
付の第２図に示す。更に第２図中No.44〜46画分を再ク
ロマトした分画パターンを添付の第３図に示す。
本試料No.1をβ−1,3−グルカナーゼ（ザイモリエイ
ス−100T、生化学工業製）で消化し、該酵素消化液をGP
C（カラム:TSKgelG4000PWXL、G3000PWXL、G2500PWXL直
列；移動相：蒸留水、流速:0.6ml/min）で分析し、酵素
消化液中の糖組成（グルコース40％、ラミナリビオース
30％、ラミナリトリオース20％、ラミナリテトラオース
８％、ラミナリペンタオース２％、回収率94％）が確認
出来た。このことから本試料（No.1）の糖構造は（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分を含有するβ−ポリ
グルコシドであることがわかる。
ス−100T、生化学工業製）で消化し、該酵素消化液をGP
C（カラム:TSKgelG4000PWXL、G3000PWXL、G2500PWXL直
列；移動相：蒸留水、流速:0.6ml/min）で分析し、酵素
消化液中の糖組成（グルコース40％、ラミナリビオース
30％、ラミナリトリオース20％、ラミナリテトラオース
８％、ラミナリペンタオース２％、回収率94％）が確認
出来た。このことから本試料（No.1）の糖構造は（１→
３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分を含有するβ−ポリ
グルコシドであることがわかる。
調製例2:カードランの水に対する溶解度差による分画 市販カードラン（試料No.101）50gを蒸留水に懸濁
し、下記のフローシートに示す操作により分画を行っ
た。
し、下記のフローシートに示す操作により分画を行っ
た。
調製例3:カードラン水不溶性糖画分のギ酸分解による調
製 試料No.102の45gをK.Ogawaらの方法［Carbohydr.Re
s.,29,397〜403（1973）］によりギ酸分解を行った。操
作内容を下記のフローシートに示す。
製 試料No.102の45gをK.Ogawaらの方法［Carbohydr.Re
s.,29,397〜403（1973）］によりギ酸分解を行った。操
作内容を下記のフローシートに示す。
調製例４−1:カードランギ酸分解物水可溶性画分の分子
篩による再分画 先に示した調製例３で得た水可溶性画分（試料No.3）
0.15gを蒸留水30mlに溶解しGPC（カラム:TSK gelG3000P
WxL×２、G2500PWxL×１、移動相：蒸留水、流速0.5ml/
min）により各0.5ml宛分画採取し、再クロマトにより分
子量の異なる６種の試料（No.11〜16）を得た。
篩による再分画 先に示した調製例３で得た水可溶性画分（試料No.3）
0.15gを蒸留水30mlに溶解しGPC（カラム:TSK gelG3000P
WxL×２、G2500PWxL×１、移動相：蒸留水、流速0.5ml/
min）により各0.5ml宛分画採取し、再クロマトにより分
子量の異なる６種の試料（No.11〜16）を得た。
調製例４−2:カードランギ酸分解物水不溶性画分の分子
篩による再分画 調製例３で得た水不溶性画分（試料No.4）の0.2gを40
mlの0.3MNaOH溶液に溶解し、GPC（カラム:TSK gel G300
0PWXL×２、G2500PWXL×１、移動相:0.3MNaOH溶液、流
速0.5ml/min）を用い上記調製例４−１と同様の操作に
て分画、再クロマトを行い溶出液に0.3MHCl溶液を加え
て中和し、分子量の異なる２種の試料（No.17及び18）
を得た。
篩による再分画 調製例３で得た水不溶性画分（試料No.4）の0.2gを40
mlの0.3MNaOH溶液に溶解し、GPC（カラム:TSK gel G300
0PWXL×２、G2500PWXL×１、移動相:0.3MNaOH溶液、流
速0.5ml/min）を用い上記調製例４−１と同様の操作に
て分画、再クロマトを行い溶出液に0.3MHCl溶液を加え
て中和し、分子量の異なる２種の試料（No.17及び18）
を得た。
調製例5:カードラン水不溶性画分からの音波処理による
試料の調製 試料No.102の1gを約100mlの5mM NaOH溶液に懸濁し、
氷冷下音波発生機、ソニケーターTM（大岳製作所、型式
5202PZT、東京）により20KHz、80Wで12分間音波処理に
より低分子化を行った。
試料の調製 試料No.102の1gを約100mlの5mM NaOH溶液に懸濁し、
氷冷下音波発生機、ソニケーターTM（大岳製作所、型式
5202PZT、東京）により20KHz、80Wで12分間音波処理に
より低分子化を行った。
処理液を5M NaOHを用い、最終0.3M NaOH溶液とし、上
記調製剤４−２に準じクラマト分画を行い分子量の異な
る８種類の試料（No.19〜22及び103〜106）を得た。
記調製剤４−２に準じクラマト分画を行い分子量の異な
る８種類の試料（No.19〜22及び103〜106）を得た。
調製例６−1:海藻由来の阻害物質の調製（Ｉ） アラメ（Eisenia bicyclis）由来の試料は、T.Usuiら
Agric.Biol.Chem.43、603〜611（1979）の方法に従い市
販アラメ乾燥藻体（東京、吹田商店）100gを粉砕後、80
％エタノールにより低分子可溶画分を抽出除去し、残渣
から、２％CaCl2水溶液を用いラミナラン画分を抽出す
る。次いで該抽出液にエタノール95％を用い終濃度75％
溶液とし、生じた沈澱を遠沈により集め、エタノール洗
浄後、粗ラミナラン試料を得る。該粗試料を蒸留水に再
溶解し、陰イオン交換体（DEAE−トヨパール）により夾
雑する酸性物質（アルギン酸等）及び色素類を除き、エ
タノール再沈澱から試料No.25を得た。
Agric.Biol.Chem.43、603〜611（1979）の方法に従い市
販アラメ乾燥藻体（東京、吹田商店）100gを粉砕後、80
％エタノールにより低分子可溶画分を抽出除去し、残渣
から、２％CaCl2水溶液を用いラミナラン画分を抽出す
る。次いで該抽出液にエタノール95％を用い終濃度75％
溶液とし、生じた沈澱を遠沈により集め、エタノール洗
浄後、粗ラミナラン試料を得る。該粗試料を蒸留水に再
溶解し、陰イオン交換体（DEAE−トヨパール）により夾
雑する酸性物質（アルギン酸等）及び色素類を除き、エ
タノール再沈澱から試料No.25を得た。
調製例６−2:海藻由来の阻害物質の調製（II） マコンブLaminaria japonica由来の試料はJ.J.Connel
lら、J.Chem.Soc.,3494（1950）の方法に従い、市販マ
コンブ乾燥藻体（東京、吹田商店）100gを粉砕後、0.09
M HCl溶液にて約３日間静置抽出し、不溶物を濾別し、
濾液を更に１日静置し、生ずる少量の沈澱を遠心分離に
より除去し、上清に３倍容のエタノールを加え、約75％
溶液とし、生ずる沈澱を遠沈により集め、アルコール洗
浄、乾燥後水溶性ラミナラン画分（試料No.27）を得
た。
lら、J.Chem.Soc.,3494（1950）の方法に従い、市販マ
コンブ乾燥藻体（東京、吹田商店）100gを粉砕後、0.09
M HCl溶液にて約３日間静置抽出し、不溶物を濾別し、
濾液を更に１日静置し、生ずる少量の沈澱を遠心分離に
より除去し、上清に３倍容のエタノールを加え、約75％
溶液とし、生ずる沈澱を遠沈により集め、アルコール洗
浄、乾燥後水溶性ラミナラン画分（試料No.27）を得
た。
調製例７−1:真菌由来の阻害物質の調製（Ｉ） 真菌Sclerotinia libertiana（ナタネ菌核病菌）由来
の試料スクレロタンは、北原ら、岐大農報 ８、100〜1
05（1957）の方法に従ってSclerotinia libertianaの菌
核の脱脂乾燥粉末（30g）を水で充分に抽出して得た残
渣を７％NaOH溶液で抽出し、抽出液に10％CuSO4溶液を
加えて沈澱させ、これを濾別して塩酸酸性メタノールで
洗浄して銅を除き、80％メタノールで洗浄してHClを除
き、メタノール、エーテルで洗浄乾燥することを３回繰
返して精製し、6gの試料No.28を得た。
の試料スクレロタンは、北原ら、岐大農報 ８、100〜1
05（1957）の方法に従ってSclerotinia libertianaの菌
核の脱脂乾燥粉末（30g）を水で充分に抽出して得た残
渣を７％NaOH溶液で抽出し、抽出液に10％CuSO4溶液を
加えて沈澱させ、これを濾別して塩酸酸性メタノールで
洗浄して銅を除き、80％メタノールで洗浄してHClを除
き、メタノール、エーテルで洗浄乾燥することを３回繰
返して精製し、6gの試料No.28を得た。
調製例７−2:真菌由来の阻害物質の調製（II） 真菌Schizophyllum commune:スエヒロタメ由来の試料
は、市販シゾフイラン（科研製薬：商品名ソニフイラ
ン、医薬品:Lot No.J61040）をK.Tabataら、Carbohydr.
Res.,89 121〜135（1981）の方法に従い前記調製例５の
操作に準じ、水溶液中10時間音波処理後、アルカリ条件
下分子篩分画により分子量の異なる３種類の試料（No2
9、30、31）を得た。
は、市販シゾフイラン（科研製薬：商品名ソニフイラ
ン、医薬品:Lot No.J61040）をK.Tabataら、Carbohydr.
Res.,89 121〜135（1981）の方法に従い前記調製例５の
操作に準じ、水溶液中10時間音波処理後、アルカリ条件
下分子篩分画により分子量の異なる３種類の試料（No2
9、30、31）を得た。
調製例７−3:真菌由来の阻害物質の調製（III） 酵母Saccharomyces cerevisiae:パン酵母由来のβ−
グルカン試料は、市販パン酵母グルカン（シグマ社Lot
No.56F−4027）90mgに蒸留水50mlを加え、室温で２時間
撹拌後、遠心分離し、上清約50mlを、減圧濃縮により1m
lとし不溶物を再度遠心除去し、上清から0.64mgの試料
（No.33）を得た。
グルカン試料は、市販パン酵母グルカン（シグマ社Lot
No.56F−4027）90mgに蒸留水50mlを加え、室温で２時間
撹拌後、遠心分離し、上清約50mlを、減圧濃縮により1m
lとし不溶物を再度遠心除去し、上清から0.64mgの試料
（No.33）を得た。
調製例8:大麦β−グルカン由来の試料の調製 市販大麦β−グルカン（シグマ社、Lot No.56F−065
2）を0.3M NaOHにより5mg/mlの溶液とし、前記調製例４
−２に準じアルカリ条件下、分子篩分画により分子量分
布の狭いβ−グルカン試料（No.36）を得た。
2）を0.3M NaOHにより5mg/mlの溶液とし、前記調製例４
−２に準じアルカリ条件下、分子篩分画により分子量分
布の狭いβ−グルカン試料（No.36）を得た。
また、上記市販の大麦β−グルカンを5mg/mlの濃度に
て熱水に溶解し、その遠心（3,500rpm、10分）上清を前
記調製例４−１に準じて蒸留水を移動相として100μ
づつ50回GPC分画採取し、更に同条件下にて再分画採取
して分子量の異なる２種の試料（試料No.37、38）を得
た。
て熱水に溶解し、その遠心（3,500rpm、10分）上清を前
記調製例４−１に準じて蒸留水を移動相として100μ
づつ50回GPC分画採取し、更に同条件下にて再分画採取
して分子量の異なる２種の試料（試料No.37、38）を得
た。
調製例9:部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ−
グルカン（置換度DS＝0.63）の調製 調製例２に準じて得たカードラン水不溶物をA.E.Clar
ke and B.A.Stone:Phytochemistry １,175〜188（196
2）の方法に準じて、カルボキシメチル化した。即ち、1
00gのカードラン水不溶物を窒素気流下０℃で１の5M
NaOH溶液に溶解し、これを撹拌しながら236gのモノク
ロル酢酸を200mlの水に溶解したものを滴下して加え、
添加後、60〜65℃で２時間撹拌した。生ずるゲルを2.5
倍容のエタノール中で強く撹拌し細粉化し濾過した。70
％のエタノールで充分洗滌してからエタノール、エーテ
ル、エーテルで洗滌し乾燥した。このものを水７に溶
解し、1M酢酸で中和し、活性炭40gを加え、室温で１時
間撹拌し、濾過する。濾液を減圧濃縮して１とし、３
倍容のエタノールを加えて沈澱とし、エタノール、エー
テルで洗滌し、濃硫酸上減圧乾燥し、113.85gを得た。
グルカン（置換度DS＝0.63）の調製 調製例２に準じて得たカードラン水不溶物をA.E.Clar
ke and B.A.Stone:Phytochemistry １,175〜188（196
2）の方法に準じて、カルボキシメチル化した。即ち、1
00gのカードラン水不溶物を窒素気流下０℃で１の5M
NaOH溶液に溶解し、これを撹拌しながら236gのモノク
ロル酢酸を200mlの水に溶解したものを滴下して加え、
添加後、60〜65℃で２時間撹拌した。生ずるゲルを2.5
倍容のエタノール中で強く撹拌し細粉化し濾過した。70
％のエタノールで充分洗滌してからエタノール、エーテ
ル、エーテルで洗滌し乾燥した。このものを水７に溶
解し、1M酢酸で中和し、活性炭40gを加え、室温で１時
間撹拌し、濾過する。濾液を減圧濃縮して１とし、３
倍容のエタノールを加えて沈澱とし、エタノール、エー
テルで洗滌し、濃硫酸上減圧乾燥し、113.85gを得た。
得られた部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ
−グルカンは、D.F.Dursoらの硝酸ウラニル法［Methods
in Carbobydrate Chem.VIII,127−129（1980）参照に
従って測定するとエーテル化度（置換度:Degree of Sub
stitution:DS）は0.63であつた。これは糖鎖を形成して
いるグルコース残基１個当りの置換し得る水酸基３個の
うちの0.63個が置換されたことを意味するものである。
−グルカンは、D.F.Dursoらの硝酸ウラニル法［Methods
in Carbobydrate Chem.VIII,127−129（1980）参照に
従って測定するとエーテル化度（置換度:Degree of Sub
stitution:DS）は0.63であつた。これは糖鎖を形成して
いるグルコース残基１個当りの置換し得る水酸基３個の
うちの0.63個が置換されたことを意味するものである。
得られた部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ
−グルカンの25mgを5mlの0.1M酢酸アンモニウム水溶液
に溶解し、GPC（カラム：トヨパールHW65F、５×100cm;
移動相:0.1M酢酸アンモニウム水溶液；流速:5.8ml/mi
n）により分画採取し、別のカラムを用いたGPC（カラ
ム:TSKgelG6000PWXL＋G5000PWXL＋G3000PWXLの直列に使
用；移動相:0.1M酢酸アンモニウム水溶液；流速:0.6ml/
min）により再分画採取し、分子量分布の狭い試料No.41
（Mn＝231,000）を得た。
−グルカンの25mgを5mlの0.1M酢酸アンモニウム水溶液
に溶解し、GPC（カラム：トヨパールHW65F、５×100cm;
移動相:0.1M酢酸アンモニウム水溶液；流速:5.8ml/mi
n）により分画採取し、別のカラムを用いたGPC（カラ
ム:TSKgelG6000PWXL＋G5000PWXL＋G3000PWXLの直列に使
用；移動相:0.1M酢酸アンモニウム水溶液；流速:0.6ml/
min）により再分画採取し、分子量分布の狭い試料No.41
（Mn＝231,000）を得た。
また、部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ−
グルカンの0.3gを蒸留水30mlに溶解し、音波処理（9kH
z、180〜130W、１時間、音波発生機として久保田製作
所、Insonat or Model 201M使用）により低分子化した
後、そのうち4.5mlに0.5mlの1M酢酸アンモニウム水溶液
を加えて混和後、上記の試料No.41を得るための操作と
同様な操作にて、GPC分画採取およびGPC再分画採取を行
い、分子量の異なる２種の試料（No.39、40）を得た。
グルカンの0.3gを蒸留水30mlに溶解し、音波処理（9kH
z、180〜130W、１時間、音波発生機として久保田製作
所、Insonat or Model 201M使用）により低分子化した
後、そのうち4.5mlに0.5mlの1M酢酸アンモニウム水溶液
を加えて混和後、上記の試料No.41を得るための操作と
同様な操作にて、GPC分画採取およびGPC再分画採取を行
い、分子量の異なる２種の試料（No.39、40）を得た。
調製例10:置換度1.2の部分カルボキシメチル化（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの調製 調製例９によつて得られた置換度（DS）0.63のカルボ
キシメチル化（１→３）−β−Ｄ−グルカン10gを窒素
気流下０℃で25mlの10.5M NaOH溶液に加えてペースト
とし、よく撹拌しながら、それにモノクロル酢酸水溶液
（10g/12ml）を加え、60℃に加温し、４時間撹拌し、冷
却してから2M HCl溶液30mlを加え、次いで200mlの塩酸
酸性エタノール（40ml HCl/エタノール）中に注いで生
ずる沈澱を集め、70％エタノールで洗滌後、エタノー
ル、エーテルで洗滌し、減圧乾燥し、試料No.107の標品
を得た。
３）−β−Ｄ−グルカンの調製 調製例９によつて得られた置換度（DS）0.63のカルボ
キシメチル化（１→３）−β−Ｄ−グルカン10gを窒素
気流下０℃で25mlの10.5M NaOH溶液に加えてペースト
とし、よく撹拌しながら、それにモノクロル酢酸水溶液
（10g/12ml）を加え、60℃に加温し、４時間撹拌し、冷
却してから2M HCl溶液30mlを加え、次いで200mlの塩酸
酸性エタノール（40ml HCl/エタノール）中に注いで生
ずる沈澱を集め、70％エタノールで洗滌後、エタノー
ル、エーテルで洗滌し、減圧乾燥し、試料No.107の標品
を得た。
調製例９に示したDS＝0.63の部分カルボキシメチル化
（１→３）−β−Ｄ−グルカンと同様の方法で置換度を
測定した結果このものはDS＝1.20であつた。
（１→３）−β−Ｄ−グルカンと同様の方法で置換度を
測定した結果このものはDS＝1.20であつた。
調製例11:部分カルボキシメチル化ラミナランの調製 部分カルボキシメチル化ラミナランはLaminaria digi
tata由来のラミナラン（シグマ社Lot No.77F−3885）を
用い、調製例９の部分カルボキシメチル化法と同様、A.
E.Clarke and B.A.Stone:Phytochem.１,175（1962）に
記載の方法に準じ調製し、試料No.42（DS＝0.06）の標
品を得た。
tata由来のラミナラン（シグマ社Lot No.77F−3885）を
用い、調製例９の部分カルボキシメチル化法と同様、A.
E.Clarke and B.A.Stone:Phytochem.１,175（1962）に
記載の方法に準じ調製し、試料No.42（DS＝0.06）の標
品を得た。
調製例12:部分メチル化（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の調製 調製例２に準じて得たカードラン水不溶物3.0gをM.Sa
mec,Kolloid−Beihefte 51,369（1940）の方法に従い、
水80mlに懸濁し、窒素気流下、飽和苛性ソーダ水溶液1.
35mlを加え、完全に溶解させ、４℃で、こゝにジメチル
硫酸60gを徐々に加え、約１時間後、アセトン中に反応
液を滴下し、生ずる沈澱を集め、アセトンで充分洗滌
し、濃硫酸上減圧乾燥し、標記調製品（試料No.43、DS
＝0.16）の3.13gを得た。
の調製 調製例２に準じて得たカードラン水不溶物3.0gをM.Sa
mec,Kolloid−Beihefte 51,369（1940）の方法に従い、
水80mlに懸濁し、窒素気流下、飽和苛性ソーダ水溶液1.
35mlを加え、完全に溶解させ、４℃で、こゝにジメチル
硫酸60gを徐々に加え、約１時間後、アセトン中に反応
液を滴下し、生ずる沈澱を集め、アセトンで充分洗滌
し、濃硫酸上減圧乾燥し、標記調製品（試料No.43、DS
＝0.16）の3.13gを得た。
調製例13:部分硫酸化ラミナランの調製 Laminaria digitata由来のラミナランの硫酸エステル
化はピリジン中でピリジン−３酸化硫黄複合体（和光純
薬工業、Lot No.PPL8823）を用いて次の如く行った。
化はピリジン中でピリジン−３酸化硫黄複合体（和光純
薬工業、Lot No.PPL8823）を用いて次の如く行った。
充分に乾燥したLaminaria digitata由来のラミナラン
（シグマ社、Lot No.77F−3885）0.5gを50mlの脱水ピリ
ジンに溶解し、ピリジン−３酸化硫黄複合体1gを加え、
60℃で１時間反応させ、水100mlを加え、冷却し、NaOH
で中和し、あらかじめアルカリ水溶液で充分洗滌してグ
ルカンを除去した透析膜（スペクトロポア1,000カツ
ト）を用いて水に対して透析した後、濃縮し、２倍容の
アセトンを加えて糖成分を沈澱せしめ、アセトンで洗滌
後、濃硫酸上減圧乾燥し、0.38gの標記調製品を得た
（試料No.44、DS＝0.14）。
（シグマ社、Lot No.77F−3885）0.5gを50mlの脱水ピリ
ジンに溶解し、ピリジン−３酸化硫黄複合体1gを加え、
60℃で１時間反応させ、水100mlを加え、冷却し、NaOH
で中和し、あらかじめアルカリ水溶液で充分洗滌してグ
ルカンを除去した透析膜（スペクトロポア1,000カツ
ト）を用いて水に対して透析した後、濃縮し、２倍容の
アセトンを加えて糖成分を沈澱せしめ、アセトンで洗滌
後、濃硫酸上減圧乾燥し、0.38gの標記調製品を得た
（試料No.44、DS＝0.14）。
なお、調製例12〜13に示した各標品のメチル基及び硫
酸基の置換度は、下記文献、の方法に従い測定算出
した。
酸基の置換度は、下記文献、の方法に従い測定算出
した。
落合、津田、阪本；有機定量分析法（微量篇）、南
山堂（1956）； Whistler,R.L.ed.,Methods in Carbohydrate Chemi
stry III,p229〜235,277〜280（1964）,Academic Press ［市販試料］ 下記市販試料は物性を確認後、そのまま又はアルカリ
可溶化後中和し、測定に供した。
山堂（1956）； Whistler,R.L.ed.,Methods in Carbohydrate Chemi
stry III,p229〜235,277〜280（1964）,Academic Press ［市販試料］ 下記市販試料は物性を確認後、そのまま又はアルカリ
可溶化後中和し、測定に供した。
グルコース：（和光純薬工業、JIS特級試薬）：試料No.
108 ラミナリオリゴ糖：（生化学工業、ピユアー試薬）：試
料No.5〜10 ラミナラン Eisenia araborea由来：（半井化学、試
薬）：試料No.23 〃 E.araborea由来：（東京化成、試薬）：試
料No.24 〃 Laminaria digitata由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.26 レンチナン Lentinus edodes（シイタケ）由来：（味
の素、医薬Lot No.9Z01LS）：試料No.32 リヒエナン Cetraria islandica由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.34 〃 Usnea barbata由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.35 上記の各試料の分子量、Ｇ因子活性化阻害力価等の測
定結果を下記表−１に示す。
108 ラミナリオリゴ糖：（生化学工業、ピユアー試薬）：試
料No.5〜10 ラミナラン Eisenia araborea由来：（半井化学、試
薬）：試料No.23 〃 E.araborea由来：（東京化成、試薬）：試
料No.24 〃 Laminaria digitata由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.26 レンチナン Lentinus edodes（シイタケ）由来：（味
の素、医薬Lot No.9Z01LS）：試料No.32 リヒエナン Cetraria islandica由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.34 〃 Usnea barbata由来：（シグマ社、試
薬）：試料No.35 上記の各試料の分子量、Ｇ因子活性化阻害力価等の測
定結果を下記表−１に示す。
表中の分子量は前記GPCにより求めた下式で定義され
る数平均分子量（Mn）で表し、また、分子量分布は、下
式で定義される多分散度（Mw/Mn）で表わす。
る数平均分子量（Mn）で表し、また、分子量分布は、下
式で定義される多分散度（Mw/Mn）で表わす。
ただし、Hiはクロマトグラムを時間で等分に多分割し
たときのｉ番目のピーク高さ（試料濃度）を、Miはｉ番
目の分子量を表わす。
たときのｉ番目のピーク高さ（試料濃度）を、Miはｉ番
目の分子量を表わす。
Ｇ因子活性化阻害力価は下記に示す［Ｇ因子活性化阻
害物質の活性力価測定法］にて測定し、mg当りの単位と
して示した。
害物質の活性力価測定法］にて測定し、mg当りの単位と
して示した。
［Ｇ因子活性化阻害物質（以下GIと略記することがあ
る）の活性力価測定法］ 反応混合液200μ中には以下のものを含む。
る）の活性力価測定法］ 反応混合液200μ中には以下のものを含む。
（１）検体（注１）GI試料又は純水 50μ ［Ｇ因子活性化物質（GAと略記、注２）］10pg添加又は
無添加 （２）カブトガニライセート凝固酵素 前駆体画分（A280＝2.5）（注３） 30μ （３）カブトガニライセートＧ因子画分 （A280＝0.9）（注３） 20μ （４）トリス−塩酸緩衝液（pH8.0） 20μmole （５）MgCl2 20μmole （６） Boc−Leu−Gly−Arg−pNA （ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−グリシル
−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド） 0.13μmole 上記反応液を37℃で30分間インキユベートした後、遊
離するpNA（パラニトロアニリン）の量を0.04％亜硝酸
ナトリウム（0.48M HCl溶液）、0.3％スルフアミン酸
アンモニウム、0.07％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミ
ン二塩酸塩のそれぞれ0.5mlを順次加え、ジアゾカップ
リングにより色調変換し、545nmにおける吸光度
（A545）量として測定する。GI活性は次式により算出す
る。
無添加 （２）カブトガニライセート凝固酵素 前駆体画分（A280＝2.5）（注３） 30μ （３）カブトガニライセートＧ因子画分 （A280＝0.9）（注３） 20μ （４）トリス−塩酸緩衝液（pH8.0） 20μmole （５）MgCl2 20μmole （６） Boc−Leu−Gly−Arg−pNA （ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−グリシル
−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド） 0.13μmole 上記反応液を37℃で30分間インキユベートした後、遊
離するpNA（パラニトロアニリン）の量を0.04％亜硝酸
ナトリウム（0.48M HCl溶液）、0.3％スルフアミン酸
アンモニウム、0.07％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミ
ン二塩酸塩のそれぞれ0.5mlを順次加え、ジアゾカップ
リングにより色調変換し、545nmにおける吸光度
（A545）量として測定する。GI活性は次式により算出す
る。
この条件下において、GAによるＧ因子の活性化を100
％阻害するGI量を100単位とする。
％阻害するGI量を100単位とする。
（注１）検体のうち、水不溶性のものは、0.3M NaOHに
溶かした後、等容の0.3M HClを加えて中和して用い
る。
溶かした後、等容の0.3M HClを加えて中和して用い
る。
（注２）前記調製例５で調製したカードラン音波処理物
のGPC分画精製標品（表−２、No.106,分子量216,00
0）。
のGPC分画精製標品（表−２、No.106,分子量216,00
0）。
（注３）文献［T.Obayashi et al.,Clin.Chim.Acta,14
9,55〜65（1985）］に従い日本産カブトガニT.tridenta
tusから調製した。
9,55〜65（1985）］に従い日本産カブトガニT.tridenta
tusから調製した。
上記の（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を前記
の方法により不溶性担体に固定化して得られた本発明の
不溶性固定化物に、次いでLALを接触させる。両者を接
触させる場合の温度としては通常０〜40℃、好ましくは
０〜10℃、また、pHとしては６〜８の範囲が用いられ
る。続いて不溶性固定化物をLALから除く。このために
は両者の混合物から濾過や遠心分離などによつて不溶性
固定化物を除く、あるいは不溶性固定化物を充填したカ
ラムにLALを通し、通過したLALを得るなどの方法を用い
ることができる。
の方法により不溶性担体に固定化して得られた本発明の
不溶性固定化物に、次いでLALを接触させる。両者を接
触させる場合の温度としては通常０〜40℃、好ましくは
０〜10℃、また、pHとしては６〜８の範囲が用いられ
る。続いて不溶性固定化物をLALから除く。このために
は両者の混合物から濾過や遠心分離などによつて不溶性
固定化物を除く、あるいは不溶性固定化物を充填したカ
ラムにLALを通し、通過したLALを得るなどの方法を用い
ることができる。
LALと接触させる該不溶性固定化物の量は、担体上に
固定化された（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体の
Ｇ因子活性化阻害作用の強さによつて異なるので、例え
ば次のようにして決定すればよい。氷冷下、一定量のLA
Lに該不溶性固定化物（エンドトキシンを含有しないも
の）を量を変えて接触させた後、遠心分離によつて不溶
性固定化物を除き、これに対して通常の測定条件下にお
いてLALを充分に活性化する一定量のＧ因子活性化物質
（エンドトキシンを含有しないもの、またできる限りＧ
因子活性化阻害物質を含まないもの）を加え、通常のLA
L使用時と同条件で反応させる。この条件下でLALの活性
化を100％阻害する該不溶性固定化物の量を求める。次
に、上で求めた量の該不溶性固定化物と上記の一定量の
LALとを接触させた後、更にＧ因子活性化物質の量を変
化させて加えどの濃度で加えてもLALが活性化されない
ことを確認する。上記の操作によつて一定量のLAL中の
Ｇ因子の活性化を完全に阻害するのに必要な該不溶性固
定化物の量を求めることができる。
固定化された（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体の
Ｇ因子活性化阻害作用の強さによつて異なるので、例え
ば次のようにして決定すればよい。氷冷下、一定量のLA
Lに該不溶性固定化物（エンドトキシンを含有しないも
の）を量を変えて接触させた後、遠心分離によつて不溶
性固定化物を除き、これに対して通常の測定条件下にお
いてLALを充分に活性化する一定量のＧ因子活性化物質
（エンドトキシンを含有しないもの、またできる限りＧ
因子活性化阻害物質を含まないもの）を加え、通常のLA
L使用時と同条件で反応させる。この条件下でLALの活性
化を100％阻害する該不溶性固定化物の量を求める。次
に、上で求めた量の該不溶性固定化物と上記の一定量の
LALとを接触させた後、更にＧ因子活性化物質の量を変
化させて加えどの濃度で加えてもLALが活性化されない
ことを確認する。上記の操作によつて一定量のLAL中の
Ｇ因子の活性化を完全に阻害するのに必要な該不溶性固
定化物の量を求めることができる。
以下、本発明の不溶性固定化物の調製法およびそれら
を利用してエンドトキシンとのみ特異的に反応するLAL
の調製法を具体例を挙げて述べる。不溶性固定化物の調
製は松本らの方法（松本勲武ら、特開昭59−15401）に
従つて行った。
を利用してエンドトキシンとのみ特異的に反応するLAL
の調製法を具体例を挙げて述べる。不溶性固定化物の調
製は松本らの方法（松本勲武ら、特開昭59−15401）に
従つて行った。
調製例14:カードランギ酸分解物（Mn,5,800）固定化セ
ルロースの調製 セルロース粉末（メツシユ、100〜200、東洋濾紙製
造）2gをグラスフイルター上で水でよく洗浄後、吸引濾
過した後、フラスコに入れ、水30ml、2M NaOH水溶液13
mlおよびエピクロルヒドリン3mlを順次加えて得られる
懸濁液を40℃で２時間振盪した後、グラスフイルター上
で充分洗浄してエポキシ活性化セルロースを得た。得ら
れたエポキシ活性化セルロース１容（20ml）に80％ヒド
ラジン水化物水溶液1.5容（30ml）を加え、40℃で1.5時
間振盪した。反応後、グラスフイルター上で水で充分に
洗浄してヒドラジノセルロースを得た。得られたヒドラ
ジノセルロースのうち2g（湿重量）に調製例４−１で得
たカードランギ酸分解物（試料No.14、Mn＝5,800）50mg
と水素化シアノホウ素ナトリウム26mgとを0.2MK2HPO4水
溶液1.5mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪し
た。反応後、グラスフイルター上で水1mlおよび0.2M酢
酸ナトリウム水溶液1mlで順次洗浄した。このものに0.2
M酢酸ナトリウム水溶液1.0mlを加えて懸濁液とし、次い
で、無水酢酸0.5mlを加え、０℃で30分間反応させた
後、更に無水酢酸0.5mlを加え、室温で30分間処理して
未反応のヒドラジン残基をアセチル化した。反応後、
水、0.1M NaOH水溶液、水、リン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）で順次洗浄して、カードランギ酸分解物固定化
セルロースを得た。
ルロースの調製 セルロース粉末（メツシユ、100〜200、東洋濾紙製
造）2gをグラスフイルター上で水でよく洗浄後、吸引濾
過した後、フラスコに入れ、水30ml、2M NaOH水溶液13
mlおよびエピクロルヒドリン3mlを順次加えて得られる
懸濁液を40℃で２時間振盪した後、グラスフイルター上
で充分洗浄してエポキシ活性化セルロースを得た。得ら
れたエポキシ活性化セルロース１容（20ml）に80％ヒド
ラジン水化物水溶液1.5容（30ml）を加え、40℃で1.5時
間振盪した。反応後、グラスフイルター上で水で充分に
洗浄してヒドラジノセルロースを得た。得られたヒドラ
ジノセルロースのうち2g（湿重量）に調製例４−１で得
たカードランギ酸分解物（試料No.14、Mn＝5,800）50mg
と水素化シアノホウ素ナトリウム26mgとを0.2MK2HPO4水
溶液1.5mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪し
た。反応後、グラスフイルター上で水1mlおよび0.2M酢
酸ナトリウム水溶液1mlで順次洗浄した。このものに0.2
M酢酸ナトリウム水溶液1.0mlを加えて懸濁液とし、次い
で、無水酢酸0.5mlを加え、０℃で30分間反応させた
後、更に無水酢酸0.5mlを加え、室温で30分間処理して
未反応のヒドラジン残基をアセチル化した。反応後、
水、0.1M NaOH水溶液、水、リン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）で順次洗浄して、カードランギ酸分解物固定化
セルロースを得た。
調製例15:ラミナラン固定化セルロースの調製 セルロース（セルロフアイン、GC−700−ｍ、生化学
工業販売）20g（湿重量）を調製例14と同様な操作によ
つてヒドラジン誘導体とした。得られたヒドラジノセル
ロフアインのうち2g（湿重量）にLaminaria digitataの
ラミナラン（シグマ社、Lot No.77F−3885）50mgと水素
化シアノホウ素ナトリウム26mgとを0.2MK2HPO4水溶液1.
5mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪した。反
応後、調製例14に準じて洗浄、未反応のヒドラジン残基
のアセチル化および洗浄を行いラミナラン固定化セルロ
フアインを得た。
工業販売）20g（湿重量）を調製例14と同様な操作によ
つてヒドラジン誘導体とした。得られたヒドラジノセル
ロフアインのうち2g（湿重量）にLaminaria digitataの
ラミナラン（シグマ社、Lot No.77F−3885）50mgと水素
化シアノホウ素ナトリウム26mgとを0.2MK2HPO4水溶液1.
5mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪した。反
応後、調製例14に準じて洗浄、未反応のヒドラジン残基
のアセチル化および洗浄を行いラミナラン固定化セルロ
フアインを得た。
調製例16:ラミナリビオース固定化親水性ポリビニル合
成ポリマーの調製 トヨパール（親水性ポリビニル合成ポリマー、HW55、
Fine、東ソー販売）1kg（湿重量）を調製例14に準じて
操作し、エポキシ活性化トヨパールを得た。
成ポリマーの調製 トヨパール（親水性ポリビニル合成ポリマー、HW55、
Fine、東ソー販売）1kg（湿重量）を調製例14に準じて
操作し、エポキシ活性化トヨパールを得た。
得られたエポキシ活性化トヨパールのうち800mlに、
アジピン酸ジヒドラジド92gを0.1M Na2CO3水溶液1.2
に溶解し、塩酸でpHを９に調整した溶液を加え、40℃で
一夜振盪した。反応後、グラスフイルター上で0.2M Na
Cl水溶液で充分に洗浄して、ヒドラジドトヨパールを得
た。得られたヒドラジドトヨパール全量に、ラミナリビ
オース（生化学工業販売、Lot8701100）32gと水素化シ
アノホウ素ナトリウム10.4gとを0.2M K2HPO4水溶液600
mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪した。反応
後、グラスフイルター上で、水、0.2M酢酸ナトリウム水
溶液で順次洗浄した。このものに0.2M酢酸ナトリウム水
溶液400ml、次いで無水酢酸200mlを加え、０℃で30分間
振盪後、更に無水酢酸200mlを加え室温で30分間振盪し
て、未反応のヒドラジド残基をアセチル化した。反応
後、水、0.1M NaOH水溶液、水、リン酸緩衝化生理食塩
水で順次洗浄して、ラミナリビオース固定化トヨパール
を得た。
アジピン酸ジヒドラジド92gを0.1M Na2CO3水溶液1.2
に溶解し、塩酸でpHを９に調整した溶液を加え、40℃で
一夜振盪した。反応後、グラスフイルター上で0.2M Na
Cl水溶液で充分に洗浄して、ヒドラジドトヨパールを得
た。得られたヒドラジドトヨパール全量に、ラミナリビ
オース（生化学工業販売、Lot8701100）32gと水素化シ
アノホウ素ナトリウム10.4gとを0.2M K2HPO4水溶液600
mlに溶解したものを加え、室温で３日間振盪した。反応
後、グラスフイルター上で、水、0.2M酢酸ナトリウム水
溶液で順次洗浄した。このものに0.2M酢酸ナトリウム水
溶液400ml、次いで無水酢酸200mlを加え、０℃で30分間
振盪後、更に無水酢酸200mlを加え室温で30分間振盪し
て、未反応のヒドラジド残基をアセチル化した。反応
後、水、0.1M NaOH水溶液、水、リン酸緩衝化生理食塩
水で順次洗浄して、ラミナリビオース固定化トヨパール
を得た。
実施例1:カードランギ酸分解物固定化セルロースを用い
たLALの調製 調製例14で得たカードランギ酸分解物固定化セルロー
ス（湿体積0.4ml）をエンドトキシンを除くため、グラ
スフイルター上で0.1M NaOH 1および蒸留水１で順
次洗浄後、蒸留水を加えて2.6mlの懸濁液とし、これを
用いてプレゲルーＭ主剤（ゲル化法リムルステスト製
品、凍結乾燥品、LotAB01、感度0.125EU/ml、生化学工
業販売）１バイアルを溶解した後、毎分3,000回転、10
分間遠心分離し、上清（LAL−１）を得た。この上清お
よびプレゲルーＭ主剤を2.6mlの蒸留水で溶解したもの
（LAL−２）のエンドトキシン（E.coli 0111:B4由来）
および部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン［調製例９で得た資料No.41、以下、（１→３）
−β−Ｄ−グルカンと記す］に対する反応性をプレゲル
ーＭの標準操作法（0.1mlの検体に0.1mlのLALを加え、3
7℃で60分間静置、加温する。）に従つてゲル化の有無
で調べた結果を表−２に示す。表中、＋、−はゲル化の
有無を表わす。
たLALの調製 調製例14で得たカードランギ酸分解物固定化セルロー
ス（湿体積0.4ml）をエンドトキシンを除くため、グラ
スフイルター上で0.1M NaOH 1および蒸留水１で順
次洗浄後、蒸留水を加えて2.6mlの懸濁液とし、これを
用いてプレゲルーＭ主剤（ゲル化法リムルステスト製
品、凍結乾燥品、LotAB01、感度0.125EU/ml、生化学工
業販売）１バイアルを溶解した後、毎分3,000回転、10
分間遠心分離し、上清（LAL−１）を得た。この上清お
よびプレゲルーＭ主剤を2.6mlの蒸留水で溶解したもの
（LAL−２）のエンドトキシン（E.coli 0111:B4由来）
および部分カルボキシメチル化（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン［調製例９で得た資料No.41、以下、（１→３）
−β−Ｄ−グルカンと記す］に対する反応性をプレゲル
ーＭの標準操作法（0.1mlの検体に0.1mlのLALを加え、3
7℃で60分間静置、加温する。）に従つてゲル化の有無
で調べた結果を表−２に示す。表中、＋、−はゲル化の
有無を表わす。
表から明らかなようにLAL−１はエンドトキシンとの
み反応する目的のLALである。
み反応する目的のLALである。
実施例2:ラミナラン固定化セルロース（セルロフアイ
ン）を用いたLALの調製 調製例15で得たラミナラン固定化セルロフアイン湿体
積0.4mlをグラスフイルター上で、0.1M NaOH 1およ
び蒸留水１で順次洗浄後、蒸留水を加えて4mlとし、
このうち0.2mlの蒸留水1.8mlを加えた懸濁液をポリビニ
リデンフロライド膜（0.22μｍ、マイレクスGVフイルタ
ーユニツト、日本ミリポア工業製、LotCEl1）で濾過
し、ラミナラン固定化セルロフアインが付着したフイル
ターを得た。一方、カブトガニ（Tachypleus tridentat
us）の血リンパを採取し遠心分離（毎分3,000回転、５
分間）で血球（約20g）を得、これに0.02M Tris−HCl
緩衝液（pH8.0）100mlを加え、ワーリング・ブレンダー
でホモゲナイズした後、遠心分離（毎分8,000回転、30
分間、４℃）により上清と沈澱物とに分画した。この抽
出操作をもう一度繰り返し、上清合計約150mlをLALとし
て得た。このLALのうち1mlを上記のラミナラン固定化セ
ルロフアイン付着フイルターで濾過し、濾液を得、この
うち0.04mlにMgCl21.5μｇおよび合成基質（Ｎ−tert−
ブトキシカルボニル−Leu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド）4.0μｇを加えて凍結乾燥した。この凍結乾燥品
に0.2M Tris−HCl緩衝液（pH8.0）0.1mlおよび検体
（実施例１で使用したエンドトキシンあるいは（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの種々濃度の水溶液）0.1mlを
加えて37℃で30分間加温した後0.6M酢酸0.4mlを加えて
反応停止し、405nmにおける吸光度を測定した結果およ
び未処理LALを用いて同様に測定した結果を第４図に示
す。図中○印は未処理LALを使用した場合の吸光度を、
△印はラミナラン固定化セルロフアインで処理したLAL
を使用した場合の吸光度を示す。図から明らかなよう
に、ラミナラン固定化セルロフアインで処理したLALは
（１→３）−β−Ｄ−グルカンとは反応せず、エンドト
キシンとのみ反応し、これを使用することによつてエン
ドトキシンの特異的測定が可能である。
ン）を用いたLALの調製 調製例15で得たラミナラン固定化セルロフアイン湿体
積0.4mlをグラスフイルター上で、0.1M NaOH 1およ
び蒸留水１で順次洗浄後、蒸留水を加えて4mlとし、
このうち0.2mlの蒸留水1.8mlを加えた懸濁液をポリビニ
リデンフロライド膜（0.22μｍ、マイレクスGVフイルタ
ーユニツト、日本ミリポア工業製、LotCEl1）で濾過
し、ラミナラン固定化セルロフアインが付着したフイル
ターを得た。一方、カブトガニ（Tachypleus tridentat
us）の血リンパを採取し遠心分離（毎分3,000回転、５
分間）で血球（約20g）を得、これに0.02M Tris−HCl
緩衝液（pH8.0）100mlを加え、ワーリング・ブレンダー
でホモゲナイズした後、遠心分離（毎分8,000回転、30
分間、４℃）により上清と沈澱物とに分画した。この抽
出操作をもう一度繰り返し、上清合計約150mlをLALとし
て得た。このLALのうち1mlを上記のラミナラン固定化セ
ルロフアイン付着フイルターで濾過し、濾液を得、この
うち0.04mlにMgCl21.5μｇおよび合成基質（Ｎ−tert−
ブトキシカルボニル−Leu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド）4.0μｇを加えて凍結乾燥した。この凍結乾燥品
に0.2M Tris−HCl緩衝液（pH8.0）0.1mlおよび検体
（実施例１で使用したエンドトキシンあるいは（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの種々濃度の水溶液）0.1mlを
加えて37℃で30分間加温した後0.6M酢酸0.4mlを加えて
反応停止し、405nmにおける吸光度を測定した結果およ
び未処理LALを用いて同様に測定した結果を第４図に示
す。図中○印は未処理LALを使用した場合の吸光度を、
△印はラミナラン固定化セルロフアインで処理したLAL
を使用した場合の吸光度を示す。図から明らかなよう
に、ラミナラン固定化セルロフアインで処理したLALは
（１→３）−β−Ｄ−グルカンとは反応せず、エンドト
キシンとのみ反応し、これを使用することによつてエン
ドトキシンの特異的測定が可能である。
実施例3:ラミナリビオース固定化トヨパールを用いたLA
Lの調製 調製例16で得たラミナリビオース固定化トヨパール湿
体積60mlをグラスフイルター上で、0.1M NaOH1500mlお
よび蒸留水1500mlで順次洗浄後、これに実施例２と同様
な操作で得た未処理LAL2mlを蒸留水で25倍希釈したもの
を加え、４℃で30分間振盪後、遠心分離（毎分3,000回
転、10分間）により得た上清を凍結乾燥し、これに蒸留
水を加え、2mlとした。このうち0.1mlに、実施例１と同
様にエンドトキシンあるいは（１→３）−β−Ｄ−グル
カンの種々濃度の水溶液0.1mlを加え、37℃で60分間反
応させた後、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（0.1〜10,
000ng/ml）ではゲル化せず、一方エンドトキシン（100p
g/ml以上）ではゲル化した。
Lの調製 調製例16で得たラミナリビオース固定化トヨパール湿
体積60mlをグラスフイルター上で、0.1M NaOH1500mlお
よび蒸留水1500mlで順次洗浄後、これに実施例２と同様
な操作で得た未処理LAL2mlを蒸留水で25倍希釈したもの
を加え、４℃で30分間振盪後、遠心分離（毎分3,000回
転、10分間）により得た上清を凍結乾燥し、これに蒸留
水を加え、2mlとした。このうち0.1mlに、実施例１と同
様にエンドトキシンあるいは（１→３）−β−Ｄ−グル
カンの種々濃度の水溶液0.1mlを加え、37℃で60分間反
応させた後、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（0.1〜10,
000ng/ml）ではゲル化せず、一方エンドトキシン（100p
g/ml以上）ではゲル化した。
第１図は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートに関
する凝固系の反応機構を示す図である。 第２図は、市販カードランの分子篩クロマトによる分画
パターン（溶出曲線）を示す図であり、○印はＧ因子活
性化阻害力価（左側、縦軸）を示す、△印は糖含量を示
す。 第３図は、第２図で得られたNo.44〜46画分を再クロマ
トした分画パターンを示す図であり、○印はＧ因子活性
化阻害力価（左側、縦軸）を示し、△印は糖含量を示
す。 第４−１図は、未処理のLALおよび本発明により処理し
たLALと各種濃度のエンドトキシンとを反応させたとき
の吸光度を示す図であり、○印は未処理LALを示し、△
印は実施例２により処理したLALを示す。 第４−２図は、未処理のLALおよび本発明により処理し
たLALと各種濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンとを
反応させたときの吸光度を示す図であり、○印は未処理
LALを示し、△印は実施例２により処理したLALを示す。
する凝固系の反応機構を示す図である。 第２図は、市販カードランの分子篩クロマトによる分画
パターン（溶出曲線）を示す図であり、○印はＧ因子活
性化阻害力価（左側、縦軸）を示す、△印は糖含量を示
す。 第３図は、第２図で得られたNo.44〜46画分を再クロマ
トした分画パターンを示す図であり、○印はＧ因子活性
化阻害力価（左側、縦軸）を示し、△印は糖含量を示
す。 第４−１図は、未処理のLALおよび本発明により処理し
たLALと各種濃度のエンドトキシンとを反応させたとき
の吸光度を示す図であり、○印は未処理LALを示し、△
印は実施例２により処理したLALを示す。 第４−２図は、未処理のLALおよび本発明により処理し
たLALと各種濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンとを
反応させたときの吸光度を示す図であり、○印は未処理
LALを示し、△印は実施例２により処理したLALを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−235852（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−186267（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/579 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (4)
- 【請求項１】ポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造
部分を含有する糖類を部分的に分解し及び／又は分別処
理することにより得られる式（Ｉ） （式中、ｎは２〜370の数を表す） で示されるポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部
分を１分子中に少なくとも１つ含有し且つ646,000単位/
mg以上のＧ因子活性化阻害力価を有するポリグリコシド
を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、
カブトガニ・アメボサイト・ライセートを接触させた
後、該不溶性固定化物をカブトガニ・アメボサイト・ラ
イセートから分離することを特徴とする、エンドトキシ
ンに特異的に反応する実質的にＧ因子を含まないカブト
ガニ・アメボサイト・ライセートの調製法。 - 【請求項２】ポリグリコシドがさらに下記式 で示される（１→４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上及び／又は下記式 で示される（１→６）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上及び／又は下記式 式（IV）、（Ｖ）、（VI）中、 R1、R2及びR3の少くとも１つはアルキル基、ヒドロキシ
アルキル基、カルボキシアルキル基、アセチル基、硫酸
基、リン酸基、アリル基等の化学的に導入し得る基およ
びそれらの金属塩、アンモニウム塩及び有機アミン塩か
ら選ばれる残基を表わし、そして残りは水素原子を表わ
す、 で示される修飾されたβ−Ｄ−グルコシド構造単位の１
つもしくはそれ以上から構成される糖鎖を含有する請求
項１記載の調製法。 - 【請求項３】ポリグリコシドがポリ（１→３）−β−Ｄ
−グルコシド構造部分を含有する糖類を、酸、アルカリ
又はβ−グルカナーゼによる加水分解、加酢分解又は音
波処理により部分分解することにより得られるもの、或
いは該糖類を有機溶媒もしくは塩類を用いて分別沈殿さ
せるか、又は分子篩剤もしくは分子篩膜を用いて分画す
ることにより得られるものである請求項１記載の調製
法。 - 【請求項４】ポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造
部分を含有する糖類を部分的に分解し及び／又は分別処
理することにより得られる式（Ｉ） （式中、ｎは２〜370の数を表す） で示されるポリ（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部
分を１分子中に少なくとも１つ含有し且つ646,000単位/
mg以上のＧ因子活性化阻害力価を有するポリグリコシド
を不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、
カブトガニ・アメボサイト・ライセートを接触させた
後、該不溶性固定化物をカブトガニ・アメボサイト・ラ
イセートから分離することにより得られる、エンドトキ
シンに特異的に反応する実質的にＧ因子を含まないカブ
トガニ・アメボサイト・ライセート。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02255201A JP3122454B2 (ja) | 1990-09-27 | 1990-09-27 | カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 |
| PCT/JP1991/001308 WO1992006381A1 (en) | 1990-09-27 | 1991-09-27 | Process for preparing limulus amoebocyte lysate |
| EP91917028A EP0507952B1 (en) | 1990-09-27 | 1991-09-27 | Process for preparing limulus amoebocyte lysate |
| DE69123834T DE69123834T2 (de) | 1990-09-27 | 1991-09-27 | Verfahren zur herstellung von limulus amöbozytenlysat |
| US07/859,411 US5401647A (en) | 1990-09-27 | 1991-09-27 | Method of preparing Limulus amoebocyte lysate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02255201A JP3122454B2 (ja) | 1990-09-27 | 1990-09-27 | カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04134265A JPH04134265A (ja) | 1992-05-08 |
| JP3122454B2 true JP3122454B2 (ja) | 2001-01-09 |
Family
ID=17275427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02255201A Expired - Lifetime JP3122454B2 (ja) | 1990-09-27 | 1990-09-27 | カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5401647A (ja) |
| EP (1) | EP0507952B1 (ja) |
| JP (1) | JP3122454B2 (ja) |
| DE (1) | DE69123834T2 (ja) |
| WO (1) | WO1992006381A1 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP3322700B2 (ja) * | 1992-09-14 | 2002-09-09 | 生化学工業株式会社 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
| JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
| JP3429036B2 (ja) * | 1993-09-30 | 2003-07-22 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの特異的測定剤 |
| US5866150A (en) * | 1996-03-20 | 1999-02-02 | Aquaculture Technology Incorporated | Antibacterially active extracts from the marine algae chaetoceros and methods of use |
| EP0837330B1 (en) | 1996-10-21 | 2005-08-24 | Seikagaku Corporation | Method for measuring Endotoxin |
| US6270982B1 (en) * | 1997-10-09 | 2001-08-07 | Charles River Laboratories | Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins |
| AU6261999A (en) * | 1998-09-25 | 2000-04-17 | Collaborative Group, Ltd., The | Very high molecular weight beta-glucans |
| US6369216B1 (en) | 1998-09-25 | 2002-04-09 | Biopolymer Engineering Pharmaceutical, Inc. | Very high molecular weight β-glucans |
| WO2004014320A2 (en) * | 2002-08-13 | 2004-02-19 | Biopolymer Engineering, Inc. | Methods of using beta glucan as a radioprotective agent |
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| CN1939335A (zh) * | 2002-09-04 | 2007-04-04 | 路易斯维尔大学研究基金会 | 使用β葡聚糖和抗体治疗癌性的方法 |
| WO2005010207A2 (en) | 2003-03-17 | 2005-02-03 | Charles River Laboratories, Inc. | Methods and compositions for the detection of microbial contaminants |
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| WO2006076617A2 (en) * | 2005-01-13 | 2006-07-20 | Charles River Laboratories, Inc. | Method for classifying a microorganism in a biological sample |
| CA2912012C (en) | 2005-05-05 | 2018-05-29 | Sensient Flavors Inc. | Production of beta-glucans and mannans |
| US20090286692A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-11-19 | Wainwright Norman R | Cartridge and Method for Sample Analysis |
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| JP5856355B2 (ja) | 2013-08-02 | 2016-02-09 | 株式会社ユーグレナ | エンド−１，３−β−グルカナーゼ，ポリヌクレオチド，組換えベクター，形質転換体，エンド−１，３−β−グルカナーゼの製造方法，酵素製剤及び低分子化パラミロンの製造方法 |
| US9901606B2 (en) | 2016-06-09 | 2018-02-27 | Algaeon, Inc. | Euglena lysate composition |
| EP3494226B1 (en) | 2016-08-03 | 2021-09-22 | Lonza Walkersville, Inc. | Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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