PL226477B1

PL226477B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii oraz jego zastosowanie do wytwarzania pierzgi

Info

Publication number: PL226477B1
Application number: PL406622A
Authority: PL
Inventors: Anna Misiewicz; Marek Kieliszek; Katarzyna Czarniak
Original assignee: Inst Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego Im Prof Wacława Dąbrowskiego
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2017-07-31
Also published as: JP6181772B2; EP2914754A1; PL406622A1; WO2015093997A1; EP2914754B1; LT2914754T; UA114350C2; JP2016508037A

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno - Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 1645 oraz jego zastosowanie do wytwarzania pierzgi.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii. Wynalazek ma zastosowanie w przemyśle spożywczym.

Znane są szczepy Lactobacillus delbrueckii hydrolizujące cukry z wytworzeniem kwasu mlekowego, jednak nie są zdolne hydrolizować cukrów w brzeczkach o w wysokim ciśnieniu osmotycznym. Dla większości bakterii większe ciśnienie osmotyczne jest czynnikiem hamującym wzrost. Wysokie ciśnienie osmotyczne brzeczki miodowej, jak również obecność związków grzybobójczych oraz bakteriobójczych powoduje zahamowanie wzrostu większości mikroorganizmów. Zgodnie z klasyczną systematyką Orla-Jensen bakterie z gatunku Lactobacillus charakteryzują się zdolnością do wytwarzania z cukrów prostych i dwucukrów kwasu mlekowego w formie izomeru D (-) i L(-). W stanie wiedzy dotyczącej przydatnych właściwości określonych szczepów bakterii fermentacji mlekowej istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe szczepy bakterii kwasu mlekowego zdolne hydrolizować cukry w wysokim ciśnieniu osmotycznym z wytworzeniem kwasu mlekowego. Celem wynalazku było uzyskanie nowego szczepu z rodzaju Lactobacillus o zdolnościach przeżywania w wysokim ciśnieniu osmotycznym oraz sposób wytwarzania pierzgi przy użyciu tego szczepu, która będzie charakteryzowała się naturalną trwałością dzięki obecności kwasu mlekowego.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 1645 p.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu zdefiniowanego w pierwszym przedmiocie wynalazku do wytwarzania pierzgi.

Trzecim przedmiotem wynalazku jest pierzga charakteryzująca się tym, że zawiera szczep bakterii zdefiniowany w pierwszym przedmiocie wynalazku.

Szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p uzyskano na drodze wyizolowania monokultury bakterii z naturalnej pierzgi wydobytej z ramek pszczelich w końcowej fazie fermentacji.

₃

Pierzgę pobierano z komórek plastra pszczelego i umieszczano w 10 cm³ płynnego bulionu MRS. Inkubacja trwała 48 godz. w temperaturze 25°C, 30°C i 37°C w warunkach ściśle beztlenowych oraz tlenowych. Wszystkie badane próbki były dziesięciokrotnie rozcieńczane, z czego pobierano 100 μΐ hodowli bakteryjnej na stałe podłoże wzrostowe MRS agar. Posiane płytki MRS inkubowano przez 24-72 godz. w temperaturze 25°C, 30°C i 37°C, w warunkach ściśle beztlenowych oraz tlenowych. Następnie bakterie poddano wielokrotnej selekcji. Selekcję a następnie adaptację do nowych warunków hodowli przeprowadzono na podłożach zawierających jako jedyne źródło węgla glukozę, fruktozę, skrobię, sacharozę oraz na brzeczkach miodowych o gęstości 7, 15, 30, 40, 45 i 50°Blg.

W wyniku tego uzyskano nowy szczep charakteryzujący się następującymi cechami:

- morfologiczne - kolonie bakterii rosnące na stałej pożywce MRS agar w warunkach ściśle beztlenowych mają kształt owalny, lekko wypukły koloru mlecznego o regularnych brzegach, wielkość około 1 mm; młode kolonie są koloru kremowego, a starsze przybierają lekko rdzawy odcień. W obrazie mikroskopowym bakterie mają postać krótkich, zgiętych pałeczek układających się pojedynczo lub tworzących nieregularne skupiska. Nie wytwarzają przetrwalników. Są Gram +, katalazo- ujemne.

- fizjologiczne i biochemiczne - optymalna temperatura wzrostu szczepu wynosi 30°C-37°C. Brak wzrostu następuje w skrajnych temperaturach 25°C i 45°C.

Stwierdzono, że nowy szczep podobnie jak inne szczepy z gatunku Lactobacillus delbrueckii wg testu API firmy bioMerieux (API 50 CHL) zdolny jest do fermentacji następujących cukrów: D-glukozy, D-fruktozy, sacharozy, trehalozy, glukonianu. Dodatkowo nieoczekiwanie okazało się, że szczep ten fermentuje skrobię.

Zgodnie z założonym celem wynalazku nowy szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p charakteryzuje się wysoką opornością osmotyczną, tj. zdolnością przeżywania w stężeniu do 50°Blg. Nieoczekiwanie okazało się, że szczep hydrolizuje skrobię z wytworzeniem kwasu mlekowego. Nowy szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p nie znajduje odpowiednika wśród znanych szczepów z rodzaju Lactobacillus do rozkładania skrobi oraz brzeczki miodowej.

Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wzrost bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p podczas hodowli na brzeczkach miodowych, fig. 2 przebieg fermentacji próby kontrolnej pyłku pszczelego z brzeczką miodową w warunkach ograniczonego dostępu tlenu w temperaturze 30°C, fig. 3 ilustruje przebieg fermentacji pyłku pszczelego

PL 226 477 B1 wraz z brzeczką miodową z zastosowaniem 50% inokulum bakterii L. delbrueckii subsp. delbrueckii nr 2 KKP 1645 w warunkach ograniczonego dostępu tlenu w temperaturze 30°C

P r z y k ł a d I

Zakres badań obejmował hodowlę ożywionych bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p w płynnej pożywce MRS z 2% fruktozą przez okres 24 h w temperaturze 25°C, 30°C, 37°C i 45°C [tabela1]. W niniejszym badaniu tylko w przypadku 25°C i 45°C nie stwierdzono wzrostu bakterii fermentacji mlekowej.

T a b e l a 1

Wyniki temperatury na wzrost bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p

Temperatura inkubacji	KKP 1645
25°C	-
30°C	+
37°C	+
45°C	_

P r z y k ł a d II

Zakres badań obejmował hodowlę ożywionych bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p w płynnej pożywce MRS z 2% fruktozą zawierającym różne dodatki NaCl (0,5-12%) przez okres 24 h w temperaturze 37°C [tabela2]. W niniejszym badaniu nie stwierdzono znaczącego wpływu dodatku NaCl na rozwój bakterii fermentacji mlekowej.

T a b e l a 2

Wyniki wpływu stężenia NaCl na szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p

Stężenie NaCl (%)	KKP 1645
0,5	+
5	+
8	+
10	+
12	+

P r z y k ł a d III

Zakres badań obejmował hodowlę ożywionych bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p w płynnej pożywce MRS z 2% fruktozą o pH 4.0, 5.5, 6.5, 7.5, 8.0 przez okres 24 h w temperaturze 37°C [tabela3]. W niniejszym badaniu tylko w przypadku pH 4.0 nie stwierdzono wzrostu bakterii fermentacji mlekowej.

T a b e l a 3

Wyniki wpływu pH na szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p

PH	KKP 1645
4	-
5.5	+
6.5	+
7.5	+
8	+

PL 226 477 B1

P r z y k ł a d IV

Hodowlę bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p prowadzono na bulionie MRS z 2% fruktozą i umieszczono na okres 24 h w temperaturze 37°C.

Zdolność do wytwarzania kwasu mlekowego określono prowadząc proces fermentacji w ciekłych podłożach zawierających glukozę, fruktozę, sacharozę, skrobię, laktozę, jako jedyne źródło węgla oraz na brzeczkach miodowych 7°Blg, 15°Blg, 30°Blg w temperaturze 37°C.

Podłoża do prowadzenia biosyntezy kwasu mlekowego szczepiono materiałem posiewowym w ilości 10%. Proces biosyntezy kwasu mlekowego prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej o częstości 33 obrotów 150 obr/min w kolbach płaskodennych o objętości 500 cm³ zawierających 100 cm³ podłoża fermentacyjnego. Temperatura hodowli wynosiła 37°C, czas hodowli 72 godziny.

W tabeli 4 przedstawiono wyniki przeprowadzonej biosyntezy kwasu mlekowego przez nowy szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p.

T a b e l a 4

Wyniki przeprowadzonej biosyntezy kwasu mlekowego (72 h) przez szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p

Podłoże	Ilość kwasu mlekowego w g/ 100 cm³ płynu pohodowlanego	Cukry redukujące w przeliczeniu na glukozę [%]
forma D(+)	forma L (-)
Fruktoza	2,9	0,8	0,1
Glukoza	3,7	0,3	0, 17
Sacharoza	3,8	0,2	0, 75
Skrobia	2,1	1,8	0,1
Brzeczka miodowa 7°Blg	4,5	0, 14	1,98
Brzeczka miodowa 15°Blg	4,3	0,22	2, 11
Brzeczka miodowa 30°Blg	3,9	0,31	11,62

P r z y k ł a d V

Określono wpływ brzeczek miodowych na wzrost bakterii w układzie OD (gęstości optycznej). ₃

Namnażanie bakterii prowadzono po zaszczepieniu płynnego podłoża hodowlanego 1 cm³ 24 godz. hodowli bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p. Oznaczenie gęstości optycznej wykonano w celu określenia wzrostu komórek bakteryjnych na brzeczce miodowej 7, 15, 30, 40, 45 i 50°Blg [tabela 5]. Pomiary OD przeprowadzono na spektrofotometrze przy długości fali λ=550 nm. W porównaniu ze znanymi szczepami z rodzaju Lactobacillus, przyrost biomasy szczepu Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p na brzeczkach miodowych jest znacznie wyższy. Nowy szczep Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p toleruje wyższe stężenia cukrów - charakteryzuje się wysoką tolerancją osmotyczną w porównaniu z innymi szczepami bakterii fermentacji mlekowej. Wzrost bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p podczas hodowli na brzeczkach miodowych pokazano na fig. 1.

P r z y k ł a d VI

Określenie właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p.

W badaniu antagonizmu międzyszczepowego zastosowano metodę kropelkową (Klewicka E.

i wsp. 1999. Antagonistyczna aktywność bakterii fermentacji mlekowej Lactobacillus acidophilus. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość). Polega ona na równoległym wzroście szczepu wskaźnikowego i badanego. Grupę drobnoustrojów wskaźnikowych stanowiły Bacillus cereus KKP 358, Listeria monocytogenes KKP 1170, Salmonella sp. KKP 996, Pseudomonas aeruginosa KKP 161, Escherichia coli KKP 364, Serratia liquefaciens KKP 1665, Staphylococcus aureus KKP 1497, Staphylococcus saprophyticus KKP 1493. Bakterie wskaźnikowe pochodziły z Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS.

Wyniki badań właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p zostały przedstawione w tabeli 5.

PL 226 477 B1

T a b e l a 5

Działanie antagonistyczne szczepu Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p wobec bakterii wskaźnikowych

Szczep wskaźnikowy	Średnica strefy zahamowania wzrostu (w mm)
Serratia liquefaciens KKP 1665	19
Escherichia coli KKP 364	19
Salmonella sp. KKP 996	19
Listeria monocytogenes KKP 1170	23
Pseudomonas aeruginosa KKP 161	17
Staphylococcus aureus KKP 1497	20
Staphylococcus saprophyticus KKP 1493	17
Bacillus cereus KKP 358	21

Na podłoże stałe MRS agar nanoszono w formie kropli 5 μΐ hodowli bakterii Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p i po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C powierzchnię zalewano murawą zawierającą szczep wskaźnikowy w ilości 10⁸ jtk/ml. Następnie płytki ponownie inkubowano przez okres 24 godz. w temp. 37°C. Po inkubacji wokół kolonii bakterii mlekowej powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę stopnia antagonizmu.

P r z y k ł a d VII

W celu scharakteryzowania wybranych bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p przeprowadzono analizę oporności na antybiotyki metodą krążkową stosując podłoże wzrostowe MRS Agar oraz podłoże kwaszące Blickfeldta z CaCO3 [tabela 6] .

T a b e l a 6

Wyniki badań antybiotykooporności szczepu Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p (średnica strefy zahamowania wzrostu w mm)

Antybiotyk	Podłoże MRS	Podłoże Blickfeldta z CaCO3
Ampicylina	40	37
Penicylina	48	48
Streptomycyna	0	17
Erytromycyna	34	37

P r z y k ł a d VIII

W celu sprawdzenia możliwości zastosowania szczepu bakterii wg wynalazku do wytwarzania pierzgi przeprowadzono fermentację z jego zastosowaniem. Do brzeczki wraz z pyłkiem kwiatowym dodawano inokulum szczepu 10% lub 50%, w postaci 48 godzinnej hodowli. Liczba bakterii w dodawanym inokulum mieściła się w granicach 10⁶-10⁷ jtk/ml. Równolegle prowadzono fermentację w próbkach kontrolnych o gęstości brzeczek 7, 14 i 30°Blg, zawierających jedynie mikroflorę naturalną pyłku pszczelego.

Przebieg fermentacji próbki kontrolnej pyłku pszczelego przedstawiono na fig. 2. We wszystkich trzech próbkach o gęstości 7, 14 i 30°Blg nastąpiła redukcja liczby bakterii fermentacji mlekowej z 10² do 10¹ jtk/g w podłożach o gęstości 14 i 30°Blg oraz całkowite zahamowanie wzrostu bakterii mlekowych w podłożu o gęstości 7°Blg. Największą ilość kwasu mlekowego w ilości 1,39 g/100 g uzyskano przy gęstości 30°Blg, najmniejszą przy gęstości 7°Blg. We wszystkich próbkach, tak jak dotychczas odnotowano stopniowy wzrost kwasowości - największy w podłożu o gęstości 7°Blg do wartości 5,5 g kw. mlekowego/100 g. Zmniejszeniu uległa również ilość cukrów w podłożu niezależnie od gęstości fermentowanego podłoża, a także ilość białka w supernatancie.

PL 226 477 B1

Na fig. 3 przedstawiono dynamikę fermentacji mieszaniny pyłku i brzeczki miodowej w trakcie dniowej fermentacji z 50% inokulum zawierającym szczep wg wynalazku. Do zaszczepienia podło10 ża stosowano inokulum o gęstości 10¹⁰ jtk/ml. W podłożu o gęstości 7, 14°Blg przez cały okres fermentacji liczba bakterii mlekowych utrzymywała się na podobnym poziomie. Zdecydowana redukcja liczby bakterii fermentacji mlekowych wystąpiła w podłożu o gęstości 30°Blg. Zwiększając ilości inokulum z 10% do 50% nie zaobserwowano wzrostu końcowej zawartości kwasu mlekowego w podłożu. Uzyskano podobne wartości, przy czym największa dla szczepu Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii nr 2 KKP 1645 (30°Blg), która wynosiła 2,48 g/ 100 g. Podobnie jak w przypadku poprzednich fermentacji zmniejszyła się zawartość cukrów, białka.

Claims

1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus delbrueckii zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego Warszawie pod numerem KKP 1645p.

2. Zastosowanie szczepu zdefiniowanego w zastrz. 1, do wytwarzania pierzgi.

3. Pierzga, znamienna tym, że zawiera szczep bakterii zdefiniowany w zastrz. 1.