CN112870130A - 一种杜仲花粉发酵液的制备方法及其化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种杜仲花粉发酵液制备方法，本发明包括花粉破壁与去离子水混合灭菌，以乳酸菌或酵母菌为发酵菌种通过生物发酵的方法制作而来，采用益生菌对杜仲花粉进行发酵，提高了杜仲花粉的生物活性，同时避免了提取方法造成的活性成分流失。本发明所采用的发酵法，不添加任何有机试剂、香精等化学成分，发酵条件温和，确保了发酵产品的安全性。本发明还提供上述制备方法制备的杜仲花粉发酵液作为护肤品中的有效成分的应用，本发明的杜仲花粉发酵物可以有效抵抗自由基，促进胶原蛋白再生，更易被皮肤吸收，可以作为抗衰老因子添加到化妆品中。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域技术领域，具体涉及一种杜仲花粉发酵液制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
杜仲是我国珍贵的中药材，以往对杜仲的研究主要集中在树皮和叶子上，现代研究表明，杜仲雄花黄酮类化合物含量远高于树皮和叶子，富含绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、槲皮素等活性物质和多种矿质元素、粗蛋白、维生素和氨基酸等营养物质，且无毒副作用。植物乳杆菌和酵母菌是重要的益生菌，利用其对杜仲花粉进行发酵，在不破坏营养成分的情况下，不仅可以脱敏，还可以调高花粉生物活性潜力。同时避免了化学提取过程中有机试剂的残留，提高了杜仲花粉活性成分的利用率。
目前杜仲花粉在化妆品的领域涉及还比较少。专利CN111317694A公开了一种杜仲发酵提取液及其制备方法和其在化妆品中的应用，主要针对的是杜仲叶子。中国专利CN104644461A公开了具有促进胶原蛋白合成火星的化合物在抗衰老化妆品中的应用，其通过乙醇、三氯甲烷和甲醇有机溶剂提取、回收获得了桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸具有促进胶原蛋白合成，延缓和抑制皮肤衰老的效果。其缺点在于，多种活性成分的利用率不高，且化学提取过程残留有机试剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决现有的杜仲发酵提取液生物活性低、活性成分易流失的问题。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种杜仲花粉发酵液制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的杜仲花粉粉碎并过筛，得到杜仲花粉粉末；
(2)按照质量比为10-30:100-300，将步骤(1)中得到的杜仲花粉粉末与水混合，115-122℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；
(3)发酵菌预处理：将低温保存的乳酸菌或酵母菌进行划线，获取单菌落；将挑取的单菌落接种到相应液体培养基中，在28-42℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，通过离心法收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于步骤(2)中制得的杜仲花粉液中，得到接种浓度为105-108CFU/mL的混合液；
(4)将步骤(3)中得到混合液在震荡条件下培养12-72h，得到发酵液，发酵温度为28-42℃；
(5)将步骤(4)中所得的发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为杜仲花粉发酵液。
本发明采用益生菌对杜仲花粉进行发酵，提高了杜仲花粉的生物活性，同时避免了提取方法造成的活性成分流失。
本发明所采用的发酵法，不添加任何有机试剂、香精等化学成分，发酵条件温和，确保了发酵产品的安全性。
优选地，所述步骤(1)中杜仲花粉粉碎过100-300目筛。
优选地，所述步骤(3)中乳酸菌接种的培养基为MRS培养基。
优选地，所述步骤(3)中酵母菌接种的培养基为YPDA培养基。
优选地，所述步骤(5)中离心的转速为3500-12000r/min，离心时间为10-45min。
优选地，所述步骤(5)中离心半径为9-12cm。
优选地，所述步骤(5)中灭菌温度为115-122℃，灭菌时间为15min。
优选地，所述步骤(5)中杜仲花粉发酵液的pH值为4.5-6.8。
一种护肤用产品，包括上述制备方法制得的杜仲花粉发酵液。
进一步地，所述杜仲花粉发酵液作为护肤品中的有效成分的应用。
本发明提供的杜仲花粉发酵液中具有优异的抗衰老美白能力，可以促进胶原蛋白合成。
本发明具有如下的有益效果：
1、本发明采用益生菌对杜仲花粉进行发酵，提高了杜仲花粉的生物活性，同时避免了提取方法造成的活性成分流失。
2、本发明所采用的发酵法，不添加任何有机试剂、香精等化学成分，发酵条件温和，确保了发酵产品的安全性。
3、本发明提供的杜仲花粉发酵液中具有优异的抗衰老美白能力，可以促进胶原蛋白合成。
附图说明
图1为本发明实施例的杜仲花粉发酵液对DPPH自由基的清除作用柱形图；
图2为本发明实施例的杜仲花粉发酵液对ABTS自由基的清除作用柱形图；
图3为发明实施例的杜仲花粉发酵液对酪氨酸酶活性和熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率柱型图；
图4为发明实施例的杜仲花粉发酵液促进成纤维细胞增殖的柱型图；
图5为发明实施例的杜仲花粉发酵液促进成纤维细胞中胶原蛋的合成。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
取100g干燥的杜仲花粉，粉碎，并过200目筛，加入1000mL水混合，121℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；将低温保存的乳酸菌进行划线，获取单菌落，将挑取的单菌落接种到MRS培养基中，在32℃的培养箱中培养，直到达到指数生长期，通过离心法收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于杜仲花粉液中，最终细胞密度相当108CFU/mL；杜仲花粉液在震荡条件下培养24h，发酵温度为32℃，得到发酵液；将发酵液在8000r/min下离心10min，离心半径为9cm，收集上清液，121℃下灭菌15min，即制得杜仲花粉发酵液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液还可直接作为化妆水使用。
实施例2
取100g干燥的杜仲花粉，粉碎，并过200目筛，加入1000mL水混合，121℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；将低温保存的酵母菌进行划线，获取单菌落，将挑取的单菌落接种到YPDA培养基中，在32℃的培养箱中培养，直到达到指数生长期，通过离心法收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于杜仲花粉液中，最终细胞密度相当108CFU/mL；杜仲花粉液在震荡条件下培养24h，发酵温度为32℃，得到发酵液；将发酵液在8000r/min下离心10min，离心半径为9cm，收集上清液，121℃下灭菌15min，即制得杜仲花粉发酵液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液还可直接作为化妆水使用。
实施例3
取100g干燥的杜仲花粉，粉碎，并过200目筛，加入1000mL水混合，121℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；将乳酸菌菌株和酵母菌菌株分别在30℃的MRS和YPDA培养基中繁殖，直到达到指数生长期，通过离心法收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于杜仲花粉液中，最终细胞密度相当108CFU/mL；杜仲花粉液在震荡条件下培养24h，发酵温度为32℃，得到发酵液；将发酵液在8000r/min下离心10min，离心半径为9cm，收集上清液，121℃下灭菌15min，即制得杜仲花粉发酵液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。
本实施例制备的杜仲花粉发酵液还可直接作为化妆水使用。
对比例1
取100g干燥的杜仲花粉，粉碎，并过200目筛，加入1000mL水混合，121℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；将杜仲花粉液在震荡条件下培养24h8000r/min离心10min，离心半径为9cm，收集上清液，121℃下灭菌15min，制得未经发酵的杜仲花粉液。
分析实验
1、将实施例1-3的杜仲花粉发酵液化妆品和对比例1的未经发酵的杜仲花粉液进行成分分析，分析产品的杜仲发酵液含蛋白质、粗多糖、总黄酮、总酚，结果如表1所示。
表1为各杜仲花粉发酵液的成分分析结果
对比实施例1-3与对比例1结果可知，发酵后的花粉蛋白质、黄酮、多酚含量都有所提高，多糖含量有所下降，说明通过发酵能够使花粉中的营养成分充分发挥出其价值。
2、DPPH自由基清除率测定
用无水乙醇配置100μg/mLDPPH工作溶液，避光保存，向实验组中加入100μL稀释1000倍的杜仲花粉发酵液和900微升DPPH工作液(A1)，向对照组中加入100μL的无水乙醇溶液和900微升DPPH工作液(A0)，每个样品重复三次，混匀后，室温黑暗处静置半个小时，离心，去上清在517nm处测定吸光值，实施例1-3和对比例1的测定结果如图1和表2所示。
根据以下公式计算DPPH清除率：
DPPH清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100％。
3、ABTS自由基清除率测定
将7.4mmol/L的ABTS与2.6mmol/L的过硫酸钾混合，在室温避光放置12h，配成ABTS储备液，使用前将储备液用PBS稀释50倍，配成工作液。向实验组中加入100μL稀释1000倍的杜仲花粉发酵液和900μL的ABTS工作液,室温避光放置6min，于波长734nm下测定吸光度为A，用去离子水代替样品溶液测定吸光度为B。实施例1-3和对比例1的测定结果如图2和表2所示。
根据以下公式计算ABTS清除率：
ABTS清除率(％)＝[(A-B)/A]*100％。
表2为杜仲花粉发酵液清除DPPH和ABTS自由基能力的测定
对比实施例1-3与对比例1的结果可知，发酵后的花粉清除自由基，抗氧化的效率更高。
4、杜仲花粉发酵液美白功效分析
酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一种结构复杂含有双核铜的蛋白酶，参与调控生物体内黑色素合成过程，与皮肤的颜色密切相关。适当的抑制酪氨酸酶的活性，则能相应减少黑色素的合成，从而达到美白淡斑的功效。对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价美白产品的主要指标。
PBS缓冲液体系中，以蘑菇酪氨酸酶为催化剂，左旋多巴为底物进行反应。实验时，向反应孔中依次加入磷酸盐缓冲液、样品、蘑菇酪氨酸酶(100u/mL)，在37℃水浴10min，测定此时各实验孔在475nm波长下的OD值。最后向每个实验孔加入底物左旋多巴(1mg/mL)，反应30min时测定此时各孔OD值。实施例1-3和对比例1的测定结果如图3和表4所示。
表3为测定蘑菇酪氨酸酶活性的试验体系
测定时，以相应的对照组为参比，对酪氨酸酶的抑制率的计算公式如下：
抑制率计算公式：I(％)＝1-[(C-D)/(A-B)]×100％。
表4为杜仲花粉发酵液对蘑菇酪氨酸酶活性抑制率
对比实施例1-3与对比例结果可知，发酵后的花粉对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性更大。
5、杜仲发酵液对HFF细胞增殖的影响：
取对数生长期、浓度为1000个/mL的人HFF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μL，每个样品设3个复孔。将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。
将杜仲花粉发酵液稀释1000倍后加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37℃、包含5％C02的细胞培养箱中孵育24h。然后向每孔中加入CCK8溶液10μL，于37℃、包含5％C02的细胞培养箱中孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
计算细胞存活率，实施例1-3和对比例1的结果如表5和图4所示：
表5为杜仲提取物对人HFF细胞增殖的影响
| 样品名称 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对照组 |
| 细胞存活率 | 1.73 | 1.56 | 1.79 | 1.21 | 1 |
对比实施例1-3与对比例结果可知，发酵后的花粉促进人HFF细胞增殖的效率更高。
6、杜仲提取物对HFF胶原蛋白分泌的影响
取对数生长期、浓度为5000个/mL的人HFF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μL,每个样品设3个复孔。向实验组中加入10μL样品，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h，每组样品设3个复孔。收集细胞培养上清液，采用ELISA法，用酶标仪在450nm处测定吸光值，计算出I型胶原蛋白的相对含量。实施例1-3和对比例1的测定结果如表6和图5所示。
表6为杜仲提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
由表6和图5可知，向HFF细胞中添加本发明提供的杜仲发酵液后，实施例3中，皮肤中的I型胶原蛋白含量为233％，说明本发明提供的杜仲发酵液能够显著的促进I型胶原蛋白的表达，可以作为抗老因子添加到化妆品中。
综上，本发明提供的杜仲提取物具有优异的抗衰老的能力，可作为抗衰老添加剂加入到化妆品中。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的杜仲花粉粉碎并过筛，得到杜仲花粉粉末；
(2)按照质量比为10-30:100-300，将步骤(1)中得到的杜仲花粉粉末与水混合，115-122℃下灭菌15min，制得杜仲花粉液；
(3)发酵菌预处理：将低温保存的乳酸菌或酵母菌进行划线，获取单菌落；将挑取的单菌落接种到相应液体培养基中，在28-42℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，通过离心法收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于步骤(2)中制得的杜仲花粉液中，得到接种浓度为105-108CFU/mL的混合液；
(4)将步骤(3)中得到混合液在震荡条件下培养12-72h，得到发酵液，发酵温度为28-42℃；
(5)将步骤(4)中所得的发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为杜仲花粉发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中杜仲花粉粉碎过100-300目筛。
3.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中乳酸菌接种的培养基为MRS培养基。
4.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中酵母菌接种的培养基为YPDA培养基。
5.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中离心的转速为3500-12000r/min，离心时间为10-45min。
6.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中离心半径为9-12cm。
7.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中灭菌温度为115-122℃，灭菌时间为15min。
8.根据权利要求1所述的一种杜仲花粉发酵液制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中杜仲花粉发酵液的pH值为4.5-6.8。
9.一种护肤用产品，其特征在于，包括如权利要求1所述的杜仲花粉发酵液制备方法制得的杜仲花粉发酵液。
10.如权利要求9所述的一种护肤用产品，其特征在于：所述杜仲花粉发酵液作为护肤品中的有效成分的应用。
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