PL185681B1

PL185681B1 - Sposób wytwarzania L-aminokwasu przy użyciu mikroorganizmu

Info

Publication number: PL185681B1
Application number: PL94314090A
Authority: PL
Inventors: Hiroyuki Kojima; Kazuhiko Totsuka
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2003-07-31
Also published as: SK53796A3; US5830716A; PE30295A1; DE69429452D1; PL314090A1; CA2175042A1; SK283058B6; EP0733712A1; DE69429452T2; HU9601085D0; CZ121396A3; ES2166788T3; AU8002694A; WO1995011985A1; CN1082092C; HU221120B1; KR960705947A; MY121990A; DE69429452C5; CZ291499B6

Abstract

1. Sposób wytwarzania L-aminokwasu, zwlaszcza L-treoniny, L-lizyny, kwasu L-gluta- minowego, L-leucyny, L-izoleucyny, L-waliny lub L-fenyloalaniny, przy uzyciu mikroorgani- zmu, w którego genomie korzystnie znany jest fragment DNA zawierajacy miejsce poczatku replikacji plazmidu zawierajacego gen transhydrogenazy, dziala gen transhydrogenazy i mozliwa jest amplifikacja tego genu, zwlaszcza mikroorganizmu dobranego sposród grupy obejmujacej bakterie nalezace do rodzaju Escherichia, Bacillus lub Serratia oraz Brevibacte- rium lactofermentum, obejmujacy etapy, w których modyfikuje sie lub dostarcza zmodyfiko- wany mikroorganizm, hoduje sie mikroorganizm w podlozu hodowlanym, w którym powstaje i gromadzi sie L-aminokwas, a nastepnie wydziela sie L-aminokwas z podloza hodowlanego, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm z pobudzona aktywnoscia enzymatyczna transhydrogenazy nukleotydu nikotynoamidowego w komórce. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm z pobudzona ekspresja genu kodujacego transhydrogenaze nukleotydu nikotynoamidowego w komórce. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm ze zamplifi- kowanym genem kodujacym transhydrogenaze nukleotydu nikotynoamidoadeninowego w komórce. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-aminokwasu przy użyciu mikroorganizmu. Typowe przykłady mikroorganizmów stosowanych w sposobie według wynalazku obejmują mikroorganizmy należące do rodzaju Escherichia , Bacillus, Serratia i Brevibacterium lactofermentum. Sposobem według wynalazku wytwarza się zwłaszcza takie L-aminokwasy jak L-tre-onina, L-lizyna, kwas L-glutaminowy, L-leucyna, L-izoleucyna, L-walina lub L-fenyloalanina.

Fermentacja L-aminokwasów jest typowym przykładem dobrze znanego sposobu wytwarzania substancji docelowej z zastosowaniem mikroorganizmów. L-aminokwasy stosuje się nie tylko do przypraw i artykułów żywnościowych, ale także jako składniki różnych leczniczych mieszanek odżywczych, dodatków do paszy dla zwierząt, jako czynniki stosowane w przemyśle farmaceutycznym i chemicznym, ponadto jako czynniki wzrostowe przy wytwarzaniu innych L-aminokwasów takich jak u L-lizyna i L-homoseryna z zastosowaniem mikroorganizmów. Mikroorganizmy należące do rodzaju Escherichia, Bacillus i Serratia oraz Brevibacterium lactofermentum znane są jako mikroorganizmy, które można stosować do fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasu.

Do fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów można stosować bakterie typu dzikiego (szczepy typu dzikiego), szczepy auksotroficzne otrzymane z szczepów typu dzikiego, mutanty o zmienionej regulacji metabolizmu otrzymane z szczepów typu dzikiego jako różne mutanty oporne na leki oraz szczepy posiadające zarówno właściwości szczepów auksotroficznych, jak i mutantów o zmienionej regulacji metabolizmu. Substancje wymagane przez szczepy auksotroficzne różnią się w zależności od szczepu, a szczepy auksotroficzne wymagające identycznej substancji, różnią się stopniem auksotrofii. Podobnie, rozmaite są mutanty o zmienionej regulacji metabolizmu, otrzymywane jako mutanty oporne na leki.

Do fermentacji L-aminokwasów zastosowano ostatnio technikę zrekombinowanego DNA. Teoria tej technologii opiera się na wzmacnianiu układu biosyntezy L-aminokwasu w gospodarzu będącym mikroorganizmem przez wzbogacanie w gen(y) kodujący(ce) enzym(y) biosyntezy L-aminokwasów. Szczegóły takiej techniki opisano na przykład w „Amino Acid Fermentation, Society Press Japan (1986)”.

Jednakże, mikroorganizmy zazwyczaj stosowane w fermentacyjnym wytwarzaniu L-amino-kwasów posiadają szlaki biosyntetyczne, obejmujące szlaki biosyntezy L-aminokwasów

185 681 i szlaki biosyntezy koenzymów, identyczne ze szlakami mikroorganizmów typu dzikiego. Mikroorganizmy wytwarzające L-aminokwasy modyfikuje się przez zniesienie wrażliwości na hamowanie przez produkt końcowy lub inne czynniki występujące w szlaku biosyntezy aminokwasów. Jako środki do wyhodowania takich szczepów stosowano, na przykład, zapewnienie właściwości auksotroficznych lub oporności na lek komórkom mikroorganizmu lub amplifikowanie genu(ów) koduj ącego(ych) enzym(y) biosyntezy przez technologię zrekombinowanego DNA.

Podczas wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem mikroorganizmów, każda substancja wytwarzana jest w szlaku biosyntezy w komórce mikroorganizmu. Jednym z ważnych koenzymów o zasadniczym znaczeniu dla efektywnego działania odpowiedzialnych enzymów w układzie biosyntetycznym jest zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (dalej w niniejszym opisie określany jako NADPH). Jednakże, nie donoszono o zależności pomiędzy ilością NADPH w komórce a wydajnością wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem mikroorganizmów.

Transhydrogenaza dinukleotydu nikotynoamidowego (dalej w niniejszym opisie określana po prostu jako „transhydrogenaza”) jest znana jako jeden z enzymów odpowiedzialnych za wytwarzanie NADPH. Wiadomo, że enzym ten jest obecny w różnych organizmach, włącznie z mikroorganizmami należącymi do rodzaju Escherichia, Bacillus i Serratia. Stosując Escherichia coli, typowy mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia, przeprowadzono oczyszczenie transhydrogenazy (David M. Ciarkę i Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem., 149, 517-523 (1985)), sklonowanie kodującego ją genu (David M. Ciarkę i Philip D. Bragg, J. Bacteriology, 162, 367-373 (1985)) i określenie sekwencji nukleotydowej genu (David M. Ciarkę, Tip W. Loo, Shirley Gillam i Philip D. Bragg, Eur. J. biochem. 158, 647-653 (1986)), co również uczyniło oczywistym jego istnienie. Jednakże, fizjologiczna funkcja enzymu jest wciąż prawie nieznana. Wskazuje na to fakt, że szczepy pozbawione tego enzymu nie wykazują żadnych zmian fenotypowych.

Konwencjonalnie, wydajność wytwarzania substancji docelowej poprawia się poprzez zniesienie wrażliwości na regulację syntezy przez produkt(y) końcowy(e) lub inne czynniki wytwarzane w szlaku biosyntezy substancji docelowej lub poprzez koenzym wymagany do syntezy substancji docelowej, który występuje w komórkach mikroorganizmów. Konkretnym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu poprawienia wydajności wytwarzania substancji docelowej w oparciu o całkowicie nową teorię niż wspomniana powyżej.

W biosyntezach takich substancji, jak L-aminokwasy, w żywych organizmach zachodzi szereg reakcji redukcji. W wielu przypadkach koenzym NADPH jest wykorzystywany fizjologicznie jako wewnątrzkomórkowa substancja redukująca. Na przykład, dehydrogenaza glutaminianowa wymaga NADPH jako koenzymu w szlaku biosyntezy kwasu L-glutaminowego. Dehydrogenaza semialdehydu asparaginowego, reduktaza dihydrodipikolinianowa wymagają NADPH jako koenzymu w szlaku biosyntezy L-lizyny.

W szlakach biosyntezy innych L-aminokwasów NADPH odgrywa również ważną rolę jako koenzym. Ponadto, kwas glutaminowy ma zasadnicze znaczenie jako donor grup aminowych w wielu szlakach biosyntezy L-aminokwasów. Dlatego też, NADPH jest także wymagany do dostarczania grup aminowych w biosyntezach L-aminokwasów.

NADPH jest głownie wytwarzany przez metabolizm glukozy w cyklu pentozofosforanowym, w którym zaangażowane są dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i dehydrogenaza fosfoglukonianowa. Można obliczyć, że w cyklu pentozofosforanowym wydajność wytwarzania NADPH wynosi 12 cząsteczek na jedną cząsteczkę glukozy, ponieważ uwalniany jest dwutlenek węgla.

Z drugiej strony, zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (dalej w niniejszym opisie określany jako „NADH”) jest cząsteczką bardzo podobną do NADPH, jednak nie może on jednak w większości przypadków być wykorzystywany jako koenzym do biosyntezy L-amino-kwasów. NADH jest biosyntetyzowany przez cykl kwasów trikarboksylowych i w komórce obecnąjest zazwyczaj jego wystarczającą ilość.

W szlakach biosyntezy L-aminokwasów, w wyniku procesu biosyntezy pożądanych L-aminokwasów z glukozy często wytwarzane są wewnątrzkomórkowe składniki, które nie

185 681 mogą być efektywnie wykorzystywane. Zakłada się, że takie składniki są zazwyczaj utleniane w cyklu kwasów trikarboksylowych, w wyniku czego tworzą się duże ilości NADH.

Wysunięto hipotezę, że podczas wytwarzania substancji docelowej w procesie wytwarzania substancji docelowej z zastosowaniem mikroorganizmu wymagana jest duża ilość NADPH; do dostarczenia tego NADPH nieuniknione jest zużywanie glukozy i w konsekwencji wydajność wytwarzania substancji docelowej w przeliczeniu na zużyty cukier ulega obniżeniu (hipoteza 1).

Ponadto wysunięto hipotezę, że podczas procesu wytwarzania substancji docelowej z zastosowaniem mikroorganizmu nieuniknione jest akumulowanie wewnątrzkomórkowych składników, które nie mogąbyć efektywnie wykorzystywane podczas wytwarzania substancji docelowej; są one metabolizowane w cyklu kwasów trikarboksylowych, w wyniku czego występuje wzrost stężenia NADH w komórce (hipoteza 2).

Na podstawie opisanych powyżej hipotez 1 i 2 zakłada się, że jeśli wewnątrzkomórkowy NADH może być efektywnie przekształcany w NADPH, to ilość cukru wymaganego do syntezy NADPH przez mikroorganizm może się zmniejszyć, a substancja docelowa może być wytwarzana z wyższą wydajnością. Równocześnie zakłada się, że jako środek do przekształcania NADH wytwarzanego w cyklu kwasów trikarboksylowych w NADPH można wykorzystać transhydrogenazę.

Wykonano badania na podstawie opisanej powyżej koncepcji. W wyniku intensywnych badań udało się z bakterii z rodzaju Escherichia otrzymać fragment DNA zawierający gen transhydrogenazy i wykorzystując ten fragment DNA wzmocnić zdolność mikroorganizmów do wytwarzania zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. Stwierdzono ponadto, że wydajność wytwarzania L-aminokwasu ulega poprawie w wymienionych powyżej mikroorganizmach posiadających wzmocnione zdolności wytwarzania zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania L-aminokwasu, zwłaszcza L-treoniny, L-lizyny, kwasu L-glutaminowego, L-leucyny, L-izoleucyny, L-waliny lub Lfenyloalaniny, przy użyciu mikroorganizmu, w którego genomie korzystnie znany jest fragment DNA zawierający miejsce początku replikacji plazmidu zawierającego gen transhydrogenazy, działa gen transhydrogenazy i możliwa jest amplifikacja tego genu, zwłaszcza mikroorganizmu dobranego spośród grupy obejmującej bakterie należące do rodzaju Escherichia, Bacillus lub Serratia oraz Brevibacterium lactofermentum, obejmujący etapy, w których modyfikuje się lub dostarcza zmodyfikowany mikroorganizm, hoduje się mikroorganizm w podłożu hodowlanym, w którym powstaje i gromadzi się L-aminokwas, a następnie wydziela się L-aminokwas z podłoża hodowlanego, charakteryzujący się tym, że hoduje się mikroorganizm z pobudzoną aktywnością enzymatyczną transhydrogenazy nukleotydu nikotynoamidowego w komórce.

Korzystnie, hoduje się mikroorganizm z pobudzoną ekspresją genu kodującego transhydrogenazę nukleotydu nikotynoamidowego w komórce.

Szczególnie korzystnie, hoduje się mikroorganizm ze zamplifikowanym genem kodującym transhydrogenazę nukleotydu nikotynoamidoadeninowego w komórce.

Substancjami docelowymi, które maja być wytwarzane przez mikroorganizm według niniejszego wynalazku są różne L-aminokwasy, takie jak L-treonina, L-lizyna, kwas Lglutaminowy, L-leucyna, L-izoleucyna, L-walina i L-fenyloalanina. Dotyczyć może to również jakiejkolwiek innej niż powyższe substancji spośród tych dotychczas wytwarzanych przez mikroorganizmy, pod warunkiem, że do jej biosyntezy wymagany jest NADPH, na przykład kwasów nukleinowych jak kwas guanylowy i kwas inozyno wy, witamin, antybiotyków, czynników wzrostowych i substancji aktywnych fizjologicznie. Ponadto, nie trzeba dodawać, że nawet w przypadku substancji nie wytwarzanej dotąd przy użyciu mikroorganizmu, niniejszy wynalazek można zastosować pod warunkiem, że do jej biosyntezy wymagany jest NADPH.

W biosyntezie streptomycyny, na przykład, NADPH wykorzystywany jest do syntezy dTDP-4-okso-4,6-dideoksy-D-glukozy z dTDP-glukozy. Ponadto, aminokwasy służą jako prekursory w przypadku antybiotyków peptydowych, a zatem samo przez się jest zrozumiałe,

185 681 że NADPH jest wymagany do ich biosyntezy. Ponadto, prekursorami penicyliny, antybiotyku beta-laktamowego są L-walina, L-cysteina i kwas L-alfa-aminoadypinowy, a zatem NADPH jest wymagany do ich biosyntezy.

Informację na temat, jaka substancja wymaga NADPH w swojej syntezie, można uzyskać ze szlaku biosyntezy, jeśli szlak biosyntezy tej substancji jest znany.

Nie jest szczególnie ograniczone jaki mikroorganizm można wykorzystać w niniejszym wynalazku, pod warunkiem, że należy on do tych dotychczas stosowanych do wytwarzania substancji, takich jak bakterie należące do rodzaju Escherichia, maczugowce, bakterie należące do rodzaju Bacillus i bakterie należące do rodzaju Serratia. Jest on korzystnie takim organizmem, w którym fragment DNA zawierający miejsce początku replikacji plazmidu otrzymano dla tego mikroorganizmu, działa gen transhydrogenazy i można zwiększyć liczbę kopii genu transhydrogenazy. Z drugiej strony, szczep, który wyjściowo posiada wysoką zdolność wytwarzania substancji docelowej, jest najbardziej preferowany do stosowania jako szczep do poprawiania produktywności według niniejszego wynalazku. Albowiem, uważa się, że w szczepie wykazującym wysoką produktywność, wynik poprawiania produktywności według niniejszego wynalazku będzie silny, ponieważ zjawiska opisanych powyżej hipotezy 1 i 2 wykazują silne działanie. Przykładem jest szczep Escherichia coli B-3996 i podobne, gdy substancją docelową jest L-treonina, szczep Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3579) i podobne, gdy substancją docelową jest L-fenyloalanina, szczep Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853) i podobne, gdy substancją docelową jest kwas L-glutaminowy i Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (FERM P-3387, ATCC 31269) i podobne, gdy substancją docelowąjest L-lizyna.

Nie pojawiają się żadne problemy z podłożem wykorzystywanym do wytwarzania substancji docelowej, gdy stosuje się dobrze znane, stosowane dotychczas podłoże, zależne od wykorzystywanego mikroorganizmu. A zatem, można zastosować zwykłe podłoże, które zawiera źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i ewentualnie inne składniki organiczne. Do przeprowadzenia niniejszego wynalazku nie jest wymagane żadne specjalne podłoże.

Jako źródło węgla możliwe jest stosowanie cukrów, takich jak glukoza, laktoza, galaktoza, fruktoza i hydrolizat skrobi; alkoholi, takich jak glicerol lub sorbitol, i kwasów organicznych, takich jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy i kwas bursztynowy lub podobne.

Jako źródło azotu możliwe jest stosowanie nieorganicznych soli amonowych, takich jak siarczan amonowy, chlorek amonowy i fosforan amonowy; azotu organicznego, takiego jak hydrolizat soi; amoniaku gazowego i wodnego roztworu amoniaku.

Jako źródła organicznych śladowych substancji odżywczych, wskazane jest aby zawarte były w pożądanych ilościach wymagane substancje, takie jak witamina B1, L-homoseryna i Ltyrozyna bądź ekstrakt drożdżowy. Ewentualnie, dodaje się inne niż wymienione powyżej substancje - małe ilości fosforanu potasowego, siarczanu magnezowego, jonu żelaza, jonu magnezu i podobnych.

Hodowlę można prowadzić w dobrze znanych, stosowanych uprzednio warunkach, które zależą od wykorzystywanego mikroorganizmu. Mianowicie, korzystne jest prowadzenie hodowli wciągu 16-120 godzin w warunkach tlenowych. Podczas hodowli kontroluje się temperaturę hodowli, tak aby wynosiła od 25°C do 45°C i pH, tak aby wynosiło 5-8. W razie potrzeby, do doprowadzania pH można użyć nieorganicznych lub organicznych substancji kwaśnych lub zasadowych, jak również gazowego amoniaku.

W niniejszym wynalazku nie jest wymagana żadna specjalna metoda zbierania produktu metabolicznego z płynu podłoża po zakończeniu hodowli. Mianowicie, niniejszy wynalazek można przeprowadzić przez połączenie konwencjonalnych dobrze znanych metod, takich jak metoda żywicy jonowymiennej, metoda wytrącania i podobne.

Przykładem sposobu zwiększania produktywności mikroorganizmów pod względem NADPH jest zwiększanie aktywności enzymatycznej transhydrogenazy w komórkach mikroorganizmów.

Przykładem sposobu zwiększania aktywności enzymatycznej transhydrogenazy jest podwyższanie ekspresji genu transhydrogenazy w komórkach mikroorganizmów. Ponadto,

185 681 innym sposobem zwiększania aktywności enzymatycznej transhydrogenazy jest modyfikacja genu transhydrogenazy i tworzenie transhydrogenazy o podwyższonej aktywności.

Przykładem sposobu zwiększania ekspresji genu transhydrogenazy w komórkach mikroorganizmów jest zwiększenie liczby kopii genu transhydrogenazy w komórkach mikroorganizmów.

Do zwiększenia liczby kopii genu transhydrogenazy, konieczny jest fragment DNA zawierający wyżej wspomniany gen. W związku z tym, gen transhydrogenazy sklonowano w szczepie K-12 Escherichia coli jako bakterii należącej do rodzaju Escherichia i określono jego sekwencję nukleotydową (D. M. Ciarkę i in., Eur. J. Biochem., 158, 647-653. A zatem, przygotowanie fragmentu DNA zawierającego wyżej wspomniany gen uzyskuje się przez zastosowanie metody ujawnionej przez Clarke'a i in. Ponadto, pożądany fragment DNa można otrzymać metodą hybrydyzacji stosując syntetyczną sondę DNa, przygotowaną w odniesieniu do sekwencji nukleotydowej ujawnionej przez D. M. Clarke'a i in., oraz metodą PCR stosując syntetyczne startery DNA przygotowane w odniesieniu do wyżej wspomnianej sekwencji nukleotydowej. Jeśli fragment DNA zawierający gen transhydrogenazy zliguje się z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w docelowym mikroorganizmie, możliwe jest zwiększenie liczby kopii genu transhydrogenazy.

Starter DNA, który stosuje się klonując gen transhydrogenazy z bakterii należącej do rodzaju Escherichia przez zastosowanie metody PCR można właściwie przygotować na podstawie, na przykład, znanej sekwencji Escherichia coli (D. M. Ciarkę i in., Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)). Ponieważ transhydrogenaza zawiera dwie podjednostki, może być konieczne zamplifikowanie obu genów pntA i pntB każdej z nich. Odpowiednie są dwa startery 5'-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) i 5'CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2), które mogą zamplifikować region o długości 3 kb zawierający oba geny pntA i pntB. Startery te różnią się nieznacznie od sekwencji podanej przez Clarke'a i in. Jednakże, dzięki zmianom w sekwencji, możliwe jest wprowadzenie miejsca rozszczepienia BamHI przed obu genami pntA i pntB oraz miejsca rozszczepienia HindIU za obu genami pntA i pntB. Ani miejsce BamHI, ani miejsce Hindlll nie występuje w obu genach i w ich pobliżu. Są one zatem dogodne przy klonowaniu zamplifikowanego fragmentu DNA z wykorzystaniem tych enzymów restrykcyjnych i przy przenoszeniu do DNA innego wektora. Syntezę DNA startera można przeprowadzić zgodnie z powszechną metodą, stosując syntezator DNA model 380B, produkowany przez Applied Biosystems, oraz przez zastosowanie metody z wykorzystaniem fosforynoamidów (patrz Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)). PCR można przeprowadzić stosując DNA Thermal Cycler model PJ2000, produkowany przez Takara Shuzo Co., Ltd., i używając polimerazy DNa Tag, zgodnie z metodą podaną przez producenta.

Fragment DNA zawierający gen transhydrogenazy można otrzymać z mikroorganizmu innego niż bakterie należące do rodzaju Escherichia. Pożądany fragment DNA można otrzymać stosując jako metodę jego otrzymywania metodę hybrydyzacji z syntetyczną sondę DNA, przygotowaną w odniesieniu do sekwencji nukleotydowej ujawnionej przez D. M. Clarke'a i in., oraz metodą PCR stosując syntetyczne startery DNA przygotowane w odniesieniu do wyżej wspomnianej sekwencji nukleotydowej.

Sondę DNA do stosowania w metodzie hybrydyzacji lub startery DNA do stosowania przy klonowaniu genu przez zastosowanie metody PCR można odpowiednio przygotować na podstawie, na przykład, znanej sekwencji Escherichia coli (D. M. Ciarkę i in., Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)). Zakłada się, że sekwencja nukleotydową genu jest inna dla każdego z mikroorganizmów. Pożądane jest zatem przygotowanie syntetycznych DNA odpowiadających częściom konserwatywnym w stosunku do transhydrogenaz pochodzących z każdego z mikroorganizmów.

Gen transhydrogenazy' zamplifikowany metodą PCR liguje się z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w komórce bakterii należącej do rodzaju Escherichia, jeśli wprowadza się go do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, i wprowadza się go do komórek bakterii należącej do rodzaju Escherichia.

185 681

W przypadku wprowadzania otrzymanego fragmentu DNA zawierającego gen transhydrogenazy do mikroorganizmu innego niż należący do rodzaju Escherichia, wyżej wspomniany fragment DNA liguje się z DNA wektora ulegającego autonomicznej replikacji w komórce mikroorganizmu poddawanego wprowadzaniu wyżej wspomnianego fragmentu DNA, i wprowadza do wyżej wymienionych komórek.

DNA wektora plazmidowego jest korzystny jako DNA wektora, który może być wykorzystany w niniejszym wynalazku; jego przykładami sąpUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 i podobne. Dostępne są również inne niż powyższe, fagowe wektory DNA. W celu uzyskania wydajnej ekspresji transhydrogenazy, dopuszczalne jest również zastosowanie wektora działającego w mikroorganizmach, takiego jak lac, trp i PL. Ponadto, w celu zwiększenia liczby kopii genu transhydrogenazy, DNA zawierający wyżej wspomniany gen można zintegrować z chromosomem stosując metodę wykorzystującą transpozon (Berg, D.E. i Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983), faga Mu (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekombinację homologiczną (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

Jeśli mikroorganizmem, do którego wprowadza się gen jest maczugowiec, DNA wektora, który można zastosować w niniejszym wynalazku, jest wektor plazmidowy ulegający autonomicznej replikacji w maczugowcu, taki jak pAM330 (patrz publikacja japońskiego opisu patentowego numer 1-11280) i pHM1519 (patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 58-77895).

W celu wyselekcjonowania szczepu posiadającego rzeczywiście wzmocnioną aktywność enzymatyczną transhydrogenazy ze szczepów-kandydatów posiadających potencjalnie wzmocnioną aktywność enzymatyczną transhydrogenazy, można zastosować jako metodę potwierdzenia wzmocnienia aktywności enzymatycznej transhydrogenazy na przykład znaną metodę (David M. Clarke i Philip D. Bragg, Journal of Bacteriology, 162, 367-373 (1985)).

Przedmiot wynalazku w przykładach realizacji jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia przygotowywanie plazmidu pMW::THY, fig. 2 przedstawia przygotowywanie plazmidu pHSG::THYB, a fig. 3 przedstawia przygotowywanie plazmidu pSU::THY.

Niniejszy wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej konkretnie poniżej, w korzystnych przykładach wykonania.

Przykład 1: Klonowanie genu transhydrogenazy

Sekwencja nukleotydowa genów pntA i pntB, które kodują transhydrogenazę Escherichia coli, została określona uprzednio (D. M. Clarke i in., Eur. J. Biochem. 158, 647-653 (1986)), i opisano, że pntA i pntB kodują białka o długości odpowiednio 502-reszt aminokwasowych i 462 reszt aminokwasowych. Ponadto, wiadomo również, że oba wymienione powyżej białka są wymagane do ekspresji aktywności enzymatycznej transhydrogenazy, że oba geny pntA i pntB zlokalizowane są kolejno na chromosomalnym DNA, i że dzięki temu oba geny można sklonować w jednym fragmencie DNA.

Aby ułatwić późniejsze operacje, autorzy wynalazku jednocześnie sklonowali nie tylko oba geny pntA i pntB, ale również region położony przed tymi genami, który posiada aktywność promotora. Konkretnie, fragment DNA zawierający gen i region promotora zamplifikowano przez PCR w celu sklonowania go.

Jako startery PCR zsyntetyzowano zgodnie z konwencjonalną metodą dwa syntetyczne oligonukleotydy, posiadające sekwencję 5 '-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) i 5'-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2). Jako DNA matrycowy do PCR przygotowano całkowity genomowy DNA Escherichia coli K-12 MC 1061 według metody Saitoh i Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963)). Docelowy fragment DNA zamplifikowano przez PCR stosując dwa oligonukleotydy starterowe i matrycę chromosomalnego DNA zgodnie z metodą Erlicha i in. (PCR Technology, Stockton press (1989)). Syntetyczne DNA użyte jako startery miały niewielką różnicę w odpowiadających środkowych częściach syntetycznych fragmentów DNA w porównaniu z sekwencją nukleotydową podaną przez Clarke i in. Jest to zaplanowane dla wprowadzenia miejsca rozszczepienia BamHI i miejsca rozszczepienia Hindlll przy projektowaniu syntetycznych oligonukleotydów. Te miejsca rozszczepienia enzymów

185 681 restrykcyjnych wymagane są do wstawiania zamplifikowanego fragmentu DNA do DNA wektora. Wprowadzenie miejsc restrykcyjnych powoduje brak dopasowania pomiędzy starterami i chromosomalnym DNA w procesie PCR. Jednakże, brak dopasowania nie wpływa na amplifikację DNA w PCR, ponieważ te miejsca restrykcyjne zlokalizowane były w środkowych częściach syntetycznego fragmentu DNA. Amplifikację fragmentu DNA o długości 3,0 kb potwierdzono przez elektroforezę w żelu agarozowym.

Zamplifikowany fragment DNA o długości 3,0 kb i wektor plazmidowy pMWl 18, posiadający marker oporności na ampicylinę, (dostępny w Nippon Gene Inc.) strawiono BamHI i HindUL Strawione fragment DNA i DNA wektora zligowano ligazą DNA w celu przygotowania zrekombinowanego DNA. Otrzymany zrekombinowany plazmid nazwano pMW::THY (patrz fig. 1).

Escherichia coli JM109 (dostępna w Takara Shuzo Co., Ltd.) stransformowano plazmidem pMW::THY i otrzymano transformant Escherichia coli JM 109 (pMW::THY). Aktywność enzymatyczną transhydrogenazy obecną w każdym z roztworów ekstraktów komórkowych Escherichia coli JM109 i Escherichia coli JM 109 (pMW::THY) mierzono zgodnie ze znaną metodą (David M. Ciarkę i Philip D. Bragg, J. Bacteriology, 162, 367-373 (1985)). Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Szczepy	JM 109	JM109 (pMW::THY)
Aktywność właściwa transhydrogenazy (μ/mg białka)	1,0	1,7

Jak przedstawiono w tabeli 1, jest oczywiste, że Escherichia coli JM 109 (pMW::THY) ma wyższą aktywność enzymatyczną niż Escherichia coli JM 109. Na podstawie wyników udowodniono, że fragment DNA wstawiony do plazmidu pMW::THY zawiera gen transhydrogenazy. Escherichia coli zawierającą plazmid pMW::THY oznaczono jako szczep AJ12929. Szczep AJ 12929 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia; kod pocztowy 305) 4 października 1993 r. pod numerem depozytowym FERM P-13890, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 14 września 1994 r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-4798.

DNA plazmidowy pMW::THY przygotowano zgodnie z konwencjonalną metodą i strawiono BamHI i HindIII dla wyizolowania fragmentu DNA o długości 3,0 kb zawierającego gen transhydrogenazy. Wektor plazmidowy pHSG399, posiadający marker oporności na chloramfenikol (dostępny w Takara Shuzo Co., Ltd.) strawiono BamHI i HindIII i wyizolowano duży fragment. Następnie fragment DNA zawierający gen transhydrogenazy i duży fragment BamHIHindUI pHSG399 zligowano ligazą DNA dla otrzymania plazmidu pHSG::THY.

Plazmid pHSG::THY może ulegać autonomicznej replikacji w komórkach mikroorganizmów należących do Escherichia, ale nie utrzymuje się w sposób stabilny w komórkach maczugowców. A zatem, do plazmidu pHSG::THY wprowadzono miejsce początku replikacji otrzymane z plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji pochodzącego z maczugowca.

Plazmid pHM1519, ulegający autonomicznej replikacji w komórkach maczugowców (patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 58-77895) strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI dla otrzymania fragmentu DNA o długości 3,0 kb, zawierającego miejsce początku replikacji. Z drugiej strony, plazmid pHSG::THY strawiono BamHI dla otrzymania fragmentu DNA. Oba fragmenty DNA zligowano ligazą DNA w celu przygotowania plazmidu pHSG::THYB (fig. 2). Szczep Escherichia coli zawierający pHSG:THYB oznaczono jako szczep AJ12872. Ten szczep AJ12872 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 4 października 1993 r. pod numerem depozytowym FERM P-13889, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 14 września 1994 r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-4797.

185 681

Ponadto, plazmid pSU18, który ulega autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia i ma gen oporności na kanamycynę (Borja, Bartolome i in., Gene, 102, 75-78 (1991)) strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindlH dla otrzymania dużego fragmentu. Duży fragment zligowano stosując ligazę DNA z fragmentem DNA o długości 3,0 kb, zawierającym opisany powyżej gen transhydrogenazy w celu przygotowania plazmidu pSU::THY (fig. 3). Szczep Escherichia coli zawierający pSU::THY oznaczono jako szczep AJ12930. Ten szczep AJ12930 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Microorganism Breeding, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 4 października 1993 r. pod numerem depozytowym FERM P-13 891, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na wanmkach Porozumienia Budapesztańskiego 14 września 1994 r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-4799.

Stwierdzono, jak na wydajność wytwarzania różnych L-aminokwasów w komórkach bakterii należącej do rodzaju Escherichia lub maczugowca wpływa zwiększenie aktywności transhydrogenazy w obu bakteriach.

Przykład 2: fermentacyjne wytwarzanie L-treoniny przez szczep z wprowadzoną transhydrogenazą

Spośród wytwarzających L-treoninę bakterii z gatunku Escherichia coli, szczep B-3996 (patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 3-501682 (PCT)) posiada najwyższą zdolność wytwarzania wśród tych znanych obecnie. A zatem, szczepu B-3996 użyto jako gospodarza do oszacowania wpływu wzmocnienia transhydrogenazy. Szczep B-3996 zawierający plazmid pVIC40 (broszura publikacji światowego opisu patentowego numer W090/04636), który otrzymano przez wstawienie operonu treoninowego do wektora plazmidowego o szerokim spektrum gospodarzy pAYC32, posiadającego marker oporności na streptomycynę (zobacz, Chistoserdov A. Y. i Tsygankov Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). Szczep B-3996 zdeponowano w Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breding pod numerem rejestracyjnym RIA1867.

Plazmid pMW:: THY odzyskano z Escherichia coli AJ12929 otrzymanego w Przykładzie 1 według metody Maniatisa i in. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21 (1989)). Otrzymany plazmid pMW: : THY wprowadzono do szczepu B-3996 według metody D. M. Monisona (Methods in Enzymology, 68, 326, (1979)). Szczep B-3996 stransformowany pMW::THY oznaczono jako szczep B-3996(pMW::THY). Szczep B-3996 i szczep B-3996(pMW::THY) hodowano w następujących warunkach.

Hodowlę prowadzono w ciągu 38 godzin w temperaturze 37°C z mieszaniem przy 114116 obrotach na minutę, stosując podłoże posiadające skład przedstawiony w tabeli 2. Wymienione w tabeli 2 składniki A, B i C przygotowano oddzielnie, wyjałowiono i schłodzono, przy mieszaniu stosując 16/20 objętości składnika A, 4/20 objętości składnika B i 30 g/litr składnika C. Wyniki hodowli przedstawiono w tabeli 3. Udowodniono, że wydajność wytwarzania L-treoniony poprawiła się w wyniku wzmocnienia wewnątrzkomórkowej aktywności transhydrogenazy w wytwarzającej L-treoninę bakterii należącej do rodzaju Escherichia.

Tabela 2. Podłoże do wytwarzania treoniny

g/litr
1	2	3
(A)	(NH4)₂SO4	16
	KH2PO4	1
	MgSO47H₂O	1
	FeSO47H₂O	0,01
	MnSO45H₂O	0,01
	Ekstrakt drożowy (Difco)	2
	L-metionina	0,5
	Doprowadzone KOH do pH 7,0 i autoklawowane w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut	(16/20 objętości)

185 681 cd. tabeli 2

1	2	3
(B) (C) Antybiotyki	20% glukoza Autoklakckaza w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut CaCO3 zgodny z farmakopeą AutoklakCkazL w temperaturze 180°C w ciągu 2 dni (streptomycyna: 100 pg/ml, k^smy^a: 5 pg/ml)	(4/20 objętości) (30 g/litr)

Tabela 3

Szczepy	B-3996	B-3996(pMW: :THY)
freonina (g/litr)	12,97	13,99

Przykład 3: fermentacyjne wytwαrozzie L-lizyny przez szczep z wprowadzoną trazyhydrogenazą

Sprawdzano, czy wydajność kytksrzaziz L-lisLzy poprawiła się w wyniku wsmoczieziz wewzątrokcmórkcwej aktywności trsnyhydrcgezsoL w maczugowcu kytwsrzzjącLm Lalioyzę. Jako wLksrzającą L-lizynę bakterię należącą do maczugowców oaytcycwsnc szczep Brevibacterium lactofermentum AJ3990. Szczep AJ3990 zdeponowano w Nalwnal Institute of Bicsczzcz and Humań Tzchzolcgy, Agency of Induytrisl Science and Techzolcgy, Ministry of Izterzαticzαl Trade and Industry i nadano mu numer depcsytoky FERM P-3387. Plazmid pHSG::THYB odzyskano ze szczepu Escherichia coli AJ12872 otrzymanego w przykładzie 1 według metody Msziztiyz i in. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Μ^ϊζ^, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborator^y Press, 1. 21 (1989)). Otrzymany plazmid wprcwsdoozo do szczepu AJ3390 według metody transformacji stosując impuls elektryczny (patrz japoński kyłożezicwL opis patentowy numer 2-207791). Szczep AJ3990 strzzsformcwzny pHSG::THYB oznaczono jako szczep AJ3990 (pHSG::THYB). Szczep AJ3990 i szczep AJ3990 (pHSG::THYB) hodowano w następujących warunkach.

Hodowlę prowadzono w ciągu 72 godzin w temperaturze 31,5°C z mieszaniem przy 114-116 obrotach nr minutę, stosując podłoże posiadające skład przedstawiony w tabeli 4. Jsko cukier użyto trzech różnych cukrów, glukozy, sacharozy i fruktozy. Wyniki hodowli prszdytzwiozo w tabeli 5. Udowodniono, że wydajność kytwsroaziα L-lizyny poprawiła się w wyniku wzmocnienia wewzątrokomórkowej aktywności trsnshLdrogezaoL w maczugowcu kytkaroającym L-lizynę.

Tabela 4. Podłoże do wytkaroazia lizyny

Cukier	36 g/litr
NH,Cl	20 g/litr
KH₂PO4	1 g/litr
MgSO47H₂O	0,4 g/litr
FeSO47H₂O	10 mg
MzSO44H2O	8 mg
Hydrolizat białkowy soi (jako źródło azotu)	1 mg
Tiamina-HCl	100 mg
Satyna	300 mg
Po autcklakcksniu w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut, dodawano 3% węglan wapniowy wL’alakiszL osobno.

Tabela 5

	Akumulokaza ilość chlorowodorku L-lizyny (g/litr)
	AJ3990	AJ3990(pHSG::THYB)
Glukoza	13,6	14,5
Sacharoza	11,1	12,6
Fruktoza	8,2	11,9

185 681

Przykład 4: fermentacyjne wytwarzanie L-fenyloalaniny przez szczep z wprowadzoną transhydrogenazą

Sprawdzano, czy wydajność wytwarzania L-fenyloalaniny ulegała poprawie przez wzmocnienie wewnątrzkomórkowej aktywności transhydrogenazy w wytwarzającej L-fenylo-alaninę bakterii należącej do rodzaju Escherichia. Jako wytwarzającą L-fenyloalaninę bakterię należącą do rodzaju Escherichia, zastosowano szczep Escherichia coli AJ 12604. Szczep AJ12604 zawierający plazmid pBR-aroG4, który otrzymano przez wstawienie zmutowanego genu aroG do wektora plazmidowego pBR322, posiadającego marker oporności na ampicylinę, oraz plazmid pACMAB, który otrzymano przez wstawienie zmutowanego genu pheA do wektora plazmidowego pACYC184, posiadającego marker oporności na chloramfenikol (patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 5-236947). Szczep AJ 12604 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 12 stycznia 1991 r. pod numerem depozytowym FERM P-11975, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 26 września 1991 r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-3579. Plazmid pSU::THY odzyskano ze szczepu Escherichia coli AJ12930 otrzymanego w przykładzie 1 sposobem według metody Maniatisa i in. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21 (1989)). Otrzymany plazmid wprowadzono do szczepu AJ12604 sposobem według metody D. M. Morrisona (Methods in Enzymology, 68, 326, (1979)). Szczep AJ12604 stransformowany pSUr.THY oznaczono jako szczep AJ12604(pSU::THY). Szczep AJ12604 i szczep AJ12604(pSU::THY) hodowano w następujących warunkach.

Hodowlę prowadzono w ciągu 16 godzin w temperaturze 37°C z mieszaniem przy 114116 obrotach na minutę, stosując podłoże posiadające skład przedstawiony w tabeli 6. Wyniki hodowli przedstawiono w tabeli 7. Udowodniono, że wydajność wytwarzania L-fenyloalaniny ulegała poprawie w wyniku wzmocnienia wewnątrzkomórkowej aktywności transhydrogenazy w wytwarzającej L-fenyloalaninę bakterii należącej do rodzaju Escherichia.

Tabela 6. Podłoże do wytwarzania fenyloalaniny

	g/litr
Glukoza	20
Na₂HPO4	29,4
KH2PO4	6
NaCl	1
NH4CI	2
Cytrynian sodowy	20
L-glutaminian sodowy	0,4
MgSO47H₂O	3
CaCl₂	0,23
Tiamina-HCl	2 mg
L-tyrozyna	75 mg
Po autoklawowaniu w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut dodawano 3% węglan wapniowy wyjałowiony oddzielnie.

Tabela 7

Szczep	AJ 12604	AJ 12604 (pSU::THY)
Akumulowana ilość	4,28	4,89
L-fenyloalaniny (g/litr)	3,75	4,28

185 681

LISTA SEKWENCJI

1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co. Inc.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Metoda wytwarzania substancji (iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT:

(B) ULICA:

(C) MIEJSCOWOŚĆ:

(D) STAN:

(E) KRAJ:

(F) KOD POCZTOWY (ZIP):

(vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vi) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO:

(B) NUMER REJESTRACYJNY:

(C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE:

(ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX:

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: 'jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2: CGTTCTGTTA AGCTTTCTCA ATAA

185 681 .3

Hmdin

BamHl trawienie BamHl i Hindtll

BamHl Hindm

trawienie BamHl i Hindtll ligaza DNA

Hindin

BamHl

185 681

Fig.2

BamHI H/ndlll

BamHI

BamHI pntA pntB

HiaKR

BamHI miejsce początku replikacji Brevibacteruun

Hindlll

BamHI

185 681

Fig.1

chromosomalny DNA E. coli syntetyczny starter reakcja PCR trawienie BamHI i Hindlll pntA pntB

BamHI

HindIU

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania L-aminokwasu, zwłaszcza L-treoniny, L-lizyny, kwasu L-glutaminowego, L-leucyny, L-izoleucyny, L-waliny lub L-fenyloalaniny, przy użyciu mikroorganizmu, w którego genomie korzystnie znany jest fragment DNA zawierający miejsce początku replikacji plazmidu zawierającego gen transhydrogenazy, działa gen transhydrogenazy i możliwa jest amplifikacja tego genu, zwłaszcza mikroorganizmu dobranego spośród grupy obejmującej bakterie należące do rodzaju Escherichia, Bacillus lub Serratia oraz Brevibacterium lactofermentum, obejmujący etapy, w których modyfikuje się lub dostarcza zmodyfikowany mikroorganizm, hoduje się mikroorganizm w podłożu hodowlanym, w którym powstaje i gromadzi się L-aminokwas, a następnie wydziela się L-aminokwas z podłoża hodowlanego, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm z pobudzoną aktywnością enzymatyczną transhydrogenazy nukleotydu nikotynoamidowego w komórce.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm z pobudzoną ekspresją genu kodującego transhydrogenazę nukleotydu nikotynoamidowego w komórce.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm ze zamplifikowanym genem kodującym transhydrogenazę nukleotydu nikotynoamidoadeninowego w komórce.