CN104403023B - 一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：A、将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，配成悬浮液a，加入氢氧化钠、微生物蛋白酶制剂后抽提1h～10h，再进行离心分离，取沉淀a；B、将沉淀a用水洗涤后配成悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂后抽提2h～12h，然后进行离心分离，取沉淀b；C、将沉淀b洗涤后干燥，即得到酵母葡聚糖粉；与现有技术相比，本发明方法不仅操作简单，而且葡聚糖的提取纯度高，还可以避免资源的浪费，节约成本，降低啤酒工业中啤酒废酵母残渣的排放对环境的不利影响，为啤酒废酵母的综合利用开辟了一条新的途径，实现啤酒废酵母的增值增效，产生巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取碱不溶性葡聚糖的方法，尤其涉及一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法。
背景技术
酵母多糖是酵母细胞壁的主要成分，占细胞干重的30％左右，啤酒酵母细胞壁有三层结构，外层是D-甘露聚糖，中间是蛋白质，内层是D-葡聚糖，其中葡聚糖占30％～40％。啤酒酵母细胞壁中的碱不溶酸不溶葡聚糖是以β-(1,3)-D-葡聚糖为主链、含有β-(1,6)分支的葡聚糖，能提高免疫力的物质就是β-(1,3)-D-葡聚糖，具有较强生物活性的葡聚糖分子量为100～200KDa。
葡聚糖能够增强动物的非特异性免疫***，激活巨噬细胞的活性，通过吞噬作用吸收、破坏和清除体内的病原微生物，提高动物的免疫功能。例如葡聚糖在水产养殖中可以减少水产动物尤其是鱼、虾的病害。因此在动物的饲料中添加葡聚糖会大大增加水产动物对疾病的抵抗力，促进动物生长发育。此外，葡聚糖还能促进动物胃肠蠕动，吸附肠道内的有害物质，例如真菌毒素；也能促进肠内有益菌的增殖。
由于酵母葡聚糖独特的免疫活性，目前已作为一种饲料添加剂而得到广泛的应用。国内外对酵母细胞壁葡聚糖的提取方法较多，主要有酸法提取、碱法提取、酸碱一体法、有机溶剂提取、自溶-酶-碱法、超声波提取、酶法等。在工业生产中，根据不同的生产目的可以采用不同的工艺方法从酵母细胞中提取葡聚糖，但是这些方法多采用纯净的酵母细胞为原料，操作复杂，成本较高。
啤酒废酵母是啤酒生产的副产物，是啤酒生产过程中历经主发酵和后发酵的酿造工序之后所产生的，含有丰富的营养成分及功能性成分。目前工业上已经开始利用啤酒废酵母提取核糖核酸，以提高啤酒废酵母的利用价值，但是在此过程中，啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣却没有得到有效利用，该啤酒废酵母残渣的主要成分为破碎的啤酒酵母细胞壁，含有丰富的葡聚糖，其直接排放是对资源的浪费。
发明内容
本发明的目的旨在克服上述现有技术中的不足，提供一种操作简单、提纯率高、避免资源浪费的从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成悬浮液a，加入氢氧化钠、微生物蛋白酶制剂，并在温度为30℃～70℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提1h～10h，再对抽提物进行离心分离，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，并在温度为30℃～70℃、pH为6.0～10.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提2h～12h，再对抽提物进行离心分离，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，进行干燥，即得到酵母葡聚糖粉；
作为优选，在步骤A中，将啤酒废酵母进行过筛、脱苦、脱臭处理后配制成酵母浓度以重量计为1％～20％的悬浮液，再加入氯化钠，使悬浮液中的氯化钠浓度以重量计为1％～20％，然后使用氢氧化钠将该悬浮液的pH值调节至7.5，接着使用不锈钢反应釜在温度50℃～100℃的条件下抽提2h～12h，将得到的抽提物迅速冷却至室温，再用板框压滤机过滤，得到的滤渣即为啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣；
作为优选，在步骤A中，所述悬浮液a中啤酒废酵母残渣的浓度以重量计为5％～15％、氢氧化钠的浓度以重量计为5％～10％；
作为优选，在步骤A中，所述微生物蛋白酶制剂为枯草芽孢杆菌蛋白酶，酶活力与底物浓度之比为1000U/g～10000U/g；
作为优选，步骤A、步骤B中的离心分离均采用碟片离心机，转速为5000r/min，分离时间为20min；
作为优选，在步骤B中，将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为5％～15％的悬浮液b，所述胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为500U/g～5000U/g；
作为优选，步骤C中的干燥方式为滚筒干燥，进水温度为100℃～200℃，出水温度为50℃～90℃，滚筒转速为1r/min～50r/min；
根据上述方法所得到的酵母葡聚糖粉具有下述特性：性状为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量≤7％，水分含量≤7％，总糖含量≥80％。
本发明是以啤酒厂生产啤酒后的啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣为原料，采用两次酶法抽提得到酵母葡聚糖。第一次用酶-碱法抽提除去碱溶性甘露聚糖，第二次用酶法抽提除去细胞壁上的蛋白。酵母细胞壁主要是由内层的葡聚糖和外层的甘露聚糖组成，中间夹杂着胞壁蛋白质，这些蛋白还以共价键与甘露聚糖连接着，而大部分的葡聚糖是不溶于碱性溶液的，但甘露聚糖则是碱溶性的。本发明采用氢氧化钠溶液对酵母细胞壁进行抽提，并且在抽提时加入蛋白酶，水解与甘露聚糖连接的蛋白质，使得细胞壁上的甘露聚糖抽提得更彻底，实现两种多糖的完全分离，大大提高沉淀中葡聚糖的纯度。同时在第二次抽提中，也加入蛋白酶，将附着在细胞壁上剩余的蛋白水解成肽和氨基酸，释放到水溶液中，使得沉淀中葡聚糖的纯度进一步提高。
本发明在第一次用抽提时加入微生物蛋白酶试剂是因为这种蛋白酶纯化得不完全，还带有纤维素酶以及葡聚糖酶的活性，它不仅能水解连接着甘露聚糖的蛋白质，使得甘露聚糖更容易从细胞壁上释放出来，使甘露聚糖抽提更彻底，而且还能水解葡聚糖和甘露聚糖之间的连接键，使得甘露聚糖和葡聚糖能更彻底的分开。
本发明在第二次抽提时加入胰蛋白酶制剂进行水解是因为它具有很强的酶活力以及针对酵母细胞壁蛋白的特异水解能力，能将细胞壁上的蛋白水解干净，从而释放到溶液中，进一步提高沉淀中葡聚糖的纯度。
啤酒酵母是啤酒生产的工业副产品，其作为饲料原料，安全而可靠，根据本发明方法所得到的酵母葡聚糖粉纯度较高，而且提取率≥36％，可以直接用于饲料加工。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法采用两次酶解法从啤酒废酵母残渣中提取碱葡聚糖，不仅操作简单，而且葡聚糖的提取纯度高，还可以避免资源的浪费，节约成本，降低啤酒工业中啤酒废酵母残渣的排放对环境的不利影响；同时，本发明方法可以与用啤酒废酵母提取核糖核酸的方法结合使用，为啤酒废酵母的综合利用开辟了一条新的途径，实现啤酒废酵母的增值增效，延长拓宽产业链条，产生巨大的经济效益。
具体实施方式
为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通过具体的实施例进行详细地说明：
实施例一
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为10％的悬浮液a，加入氢氧化钠、枯草芽孢杆菌蛋白酶，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为7.5％，枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活力与底物浓度之比为5500U/g，然后在温度为50℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提5.5h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为10％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为2500U/g，然后在温度为50℃、pH为8.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提7h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为150℃、出水温度为70℃、滚筒转速为25r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为5.6％，水分含量为5.1％，总糖含量(以葡萄糖计)为84.7％。
实施例二
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为15％的悬浮液a，加入氢氧化钠、微生物蛋白酶试剂，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为10％，微生物蛋白酶试剂的酶活力与底物浓度之比为10000U/g，然后在温度为70℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提1h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为15％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为5000U/g，然后在温度为70℃、pH为10.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提2h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为200℃、出水温度为90℃、滚筒转速为50r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为6.9％，水分含量为6.3％，总糖含量(以葡萄糖计)为82.1％。
实施例三
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为5％的悬浮液a，加入氢氧化钠、枯草芽孢杆菌蛋白酶，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为5％，枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活力与底物浓度之比为1000U/g，然后在温度为30℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提10h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为5％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为500U/g，然后在温度为30℃、pH为6.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提12h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为100℃、出水温度为50℃、滚筒转速为1r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为7％，水分含量为7％，总糖含量(以葡萄糖计)为80％。
实施例四
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母进行过筛、脱苦、脱臭处理后配制成酵母浓度以重量计为1％的悬浮液，再加入氯化钠，使悬浮液中的氯化钠浓度以重量计为1％，然后使用氢氧化钠将该悬浮液的pH值调节至7.5，接着使用不锈钢反应釜在温度50℃℃的条件下抽提12h，将得到的抽提物迅速冷却至室温，再用板框压滤机过滤，得到的滤渣即为啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣；
再将得到的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为6％的悬浮液a，加入氢氧化钠、微生物蛋白酶试剂，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为5％，微生物蛋白酶试剂的酶活力与底物浓度之比为5000U/g，然后在温度为60℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提10h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为10％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为1000U/g，然后在温度为55℃、pH为8.5的条件下使用不锈钢反应釜抽提12h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为150℃、出水温度为70℃、滚筒转速为20r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为5.5％，水分含量为7％，总糖含量(以葡萄糖计)为83.4％。
实施例五
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母进行过筛、脱苦、脱臭处理后配制成酵母浓度以重量计为10％的悬浮液，再加入氯化钠，使悬浮液中的氯化钠浓度以重量计为10％，然后使用氢氧化钠将该悬浮液的pH值调节至7.5，接着使用不锈钢反应釜在温度75℃的条件下抽提7h，将得到的抽提物迅速冷却至室温，再用板框压滤机过滤，得到的滤渣即为啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣；
再将得到的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为8％的悬浮液a，加入氢氧化钠、枯草芽孢杆菌蛋白酶，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为6％，枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活力与底物浓度之比为3000U/g，然后在温度为60℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提10h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为13％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为2000U/g，然后在温度为55℃、pH为8.5的条件下使用不锈钢反应釜抽提10h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为140℃、出水温度为50℃、滚筒转速为30r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为5.9％，水分含量为6.4％，总糖含量(以葡萄糖计)为81.7％。
实施例六
一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母进行过筛、脱苦、脱臭处理后配制成酵母浓度以重量计为20％的悬浮液，再加入氯化钠，使悬浮液中的氯化钠浓度以重量计为20％，然后使用氢氧化钠将该悬浮液的pH值调节至7.5，接着使用不锈钢反应釜在温度100℃的条件下抽提2h，将得到的抽提物迅速冷却至室温，再用板框压滤机过滤，得到的滤渣即为啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣；
再将得到的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成以重量计浓度为12％的悬浮液a，加入氢氧化钠、枯草芽孢杆菌蛋白酶，悬浮液a中氢氧化钠的浓度以重量计为9％，枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶活力与底物浓度之比为7000U/g，然后在温度为45℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提8h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为8％的悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，悬浮液b中胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为4000U/g，然后在温度为60℃、pH为8.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提6h，再用碟片离心机以5000r/min的转速对抽提物进行离心分离20min，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，在进水温度为160℃、出水温度为60℃、滚筒转速为35r/min的条件下进行滚筒干燥，即得到酵母葡聚糖粉。
根据本方法得到的酵母葡聚糖粉为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量为6.2％，水分含量为6.6％，总糖含量(以葡萄糖计)为80.7％。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从啤酒废酵母残渣中提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于它包括以下步骤：
A、酶-碱法提纯
将啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣用水洗涤，然后配成悬浮液a，加入氢氧化钠、微生物蛋白酶制剂，并在温度为30℃～70℃的条件下使用不锈钢反应釜抽提1h～10h，再对抽提物进行离心分离，取沉淀a；
B、酶法再提纯
将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成悬浮液b，加入胰蛋白酶制剂，并在温度为30℃～70℃、pH为6.0～10.0的条件下使用不锈钢反应釜抽提2h～12h，再对抽提物进行离心分离，取沉淀b；
C、干燥
将步骤B得到的沉淀b用水洗涤后，进行干燥，即得到酵母葡聚糖粉；
在步骤A中，所述微生物蛋白酶制剂为枯草芽孢杆菌蛋白酶；
步骤A、步骤B中的离心分离均采用碟片离心机，转速为5000r/min，分离时间为20min。
2.根据权利要求1所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于在步骤A中，将啤酒废酵母进行过筛、脱苦、脱臭处理后配制成酵母浓度以重量计为1％～20％的悬浮液，再加入氯化钠，使悬浮液中的氯化钠浓度以重量计为1％～20％，然后使用氢氧化钠将该悬浮液的pH值调节至7.5，接着使用不锈钢反应釜在温度50℃～100℃的条件下抽提2h～12h，将得到的抽提物迅速冷却至室温，再用板框压滤机过滤，得到的滤渣即为啤酒废酵母提取细胞内容物后剩余的啤酒废酵母残渣。
3.根据权利要求1所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于在步骤A中，所述悬浮液a中啤酒废酵母残渣的浓度以重量计为5％～15％、氢氧化钠的浓度以重量计为5％～10％。
4.根据权利要求1所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于在步骤A中，所述微生物蛋白酶制剂，酶活力与底物浓度之比为1000U/g～10000U/g。
5.根据权利要求1所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于在步骤B中，将步骤A得到的沉淀a用水洗涤后配成以重量计浓度为5％～15％的悬浮液b，所述胰蛋白酶制剂的酶活力与底物浓度之比为500U/g～5000U/g。
6.根据权利要求1所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法，其特征在于步骤C中的干燥方式为滚筒干燥，进水温度为100℃～200℃，出水温度为50℃～90℃，滚筒转速为1r/min～50r/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的提取碱不溶性葡聚糖的方法所得到的酵母葡聚糖粉，其特征在于它具有下述特性：性状为干燥无定型粉，均匀一致，颜色为灰白色，无味，难溶于水，以重量计，其灰分含量≤7％，水分含量≤7％，总糖含量≥80％。
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