BR112021000601A2 - Processo microbiológico para a produção de pão de abelha - Google Patents

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Giammaria Giuliani
Marco Gobbetti
Raffaella Di Cagno
Pasquale Filannino
Vincenzo Cantatore
Antonio Mascolo
Barbara Marzani
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Giuliani S.P.A.
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Abstract

"processo microbiológico para a produção de pão de abelha". a presente invenção se refere a um processo biotecnológico para a produção de um pólen fermentado compreendendo a inoculação do pólen com pelo menos uma bactéria láctica da espécie lactobacillus kunkeei selecionada do lactobacilus kunkeei pf12 (dsm 32843), pf13 (dsm 32845) e/ou pl13 (dsm 32844) e a fermentação do pólen inoculado com a referida bactéria láctica. o pólen fermentado obtido possui propriedades nutricionais e organolépticas semelhantes ao pão de abelha naturalmente produzido dentro do favo de mel da colmeia e encontra aplicação no campo alimentício e nutracêutico. a invenção engloba, adicionalmente, lactobacilus kunkeei pf12 (dsm 32843), pf13 (dsm 32845) e/ou pl13 (dsm 32844) como tal e composições englobando essas cepas.

Description

"PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA A PRODUÇÃO DE PÃO DE ABELHA" CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um processo microbiológico para a produção de pão de abelha.
[002] A presente invenção tem origem no campo dos processos biotecnológicos para a produção de produtos nutricionais, dietéticos ou alimentícios.
[003] Em particular, a presente invenção refere-se a um processo biotecnológico para a produção de pólen fermentado semelhante ao pão de abelha produzido naturalmente nos favos de mel da colmeia.
ANTECEDENTES
[004] O pólen é o elemento germinativo masculino das plantas, fanerógama, que se situa em forma pulverulenta nas anteras florais colocadas na parte terminal dos estames das flores e consiste em estruturas microscópicas às quais as plantas confiam o transporte de suas células germinativas. As abelhas o recolhem e utilizam o mesmo para a produção de geleia real e para alimentação das larvas.
[005] Na natureza, o pólen é a principal fonte de proteínas, lipídios, esteróis, minerais e vitaminas para as abelhas (Apis mellifera L.), enquanto no setor alimentício e dietético tornou-se objeto de crescente interesse devido ao seu alto teor de nutrientes.
[006] As abelhas coletam o pólen das inflorescências das plantas ou do meio ambiente e o depositam em colmeias onde é misturado ao néctar, mel e secreções glandulares, formando grânulos que constituem a principal fonte proteica das larvas e dos insetos adultos.
[007] O pólen dentro dos favos de mel da colmeia é submetido a uma série de transformações bioquímicas principalmente por bactérias do ácido láctico e outros microrganismos. O pólen fermentado dentro dos favos de mel é denominado “pão de abelha” (Vasquez & Olofsson, 2009).
[008] O pão de abelha tem uma composição diferente em relação ao pólen inicial, pois este sofreu modificações bioquímicas, como a redução de polissacarídeos complexos, alterações no perfil de aminoácidos, proteínas e lipídios e aumento de carboidratos simples e na acidez por titulação (Lee e outros, 2014; Human e Nicolson, 2006; Andelkovic e outros., 2012).
[009] Essas variações tornam o pão de abelha um ambiente microbiologicamente estável e, além disso, a fermentação do pólen nos favos de mel aumenta sua digestibilidade e valor nutricional em comparação com o pólen fresco.
[010] As propriedades nutricionais e funcionais, como a atividade antioxidante, anti- inflamatória, hepato protetora, antiaterosclerose e imunomoduladora, tornam o pão de abelha um produto adequado para a dieta humana (Markiewicz-Zukowska e outros, 2013; Nagai e outros, 2004; Denisow e Denisow - Pietrzyk, 2016).
[011] Contudo, a quantidade de pão de abelha disponível é inadequada em relação à demanda do mercado, uma vez que a retirada dos favos de mel é cara, pode causar danos à estrutura da colmeia e em qualquer caso a quantidade presente nas colmeias não é capaz de satisfazer a crescente demanda do mercado. A falta desse produto determina um alto preço de mercado.
[012] Na tentativa de superar essas limitações e desvantagens, os apicultores coletam o pólen diretamente das abelhas forrageiras na entrada das colmeias, com o auxílio de “armadilhas polínicas” constituídas por grades que retêm o pólen em sua superfície.
[013] Porém, ao contrário do pão de abelha, que não requer nenhum tipo de condicionamento, o pólen fresco não é um substrato estável e pode estimular a produção de micotoxinas. O pólen fresco coletado, portanto, precisa ser seco ou congelado antes de ser armazenado. No entanto, verificou-se que a secagem, quando realizada a temperaturas superiores a 35°C, provoca uma perda de nutrientes e compostos voláteis. Por outro lado, o congelamento apresenta altos custos de produção.
[014] Um compromisso entre as duas tecnologias é representado pela desumidificação à baixa temperatura. No entanto, essa tecnologia tem se mostrado menos eficaz do que o congelamento, na manutenção das propriedades organolépticas e nutricionais do pão de abelha. Atualmente, portanto, é sentida a necessidade de pão de abelha de origem diferente da natural, que tenha propriedades organolépticas e nutricionais semelhantes ao produto in natura, em quantidades adequadas às necessidades do mercado.
[015] Diante do exposto, faz parte dos objetivos gerais da presente invenção um processo industrial de produção de pão de abelha que permita obter uma quantidade de produto adequada às necessidades do mercado, ao mesmo tempo que protege a estrutura da colmeia.
[016] Um dos objetivos da presente invenção é fornecer um processo microbiológico para a produção de pão de abelha com propriedades organolépticas semelhantes às do produto natural.
[017] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um processo biotecnológico para a produção de pão de abelha com um valor nutricional e funcional superior ao do pólen fresco.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[018] A presente invenção tem origem na observação de que ao realizar uma fermentação do pólen com bactérias frutofílicas lácticas selecionadas, se reproduzem condições ambientais semelhantes às típicas da fermentação natural que levam à formação do pão de abelha.
[019] Em particular, verificou-se que ao fermentar o pólen com bactérias lácticas frutofílicas específicas em combinação com uma levedura selecionada, o pólen fermentado é obtido, o qual pode ser assimilado com o pão de abelha produzido naturalmente, aumentando o rendimento da produção para a mesma quantidade inicial de pólen.
[020] O Requerente identificou, portanto, cepas selecionadas de bactérias lácticas que usam frutose como o substrato preferido, em relação à glicose como uma fonte de carbono para a produção de pão de abelha e as usou em um processo biotecnológico para produzir pão de abelha sintético ou semissintético.
[021] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um processo microbiológico para a produção de pão de abelha que compreende: uma etapa a) de preparação do inoculo e inoculação de pólen com bactérias lácticas de partida usando frutose como substrato preferido em relação à glicose como fonte de carbono para a produção de pão de abelha e uma etapa b) da fermentação do pólen, sendo o referido processo caracterizado pelo fato de que as bactérias lácticas de partida inoculadas pertencerem à espécie Lactobacillus kunkeei.
[022] Os inventores também descobriram que as cepas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e suas misturas são particularmente adequadas como bactérias iniciadoras de ácido láctico do processo da invenção.
[023] Vantajosamente, o pão de abelha obtido com o processo biotecnológico da invenção é fornecido com um valor nutricional e uma vida útil mais longa do que o pólen de origem natural.
[024] O pão de abelha obtido a partir do processo da invenção também tem um valor nutricional mais alto do que o pólen usado como matéria-prima do processo.
[025] Especificamente, o pão de abelha ou pólen fermentado obtido pelo processo microbiológico/biotecnológico da invenção tem um teor total de aminoácidos e peptídeos livres maior do que o pólen não fermentado usado como matéria-prima e um teor maior de proteínas digestíveis.
[026] Além disso, o pão de abelha ou pólen fermentado obtido tem níveis mais elevados de compostos fenólicos livres solúveis, tipicamente fornecidos com atividade antioxidante celular, do que o pólen inicial.
[027] A combinação de características nutricionais e de longa duração do pão de abelha obtido com o presente processo são apreciáveis no contexto nutricional e dietético e o tornam adequado para a formulação de produtos nutracêuticos, dietéticos ou alimentícios.
[028] Vantajosamente, o pão de abelha obtido com o presente processo apresenta uma composição química típica do pão de abelha, obtido protegendo a estrutura da colmeia. De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um pão de abelha ou pólen fermentado obtido com o processo definido de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento.
[029] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende pão de abelha ou pólen fermentado obtido com o processo descrito no presente documento e um veículo comestível.
[030] Outro objeto da presente invenção são bactérias lácticas selecionadas pertencentes à espécie Lactobacillus kunkeei, preferencialmente selecionadas de PF12, PF15 e PL13 e suas misturas.
[031] De acordo com um aspecto, a invenção se refere a três cepas bacterianas pertencentes à espécie Lactobacillus kunkeei, em que as referidas cepas são:
[032] Lactobacillus kunkeei PF12 depositado com o número de acesso DSM 32843 em 4 de julho de 2018 no International Deposit Centre Leibniz-lnstitut DSMZ -
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;
[033] Lactobacillus kunkeei PF15 depositado com o número de acesso DSM 32845 em 4 de julho de 2018 no International Deposit Centre Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;
[034] Lactobacillus kunkeei PL 13 depositado com o número de acesso DSM 32844 em 4 de julho de 2018 no International Deposit Centre Leibniz-lnstitut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;
[035] As três cepas previamente identificadas, cuja certificação está anexada, foram depositadas em nome da empresa Giuliani S.p.A, proprietária dos direitos do presente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[036] As características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir dos desenhos anexos, em que: - A figura 1 mostra um gráfico que ilustra os valores de densidade celular de bactérias lácticas (Log CFU g-1) (linhas sólidas) e acidez titulável (mL 0,1 M NaOH 10 g-1) (TTA) (linhas tracejadas) durante a incubação, a 30°C por 9 dias, do pólen inoculado com o iniciador misto (composto por Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B) (símbolos sólidos) e pólen não inoculado submetido à fermentação espontânea (símbolos em branco);
- A figura 2 mostra os valores de concentração (mg kg-1) de aminoácidos livres no pólen fresco (barras pretas) e no pólen fermentado a 30°C por 216 h (barras vermelhas) com o iniciador misto (composto de Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B); - A figura 3 mostra um gráfico de barras A com os valores de digestibilidade in vitro de proteínas (expressos como % das proteínas totais) em pólen fresco (barra preta) e em pólen fermentado a 30ºC por 216 h (barra vermelha) com o iniciador misto (composto de Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B), e um gráfico B mostrando duas curvas relacionadas ao perfil de peptídeo determinado por cromatografia de exclusão molecular (RP- FPLC, 214 nm) em pólen fresco (barra preta) e no pólen fermentado a 30°C por 216 h (barra vermelha) com o iniciador misto (composto por Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B); - A figura 4 mostra os gráficos de barras relacionados à concentração (g ácido gálico eq kg-1 peso seco) dos compostos fenólicos livres solúveis em água (barras brancas) e metanol (barras cinza) em pólen fresco e em pólen fermentado a 30°C por 216 h com o iniciador misto (composto de Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B). - A figura 5 mostra gráficos de barras relacionados à porcentagem de viabilidade celular em queratinocitos humanos NCTC2544 após a indução de estresse oxidativo induzido com H2O2 1 mM de acordo com o teste do Exemplo 12. As células foram previamente incubadas por 16h com 100, 250 e 500 µg/mL de amostra B, FER867, FER868,
FER869, FER870 e FER871. Células não tratadas (Controle). Células tratadas com H2O2 1 mM (células estressadas com H2O2), * (p <0,05), **(p <0,01), *** (p <0,005), **** (p <0,001).
[037] Esses resultados são indicativos da proteção dos compostos testados sobre o estresse oxidativo induzido e destacam o efeito antioxidante acentuado do pão de abelha fermentado obtido com o processo da invenção. - As Figuras 6A e 6B mostram gráficos de barras relacionados à expressão do gene TNFa em queratinocitos humanos NCTC2544 avaliados por qRT-PCR de acordo com o Exemplo 12. As células foram tratadas a 37°C durante 16(A) e 24h (B), 5% de CO2 com: RPMI 2,5% FCS (Controle); RPMI 2,5% FCS e 10 µg/mL LPS (Controle + LPS); 100, 250 e 500 µg/mL amostra A (FRESH), B (CONTROLE) e FER867, FER868, FER869, FER870 e FER871. Células não tratadas (Controle). Células tratadas com 10 μg/mL de LPS (LPS). Os valores representam a média ± SEM de dois experimentos realizados em duplicata. Esses resultados são indicativos de atividade anti-inflamatória e destacam o acentuado efeito anti-inflamatório do pão de abelha fermentado obtido com o processo da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[038] De acordo com um aspecto geral da invenção, um processo microbiológico é fornecido para a produção de um pólen fermentado semelhante ao pão de abelha, em que o material de partida à base de pólen é inoculado com uma ou mais cepas selecionadas de bactérias lácticas vantajosamente da espécie Lactobacillus kunkeei, para realizar uma fermentação que reproduza substancialmente a fermentação que ocorre na natureza do pólen armazenado dentro dos favos de mel da colmeia.
[039] De acordo com um aspecto geral, a invenção se refere a um processo de fermentação de pólen de acordo com a reivindicação 1.
[040] Outras modalidades do processo da invenção são definidas nas reivindicações 2-7.
[041] Os inventores observaram que o pólen fermentado obtido com o processo da invenção tem melhores características nutricionais, tanto no que diz respeito ao pólen fresco como o pão de abelha fermentado naturalmente nas colmeias juntamente com uma vida útil mais longa. Esta combinação de características torna o pólen fermentado obtido com o processo da invenção particularmente adequado como um produto nutricional, dietético ou nutracêutico. A título de exemplo, o teor de polifenol livre total presente no pólen fermentado obtido com o processo da invenção é igual a 84,64 g eq. ácido gálico por kg de peso seco, quantidade consideravelmente superior ao teor indicado na literatura para o pão de abelha obtido com a fermentação natural que é igual a 8,9 - 36,52 g de ácido gálico equivalente por kg de peso seco, conforme descrito na literatura por Markiewicz- Zukowska e outros, 2013; Oltica e outros, 2007; Zuluaga e outros, 2015.
[042] O material de partida do processo descrito no presente documento se baseia ou consiste em pólen. Um pólen adequado pode ser fresco ou desumidificado. Este último é mais adequado para a implementação do processo em escala industrial.
[043] Um pólen desumidificado adequado é aquele que após a coleta é submetido à secagem em corrente de ar quente, por exemplo, para obter uma porcentagem de umidade igual ou inferior a 12%. Baixas porcentagens de água, por exemplo, umidade relativa abaixo de 0,5, tornam o pólen uma matéria-prima suficientemente estável, se devidamente embalado e armazenado. Normalmente, o pólen desumidificado apresenta-se na forma de grânulos cuja cor é função da espécie ou das diferentes espécies botânicas visitadas pelas abelhas.
[044] A título de exemplo, um pólen multiflora desumidificado adequado tem as seguintes características organolépticas: - Aparência: grânulos de pequeno tamanho, de cor variável dependendo da espécie botânica de origem. - Odor: vegetal, de grama seca. - Sabor: característico, vegetal, de flores secas, de feno. Solubilidade: pouco solúvel em água e em solventes orgânicos. - Água: 7 a 15% - Glúcidos: 25 a 48% - Proteínas: 11 a 28% - Lipídeos: 1 a 14% - Sais minerais: 1 a 5%
[045] Dentro do processo descrito neste documento, o pólen desumidificado que normalmente ocorre na forma de grânulos ou partículas aglomeradas, pode ser usado como está ou pode ser previamente tratado para degradar ou quebrar a casca externa dos grânulos para tornar o conteúdo interno disponível para a atividade fermentativa dos microrganismos inoculados.
[046] De modo a romper a camada de revestimento dos grãos de pólen, tipicamente composta por celulose, substâncias pécticas, carotenoides e polifenóis, é possível usar um tratamento físico, por exemplo um tratamento mecânico ou um tratamento biológico.
[047] Os tratamentos mecânicos adequados incluem cominuição, pulverização, micronização, alta pressão e/ou ultrassom do pólen ou um tratamento térmico.
[048] Para degradar a parede externa do grânulo de pólen é possível realizar uma fragmentação ou redução dimensional dos grânulos em partículas menores ou outras tecnologias que não modifiquem substancialmente as características nutricionais da matriz de partida ou do pólen, ou que permitam a obtenção de produtos com maior valor nutricional. A degradação da camada externa dos grãos de pólen pode compreender um tratamento para a redução do seu tamanho, recorrendo a equipamentos tradicionalmente utilizados na indústria alimentícia ou farmacêutica.
[049] A título de exemplo, podem ser usados equipamentos que envolvam a passagem de pólen através de uma malha de metal com lacuna de malha adequada, como granuladores de braço oscilante ou o uso de vários tipos de moinhos, como facas, rolamentos de esferas, etc. ou micronizadores ou combinações desses equipamentos.
[050] A redução de tamanho ou cominuição dos grãos de pólen também pode ser realizada usando técnicas úmidas, por exemplo, usando misturadores de quatro vias com picador e facas, homogeneizadores de rotor de estator imersos no meio fluido, sistemas de ultrassom e outros dispositivos disponíveis comercialmente.
[051] Tratamentos térmicos também podem ser usados opcionalmente em pressão superior à ambiente ou tratamentos de ultrassom ou outros processos que permitem pasteurização a frio com o auxílio de altas pressões, como Processamento de Alta Pressão (HPP). Por exemplo, no caso de tratamento térmico sob pressão, o pólen pode ser convenientemente reconstituído em 10% de água.
[052] No caso do tratamento com ultrassom, o pólen também pode ser usado como está. Também é possível usar como matéria-prima extratos de pólen purificados obtidos de pólen entomófilo previamente sujeito a uma ou mais etapas de extração com solvente, por exemplo, uma mistura de água e álcool.
[053] De acordo com algumas modalidades, a camada de revestimento externa do pólen é quebrada por degradação biológica, por exemplo, tratando o pólen com uma levedura.
[054] Consequentemente, algumas modalidades do processo da invenção fornecem a adição de uma levedura que degrada ou metaboliza o componente de pectina que reveste o grão de pólen. Normalmente, a adição da levedura pode ocorrer antes ou durante a etapa a) do processo. A levedura adicionada entra em contato com os grãos de pólen, desencadeando um processo de desintegração do revestimento externo do pólen que facilita o contato entre os nutrientes presentes no interior do grão e as bactérias lácticas inoculadas na etapa b) do processo.
[055] Normalmente, a adição de levedura é realizada quando o pólen de partida não foi tratado e, em particular, não foi submetido a uma ação mecânica, por exemplo de trituração ou moagem, visando quebrar a camada de revestimento do grão.
[056] De acordo com uma modalidade preferida, a levedura que degrada ou metaboliza o componente de pectina que reveste o grão de pólen pertencente à espécie Wickerhamomyces anomalus ou Hanseniaspora uvarum é uma mistura das duas espécies.
[057] De acordo com uma modalidade, a levedura usada é a cepa Hanseniaspora uvarum AN8Y27B.
[058] Em uma modalidade do processo da invenção, o inoculo é preparado usando o próprio pólen como substrato de crescimento.
[059] Em outras modalidades, o substrato de crescimento dos microrganismos inoculados é um meio de cultura adequado, tal como Frutose Levedura Peptona, FYPed opcionalmente contém levedura ou extratos vegetais e peptonas que fornecem aos microrganismos os nutrientes necessários para um crescimento rápido.
[060] Alternativamente, é possível usar uma mistura de pólen e extratos/peptonas. Em uma forma de realização preferida do processo da invenção, o inoculo de bactérias lácticas e levedura é preparado separadamente.
[061] A etapa b) de fermentação do processo é realizada inoculando bactérias lácticas tipicamente pertencentes ao gênero Lattobacillus, convenientemente da espécie Lactobacillus kunkeei.
[062] De acordo com uma modalidade preferida, a etapa a) do processo compreende a inoculação de bactérias lácticas pertencentes à espécie Lactobacillus kunkeei selecionada a partir das cepas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e suas misturas. Cada uma dessas cepas bacterianas selecionadas tem uma capacidade de crescimento e formação de colônias em um substrato à base de pólen inesperadamente maior do que outros lactobacilos também pertencentes à espécie Lactobacillus kunkeei. Além disso, as referidas três cepas têm uma capacidade surpreendente de acidificar e produzir compostos antimicrobianos, conforme documentado na parte experimental relatada nos Exemplos a seguir.
[063] Vantajosamente, a etapa de fermentação do processo da invenção é realizada dentro de um biorreator, tipicamente em condições aeróbicas. De acordo com algumas modalidades, a umidade do produto dentro do biorreator varia de 30 a 95% da massa total.
[064] Normalmente, a mistura que compreende o pólen e o microrganismo inoculado pode estar na forma semissólida quando os valores de umidade são baixos, por exemplo, de 30 a 45% e na forma semissólida ou líquida quando os valores de umidade são altos, por exemplo, de 60 a 95%.
[065] De acordo com algumas modalidades, o pH do ambiente no biorreator no início da etapa b) de fermentação está na faixa de 4 a 6.
[066] Em uma forma de realização preferida da invenção, o pH do sistema tem um valor entre 5,25 +/- 0,25 e possivelmente corrigido dentro da referida gama pela adição de um corretor de pH convencional.
[067] Normalmente, durante a oferta da etapa b), os seguintes parâmetros e condições de reação são monitorados: - Quantidade de açúcares (glicose e frutose) - Acidez total titulável - pH - Ácido láctico e ácido acético - Densidade celular
[068] O processo pode ser interrompido quando são obtidas as quantidades desejadas de ácidos orgânicos/densidade celular/ácidos fenólicos livres/açúcares residuais/aminoácidos livres. Em uma modalidade do processo da invenção, o pólen fermentado obtido é submetido a uma etapa c) de redução da carga microbiana. De acordo com uma modalidade, o pólen fermentado obtido, opcionalmente sujeito à etapa c), é submetido a uma etapa de secagem a frio, por exemplo, é liofilizado, tipicamente em um liofilizador. Alternativamente, o pólen fermentado pode ser armazenado congelado convenientemente após centrifugação, a temperaturas, por exemplo, da ordem de -40°C ou menos.
[069] Em outra modalidade da invenção, o pólen fermentado é liofilizado com o objetivo de manter os microrganismos vivos e vitais. Alternativamente, o pólen fermentado ou biomassa obtido pode ser armazenado congelado, tipicamente após centrifugação, a temperaturas abaixo de 0, por exemplo, na ordem de -40°C ou inferior.
[070] Para os fins da presente invenção, outras técnicas convencionais também podem ser usadas para remover água do pólen fermentado, por exemplo, recorrendo à secagem por pulverização.
[071] De acordo com uma modalidade, o processo da invenção compreende as seguintes etapas: - fornecimento de material de partida com base em pólen fresco não pré-tratado, de preferência armazenado a - 20°C, ou pólen seco ou desumidificado, convenientemente armazenado a + 4°C ou à temperatura ambiente e/ou opcionalmente pré-tratado por trituração, pulverização, micronização, tratamentos térmicos, alta pressão e/ou tratamentos de ultrassom ou extrato de pólen; - diluição opcional tipicamente com água destilada e correção do valor do pH do pólen até atingir o valor entre 5,25 +/- 0,25; - inoculação de suspensões de células compreendendo bactérias lácticas selecionadas das cepas L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 ou suas misturas, e possivelmente inoculação de levedura com atividade pectinolítica pertencente ao gênero Wickerhamomyces, ou à espécie Hanseniaspora uvarum, por exemplo, cepa AN8Y27B; - adição de água tipicamente destilada até que uma umidade final de 30 a 95% seja atingida. Normalmente, o valor de umidade final também inclui o teor de água inicial do pólen, por exemplo igual a cerca de 21,56% e a água adicionada durante a etapa de inoculação. - Incubação a 30°C preferencialmente por 24 - 216 h em tubos estéreis ou em biorreator, e isolamento do pólen fermentado obtido.
[072] De acordo com algumas modalidades, o pólen fermentado obtido a partir do processo descrito acima pode ser liofilizado em um liofilizador ou pode ser congelado, de preferência após centrifugação, a temperaturas de cerca de -20°C ou menos.
[073] Em certas modalidades, o pólen fermentado pode ser submetido a tratamentos a fim de reduzir a carga microbiana, para remover a água ou a outros tratamentos, a fim de estabilizar o pólen fermentado.
[074] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um pão de abelha ou pólen fermentado obtido com o processo descrito de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento. O pólen fermentado obtido com o processo da invenção tem níveis mais elevados de compostos fenólicos solúveis livres do que o pólen inicial. Esses e outros recursos são ilustrados em detalhes nos exemplos a seguir. Em outras modalidades da invenção, a fração líquida possivelmente resultante da etapa b) de fermentação é separada do componente sólido e usada para fins alimentícios, dietéticos ou nutricionais. As frações líquidas e sólidas podem ter uso nutricional.
[075] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, uma composição nutricional ou dietética é fornecida compreendendo o pólen fermentado obtido de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento e um veículo comestível.
[076] De acordo com um quarto aspecto, é fornecida uma composição compreendendo bactérias lácticas pertencentes às cepas de Lactobacillus kunkeei, cepas de
Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e suas misturas e um veículo comestível.
[077] As cepas bacterianas da composição podem estar vivas e viáveis ou na forma inativada de acordo com as técnicas tradicionais, por exemplo, por finalização. As composições descritas no presente documento são adequadas para administração oral.
[078] As composições para administração oral podem estar na forma sólida ou líquida. No caso da forma sólida, eles contêm o pão de abelha obtido a partir do processo descrito no presente documento como um componente biologicamente ativo e um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis.
[079] As composições de forma sólida típicas compreendem comprimidos, grânulos, cápsulas, pós, formas de dosagem extemporâneas, doces, gomas de mascar, jujubas de composição e forma diferentes.
[080] A presente invenção se aplica a qualquer forma de dosagem sólida, semissólida e líquida que pode se tornar um veículo comestível para administrar a invenção.
[081] A presente invenção aplica-se a todas as formas de dosagem nas quais a preparação é diluída antes da administração ou usada como tal, estando na forma sólida, semissólida ou líquida.
[082] Os comprimidos geralmente compreendem um veículo ou excipiente adequado em que o extrato da planta é disperso, tipicamente na forma seca. Neste caso, os excipientes adequados contidos na formulação são derivados de celulose, tais como hidroximetilcelulose,
hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose, etilhidroxietilcelulose, acetato butirato de celulose, acetato ftalato de celulose e suas misturas.
[083] Exemplos adicionais de excipientes adequados compreendem polímeros pertencentes à família lactama, tais como pirrolidona e seus derivados, por exemplo, polivinilpirrolidona, polivinilpolipirrolidona e suas misturas, sais inorgânicos, tais como cálcio ou fosfato dicálcico, lubrificantes, tais como estearato de magnésio, triacilgliceróis e suas misturas.
[084] No caso da forma líquida, a composição contém a fração líquida separada no final da etapa b) de fermentação como um componente biologicamente ativo e um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis.
[085] As composições típicas na forma líquida compreendem soluções, emulsões, suspensões, xaropes. O pão de abelha ou pólen fermentado obtido com o processo da invenção contido na composição da invenção pode estar presente em quantidades variáveis, por exemplo, compreendidas na faixa de 0,0001% a 100% em peso; de 0,001% a 50% em peso, de 0,1% em peso a 20% em peso, tipicamente de 0,5 a 5% em peso.
[086] De acordo com certas modalidades, a composição da invenção compreende ainda uma ou mais substâncias ativas, como vitaminas, minerais, micronutrientes e outras substâncias ativas.
[087] De acordo com algumas modalidades, a composição para administração oral é um alimento funcional,
uma composição nutracêutica, um produto dietético, um complemento ou um produto nutricional.
[088] A composição pode ser comercializada em formas de dosagem convencionais, como sachê de alumínio termossoldado do tipo sachê ou embalagem stick contendo um componente sólido ou uma dispersão do componente sólido em um líquido, recipientes para a reconstituição extemporânea de um sólido em um líquido, cápsulas duras ou moles contendo um sólido disperso em um óleo de qualidade alimentício ou outro líquido compatível, frascos ou garrafas contendo a dispersão de um sólido em um líquido.
[089] De acordo com alguns aspectos, a presente invenção se refere a pão de abelha obtido de acordo com qualquer uma das modalidades do processo descrito no presente documento ou uma composição que o contém, para uso no tratamento de doenças metabólicas, cardiovasculares, ósseas, cerebrais ou intestinais ou como um acionador para a funcionalidade do microbioma intestinal.
[090] De acordo com outros aspectos, a presente invenção fornece o uso de pão de abelha obtido de acordo com qualquer uma das modalidades do processo descrito no presente documento ou de uma composição que o contenha, para tratamento por ingestão oral ou uso cosmético da pele em particular como tratamento antienvelhecimento ou para reduzir o envelhecimento da pele e para tratamento dos cabelos
[091] O pão de abelha obtido com o processo da invenção tem atividade antioxidante celular e é utilizado na prevenção ou tratamento de doenças que dão origem a uma produção não fisiológica de radicais livres, tipicamente doenças de pele como tumores, doenças pré- cancerígenas ou actínicas ou estados de vermelhidão como consequência de queimaduras solares, manchas na pele, aspereza ou envelhecimento da pele. Além disso, o pão de abelha da invenção encontra aplicação na manutenção do organismo de um indivíduo em condições fisiológicas de saúde.
[092] De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece bactérias lácticas selecionadas pertencentes às espécies Lactobacillus kunkeei selecionadas de PF12, PF15 e PL13 e suas misturas.
[093] Os inventores selecionaram as cepas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 devido a capacidade surpreendentemente melhorada de crescimento, acidificação, mostrada na Tabela 1 a seguir, para a produção de compostos antimicrobianos, mostrados nas Tabelas 2 e 3 a seguir, em comparação com outras cepas pertencentes à mesma espécie. Como um exemplo, um protocolo usado para a seleção das cepas bacterianas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 é descrito abaixo. O protocolo, que é descrito em mais detalhes no Exemplo 1 a seguir, compreende o teste de cepas bacterianas isoladas de flores, pólen, pão de abelha e do trato gastrointestinal de abelhas. A capacidade de crescimento, acidificação e produção de compostos antimicrobianos das cepas identificadas foram testadas. Um extrato de pólen aquoso foi usado como sistema modelo para o crescimento bacteriano. O extrato de pólen foi obtido de acordo com o seguinte procedimento.
[094] Cem gramas de pólen foram adicionados com contas de vidro, misturados com um litro de água destilada e agitados a 500 rpm por 2 h. A mistura foi centrifugada a 10.000 x g durante 20 minutos. O sobrenadante foi coletado, e o resíduo foi extraído sequencialmente com um litro de metanol acidificado (0,1% HCl, v/v), uma mistura de hexano/acetona/etanol 50:25:25 (v/v/v), e água fervente, respectivamente, conforme descrito acima. Todos os extratos foram secos e dissolvidos em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), misturados e posteriormente diluídos em água destilada até um volume final de 1 litro. O extrato de pólen foi esterilizado por filtração estéril em membrana com porosidade 0,22 μm. As cepas foram inoculadas individualmente a uma densidade celular final de cerca de 7,0 log UFC/mL, e o extrato de pólen foi incubado a 30°C por 24 h. O crescimento e a acidificação foram monitorados, e a cinética de crescimento e acidificação das cepas foi modelada matematicamente usando a equação de Gompertz. A atividade antimicrobiana das cepas foi testada contra 8 bactérias indicadoras de deterioração ou patogênicas e 8 fungos indicadores. Para testar a atividade antimicrobiana das cepas, as bactérias lácticas foram cultivadas no extrato de pólen a 30ºC por 24 h, e o sobrenadante foi recuperado por centrifugação a
10.000 x g por 10 min. a 4ºC e esterilizado por filtração estéril em um membrana com porosidade 0,22 µm. A atividade antibacteriana foi avaliada por poços de difusão em agar, enquanto a atividade antifúngica foi avaliada por ensaio de diluição em agar.
[095] A Tabela 1 abaixo mostra os dados de densidade celular, expressos como densidade óptica, DO620 e acidificação, expressos como variação de pH (ΔpH) no extrato de pólen fermentado por 24 h a 30ºC com as cepas de bactérias lácticas pertencentes a diferentes espécies e isoladas de flores, pólen, pão de abelha e do trato gastrointestinal das abelhas.
Tabela 1 Cepas DO620 ΔpH
Lactobacillus kunkeei PF12 2,102 1,05
L, kunkeei PF18 2,030 0,83
L. kunkeei PF16 1,993 0,94
L. kunkeei PLA21 1,890 0,71
L. kunkeei PL13 1,882 1,03
L. kunkeei PL9 1,863 0,66
L. kunkeei PL28 1,763 0,97
L. kunkeei PF15 1,762 0,69
L. kunkeei BIII60 1,758 0,78
L. kunkeei B17 1,758 0,79
L. kunkeei BV61 1,734 0,95
L. kunkeei PL24 1,682 0,61
L. kunkeei PLA14 1,636 0,63
L. kunkeei PL15 1,621 0,80
L. kunkeei PFA7 1,601 0,77
Cepas DO620 ΔpH
L. kunkeei PL33 1,597 0,81
L. kunkeei PF6 1,551 0,63
L. kunkeei PFA3 1,517 0,70
L. kunkeei PL3 1,475 0,75
L. kunkeei PLA6 1,473 0,79
F. fructosus B4 1,426 0,88
L. kunkeei PL31 1,419 0,62
L. kunkeei PFA2 1,412 0,70
L. kunkeei PLA13 1,402 0,58
L. kunkeei PFB7 1,340 0,83
L. kunkeei PL27 1,327 0,71
Lactobacillus plantarum 1,228 0,55 PLB16
L. kunkeei PF7 1,222 0,69
L. plantarum PLB15 1,123 0,55
L. kunkeei B4I 1,105 0,68
L. kunkeei PLA16 0,921 0,48
L. kunkeei PFA15 0,918 0,63
L. kunkeei PLB30 0,892 0,59
L. plantarum PLB1 0,822 0,43
L. kunkeei PFA5 0,801 0,57
L. kunkeei PFA35 0,781 0,42
Cepas DO620 ΔpH
Fructobacillus fructosus 0,686 0,22 MBIII5
L. kunkeei B7 0,678 0,40
L. kunkeei BVI14 0,672 0,28
L. kunkeei PLA8 0,640 0,42
L. kunkeei PFB13 0,581 0,47
L. kunkeei B23I 0,538 0,28
L. kunkeei BVI52 0,426 0,24
L. kunkeei PFA4 0,421 0,43
L. kunkeei BV20 0,349 0,13
F. fructosus PFB34 0,342 0,34
F. fructosus PFA34 0,324 0,22
L. kunkeei PFA12 0,308 0,28
F. fructosus PFB29 0,305 0,27
L. kunkeei PLA9 0,303 0,12
F. fructosus B5 0,300 0,26
L. kunkeei BIII59 0,296 0,27
F. fructosus PL22 0,285 0,10
F. fructosus B1 0,243 0,06
F. fructosus PFA25 0,231 0,17
F. fructosus PFA18 0,228 0,19
L. kunkeei PFA9 0,224 0,18
Cepas DO620 ΔpH
L. kunkeei PLB20 0,223 0,14
L. kunkeei PLB18 0,223 0,14
L. kunkeei PL20 0,182 0,14
L. kunkeei PLB12 0,174 0,19
L. kunkeei PLA24 0,169 0,13
F. fructosus PFA23 0,135 0,15
F. fructosus PL17 0,133 0,04
L. kunkeei PFB3 0,123 0,11
F. fructosus PLA1 0,121 0,09
L. kunkeei PF10 0,112 0,06
Lactobacillus curvatus 0,112 0,16 PFB10
L. kunkeei PLB17 0,112 0,12
L. kunkeei PF29 0,110 0,14
Lactococcus lactis PFB12 0,110 0,16
L. curvatus PFB19 0,109 0,10
L. kunkeei PF5 0,108 0,03
F. fructosus MBIII2 0,108 0,27
L. kunkeei PLB29 0,104 0,06
L. kunkeei PL12 0,099 0,16
F. fructosus PL10 0,097 0,11
F. fructosus PLB6 0,096 0,11
Cepas DO620 ΔpH F. fructosus PL25 0,086 0,02 L. curvatus PL34 0,085 0,10 Leuconostoc citreum PFB11 0,084 0,08 L. curvatus PL32 0,082 0,08 F. fructosus PFB26 0,082 0,13 L. curvatus PLB7 0,080 0,03 L. kunkeei BVI17 0,080 0,03 F. fructosus PL21 0,078 0,09 L. lactis EF70 0,075 0,06 L. curvatus PFB30 0,073 0,05 L. curvatus PFB8 0,073 0,04 L. lactis EF67 0,069 0,04 L. lactis PFB15 0,052 0,04 L. kunkeei PLB34 0,046 0,07 L. kunkeei PF1 0,044 0,09
[096] Como pode ser visto a partir dos dados experimentais, as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 têm uma capacidade surpreendentemente maior de crescimento, de acidificação do que aquelas encontradas para as outras cepas testadas, pertencentes à mesma espécie bacteriana.
[097] A Tabela 2 que se segue mostra os espectros de inibição* do extrato de pólen fermentado com cepas de bactérias de ácido láctico a 30ºC por 24 h.
A atividade antibacteriana foi testada contra 8 cepas de bactérias patogênicas ou indicadoras de deterioração‡. O extrato de pólen não fermentado foi usado como controle.
Tabela 2 Staphy- Listeri Escheri Bacillu Pantoea Escheri Serratia Serratia lococcu a chia s agglome chia marcesce marcesce s monocyt coli megater rans hermann ns DR8 ns DR10 aureus ogenes DSM ium F6 DTB8 ii PS2 DSM ATCC 19 30083 20231 115 Unferment ed pollen - - - - - - - - extract Lactobaci llus + +++ +++ ++++ ++ +++ ++ +++ kunkeei PF12 L. kunkeei + ++ ++ +++ ++++ +++ ++ ++ PF16 L. kunkeei + ++ ++ +++++ +++ +++ ++ ++ PL13 L. kunkeei - ++ ++ ++++ ++++ +++ ++ - PL28 L. kunkeei - ++ ++ ++++ ++ - ++ - BV61 L. kunkeei - + ++ ++++ - - ++ +++ PF18 L. kunkeei + ++ ++ ++++ ++++ + ++ - B17 L. kunkeei - + ++ ++++ + + ++ - BIII60 L. + ++ +++ +++++ ++++ + +++ +++ kunkeei
Staphy- Listeri Escheri Bacillu Pantoea Escheri Serratia Serratia lococcu a chia s agglome chia marcesce marcesce s monocyt coli megater rans hermann ns DR8 ns DR10 aureus ogenes DSM ium F6 DTB8 ii PS2 DSM ATCC 19 30083 20231 115 PF15
L. kunkeei - + ++ ++++ - - ++ +++ PL9 L. kunkeei - + +++ ++++ +++ - ++ +++ PLA21 F. fructosus - + ++ ++++ ++ +++ ++ +++ B4 L. kunkeei + ++ ++ ++++ +++ +++ ++ - PFB7 L. kunkeei - + + ++++ ++ + + ++ PL27 L. kunkeei - ++ ++ +++++ ++ - + ++ PFA2 L. kunkeei - +++ ++ +++ ++++ - ++ +++ PFA3 L. kunkeei - + + ++++ ++ + + ++ PL3 L. kunkeei + ++ +++ +++++ + - ++ +++ PLA6 L. kunkeei - + + +++++ +++ - +++ - PL33 L. kunkeei - + + ++++ ++ + + ++ PL15 L. kunkeei - +++ ++ ++++ +++ - + ++ PFA7
Staphy- Listeri Escheri Bacillu Pantoea Escheri Serratia Serratia lococcu a chia s agglome chia marcesce marcesce s monocyt coli megater rans hermann ns DR8 ns DR10 aureus ogenes DSM ium F6 DTB8 ii PS2 DSM ATCC 19 30083 20231 115 L. kunkeei - + ++ ++++ + ++ ++ ++ PL24 L. kunkeei + +++ + +++++ ++ ++ + - PLA14 L. kunkeei - + ++ +++ + + + - PF6 L. kunkeei + +++ + +++++ ++ ++ + - PL31 L. kunkeei - ++ ++ ++++ ++ ++ ++ - PLA13 Lactobaci llus - + ++ ++++ + + - - plantarum PLB16 L. plantarum - + ++ +++ + + - - PLB15 L. kunkeei + + + ++++ + - + - B4I L. kunkeei - ++ +++ ++++ ++++ +++ ++ ++ PF7 L. kunkeei - + ++ ++++ + + - - PFA15 L. kunkeei + +++ + +++++ ++ ++ + - PLB30 L. kunkeei - ++ ++ +++++ ++ ++ ++ ++ PFA5
Staphy- Listeri Escheri Bacillu Pantoea Escheri Serratia Serratia lococcu a chia s agglome chia marcesce marcesce s monocyt coli megater rans hermann ns DR8 ns DR10 aureus ogenes DSM ium F6 DTB8 ii PS2 DSM ATCC 19 30083 20231 115 L. kunkeei + + + ++++ + - + - PLA16 L. plantarum - + + ++++ + + - - PLB1 L. kunkeei + +++ +++ +++++ ++ + ++ - PFA35 L. kunkeei - ++ ++ +++++ ++++ ++ ++ ++ B7 L. kunkeei - + ++ +++++ + ++++ ++ - PLA8 L. kunkeei - ++ ++ +++++ ++++ ++ ++ ++ PFB13 L. kunkeei - ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ PFA4
[098] * A atividade antibacteriana foi avaliada da seguinte forma: -, sem inibição; +, halo de inibição de diâmetro <1 mm; ++, halo de inibição com diâmetro de 1-2,5 mm; +++, halo de inibição com diâmetro de 2,5-4,0 mm; ++++ halo de inibição com diâmetro 4,0-6 mm; +++++ halo de inibição do diâmetro> 6 mm.
[099] ‡Condições de crescimento: Staphylococcus aureus DSM 20231, meio de extrato de levedura de soja Trypticase a 37°C; Listeria monocytogenes ATCC 19115, meio de infusão de cérebro e coração a 37°C;
Escherichia coli DSM 30083, caldo Luria-Bertani a 37ºC; Bacillus megaterium F6, caldo Luria-Bertani a 30ºC; Pantoea agglomerans DTB8, caldo nutriente a 30ºC; Escherichia hermannii PS2, caldo nutriente a 30ºC; Serratia marcescens DR8, caldo nutriente a 30ºC; Serratia marcescens DR10, caldo nutriente a 30°C.
[0100] A Tabela 3 que se segue mostra o espectro de inibição* do extrato de pólen fermentado com as bactérias lácticas a 30ºC por 24 h. A atividade antifúngica foi testada contra 8 cepas de fungos indicadores‡. A porcentagem de inibição do crescimento micelial foi calculada em relação ao crescimento da cepa indicadora em Agar Dextrose de Batata (PDA) suplementado com extrato de pólen não fermentado. Tabela 3 Aspergi Aspergi Penicil Penicil Penicil Aspergi Penicil Penicil llus llus lium lium lium llus lium lium versico niger roquefo polonic albocor parasit paneum bialowi lor CBS DPPMAF3 rti um CBS emium icus CBS ezense 117286 DPPMA1 112490 CBS CBS 101032 CBS 109582 971.97 110102 Lactobac illus +++ ++ ++ - ++ - - - kunkeei PF12 L. kunkeei +++ - - - ++ + - - PF16 L. kunkeei +++ - - + ++ ++ ++ - PL13 L. kunkeei - - - - - - - - PL28
Aspergi Aspergi Penicil Penicil Penicil Aspergi Penicil Penicil llus llus lium lium lium llus lium lium versico niger roquefo polonic albocor parasit paneum bialowi lor CBS DPPMAF3 rti um CBS emium icus CBS ezense 117286 DPPMA1 112490 CBS CBS 101032 CBS 109582 971.97 110102 L. kunkeei - - - - - - - - BV61 L. kunkeei - - - - - - - - PF18 L. kunkeei - - - - - - - - B17 L. kunkeei - - - - ++ - - - BIII60 L. kunkeei - - - - - - - - PF15 L. kunkeei - - - - - - - - PL9 L. kunkeei - - - - - - - - PLA21 F. fructosu - - ++ - - ++ - - s B4 L. kunkeei - - - - - - - - PFB7 L. kunkeei - - - - - - - - PL27 L. kunkeei - - - - ++ - - - PFA2
Aspergi Aspergi Penicil Penicil Penicil Aspergi Penicil Penicil llus llus lium lium lium llus lium lium versico niger roquefo polonic albocor parasit paneum bialowi lor CBS DPPMAF3 rti um CBS emium icus CBS ezense 117286 DPPMA1 112490 CBS CBS 101032 CBS 109582 971.97 110102 L. kunkeei - - ++ - - - - + PFA3 L. kunkeei - - - - - - - - PL3 L. kunkeei - - - - - - - - PLA6 L. kunkeei - - - - - - - - PL33 L. kunkeei - - - - - - - - PL15 L. kunkeei - - - - - - - - PFA7 L. kunkeei - - - - - - - - PL24 L. kunkeei - - - - - - - - PLA14 L. kunkeei - ++ + - - ++ - - PF6 L. kunkeei - - - - - - - - PL31 L. kunkeei +++ - - - - - - - PLA13
Aspergi Aspergi Penicil Penicil Penicil Aspergi Penicil Penicil llus llus lium lium lium llus lium lium versico niger roquefo polonic albocor parasit paneum bialowi lor CBS DPPMAF3 rti um CBS emium icus CBS ezense 117286 DPPMA1 112490 CBS CBS 101032 CBS 109582 971.97 110102 Lactobac illus - - + - ++ - - - plantaru m PLB16 L. plantaru - - - - - - - - m PLB15 L. kunkeei - - - - - - - - B4I L. kunkeei - - - - - - - - PF7 L. kunkeei - - - - - - - - PFA15 L. kunkeei - - - - - - - - PLB30 L. kunkeei - - - - - - - - PFA5 L. kunkeei - - - - - - - - PLA16 L. plantaru - - - - - - - - m PLB1 L. kunkeei - - - - - - - - PFA35 L. - - - - - - - - kunkeei
Aspergi Aspergi Penicil Penicil Penicil Aspergi Penicil Penicil llus llus lium lium lium llus lium lium versico niger roquefo polonic albocor parasit paneum bialowi lor CBS DPPMAF3 rti um CBS emium icus CBS ezense 117286 DPPMA1 112490 CBS CBS 101032 CBS 109582 971.97 110102 B7 L. kunkeei - - + - ++ - - - PLA8 L. kunkeei ++ - + - - - - - PFB13 L. kunkeei - - + - - - - - PFA4
[0101] * A atividade antifúngica foi avaliada da seguinte forma: sem inibição; +, inibição do crescimento radial do micélio <25%; ++, inibição do crescimento radial do micélio em 25-50%; +++, inibição do crescimento radial do micélio em 50-75%; ++++ inibição do crescimento radial do micélio > 75%.
[0102] ‡ Condições de crescimento: Agar dextrose de batata a 25ºC por 8 dias.
[0103] Os dados experimentais das Tabelas 2 e 3 destacam ainda que as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 têm uma atividade antimicrobiana surpreendentemente maior do que a encontrada para as outras cepas testadas, pertencentes à mesma ou a outras espécies bacterianas. Terminologia
[0104] No presente contexto, o termo pólen significa pólen entomófilo coletado por abelhas forrageiras e processado por elas; o referido pólen pode provir de uma única espécie botânica (monoflora) ou de várias espécies botânicas (multiflora).
[0105] Alimento funcional significa qualquer alimento ou ingrediente alimentício modificado que possa proporcionar um benefício ou proteção contra um problema ou condição fisiológica, além dos nutrientes tradicionais nele contidos.
[0106] Produto nutracêutico significa um produto isolado ou purificado de substâncias comestíveis. Um nutracêutico é aquele que demonstra ter um benefício fisiológico ou que oferece proteção contra um problema ou distúrbio fisiológico.
[0107] Suplemento dietético ou alimentício significa um produto que contém uma vitamina, mineral, extrato vegetal, aminoácido, metabólito, extrato, concentrado ou misturas desses ingredientes.
[0108] O termo veículo comestível significa qualquer veículo comestível que pode ser usado na formulação de um suplemento alimentício, nutracêutico ou dietético/alimentício.
[0109] No âmbito da presente descrição, os termos pão de abelha e pólen fermentado obtidos com o processo da invenção designam o mesmo produto e são permutáveis. As propriedades organolépticas e/ou nutricionais do pão de abelha tradicional descrito no capítulo anterior dedicado à técnica anterior são substancialmente semelhantes às do pólen fermentado obtido com o processo da invenção
[0110] Os exemplos que se seguem são fornecidos apenas para fins ilustrativos de algumas modalidades da invenção. Exemplo 1 Protocolo para a seleção de cepas bacterianas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13
[0111] De modo a selecionar as três cepas de bactérias iniciadoras lácticas, 93 cepas pertencentes a diferentes espécies e isoladas de flores, pólen, pão de abelha e do trato gastrointestinal de abelhas foram testadas quanto à capacidade de crescer, acidificar e produzir compostos antimicrobianos. O extrato de pólen foi usado como sistema modelo para o crescimento bacteriano. O extrato de pólen foi obtido da seguinte maneira. Cem gramas de pólen foram adicionados com contas de vidro, misturados com um litro de água destilada e agitados a 500 rpm por 2 h. A mistura foi centrifugada a 10000 x g durante 20 minutos. O sobrenadante foi coletado, e o resíduo foi extraído sequencialmente com um litro de metanol acidificado (0,1% HCl, v/v), uma mistura de hexano/acetona/etanol 50:25:25 (v/v/v), e água fervente, respectivamente, conforme descrito acima. Todos os extratos foram secos e dissolvidos em 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), misturados e posteriormente diluídos em água destilada até um volume final de 1 litro. O extrato de pólen foi esterilizado por filtração estéril em membrana com porosidade 0,22 µm. As cepas foram inoculadas individualmente a uma densidade celular final de cerca de 7,0 log UFC/mL, e o extrato de pólen foi incubado a 30ºC por 24 h. O crescimento e a acidificação foram monitorados,
e a cinética de crescimento e acidificação das cepas foi modelada matematicamente usando a equação de Gompertz. A atividade antimicrobiana das cepas foi testada contra 8 bactérias indicadoras de deterioração ou patogênicas e 8 fungos indicadores. Para testar a atividade antimicrobiana das cepas, as bactérias lácticas foram cultivadas em extrato de pólen a 30ºC por 24 h, e o sobrenadante foi recuperado por centrifugação a 10.000 x g por 10 min. a 4ºC e esterilizado por filtração estéril em uma membrana com porosidade 0,22 µm. A atividade antibacteriana foi avaliada por poços de difusão em agar, enquanto a atividade antifúngica foi avaliada por ensaio de diluição em agar.
[0112] As cepas de L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 foram selecionadas por apresentarem melhor capacidade de crescimento, acidificação (Tabela 1 acima) e produção de compostos antimicrobianos (Tabelas 2 e 3 acima). Exemplo 2 Fermentação de extrato de pólen usando bactérias lácticas
[0113] O extrato de pólen, obtido de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1, foi utilizado como sistema modelo para o crescimento de 93 bactérias lácticas, a fim de testar a sua capacidade de crescimento e acidificação. As cepas foram cultivadas em caldo FYP (10 g D-frutose, 10 g extrato de levedura, 5 g polipeptona*, 2 g acetato de sódio, 0,5 g Tween 80, 0,2 g MgSO4-7H2O, 0,01 g MnSO4-4H2O, 0,01 g FeSO4- 7H2O, 0,01 g de NaCl por litro de água destilada [pH 6,8]) a 30ºC por 24 h. As células foram recuperadas por centrifugação (10000 x g por 10 min. a 4°C), lavadas duas vezes em tampão fosfato 50 mM pH 7,0 e suspensas no extrato de pólen até uma densidade final de cerca de 7 Log CFU/mL. O extrato de pólen foi então incubado a 30ºC por 24 h. O crescimento (densidade óptica, DO620) e a acidificação (mudança de pH, ΔpH) foram monitorados durante a incubação. Resultados
[0114] Noventa e três cepas de bactérias lácticas pertencentes a diferentes espécies foram testadas quanto à capacidade de crescimento e acidificação no extrato de pólen (Tabela 1). Os maiores valores de densidade celular (DO620 1,473 - 2,102) e a maior capacidade de acidificação foram encontrados nos extratos de pólen fermentados com cepas pertencentes à espécie Lactobacillus kunkeei (Tabela 1). Exemplo 3 Atividade antimicrobiana do extrato de pólen fermentado com as cepas de bactérias lácticas selecionadas
[0115] Para testar a capacidade das bactérias de ácido láctico de produzir compostos antimicrobianos durante a fermentação do pólen, as bactérias foram cultivadas em extrato de pólen, conforme descrito no Exemplo 1, e o sobrenadante foi recuperado por centrifugação (10000 x g por 10 min. a 4°C) e esterilizado por filtração estéril em membrana com porosidade de 0,22 µm. A atividade antibacteriana do extrato foi avaliada por ensaio de difusão de poços de agar. As análises foram conduzidas em camada dupla constituída por 15 mL de agar- água (2% agar, p/v) e 5 mL do meio de agar específico para crescimento da cepa indicadora (Tabela 2), e inoculado em densidade celular de cerca de 4 Log CFU/mL com as células recuperadas de uma cultura da cepa indicadora incubada por 24 h na temperatura de crescimento ideal. Os poços (5 mm de diâmetro) foram feitos em camada dupla, e 100 µL de extrato de pólen fermentado e sem células foram adicionados a cada poço. O extrato de pólen não fermentado foi usado como controle. As placas foram armazenadas por 1 h a 4ºC para permitir a difusão radial do extrato de pólen, e incubadas a 30 ou 37ºC por 24 h. A atividade antifúngica do extrato foi avaliada pelo ensaio de diluição em Agar, avaliando a taxa de crescimento radial do micélio fúngico usado como indicador (Tabela 3). O extrato de pólen fermentado e livre de células foi adicionado na concentração de 30% (v/v) ao meio de crescimento (Agar Dextrose de Batata, PDA) e 15 mL do meio foram vertidos em placas de Petri (90 mm de diâmetro). As placas controle continham apenas PDAs, sem adição de extrato de pólen. O ensaio foi realizado colocando cápsulas de micélio de 3 mm de diâmetro no centro das placas de Petri contendo o meio de cultura. O crescimento radial do micélio (diâmetro em mm) foi determinado após 8 dias de incubação a 25ºC em condições aeróbias. A porcentagem de inibição do crescimento é calculada da seguinte forma: [(crescimento do micélio no controle - crescimento do micélio na presença do extrato de pólen)/crescimento do micélio no controle] x 100. Os resultados são expressos como a média de pelo menos 4 medições de crescimento micelial. Resultados
[0116] Os extratos de pólen fermentados apresentaram alta atividade antibacteriana e antifúngica, significativamente (P <0,05) maior que o extrato de pólen não fermentado (Tabelas 2 e 3). O uso das cepas L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 na forma de iniciadores mistos garante o mais amplo espectro de inibição.
Exemplo 4 Protocolo de preparação e inoculação de culturas de Lactobacillus kunkeei PF12. PF15. e PL13 1)Desenvolver as cepas L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 em caldo FYP (10 g de D-frutose, 10 g de extrato de levedura, 5 g de polipeptona*, 2 g de acetato de sódio, 0,5 g de Tween 80, 0,2 g de MgSO4-7H2O, 0,01 g MnSO4-4H2O, 0,01 g FeSO4-7H2O, 0,01 g NaCl por litro de água destilada [pH 6,8]) a 30ºC durante 24 h. 2)Centrifugar cada caldo de cultura a 10.000 X g por 10 min. a 4°C. 3)Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl). 4)Centrifugar cada suspensão de células a 10.000 x g por 10 min. a 4°C. 5)Remover o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl). 6)Centrifugar cada suspensão de células a 10000 x g por 10 min. a 4°C. 7)Remover o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl). 8)Trazer cada suspensão de células a uma densidade celular de 9 Log CFU/mL correspondendo a uma densidade óptica de 0,25 lida no espectrofotômetro a um comprimento de onda de 620 nm em uma cubeta contendo 100 µL de suspensão de células e 900 µL de água.
9)Adicionar as suspensões celulares de cada cepa ao pólen (previamente descongelado e levado à temperatura ambiente) na proporção de 1:10 para se obter um inoculo final correspondente a 8 Log UFC/g.
[0117] A polipeptona pode ser substituída por outros hidrolisados de proteína (por exemplo, peptona, extrato de carne, triptona). Exemplo 5 Protocolo para a preparação e inoculação da cultura de Wickerhamomyces anomalus ou Hanseniaspora uvarum AN8Y27B ou outra levedura pertencente aos gêneros Wickerhamomyces ou Hanseniaspora: 1) Desenvolver Wickerhamomyces anomalus ou Hanseniaspora uvarum AN8Y27B, ou outra levedura pertencente aos gêneros Wickerhamomyces ou Hanseniaspora em caldo de levedura extrato de peptona dextrose (YPD, Oxoid) a 30ºC por 48-72 h. 2)Centrifugar o caldo de cultura a 10.000 c g por 10 min. a 4°C. 3)Remover o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl). 4)Centrifugando a suspensão de células a 10.000 x g por 10 min. a 4°C. 5)Remover o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl). 6)Centrifugando a suspensão de células a 10.000 x g por 10 min. a 4°C. 7)Remover o sobrenadante e ressuspender as células em solução fisiológica (9 g/L de NaCl).
8)Trazendo a suspensão de células a uma densidade celular de 7 Log CFU/mL correspondendo a uma densidade óptica de 0,1 lida no espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nm em uma cubeta contendo 100 µL de suspensão de células e 900 µL de água. 9)Centrifugar a suspensão de células a 10000 x g por 10 min. a 4°C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em um volume 100 vezes menor que o volume inicial. 10)Adicionar a suspensão celular da cepa ao pólen (previamente descongelado e levado à temperatura ambiente) na proporção de 1:10 para obter um inoculo final correspondente a 8 Log UFC/g.
Exemplo 6 Protocolo de preparação e inoculação de culturas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15, e PL13 1)Cultivar L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 em caldo FYP (10 g D-frutose, 10 g extrato de levedura, 5 g polipeptona*, 2 g acetato de sódio, 0,5 g Tween 80, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,01 g MnSO4.4H2O, 0,01 g FeSO4.7H2O, 0,01 g NaCl por litro de água destilada [pH 6,8]) a 30ºC por 24 h para a preparação do pré-inoculo. 2) Transferir a cultura do pré-inoculo de cada cepa em 10% no meio de crescimento preparado com o pólen seco em grânulos e armazenado a + 4°C, pré-tratado com um moinho ou granulador a fim de quebrar, pelo menos parcialmente, a camada de revestimento externa dos grânulos, ressuspensos em água desmineralizada estéril a uma concentração entre 10 e 20% (peso/peso) e trazidos a um valor de pH entre 5,25 +/- 0,25; incubando a 30ºC por 24 h. 3)Inocular as culturas de cada cepa em um biorreator de acordo com uma proporção de 1:10, de modo a obter um inoculo final correspondendo a 7-8 Log UFC/g. O meio de crescimento é preparado com o pólen seco em grânulos e armazenado a + 4°C, pré-tratado a fim de enfraquecer a parede externa dos grânulos, conforme descrito no ponto 1, ressuspenso em água desmineralizada estéril a uma concentração entre 10 e 20%. * A polipeptona pode ser substituída por outros hidrolisados de proteína (por exemplo, peptona bacteriológica, extrato de carne, triptona). Exemplo
[0118] Fermentação do pólen fresco utilizando o iniciador misto composto pelas cepas selecionadas Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e da levedura Hanseniasoora uvarum AN8Y27B. 1)Matéria-prima: pólen fresco não pré-tratado e armazenado a -20ºC. 2)Inoculo do iniciador misto composto de L. kunkeei PF12, PF15 e PL13, e H. uvarum AN8Y27B inoculado a 8 uma densidade celular de 10 CFU/g.Os protocolos para a preparação e inoculação das culturas de L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 e de Huvarum AN8Y27B são descritos nos exemplos 4 e 5. 3)Adicionar água destilada até a umidade final de 40% (o valor da umidade final deve incluir também o teor de água inicial do pólen [cerca de 21,56%] e a água adicionada na etapa de inoculação). 4) Incubar a 30ºC por 216 h em tubos estéreis de 50 mL. Resultados
[0119] Um protocolo de fermentação de pólen fresco foi definido envolvendo a inoculação a uma densidade de 8 Log CFU/g de um iniciador misto composto pelas cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B e incubação a 30ºC por 216 h com uma umidade final de pólen de 40%. O crescimento de bactérias lácticas e a acidificação durante a incubação foram monitoradas durante a fermentação por contagem em placa em agar FYP e determinação da acidez titulável (TTA) (Figura 1). A densidade celular das bactérias lácticas TTA foi monitorada durante a fermentação espontânea do pólen não inoculado (controle), tratado nas mesmas condições, exceto para a inoculação inicial mista (Figura 1). Com a adição do iniciador misto selecionado, a densidade celular das bactérias de ácido láctico no pólen atingiu cerca de 9 Log CFU g-1 após 96 h, e permaneceu constante até 144 h, e diminuiu para cerca de 7 Log CFU g-1 durante o tempo de incubação restante. Caso contrário, durante a fermentação espontânea do pólen, as bactérias lácticas atingiram a -1 densidade de cerca de 9 Log UFC g somente após 120 h, e caíram rapidamente para 4 Log UFC g-1 durante o tempo de incubação restante. O aumento na TTA durante a fermentação foi consistente com o crescimento de bactérias lácticas. Durante a fermentação espontânea do pólen, a acidificação foi mais lenta e menos intensa (P <0,05) em relação à fermentação realizada com o iniciador misto selecionado. Exemplo 8 Protocolo de fermentação de pólen 1) Matéria-prima: pólen fresco não pré-tratado e armazenado a -20°C, ou pólen seco ou desumidificado armazenado a + 4ºC ou à temperatura ambiente, e pré-tratado por pulverização e correção do valor de pH do pólen até atingir um valor entre 5,25 +/- 0,25, 2) Inoculação, a uma densidade celular de 107 CFU/g, de iniciador composto misto pelas bactérias lácticas selecionadas L. kunkeei PF12, PF15 e PL13, e da levedura Wickerhamomyces anomalus, 3) Adicionar água destilada a uma umidade final de 70%, 4) Incubar a 30ºC por 60 h em tubos estéreis ou biorreator.
[0120] O pólen fermentado é liofilizado em um liofilizador. Exemplo 9 Protocolo de fermentação de pólen em biorreator usando as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem a inoculação de levedura com pré-tratamento mecânico 1) Matéria-prima: pólen seco em grânulos e armazenado a + 4°C, pré-tratado mecanicamente em moinho ou granulador, a fim de romper a parede externa dos grânulos ressuspensos no biorreator em água desmineralizada estéril a uma concentração entre 10 e 20% (peso/peso) levando a um volume final de 5 L. 2) Correção do valor do pH até atingir o valor entre 5,25 +/- 0,25. 3) Inoculação do iniciador composto por L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 em uma densidade celular entre 107 e 108 CFU/g.
O protocolo para a preparação e inoculação das culturas de L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 é descrito no seguinte Exemplo 6. 4) Incubar a 30ºC por 2-4 dias enquanto se agita a 70- 100 rpm para manter o meio de fermentação homogêneo. 5) Liofilizar o pólen fermentado em um liofilizador (9A) ou seco por secagem por pulverização (9B). Exemplo 10 Protocolo de fermentação de pólen em biorreator usando as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem a inoculação de levedura com pré-tratamento térmico 1) Matéria-prima: pólen desumidificado em grânulos, pré-tratado termicamente (121ºC por 15') ressuspenso no biorreator em água desmineralizada estéril a uma concentração entre 10 e 20% (peso/peso) levando a um volume final de 5 L. 2) Corrigir o valor do pH até atingir o valor entre 5,25 +/- 0,25. 3) Inocular o iniciador composto por L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 em uma densidade celular entre 107 e 108 CFU/g.
O protocolo para a preparação e inoculação das culturas de L. kunkeei PF12, PF15 e PL13 é descrito no Exemplo 6 que se segue.
4) Incubar a 30ºC por 2-4 dias enquanto se agita a 70- 100 rpm para manter o meio de fermentação homogêneo. 5) Liofilizar o pólen fermentado em um liofilizador (10A) ou secar por secagem por pulverização (10B). Exemplo 11
[0121] Valorização nutricional do pólen fermentado com o uso do iniciador misto composto pelas cepas selecionadas Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e da levedura Hanseniaspora uvarum AN8Y27B.
[0122] O pólen fermentado obtido de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 7 foi caracterizado do ponto de vista químico e nutricional. O teor de aminoácidos únicos, totais e livres no pólen foi determinado pelo Biochrom 30 Amino Acid Analyzer (Biochrom Ltd., Cambridge Science Park, Inglaterra) equipado com uma coluna de troca catiônica (Figura 2). Um protocolo multifásico, que simula a digestão in vitro, foi usado para estimar a digestibilidade das proteínas do pólen (Fig. 3). Além disso, o perfil de peptídeo do pólen foi analisado usando o sistema ÄKTA FPLC equipado com uma coluna Superose 12 10/300 GL e um detector de UV de 214 nm (Figura 3). O teor em compostos fenólicos livres, solúveis em água e metanol, foi determinado pelo ensaio de Folin-Ciocalteu (Figura 4). Resultados
[0123] Um aumento significativo (P <0,05) no total de aminoácidos livres foi observado no pólen fermentado usando o iniciador misto composto de Lactobacillus kunkeei PF12, PL13 e PF15 e Hanseniaspora uvarum AN8Y27B (Figura 2) e peptídeos (Figura 3) de cerca de 14 e 12 g kg-1 (peso seco), respectivamente, em comparação ao pólen fresco. Além disso, o pólen fermentado apresentou um teor maior (P <0,05) em proteínas digestíveis (75,14 ± 0,7%) em comparação com o pólen fresco (62,11 ± 0,8%) (Figura 3). Além disso, níveis mais elevados (P <0,05) de compostos fenólicos livres solúveis em água (15,98 ± 0,64 g de ácido gálico eq. Kg-1 peso seco) e solúveis em metanol (69,53 ± 4,52 g de ácido gálico eq. Kg- 1 peso seco) no pólen fermentado em comparação ao pólen fresco 5 (8,43 ± 0,85 e 45,73 ± 4,81 g de ácido gálico eq. kg-1 peso seco). Exemplo 12
1. TESTES EXPERIMENTAIS
2. OBJETIVO DO TRABALHO EXPERIMENTAL
[0124] O procedimento experimental relatado a seguir tem como objetivo estudar a atividade in vitro de diferentes testes de pólen fermentado (Pão de Abelha) a fim de caracterizar a atividade antioxidante e a atividade antiinflamatória (TNF-α) do mesmo na linha de queratinocitos humanos.
3. MATERIAIS
3.1 Amostras testadas DENOMINAÇÃO B FER 867 FER 868 FER 869 FER 870 FER871
INTERNA DENOMINAÇÃO CONTROLE FERMEN- FERMEN- FERMEN- FERMENTADO FERMENTADO DE TADO TADO TADO IDENTIFICA-
ÇÃO ÚNICA LOTE Lote 06/03/18B DESCRIÇÃO Pólen Cepas Cepas Cepas Cepas Cepas incubado inoculada inoculada inoculada inoculadas inoculadas a 30ºC s s s L. kunkeii L. kunkeii por 9 L. L. L. PF12, PF12, L dias sem kunkeii kunkeii kunkeii L. kunkeii kunkeii incubação PF12, L PF12, L PF12, L PF15 PF15 kunkeii kunkeii kunkeii L. kunkeii L. kunkeii PF15 PF15 PF15 PL13 PL13 L. L. L. H. 121°C por kunkeii kunkeii kunkeii uvarumAN8Y27 5’ PL13. PL13 PL13 B 121°C por 121°C por 5’ 5’ AMAZENAMENTO 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C CONCENTRAÇÕE 100-250- 100-250- 100-250- 100-250- 100-250-500- 100-250- S 500-µg/mL 500-µg/mL 500-µg/mL 500-µg/mL µg/mL 500-µg/mL *O iniciador selecionado é composto por L. kunkeei PF12, PF15 e PF3 além de Wickerhamomyces anomalus LCF1695.
[0125] Os produtos fermentados foram mantidos a 30ºC por 12 horas.
[0126] Todos os extratos foram diluídos 50 mg/mL em meio de cultura (estoque de solubilidade de solução 100%) e esterilizados por filtração (5 mg/mL). Os estoques foram armazenados a -20°C.
3.2 Reagentes e instrumentação usados
REAGENTES FORNECEDOR Peróxido de hidrogênio a 30% SIGMA, 216763 Agarose (Para uso de rotina) SIGMA, A9539-100G RPMI-1640 MEIO SIGMA, R0883 SORO FETAL BOVINO SIGMA, F7524 Dimetilssulfóxido SIGMA, D2438-50ML Solução de Gentamicina SIGMA, G1272 L-glutamina SIGMA, G7513 Solução salina fosfato tamponada da SIGMA, D8537 Dulbecco Solução de brometo de etídio SIGMA, E1510 (10 mg/mL, para biologia molecular,
solução aquosa) Tampão de carga de gel SIGMA, G2526 RNAse, nenhum detectado MTT SIGMA-Aldrich, M2128 Penicilina-Estreptomicina SIGMA, P0781 Kit reagent PRIME SCRIPT RT (Perfect Takara Real time) PreMix Ex Taq TAKARA, RR039A Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® para APPLIED BYOSISTEMS, GAPDH 4331182 Hs99999905_m1 Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® para APPLIED BYOSISTEMS, TNF-α 4331182 Hs00174128_m1 Solução de Tripsina-EDTA SIGMA, T3924 α-tocoferol SIGMA, T3251
INSTRUMENTAÇÃO FORNECEDOR QiaExpert Qiagen 15 L Banho-maria digital de +5°C a +100°C (Mod: Stuart Swbd1, BS-SWB2D) Balance (Mod. XS204) Mettler Toledo Gabinete de fluxo laminar (Mod: Gemini) Steril Manifacturing + lâmpada UV com equipamento antirreflexo Division Incubador de CO2 HeraCell (Mod:150 ADV) Thermo Scientific Freezer horizontal 85°C ULT130, 120 L Elcold (Mod: Labfrost, MME-TE21140) Câmara de contagem Bürker com grampos (DI-DA- Carlo Erba 443/3) Microplaca autoreader (EL 808) Biotek Vortex Arhos160-PBI International Instrumento MX3000p RT Stratagene
3.3 Modelos biológicos usados
3.3.1 Culturas de queratinocitos humanos
[0127] É utilizada a linhagem imortalizada de queratinocitos humanos NCTC2544 (Perry VP e outros, 1957), cultivada em frascos estéreis (25 cm3), incubada a 37ºC em atmosfera úmida a 5% de CO2 em meio de cultura RPMI suplementado com soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina.
[0128] A divisão 1: 3 é feita a cada 2 dias após atingir a monocamada por lavagem com 1 X PBS (tampão de fosfato sem Ca2+ e Mg2+) e separação das células com uma solução de 10 tripsina-EDTA a 37ºC por 2 minutos. As células foram mantidas em cultura em frascos estéreis de 25 cm3 e incubadas a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Código de catálogo HL97002
ICLC DEPOSITOR Prof. M. Ferro, DIMES, General Pathology, University of Genoa, Itália Refências  Arch Dermatol Res 1976; 256 (3): 255-260- bibliográficas PMID: 990102  Arch Dermatol Res 1976; 261 (1): 27-31
3.3.2 Controles
3.3.2.1 Estresse oxidativo induzido - Teste de
MTT
[0129] CONTROLE NEGATIVO: Células não tratadas em RPMI suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina e mantidas em placas de cultura (96 poços) a 37ºC e 5% de CO2 (no escuro).
[0130] CONTROLE POSITIVO: Células tratadas por 2h com peróxido de hidrogênio 1 mM em RPMI suplementado com
2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina e mantidas em placas de cultura (96 poços) em 37ºC e 5% de CO2 (no escuro).
3.3.2.2 Estudo de Atividade Anti-inflamatória
[0131] CONTROLE NEGATIVO: Células não tratadas em RPMI suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina e mantidas em (12 poços) placas de cultivo de 25 cm2 a 37ºC e 5% de CO2.
[0132] CONTROLE POSITIVO: Células não tratadas em RPMI suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina 10 µg/mL LPS e mantidas em (12 poços) 25 cm2 placas de cultura a 37ºC e 5% de CO2.
4. MÉTODOS
4.1 Estudo da proteção contra o estresse oxidativo induzido na linhagem de queratinocito humano NCTC2544
4.2.1 Princípio do método
[0133] Estudos conduzidos em 2005 por Rajapakse e colaboradores (2005) demonstraram a possibilidade de usar um método altamente utilizado e versátil como o do ensaio MTT para estudar a atividade antioxidante in vitro de compostos ativos. Especificamente, por meio desse método é possível estudar os efeitos protetores de tais compostos nas células posteriormente submetidas ao estresse oxidativo. A indução do estresse oxidativo é realizada pela incubação com peróxido de hidrogênio, agente que induz a produção de dano oxidativo nas células por meio da formação de ROS. Quaisquer efeitos protetores podem ser determinados por meio da avaliação da viabilidade celular pós-estresse oxidativo de células pré- tratadas/pré-expostas aos compostos ativos a serem testados, em comparação com células submetidas ao mesmo estresse oxidativo. Uma maior viabilidade celular corresponderá a um efeito protetor dos compostos testados.
4.2.2 Procedimento experimental
[0134] O ensaio foi realizado de acordo com o método descrito por Coda e colaboradores (Coda e outros, 2012), com algumas alterações. Queratinocitos humanos NCTC2544 foram semeados em uma placa de 96 poços na 4 densidade de 5 * 10 células/poço e incubados a 37ºC a 5% de CO2 até atingir cerca de 80% de confluência.
[0135] Em seguida, as células foram incubadas por 16 horas com os compostos ativos a serem testados e os respectivos controles nas seguintes concentrações: 100-250 e 500 pg/mL respectivamente para as amostras B, FER867, FER868, FER869, FER870 e FER871.
[0136] As diluições foram preparadas a partir de estoque 50mg/mL em DMSO, esterilizado por filtração e usando meio RPMI suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina. As células tratadas com H2O2 1 mM foram utilizadas como controle positivo; as células mantidas apenas em meio de cultura (RPMI 2,5% FBS) foram usadas como controle negativo.
[0137] O alfa tocoferol foi testado como antioxidante de referência nas concentrações de 100, 250 e 500 µg/mL, respectivamente.
[0138] Após 16 horas de pré-tratamento, as células foram lavadas com PBS 1 X e incubadas por 90 minutos com uma solução de H2O2 de 1 mm (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) em meio sem soro, no escuro, a 37ºC e 5% de CO2.
[0139] Uma vez concluída a etapa de indução do estresse oxidativo, a viabilidade celular das várias amostras foi avaliada de acordo com o método descrito no ponto 4.1.2 (ensaio de MTT).
[0140] Os dados foram expressos como porcentagem de viabilidade celular em comparação com células de controle (ctr) não estressadas, de acordo com a seguinte fórmula: % viabilidade celular/ctr = (amostra Abs/Absctr) * 100
[0141] Todos os ensaios foram realizados pelo menos duas vezes em duplicata.
4.3 Estudo da atividade anti-inflamatória (TNF-α)
4.4.1 Procedimento experimental
[0142] A expressão gênica do marcador de inflamação TNF-α em células NCTC2544 foi avaliada por RT- PCR quantitativo relativo (transcrição reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase-qRT-PCR).
[0143] Esta análise exigiu 3 etapas sequenciais: • extração de RNA total; • retrotranscrição em DNAc;
qRT-PCR.
[0144] Queratinocitos humanos NCTC2544 foram semeados em placas de 12 poços na densidade de 0,5 * 106 células/poço e incubados até atingir cerca de 80% de confluência.
[0145] Em seguida, as células foram incubadas por 16 e 24 horas respectivamente com as amostras B, FER867, FER868, FER869, FER870 e FER871 nas seguintes concentrações: 100, 250 e 500 µg/mL.
[0146] As diluições foram preparadas a partir do estoque 50 mg/mL em meio de cultura (RPMI), suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, na presença de 1% de penicilina e estreptomicina e 0,1% de gentamicina.
[0147] LPS (Lipopolissacarídeo) foi utilizado na quantidade de 10 µg/mL como indutor de inflamação e coincubado com soluções de tratamento por 16 e 24 h.
[0148] As células mantidas apenas no meio de cultura (RPMI 2,5% FBS) foram utilizadas como controle negativo.
[0149] As células mantidas apenas no meio de cultura (RPMI 2,5% FBS) e 10 µg/mL LPS foram usadas como um controle negativo. Após a incubação, o RNA foi extraído.
[0150] O RNA total foi extraído de células NCTC2544 de acordo com o que foi descrito por Chomczynski e Mackey (1995).
[0151] Após a incubação com os compostos ativos de interesse, as células foram lavadas com PBS (1 x) e finalmente submetidas ao procedimento de extração de RNA. Após a extração, o RNA extraído foi quantificado por meio do instrumento QiaExpert (Qiagen) e as concentrações em µg/mL do RNA total extraído no comprimento de onda de 260 nm foram calculadas.
[0152] Finalmente, a integridade do RNA (2 µg/mL) foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose a 1%.
[0153] O RNA total foi convertido em DNAc (DNA complementar), usando uma enzima capaz de sintetizar uma molécula de DNA usando uma fita de RNA como molde; esta enzima dependente do RNA da polimerase do DNA é chamada de transcriptase reversa.
[0154] A mesma se liga à extremidade 3' de uma única fita de RNA e, por meio de iniciadores aleatórios e trifosfato de desoxinucleosídeo (DNTPS), sintetiza a fita de DNAc.
[0155] Para tanto, foi utilizado um kit comercial “PrimeScript™ RT Reagent Kit (perfect Real Time)” (TakaraBiolnc., Japão), contendo 5X PrimeScript Buffer (para tempo real); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer; 6 mers aleatórios; 2 dH2O livre de RNAse.
[0156] O RNA extraído e quantificado foi diluído para uma concentração de 2 µg/mL e transcrito reversamente em DNAc. Uma Master Mix de 10 µL_ (contendo 5X PrimeScript Buffer (para tempo real); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer 50pM; Random 6 meros 100pM) foi preparada, à qual foram adicionados 10 µL de RNA (2 µg/mL).
[0157] As amostras foram colocadas em um termociclador (Stratagene Mx3000P Real Time PCR System, Agilent Technologies Italy S.p.A., Milão, Itália) e sujeito a retrotranscrição nas seguintes condições:
37ºC por 15 minutos; 85ºC por 5 segundos; 4°C em espera.
[0158] Após a retrotranscrição, às amostras foram adicionados 30 µL de água DEPC para se obter uma concentração final de DNAc de 40 ng/µL.
[0159] O qRT-PCR é um método de amplificação e quantificação em tempo real de produtos amplificados, monitorando a fluorescência emitida durante a reação.
[0160] Para amplificação por RT-PCR, foi utilizado o sistema de sondas TaqMan ® (AppliedBiosystems). As seguintes sondas TaqMan foram usadas: Hs00174128_m1 (TNF-α) e Hs99999905_m1 (GAPDFI). GAPDH. Hs99999905_m1 foi usado como gene de controle (manutenção). A sonda Taqman é um tipo de sonda que permite o desenvolvimento de fluorescência conforme a amplificação avança. Um repórter (fluoróforo FAM™) é ligado à sua extremidade 5', enquanto um supressor é ligado à extremidade 3'. A proximidade entre o repórter e o inibidor cancela a emissão do sinal de fluorescência. Somente com a atividade 5' esonucleásica da DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) a fluorescência é detectada e o acúmulo dos produtos de amplificação pode ser avaliado através do aumento da fluorescência do repórter que aumenta a cada ciclo.
[0161] Uma Master Mix foi configurada para o qRT-PCR como se segue: • 10 µL de “2X Premix Ex Taq”; • 1 µL de “20 x TaqMan Gene Expression Assays” (contendo 2 primers e a sonda fluorescente FAM™ marcada com fluoróforo);
• 0,4 µL de referência passiva Rox II; • 5 µL de água DEPC. 4 µL de DNAc foram adicionados ao Master Mix para o gene alvo e 1 µL de DNAc para o gene de manutenção.
[0162] A amplificação foi realizada por 40 execuções nas seguintes condições: • 95°C, 30 s (ativação de amplificação); • 95°C, 5 s (desnaturação) • 60°C, 20 s (recozimento - extensão);
[0163] Cada análise foi conduzida em duplicata.
[0164] Os dados obtidos foram analisados segundo o método de 2-ΔΔCt e, portanto, foi possível calcular os valores relativos de expressão do gene de interesse, normalizados em relação ao gene de manutenção e calibrados na amostra controle (células não tratadas): ΔΔCt - ΔCt alvo-manutenção (controle)-ΔCt alvo- manutenção (células tratadas)
[0165] 2-ΔΔCt foi calculado presumindo uma eficiência de amplificação de 100%.
5. RESULTADOS
5.1 Ensaio de proteção contra estresse oxidativo induzido
[0166] A Figura 5 mostra os dados relativos à atividade de proteção contra o estresse oxidativo induzido das amostras testadas, em comparação com um antioxidante de ação conhecida, o atocoferol. Os resultados mostram uma significativa atividade de proteção contra o estresse oxidativo induzido para todos os compostos analisados nas concentrações de 250 e 500 µg/mL e essa atividade é comparável à do α-tocoferol.
5.2 Estudo da atividade anti-inflamatória (TNF-α)
[0167] As Figuras 6A e B incluídas mostram os dados de expressão do gene TNF-α, respectivamente após tratamento de 16 h (Figura 6A) e 24 h (Figura 6B) com as amostras: amostra B (CONTROLE), FER867, FER868, FER869, FER870 e FER871, respectivamente nas concentrações de 100- 250 e 500 µg/mL. Após 16 horas de tratamento, as amostras B e FER867 testadas nas concentrações de 100, 250 e 500 µg/mL mostram a atividade anti-inflamatória mais significativa (Figura 6A).
[0168] A atividade anti-inflamatória é mais evidente após 24 horas de tratamento (Figura 6B), em particular para a amostra FER867.
6. CONCLUSÕES
[0169] Concluindo, os testes realizados mostraram uma atividade de proteção significativa contra o estresse oxidativo induzido para todas as amostras testadas nas concentrações de 250 e 500 µg/mL (Figura 5).
[0170] Além disso, o estudo da atividade anti- inflamatória mostrou que após 16 horas de tratamento, as amostras B, FER867 testadas nas concentrações de 100 e 250 µg/mL mostram uma atividade anti-inflamatória significativa (Figura 6A).
[0171] Para o composto FER869, a concentração de 500 µg/ml reduziu significativamente a expressão de RNAm associado a TNF-alfa. FER871 em concentrações de 100 e 500 µg/rmL mostra uma redução na produção de RNAm. A atividade anti-inflamatória dos compostos testados é mais evidente após 24 horas de tratamento (Figura 6B), em particular para o composto FER867.
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Glicerol 67 mg Exemplo 14 Comprimido Cada dose contém q.ty u.m.
Pólen fermentado com cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem a inoculação de levedura ref.
Exemplo 5 200 mg Celulose microcristalina 100 mg BioGABA [ácido gama-aminobutírico da fermentação de mosto de uva (Frutos de Vitis vinifera L.), Lactobacillus plantarum C48] 100 mg Polivinilprorrolidona 35 mg Arroz (extrato seco de semente de Oryza sativa L.) 50 mg Alfafa (extrato seco de flor Medicago sativa L. 40 mg Extrato seco do talo de Chlorella (Chlorella pyrenoidosa H.
Chick) 30 mg Fosfatidilserina 40 mg Extrato seco de folhas e flores Melissa (Melissa officinalis L.) 100 mg Extrato seco de sementes de Griffonia [Griffonia simplicifolia (DC.) Baill] 51 mg L-Teanina 12,6 mg Dióxido de silício 10 mg Estearato de magnésio 10 mg
Exemplo 15 Comprimidos mastigáveis Cada dose contém ...... q.ty u.m.
Maltodextrina 50-300 mg Dextrose 50-300 mg Frutose 50-300 mg Pólen fermentado com as cepas selecionadas Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem inoculação de levedura ref.
Exemplo 5 100 mg Aroma 10-30 mg Amido de milho 10-30 mg Celulose microcristalina 10-30 mg Dióxido de silício 5-15 mg Leucina 5-15 mg Exemplo 16 Comprimidos Cada dose contém q.ty u.m.
Fosfato de cálcio 150 mg Pólen fermentado com cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem a inoculação de levedura ref.
Exemplo 5 50 mg Resina extrato seco de Boswellia (Boswellia serrrata Roxb.) 150 mg Palmitoiletanolamida (PEA) 150 mg BioGABA [ácido gama-aminobutírico da fermentação do mosto de uva (Frutas de Vitis vinifera L.) Lactobacillus plantarum C48] 100 mg
Ácido gama aminobutírico 49 mg Extrato seco de rizoma Tumérico (Curcuma longa L.) 100 mg Celulose microcristalina 50 mg Vitamina D (Colecalciferol) 0,005 mg Vitamina B3 (Nicotinamida) 16 mg Hidroxipropilcelulose 30 mg Dióxido de silício 6 mg Mono e diglicerídeos de ácidos graxos 10 mg Vitamina B1 (mononitrato de tiamina) 1,36 mg Vitamina B2 (Riboflavina 1,4 mg Vitamina B5 (pantotenato de cálcio) 6,5 mg Vitamina B6 (cloridrato de piridoxina) 1,7 mg Vitamina K2 (Menaquinona-7) 0,075 mg Vitamina B12 (cianocobalamina) 0,026 mg Exemplo 17 Comprimidos Cada dose contém q.ty u.m.
Extrato seco da raiz de Ashwagandha (Withania somnifera L.
Dunal) 150 mg Pólen fermentado usando o iniciador misto composto de cepas Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e da levedura Hanseniaspora uvarum AN8Y27B ref.
Exemplo 4 50 mg
Celulose microcristalina 100 mg Óxido de magnésio 100 mg Extrato seco de Bacopa (Bacopa monnieri L.
Pennel) 100 mg BioGABA [ácido gama-aminobutírico da fermentação de mosto de uva (fruta Vitis vinifera L.), Lactobacillus plantarum C48] 100 mg Fosfato de cálcio 100 mg ácido gama-aminobutírico 49 mg Extrato de flor de açafrão Crocus sativusL.). 30 mg Hidroxipropilmetilcelulose 30 mg Bisglicinato de zinco 10 mg Dióxido de silício 7 mg Ácido (6S)-5-metiltetra- hidrofólico, sal de glucosamina 0,2 mg Estearato de magnesio 11 mg Exemplo 18 Barra Imunoestimulante de 30 g Pólen fermentado com as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem inoculação de levedura ref.
Exemplo 5 2 g Glicose e xarope de frutose 10-14 g Flocos de arroz. 10-12 g Lecitina de girasso l 0,5-3 g Óleo de palma (Elaeis guinensis) 0,5-3 g Maltodextrina de milho 1-2 g
Açaí (Euterpe oleracea) fruta desidratada 3-4 g Passas (Vitis apyrena 'L.) fruta desidratada 1-2 g Ácido cítrico quanto baste Aroma quanto baste Exemplo 19 Cápsula de gelatina dura Cada cápsula de gelatina dura contém:. q.ty u.m. Pólen fermentado usando o iniciador misto composto de cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e da levedura Hanseniaspora uvarum AN8Y27B ref. Exemplo 4 200 mg Maltodextrina 5-50 mg Fibra natural insolúvel 5-100 mg Estearato de magnésio 1-10 mg Dióxido de silício 3-6 mg Envoltório exterior de gelatina natural Exemplo 20 Granulado solúvel oral Cada sache contém: q.ty u.m. Pólen fermentado usando o iniciador misto composto de cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 e da levedura Hanseniaspora uvarum AN8Y27B ref. Exemplo 4 1.000 mg Inulina 200-600 mg Maltodextrina 0,5-3,0 g
[0172] Ácido málico 0,1-10 mg
Aroma 10,0-50,0 mg Sucralose 0,005 mg Exemplo 21 Mistura granular em stick pack Cada sache contém: q.ty u.m.
Pólen fermentado com as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem inoculação de levedura ref.
Exemplo 5 500 mg Extrato seco da parte aérea de Echinacea (Echinacea purpurea) 300 mg Aroma de mel 10 mg Inulina 1-2 g Goma arábica 0,5-2 g Ácido málico 0-100 mg Sucralose 0,005 mg Aroma 0,25 mg Exemplo 22 Comprimido Cada comprimido contém: Pólen fermentado com as cepas selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PL13 sem inoculação de levedura ref.
Exemplo. 5 50 mg Celulose microcristalina 50 mg Extrato seco de inflorescência de brócolis (Brassica oleracea italica var.) 125 mg BioGABA [ácido gama-aminobutírico da fermentação de mosto de uva
(Frutos de Vitis vinifera L.) 100 mg Pólen fermentado 100 mg Extrato seco de semente de mostarda (Brassica juncea L.
Czern.) 75 mg Alcachofra (Cynara scolymus L.) extrato seco de folhas 60 mg Extrato seco de frutas de acerola (Malpighia glabra L.) 100 mg Extrato seco de fruta laranja (Citrus sinensis L.) 50 mg Fosfato de cálcio 50 mg Extrato seco de planta inteira de beterraba (Beta vulgaris L.) 50 mg Hidroxipropilcelulose 20 mg Extrato seco da casca de Bayberry (Myrica cerifera L.) 30 mg Extrato seco de raiz de Astragalus (Astragalus membranaceus) 30 mg Quercetina 30 mg Vitamina E (tocotrienol tocoferol) 6 mg Beta-sitosterol 20 mg Licopeno 10 mg Nicotinamida 16 mg Dióxido de silício 10 mg Mono e diglicerídeos de ácidos graxos 10 mg Extrato seco de partes aéreas de Galeopsis (Galeopsis segetumNecker) 5 mg Tricloridrato de espermidina 0,5 mg Biotina 0,5 mg

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo microbiológico para a produção de pão de abelha, compreendendo uma etapa a) de inoculação de pólen em grãos com uma bactéria láctica de partida e uma etapa b) de fermentação do pólen, sendo o referido processo caracterizado pelo fato de que a bactéria láctica de partida inoculada é uma bactéria láctica da espécie Lactobacillus kunkeei., selecionada a partir das cepas Lactobacillus kunkeei PF12, PF15 e PF13 e suas misturas.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um tratamento preliminar dos grãos de pólen para degradação da camada de revestimento externa e disponibilização do teor de grãos para a atividade fermentativa dos lactobacilos inoculados na etapa a).
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo a inoculação de uma levedura que degrada ou metaboliza o componente pectínico de revestimento do grão de pólen, em uma etapa preliminar ou na etapa a).
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a referida levedura que degrada ou metaboliza o componente pectínico de revestimento do grão de pólen pertence à espécie Wickerhamomyces anomalus e é a cepa Hanseniaspora uvarum AN8Y27B.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, compreendendo uma etapa adicional c) de redução da carga microbiana após a etapa de fermentação.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, compreendendo uma etapa adicional de secagem, preferencialmente de liofilização ou de secagem por pulverização.
7. Pão de abelha ou pólen fermentado obtido pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6.
8. Composição compreendendo pão de abelha ou pólen fermentado de acordo com a reivindicação 7 e um veículo comestível.
9. Pão de abelha de acordo com a reivindicação 7 ou composição de acordo com a reivindicação 8, para utilização no tratamento de doenças cardiovasculares, metabólicas, ósseas, cerebrais, intestinais ou como motor da funcionalidade do microbioma intestinal.
10. Uso do pão de abelha de acordo com a reivindicação 7 ou da composição de acordo com a reivindicação 8 para o tratamento do envelhecimento cutâneo, da pele ou dos cabelos.
11. Cepas de Lactobacillus kunkeei selecionadas de Lactobacillus kunkeei PF12 tendo o número de acesso DSM 32843, Lactobacillus kunkeei PF15 tendo o número de acesso DSM 32845, Lactobacillus kunkeei PL13 tendo o número de acesso DSM32844 e suas misturas.
12. Composição contendo uma cepa de Lactobacillus kunkeei selecionada a partir de Lactobacillus kunkeei PF12 com o número de acesso DSM 32843, Lactobacillus kunkeei PF15 com o número de acesso DSM 32845, Lactobacillus kunkeei PL13 tendo o número de acesso DSM32844 e suas misturas.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que as cepas bacterianas são vivas e vitais ou inativadas.
3:2BHQJ
Figure 1 Figura1 Figura
160 10
9 140 TTA (mL 0,1M NaOH 10 g-1 )
8 120 -1
7 Log ufc g
100 6
80 5
60 4
40 3 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 h
3:2BHQJ Figura2 Figure Figura 22
GABA Pro Arg Lys Orn Trp His Phe Tyr Leu Ile Met Val Cys Ala Gly Glu Ser Thr Asp 0 1000 2000 3000 4000 5000 mg kg-1 mg (peso -1 (dry (peso seco) secco) weight)
3:2BHQJ Figura3 Figure33 Figura 80
A Proteinedigeribili(%delleproteinetotali) Proteínas digestíveis (% de of total proteins) 75 proteins (% totais) 70 proteínas 65 60 Digestible 55 50
B mAU 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 ml
3:2BHQJ
Figura Figure 44 Figura4
80 seco) (pesosecco) weight)
60 ggacidogallicoequkg acid eq.eq. (dry kg-1kg-1 Ͳ1 (peso
40 gallic gálico gácido
20
0 Raw BCP Polline Fresh pólen pólen fermentado Started BCP Pollinefermentato Pollen fermented fresco pollen fresco com o iniciador conlostarter with the selected selecionado selezionato starter
3:2BHQJ
Figura 5 Figure 5 stress induzido oxidative oxidativo induced estresse against contra
Protection
Proteção
= % of cellcelular/controle = % de viabilidade viability/control
3:2BHQJ
Figura6A Figure Figura6A6A atividade anti-inflamatória Anti-inflammatory activity (TFN-ɲ) 16h Control
Control+LPS Controle+LPS Controle
3:2BHQJ
Figura 6B Figura6B Figure 6B
Anti-inflammatory atividade activity (TFN-ɲ) 24h anti-inflamatória Controle+LPS Control
Control+LPS Controle
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