CN114410489B - 一株异常威克汉姆酵母cap5菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株及其应用。本发明所述CAP5菌株于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61857。本发明所述CAP5菌株具有良好的耐酸性，还具有果胶酶活性，其产生的果胶酶活性高，可用于果胶酶的生产中，或用于小粒咖啡等的生物脱胶过程。此外，所述CAP5菌株的乙醇产量也高，可用于乙醇的发酵生产中；结合其所具有的果胶酶活性，还可以用于果酒的酿造中。

Description

一株异常威克汉姆酵母CAP5菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株异常威克汉姆酵母CAP5菌株及其应用。
背景技术
小粒咖啡(Coffeaarabica L.)是云南省重要的高原特色优势产业之一，对促进边境地区的生态保护与绿色发展，丰富边境地区农业生产品种具有重要意义。云南小粒咖啡的初加工方式主要为湿加工法，其中的发酵脱胶环节，对技术要求最高、过程最复杂、也最容易出现问题，且该环节与咖啡商品豆的质量密切相关，脱胶的好坏直接影响咖啡的贮存效果以及具体风味，进而影响咖啡产业的利润。
目前，小粒咖啡的发酵脱胶环节以自然发酵脱胶为主，物理脱胶也已推广应用。其中，自然发酵脱胶是将咖啡脱皮后放到发酵池里，以水为介质进行自然发酵；但自然发酵脱胶的周期长，发酵过程受咖啡品种、发酵数量、咖啡鲜果成熟度及气温等的影响，脱胶过程不易控制，容易脱胶不彻底或发酵时间过长，导致咖啡味过酸，品质降低，且自然发酵过程中的微生物未经筛选，种类繁多，微生物代谢过程中产生的污染物质也容易影响咖啡品质。物理脱胶则是将咖啡鲜果脱皮后进行清洗，在清洗过程中不断摩擦咖啡豆达到脱胶目的；但物理脱胶容易出现脱胶不彻底的问题，且咖啡豆容易出现二次发酵，严重影响咖啡豆品质和贮存期。生物脱胶是把经过筛选的脱胶菌株接种到脱皮的咖啡豆上，利用菌株分泌的酶类来分解胶质；或通过外加酶制剂进行脱胶。相对自然发酵来说，生物脱胶的过程比较容易控制，且过程中不产生有毒有害物质，具有绿色、环保、效率高等优点。
例如，中国专利‘一种用于咖啡鲜果脱胶的酶制剂和方法’中，通过使用由果胶酯酶、果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸酶组成的酶制剂进行脱胶，提高了咖啡豆的脱胶效率，降低了咖啡豆的霉变率，提高了咖啡豆的质量，同时降低了水耗，更为环保。但现有关于咖啡脱胶菌株的报道较少，实际应用也还在试验示范阶段，因此，需要开发更多可用于脱胶的菌株，促进咖啡生物脱胶技术的发展。
异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)是一种较为常见的产香酵母。中国专利“一株分解果胶的酵母及其应用”中公开了一株可分解果胶异常威克汉姆酵母，但其仅进行了定性实验，果胶酶及乙醇产量不高，不适用于果胶酶及乙醇的生产中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株。
本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂。
本发明的第三个目的是提供所述CAP5菌株在生物脱胶中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述CAP5菌株在制备果胶酶中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述CAP5菌株在制备乙醇中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述CAP5菌株在果酒生产中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株，所述菌株于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广东省科学院微生物研究所(广东省广州市越秀区先烈中路100号)，菌种保藏号为GDMCC No：61857；所述CAP5菌株的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株分离自云南省小粒咖啡(Coffeaarabica L.)发酵液中，该菌株不仅能产生果胶酶分解果胶，且产生的果胶酶的活力高，最高为411.45U/mL，可用于生产果胶酶或用于小粒咖啡等的生物脱胶过程。此外，所述CAP5菌株还能发酵产生乙醇，乙醇产量最高可达127.23g/L，可用于乙醇的发酵生产中，结合其所具有的果胶酶活性，还可以用于果酒的酿造中。因此，本发明申请保护以下应用：
本发明申请保护所述CAP5菌株在生物脱胶，尤其是咖啡生物脱胶中的应用。
本发明申请保护所述CAP5菌株在制备果胶酶中的应用。
本发明申请保护所述CAP5菌株在制备乙醇中的应用。
本发明申请保护所述CAP5菌株在果酒生产中的应用。
具体地，所述制备果胶酶的方法为：将CAP5菌株接种于含果胶的发酵培养基中进行发酵培养。
具体地，所述发酵培养基中的组分和含量为：MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 0.4g/L，KCl：0.3g/L，蛋白胨0.5％～2.5％(w/v)，Mn2+1～2.5mmoL/L，1％～1.5％(w/v)果胶。
优选地，所述发酵培养基含1％(w/v)果胶，见实施例4。
优选地，所述发酵培养基含2.5％(w/v)蛋白胨，见实施例4。
优选地，所述发酵培养基含2mmoL/L Mn2+，见实施例4。
具体地，所述发酵培养的培养温度为28℃，培养时间为30～42h，发酵pH为5～8。
优选地，培养时间为36h，见实施例4。
优选地，发酵pH为6.0，见实施例4。
更优选地，所述发酵培养基含MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 0.4g/L，KCl：0.3g/L，蛋白胨21.6g/L，Mn2+1.5mmoL/L，碳源：1％(w/v)果胶，见实施例4。
更优选地，所述发酵培养的发酵温度为28℃；发酵为pH 4.32；发酵时间为30h，见实施例4。
具体地，所述制备乙醇的方法为：将CAP5菌株接种于乙醇发酵培养基中进行液体发酵培养。。
具体地，所述乙醇发酵培养基中的组分和含量为：3％(w/v)黄豆粉，25％(v/v)葡萄糖。
具体地，在配制乙醇发酵培养基时，先配制浓度为600g/L的葡萄糖溶液，再按体积比添加至培养基中，见实施例6。
具体地，所述发酵培养的培养温度为28～32℃，培养时间为60～84h。
优选地，培养温度为28℃，见实施例6。
优选地，培养时间为72h，见实施例6。
本发明还提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂中含有所述异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株或其发酵液。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株，所述菌株于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省科学院微生物研究所，菌种保藏号为GDMCC No：61857。本发明所述异常威克汉姆酵母CAP5菌株具有良好的耐酸性，还具有果胶酶活性，不仅可以降解果胶，且产生的果胶酶活性高，其在发酵中还可以产生大量乙醇，乙醇产量也高。因而可将CAP5菌株用于生产果胶酶，或用于小粒咖啡等的生物脱胶过程中，缩短脱胶时间，提高咖啡商品豆品质，还可用于生产乙醇以及果酒的酿造中。
附图说明
图1为异常威克汉姆酵母CAP5菌株的溴酚蓝染色图。
图2为异常威克汉姆酵母CAP5菌株的菌落形态图。
图3为异常威克汉姆酵母CAP5菌株在光学显微镜下放大400倍后的显微结构图。
图4为异常威克汉姆酵母CAP5菌株ITS序列的电泳图。
图5为异常威克汉姆酵母CAP5菌株基于ITS-rDNA序列的进化树。
图6为不同果胶浓度下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图7为不同发酵时间下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图8为不同发酵pH条件下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图9为不同氮源条件下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图10为不同氮源添加量下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图11为不同离子条件下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图12为不同Mn2+浓度下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的果胶酶活力。
图13为乙醇气相标准曲线。
图14为不同糖浓度下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的乙醇产量。
图15为不同发酵时间下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的乙醇产量。
图16为不同发酵温度下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的乙醇产量。
图17为不同氮源条件下异常威克汉姆酵母CAP5菌株的乙醇产量。
图18为异常威克汉姆酵母CAP5菌株的耐酸性分析结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株的分离和纯化
利用平板稀释涂布分离法对云南省小粒咖啡(Coffeaarabica L.)发酵液中的果胶降解菌进行分离。具体过程如下：
将发酵液用六层纱布过滤后，对滤液进行100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释，各吸取100μL不同稀释浓度的稀释液涂布于初筛培养基中，每个梯度设3个重复，以不接种滤液的空白平板作为对照。28℃下培养4～5d直至有菌落长出，观察菌落形态，挑取形态不同的单菌落接种于PDA培养基中进行纯化培养3～4d，连续纯化3次后编号，用甘油法进行菌种保存。
所述初筛培养基和PDA培养基分别如下所示：
初筛培养基：果胶2g，K2HPO41.0 g，MgSO40.5 g，NaNO33.0 g，FeSO47H2O0.01 g，琼脂20g，ddH2O定容至1000mL。pH：5.5，121℃灭菌20min。
PDA培养基：马铃薯200g，加入适量ddH2O，煮沸20min，四层纱布过滤，取滤液加入葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
实施例2菌株的筛选
(1)初筛
本发明采用溴酚蓝法对分离到的果胶降解菌株进行了筛选。将已分离纯化的菌株接种于以果胶为唯一碳源的溴酚蓝琼脂培养基，培养段时间后观察黄色透明圈的大小，设置3个重复。28℃恒温培养72h，测量培养基透明圈直径(D)和菌落直径(d)的大小，初步判断菌株脱胶能力的强弱。挑选D/d比值大的菌株进行下一步的复筛试验。
本发明通过溴酚蓝琼脂培养基分离筛选到了果胶降解能力较强的菌株CAP5(见图1)。由图1可以看出，CAP5菌落周围出现了明显的透明圈，后续对CAP5菌株进行液体摇瓶发酵，然后进行粗酶活测定。
(2)粗酶活测定
将CAP5菌株接种于YPD培养基上，28℃培养1～2d至长出单菌落，挑取单菌落置于盛有25mLYPD液体培养基的50mL锥形瓶中，28℃、150r/min条件下振荡培养24h获得种子液。取100μL种子液接种于150mL发酵培养基中进行发酵培养，28℃、150r/min振荡培养48h后，4℃、8000r/min离心15min，得到的上清液即为粗酶液。吸取上清液适当稀释，采用DNS法测定稀释粗酶液的果胶酶活力。
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖200g，ddH2O定容至1000mL，pH：5.5，121℃灭菌20min。
发酵培养基：果胶5g，蛋白胨5g，KCl1 g，K2HPO41 g，KH2PO40.5 g，MgSO41.0 g，ddH2O定容至1000mL，pH：5.5，121℃灭菌20min。
果胶酶活力的测定
吸取0.75mL浓度为10mg/mL的底物缓冲液于2mL的EP管中，加入0.25mL粗酶液，混匀30℃水浴反应15min后取出500μL反应液加400μLDNS终止反应，并置于沸水中煮沸5min，然后以流动水迅速冷却。以灭活的粗酶液作对照，在540nm波长下测量吸光值。
果胶酶活力的定义：在反应条件30℃、pH 5.0时，1mL酶液每分钟水解果胶底物生成1μmol半乳糖醛酸的能力定义为1个酶活力单位(U)。
酶活力(U/mL)：(A1-A0)×1000×N/0.25×K×T
A1：实验组的OD540值；A0：对照组的OD540值；1000：1mg＝1000μg；0.25：酶活测定时所用的稀释酶液体积(mL)；K：半乳糖醛酸标准曲线的斜率；T：反应时间(min)；N：上清液稀释倍数
经测定，CAP5菌株的PG活力为185.46U/mL。
实施例3 CAP5菌株的鉴定
(1)形态学鉴定
将CAP5菌株纯培养体接种于YPD培养基上，48h后观察其在培养基上的形态特征，结果如图2所示；将其在光学显微镜下放大400倍后观察，结果如图3所示。
由图2可以看出，本发明所述CAP5菌株的菌落呈圆屋顶状，白色，表面光滑不透明，边缘较整齐，呈粘稠状；由图3可以看出，CAP5菌株的显微结构为圆形或卵圆形，为出芽生殖。此外，CAP5菌株在培养过程中能产生酒精香气，推测该菌株为异常威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces sp.)菌株。
(2)分子生物学鉴定
利用真菌DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明说提取CAP5菌株的基因组DNA，并通过ITS扩增引物扩增其ITS序列，所用扩增引物如下所示：
正向引物ITS3：5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’
反向引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μL、2mM dNTPs 10μL、10pmoL/mL ITS3 1.5μL、10pmoL/mL ITS4 1.5μL、KOD FX(1.0U/μL)1.0μL、DNA 2.0μL、ddH2O 9μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，共35次循环，最后68℃延伸5min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验，结果如图4所示，由图4可以看出，扩增产物大小与预期大小相符。将扩增产物进行清洁回收后，送擎科生物科技有限公司进行测序并构建***发育树。
CAP5菌株的ITS序列如下(SEQ ID NO.1)所示：
TATGGATCTATTGCAGCGCTTATTGCGCGGCGATAAACCTTACACACATTGTCTAGTTTTTTTGAACTTTGCTTTGGGTGCATCAGCCTAGCTGCGTGCCCAAAGGTCTAAACACATTTTTTTTAATGTTAAAACCTTTAACCAATAGTCATGAAAATTTTTAACAAAAATTAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACCCTCTGGTATTCCAGAGGGTATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTGTCAAGGGTTAACTTGAAATATTGACTTAGCAAGAGTGTACTAATAAGCAGTCTTTCTGAAATAATGTATTAGGTTCTTCCAACTCGTTATATCAGCTAGGCAGGTTTAGAAGTATTTTAGGCTCGGCTTAACAACAATAAACTAAAAGTTTGACCTCAAATCAGGT AGGACTACCCGCTGAACTT
将CAP5菌株的ITS序列在NCBI数据库中与已知菌株的ITS序列进行BLAST同源比对及分析，结果显示该菌株与其它多株异常威克汉姆酵母的ITS序列有98％以上的相似性。为进一步证实CAP5菌株与已知酵母菌的亲缘关系及***地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA X生物学软件对CAP5菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及Neighbour-joining方法构建***发育树。
构建的***进化发育树如图5所示。结合上述实验结果可知，本发明所述CAP5菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，因此将其命名为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CAP5菌株，所述菌株于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广东省科学院微生物研究所(广东省广州市越秀区先烈中路100号)。
实施例4 CAP5菌株产酶发酵工艺的优化
(1)果胶添加量对果胶酶活力的影响
参照实施例2配制不同果胶含量的发酵培养基，其中，果胶的添加量按照0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％和3％(w/v)的比例添加。CAP5菌株在不同果胶含量的发酵培养基中，于28℃、150r/min振荡培养48h后，4℃、8000r/min离心15min，取上清液测果胶酶活力。测试方法参照实施例2。
不同果胶添加量下，CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图6所示，由图6可以看出，果胶添加量为1％(w/v)时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为197.74U/mL。
(2)发酵时间对果胶酶活力的影响
配制果胶添加量为1％(w/v)的发酵培养基对CAP5菌株进行发酵，发酵24h时取一次发酵液，之后每隔6h取一次，置于4℃冰箱中暂存，直至60h停止发酵后，将所有发酵液分别离心并取上清，测定果胶酶活力。
不同发酵时间下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图7所示，由图7可以看出，发酵时间为36h时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为195.28U/mL。
(3)发酵pH对果胶酶活力的影响
配制不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，1％(w/v)果胶添加量的发酵培养基对CAP5菌株进行发酵，28℃发酵36h后，取发酵液上清，测定果胶酶活力。
不同发酵pH下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图8所示，由图8可以看出，发酵pH为6.0时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为218.01U/mL。
(4)氮源对果胶酶活力的影响
配制pH为6.0，1％(w/v)果胶添加量的发酵培养基，分别选择酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和硝酸钠作为氮源对CAP5菌株进行发酵，28℃发酵36h后，取发酵液上清，测定果胶酶活力。
不同氮源条件下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图9所示，由图9可以看出，以蛋白胨为氮源时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为269.59U/mL。
(5)氮源添加量对果胶酶活力的影响
配制pH为6.0，1％(w/v)果胶添加量的发酵培养基，其中，蛋白胨的添加量分别为0、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％和3％(w/v)，对CAP5菌株进行发酵，28℃发酵36h后，取发酵液上清，测定果胶酶活力。
不同蛋白胨浓度下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图10所示，由图10可以看出，蛋白胨添加量为2.5％时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为288.63U/mL。
(6)离子对果胶酶活力的影响
配制pH为6.0，1％(w/v)果胶添加量，2.5％(w/v)蛋白胨添加量的发酵培养基，分别加入Zn2+、Al3+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Ba2+对CAP5菌株进行发酵，28℃发酵36h后，取发酵液上清，测定果胶酶活力。
不同离子条件下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图11所示，由图11可以看出，当加入Mn2+时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为303.42U/mL。
(7)离子添加量对果胶酶活力的影响
配制pH为6.0，1％(w/v)果胶添加量，2.5％(w/v)蛋白胨添加量的发酵培养基，加入不同浓度的Mn2+对CAP5菌株进行发酵，Mn2+的浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mM/L，28℃发酵36h后，取发酵液上清，测定果胶酶活力。
不同Mn2+浓度下CAP5菌株的果胶酶活力检测结果如图12所示，由图12可以看出，当加入Mn2+的量为2mM/L时，CAP5菌株的果胶酶活力最高，为312.36U/mL。
在上述实验结果的基础上，本发明对CAP5菌株的发酵条件进行了响应面法优化。优化结果表明，CAP5的最优发酵方案为：
发酵培养基：MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 0.4g/L，KCl：0.3g/L，蛋白胨21.6g/L，Mn2+1.5mmoL/L，碳源：1％(w/v)果胶；
发酵条件：发酵温度28℃；发酵pH 4.32；发酵时间：30h。
采用上述最优发酵方案对CAP5菌株进行发酵，所得果胶酶的活力高达411.45U/mL。
实施例5 CAP5菌株的培养及乙醇产量的测定
(1)菌株的培养
使用YPD培养基培养CAP5菌株并测定其乙醇产量。将CAP5菌株接种于YPD固体培养基上，28℃培养1～2d至长出单菌落，挑取单菌落置于盛有25mLYPD液体培养基的50mL锥形瓶中，28℃、150r/min条件下振荡培养24h获得种子液。取100μL种子液接种于150mL YPD液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养48h后，4℃、8000r/min离心15min，取上清液。
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖200g，ddH2O定容至1000mL，pH：5.5，121℃灭菌20min。
(2)乙醇气相标准曲线
制作乙醇气相标准曲线，分别配置0、0.5、1、2.5、5、10、20mg/mL的乙醇标准溶液。选用异丙醇作为内标，运用色谱级别异丙醇配置10mg/mL的内标溶液。
将配置好的各浓度乙醇标准溶液及内标溶液各取500μL，在2mL离心管内混匀，使用1mL注射器，通过0.22μm的针头滤膜过滤至气相瓶中，盖子密封，放入气相色谱仪中进行测定。
乙醇浓度采用气相色谱法进行分析检测。气相色谱仪的进样器温度为250℃。色谱柱规格为：19091J-413(30m×0.32mm×0.25μm)。柱温箱采用程序升温：初始温度为40℃，保持3min；以10℃/min升温到140℃；紧接着以50℃/min升温到230℃；最后在230℃保持2分钟。检测器温度控制在300℃，其中载气为氮气，流速为30mL/min；氢气流速为40mL/min；空气流速为350mL/min。每次运行样品进样量为1μL。
将乙醇浓度作为横坐标，乙醇峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标，做线性回归，结果如图13所示，得方程为：y＝0.1215x-0.016(R2＝0.9919)。
(3)样品乙醇产量测定
样品用YPD培养基进行发酵，发酵得到的上清液通过0.22μm针头滤膜过滤后即为样品液；样品液乙醇浓度测定方法与标准液测定方法相同。
经测定，在此培养条件下，CAP5菌株的乙醇产量为98.76g/L。
实施例6 CAP5菌株产乙醇发酵工艺的优化
(1)碳源添加量对乙醇产量的影响
CAP5菌株的乙醇发酵培养使用YPD培养基，培养基中含10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨，配制浓度为600g/L的葡萄糖母液，按量添加至YPD培养基，使其葡萄糖终浓度分别为100g/L，200g/L，300g/L和400g/L，每个浓度做三个重复；于28℃、150r/min振荡培养84h后，4℃、8000r/min离心15min，取上清液，稀释5倍后与内标各取500μL进行混匀，用0.22μm针头滤膜过滤，进行气相分析，分析方法参照实施例5。
不同糖(碳源)浓度下CAP5菌株的乙醇产量如图14所示，由图14可以看出，300g/L糖浓度下CAP5菌株的乙醇产量最高，为109.3g/L。由于发酵完成后，YPD培养基中的葡萄糖并未完全利用，为避免碳源浪费，后续乙醇发酵培养时改为250g/L葡萄糖。
(2)发酵时间对乙醇产量的影响
以葡萄糖浓度为250g/L的YPD培养基对CAP5菌株进行发酵，培养条件同上，每12h取10mL发酵液置于-18℃冰箱保存，直至84h停止发酵后，将所有发酵液分别离心并取上清，稀释5倍后与内标各取500uL混匀，用0.22μm针头滤膜过滤，进行气相分析。
不同发酵时间下CAP5菌株的乙醇产量检测结果如图15所示，由图15可以看出，CAP5菌株发酵时间在72～84h之间乙醇产量最高，72h时乙醇产量达到106.43g/L。
(3)发酵温度对乙醇产量的影响
以葡萄糖浓度为250g/L的YPD培养基对CAP5菌株进行发酵，设置温度梯度为24、28、32、36℃，每个温度做两个重复，培养条件同上，发酵到84h停止，发酵液离心取上清，稀释10倍后与内标各取500uL混匀，用0.22μm针头滤膜过滤后进行气相分析。
不同发酵温度下CAP5菌株的乙醇产量检测结果如图16所示，由图16可以看出，在28℃温度下乙醇产量较高，达到126.91g/L。
(4)氮源对乙醇产量的影响
以葡萄糖浓度为250g/L的培养基对CAP5菌株进行发酵，分别选择酵母粉、蛋白胨、黄豆粉作为氮源，每个氮源做两个重复，培养条件同上，发酵到84h停止，发酵液离心取上清，稀释10倍后与内标各取500uL混匀，用0.22μm针头滤膜过滤，进行气相分析。
不同氮源条件下CAP5菌株的乙醇产量检测结果如图17所示，由图17可以看出，在3种氮源中，黄豆为氮源时乙醇产量最高，达到127.23g/L。
实施例7 CAP5菌株的耐酸碱性分析
pH耐受测试：在容积为250mL的锥形瓶中加入100mL YPD液体培养基，灭菌冷却后，分别添加不同浓度的H2SO4溶液，使培养基的pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，每个pH做三个平行。接入5％(v/v)种子液后，在28℃、150rpm条件下培养，培养过程中每隔12h取样测定乙醇浓度。
结果如图18所示，由图可看出在酸性条件下，CAP5菌株仍能正常生长并产生乙醇，当pH为6.0时，CAP5的乙醇产量达到最高，为96.01g/L，而在碱性条件下，CAP5的乙醇产量下降，表明CAP5菌株为耐酸性菌株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一株异常威克汉姆酵母CAP5菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 565
<212> DNA
<213> 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)
<400> 1
tatggatcta ttgcagcgct tattgcgcgg cgataaacct tacacacatt gtctagtttt 60
tttgaacttt gctttgggtg catcagccta gctgcgtgcc caaaggtcta aacacatttt 120
ttttaatgtt aaaaccttta accaatagtc atgaaaattt ttaacaaaaa ttaaaatctt 180
caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcaacgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240
atacgtattg tgaattgcag attttcgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcacc 300
ctctggtatt ccagagggta tgcctgtttg agcgtcattt ctctctcaaa ccttcgggtt 360
tggtattgag tgatactctg tcaagggtta acttgaaata ttgacttagc aagagtgtac 420
taataagcag tctttctgaa ataatgtatt aggttcttcc aactcgttat atcagctagg 480
caggtttaga agtattttag gctcggctta acaacaataa actaaaagtt tgacctcaaa 540
tcaggtagga ctacccgctg aactt 565

Claims (10)

1. 一株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）CAP5菌株，其特征在于，所述菌株于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No：61857。
2.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的异常威克汉姆酵母CAP5菌株或其发酵液。
3.权利要求1所述CAP5菌株在生物脱胶中的应用。
4.权利要求1所述CAP5菌株在制备果胶酶中的应用。
5.权利要求1所述CAP5菌株在制备乙醇中的应用。
6.权利要求1所述CAP5菌株在果酒生产中的应用。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述制备果胶酶的方法为：将CAP5菌株接种于含果胶的发酵培养基中进行发酵培养。
8. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述制备乙醇的方法为：将CAP5菌株接种于乙醇发酵培养基中进行液体发酵培养，所述乙醇发酵培养基中的组分和含量为：黄豆粉3%w/v，葡萄糖25% v/v。
9. 根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述发酵培养基中的组分和含量为：MgSO40.3 g/L，K2HPO4 0.4 g/L，KCl：0.3 g/L，蛋白胨 0.5%～2.5% w/v，Mn2+ 1～2.5 mmoL/L，果胶 1%～1.5% w/v；发酵培养温度为28 ℃，培养时间为30～42 h，发酵pH为5～8。
10. 根据权利要求8所述应用，其特征在于，发酵培养温度为28～32 ℃，培养时间为60～84 h。
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