JP6105553B2 - 新規バチルス属微生物およびその利用 - Google Patents
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Description
16S rDNA−Fullによる菌種の同定については、アクロモペプチダーゼ(和光純薬工業(株))でDNAを抽出し、PrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ(株))のPCRを使用し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、CA、USA)のサイクルシークエンスを用い、使用プライマーは(PCR増幅:9F、1510R、シークエンス:9F、785F、802R、1510R)、シークエンスはABIPRISM3130xl Genetic Analyzer System(Applied Biosystems、CA、USA)で、塩基配列の決定にはChromasPro1.4(Technelysium Pty Ltd.,Tewantin、USA)を用い、相同性検索および簡易系統解析にはソフトウェアとしてアポロン2.0、データベースとしてアポロンDB−BA7.0((株)テクノスルガ・ラボ)、国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/Embl)を使用した。また、HB−113については、検索法に則り(スポア実験マニュアル p110〜111、技報堂出版)、各種の検索を行うと共にAPIシステムにて同定を行った。
有用菌のスクリーニング
土壌、枯れ葉、排水中、食品より、バチルス属に属する微生物を採取し分離した。本発明のために利用した菌の同定は、食品中のバチルス属の一般的分離・同定法(スポア実験マニュアル、p110〜111、技報堂出版)に準じて行なった。
コンピテンス法を用いた形質転換菌の取得
コンピテンスさせる枯草菌のマーバーグ株としては、NBRCにて入手したNBRC14144株を使用した。この株は、ドナーのDNAを菌体内に引きずり込む形質転換の能力を有するが、分泌酵素の種類が少ないのと強さが不足していた。ドナー菌としては、野生の枯草菌中から、酵素を強く分泌する株としてスクリーニングされたバチルスHB−88株を使用した。
分解酵素分泌バチルス属微生物の選出
(1)分泌酵素生産性程度は、「納豆の研究法」、第44頁((株)恒星社厚生閣、木内幹監修)に記載の方法にて行った。標準寒天培地に、検討すべき基質を溶解させ定法に従い滅菌し、直径85mmのポリシャーレに流しプレートを作成した。力価は直径8mm、厚さ1.5mmのペーパーディスク(東洋濾紙(株))を使用して、コロニー外側のクリアゾーンを測定した。測定する菌液は全て普通ブイヨン培地にて、20時間の撹拌培養後に画線培養し、有効であった菌液を30〜70μlディスクに含ませた後に測定プレートに添付した。力価の判定はクリアゾーンがコロニー外縁より1mm以内を(+)、2〜3mmを(++)、3mm以上を(+++)として判定した。なお、クリアゾーンが作成されないものは(−)とした。
トリブチリン3%を含む標準寒天培地を滅菌した後ポリトロン(POLYTRON) ホモジナイザー(KINEMATICA.CH)20000rpm5分で乳化し、シャーレに流し込み、脂質分解性確認プレートを作製した。第一スクリーニングとして、このプレートに先に分離したバチルス属微生物を画線培養し、脂質の分解性を確認した。陽性の菌液70μlをディスクに含ませ、プレートに載せ37℃で5日間恒温器に入れ、クリアゾーンを測定した。コロニーが大きく成長した際は、下部が透明であればクリアーゾーンに加えた。HB−14株、HB−88株、HB−113株はともに(+++)であった。
可溶性デンプン(和光純薬工業(株))3%を含む標準寒天培地を滅菌した後、シャーレに流し込み、デンプン分解性確認プレートを作製した。第一スクリーニングとして、このプレートに先に分離したバチルス属微生物を画線培養し、デンプンの分解性を確認した。陽性の菌液30μlをディスクに含ませ、プレートに載せ、37℃で8時間恒温器に入れ、ルゴール液適してクリアゾーンを測定した。HB−14株、HB−88株、HB−113株はともに(+++)であった。
豆乳(株式会社 ふくれん)10%を含む標準寒天培地を滅菌した後、シャーレに流し込み、植物性タンパク質分解性確認プレートを作製した。第一スクリーニングとして、このプレートに先に分離したバチルス属微生物を画線し、タンパク質の分解性を確認した。陽性の菌液50μlをディスクに含ませ、プレートに載せ、37℃で3日間恒温器に入れ、クリアゾーンを測定した。HB−14株、HB−88株、HB−113株はともに(+++)であった。
大腸菌(E.coli NBRC14237株)を普通ブイヨン培地にて20時間培養し、滅菌した標準寒天培地に1%添加し、均質に混合し、シャーレに細菌分解性確認プレートを作製した。第一スクリーニングとして、このプレートに、先に分離したバチルス属微生物を画線し、細菌の分解性を確認した。陽性の菌液70μlをディスクに含ませ、プレートに載せ37℃2日間恒温器に入れ、クリアゾーンを測定した。HB−14株、HB−88株、HB−113株はともに(+++)であった。
細胞壁の分解を明確にするため、大腸菌および乳酸菌をそれぞれ20時間培養し、これらのそれぞれの培養液160mlを5000rpmで15分遠心し、菌体を分離した。この大腸菌および乳酸菌の菌体それぞれを80mlの滅菌生理食塩水(0.85%)にて2回遠心洗浄し、20mlの菌液とした。この菌液を85℃10分殺菌し、冷水冷却後、滅菌した標準寒天培地に5%(V/V)添加し、均質に混合し大腸菌用及び乳酸菌用の細胞壁分解性確認プレートを作製した。第一スクリーニングとして、このプレートに、先に分離したバチルス属微生物を画線し、細菌の分解性を確認した。陽性の菌液70μlをディスクに含ませ、先のそれぞれのプレートに載せ37℃10時間恒温器に入れ、クリアゾーンを測定した。HB−14株、HB−88株、HB−113株は大腸菌及び乳酸菌に関しても、ともに(+++)であった。
先に記載した大腸菌を、普通ブイヨン培地にて20時間培養し、40mlの培養液を5000回転(rpm)で15分間遠心分離した。生理食塩水(0.85%)で同様に遠心洗浄し、これを3回繰り返した。全量の洗浄済みの菌、20%に、最低限必要な無機塩類(NH4NO3;1.0%、KH2PO4;0.25%、MgSO4・7H2O;0.25%、FeSO4・7H2O;0.0002%)及び寒天を加えて、シャーレに細菌分解性確認プレートを作製した。このプレートに画線し37℃で2日間恒温器にて培養し分解性を確認したところ、HB−14株、HB−88株、HB−113株では、その生育性が確認されると共にコロニー付近の培地が透明になった。なお、陽性株に対しては、上記無機塩のみの寒天培地では成育しない事を確認した。
好気処理の一般分析値
脂肪、細胞壁、タンパク質、デンプン分解性酵素を豊富に分泌し、且つ、溶菌した菌を栄養源として、生育できるHB−113(NITE BP−1277)を用いた。乳製品メーカーの排水を原水調整槽から200Lを500Lのタンクにとり、上記の菌を100mg/L加え、微細気泡発生装置MAB((株)日本水処理技研)を使用し、発生時溶存酸素10mg/L(25℃)以上の好気性条件にて24時間処理した。排水を処理した際の分析値を下記の表4、5に示す。HB−113菌添加処理した槽が、BOD、COD,N−ヘキサン、SSのカット率が無添加に比較して非常に良好な結果を示した。
汚泥の減容化試験
7%の牛乳を含む水を排水の原水モデルとし、その200mlに、普通ブイヨン培地(栄研化学(株))で培養したバチルス HB−14株(NITE BP−1275)を2ml加え、30℃にて24時間、攪拌培養して前段培養とした。この前段培養液を800mlの菓子を製造している食品会社の排水処理の汚泥液(被検汚泥液;COD=31)に加え、熱帯魚に使用するエアーストーンを通して汚泥が循環する強さ(1.2〜2.0mg 酸素/L)でエアーを送り、曝気培養した。1日後、200mlのサンプルを採取し、前段培養液を初日と同様に加えた。これを1週間継続し、汚泥量のMLSSの値を測定した。
膜を利用した排水処理での目詰まり防止試験
(1)10%の豆乳(成分無調整豆乳;株式会社 ふくれん)1000mlを排水原液モデルとして使用した。この液に、普通ブイヨン培地で20時間培養したバチルス・サブチルスHB−88株(NITE ABP−1276)を20ml加え、熱帯魚に使用するエアーストーンを通して汚泥が循環する強さ(1.2〜2.0mg 酸素/L)でエアーを送り、終日曝気培養した。1日後〜4日後にそれぞれ200mlのサンプルを採取し、その都度10%の豆乳排水原液モデルを加えて1000mlにし、曝気培養を継続した。各々のサンプルは、MLSSを測定した後に遠心(3000rpm)し、0.45ミクロンの除菌膜を使用することで5日間排水が可能であった。
排水中の油脂低減化試験
(1)無機塩((NH4)2SO4:5.0g、Na2HPO4:0.5g、MgSO4・7H2O:0.25g、CaCO3:5.0)を溶解した水溶液500mlを滅菌し、これに脱脂乳(タカナシ無脂肪乳)100mlを水で500mlとした溶液を加え、あわせて1000mlとしたものを前培養液とした。この前培養液は2セット準備した。
大腸菌抑制作用
無機塩((NH4)2SO4:5.0g、Na2HPO4:0.5、MgSO4・7H2O:0.25g、CaCO3:5.0)を970mlの水に溶解し、これに牛乳30ml(脂肪率3.6%)を加えて1000mlの油脂含有排水モデルとした。これに普通ブィヨン培地中、30℃で2日間攪拌培養した酵母(YH−01株)培養液10ml、普通ブィヨン培地で35℃1日攪拌培養したHB−88株(NITE BP−1276)培養液10mlおよび普通ブイヨン培地で35℃1日静置培養した大腸菌(NBRC14237株)10mlを加え、32℃で3日間、緩やかに攪拌培養を行った。1日後と3日後に分析サンプルを採取し、油脂含有率と添加したそれぞれの菌数を計測した。菌数の測定法は定法に従い生理食塩滅菌水で適切に希釈し、酵母(YH−01)の検出はサブロウ―寒天培地(栄研)を使用し30℃で5日間、バチルス(HB−88)は標準寒天培地を使用し37℃で2日間培養した。大腸菌は原液をデオキシコーレイト培地のプレートに0.1ml塗布し37℃で2日間培養した。結果を表8に示す。この結果、1日後、3日後共に大腸菌が減少し、油脂の分解性も実施例4と同様に十分に分解された。
2 … … 処理槽
3 … … 被処理水
4 … … 曝気パイプ
5 … … 曝気孔
6 … … 被処理水流入配管
7 … … 処理剤投入装置
8 … … 処理剤注入管
9 … … 微細気泡発生装置
10 … … 水中ポンプ
11 … … 被処理水排出配管
Claims (5)
- バチルスHB−14株(NITE BP−1275)、バチルスHB−88株(NITE BP−1276)又はバチルスHB−113株(NITE BP−1277)と命名された新規微生物。
- 請求項1記載の新規微生物を含む、余剰汚泥減容化のための排水処理生菌剤。
- 請求項1記載の新規微生物と油脂資化性酵母を含む油脂含有排水処理生菌組成物。
- 排水処理施設の被処理水中に、請求項1記載の新規微生物を、単独あるいは2種以上混合して添加することを特徴とする、余剰汚泥の減容化方法。
- 固液分離膜を用いて除水する固液分離排水処理方法において、前記固液分離膜に、請求項1記載の新規微生物を、単独あるいは2種以上混合して作用させることを特徴とする、膜通過のフラックス低下を抑制する方法。
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