BR112013003361B1 - Anticorpo, composição, conjugado de anticorpo,formulação farmacêutica e uso do anticorpo - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS, POLINUCLEOTÍDEO, POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, CONJUGADO DE ANTICORPO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DO ANTICORPO. A invenção fornece anticorpos contra Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP) e métodos de uso dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a anticorpos específicos para Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP). Além disso, a invenção se refere a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. A invenção se refere adicionalmente a métodos para produzir os anticorpos e os métodos de uso dos mesmos no tratamento de doença.
ANTECEDENTES PROTEÍNA ATIVADORA DE FIBROBLASTO (FAP) E ANTICORPOS ANTIFAP
[002] A Proteína Ativadora de Fibroblasto humana (FAP; número de acesso do GenBank AAC51668), também conhecida como Seprase, é uma serina peptidase de membrana integral de 170 kDa (EC 3.4.21.B28). Junto com dipeptidil peptidase IV (também conhecida como CD26; número de acesso do GenBank P27487), uma enzima de superfície celular estreitamente relacionada e outras peptidases, a FAP pertence à família de dipeptidil peptidase IV (Yu et al., FEBS J 277, 1126 a 1144 (2010)). Isso é um homodímero que contém duas subunidades N-glicosiladas com um domínio extracelular de C-terminal grande, em que o domínio catalítico da enzima é localizado (Scanlan et al., Proc Natl Acad Sci USA 91, 5657 a 5661 (1994)). FAP, em sua forma glicosilada, tem tanto atividade de dipeptidil peptidase quanto atividade de gelatinase pós- prolila (Sun et al., Protein Expr Purif 24, 274 a 281 (2002)).
[003] A FAP humana foi originalmente identificada em fibroblastos cultivados que usam o anticorpo monoclonal (mAb) F19 (descrito em WO 93/05804, número ATCC HB 8269). Os homólogos da proteína foram encontrados em diversas espécies, incluindo camundongos (Niedermeyer et al., Int J Cancer 71, 383 a 389 (1997), Niedermeyer et al., Eur J Biochem 254, 650 a 654 (1998); número de acesso do GenBank AAH19190). FAP tem uma distribuição de tecido exclusiva: sua expressão foi altamente regulada de modo ascendente em fibroblastos estromais reativos de mais de 90% de todos os tumores epiteliais metásticos e primários, incluindo carcinomas pulmonares, colorretais, de bexiga, ovarianos e de mama, embora seja geralmente ausente de tecidos adultos normais (Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110 a 3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235 a 7239 (1990)). Os relatórios subsequentes mostraram que a FAP não é apenas expressa em fibroblastos estromais, mas também em alguns tipos de células malignas de origem epitelial, e que a expressão de FAP se correlaciona diretamente com o fenótipo maligno (Jin et al., Anticancer Res 23, 3195 a 3198 (2003)).
[004] Devido a sua expressão em muitos cânceres comuns e sua expressão restrita em tecidos normais, a FAP tem sido considerada um alvo antigênico prometedor para imageamento, diagnóstico e terapia de uma variedade de carcinomas. Dessa forma, múltiplos anticorpos monoclonais têm surgido contra FAP para propósitos de pesquisa, diagnóstico e terapia.
[005] A sibrotuzumab/BIBH1, uma versão humanizada do anticorpo F19 que se liga especificamente à FAP humana (descrito em WO 99/57151) e anticorpos completamente humanos ou adicionalmente humanizados contra o antígeno de FAP com especificidade de epítopo F19 (descrito em Mersmann et al., Int J Cancer 92, 240 a 248 (2001); Schmidt et al., Eur J Biochem 268, 1730 a 1738 (2001); WO 01/68708)) foram desenvolvidos. O anticorpo OS4 é uma outra versão humanizada (enxertada por CDR) do anticorpo F19 (Wüest et al., J Biotech 92, 159 a 168 (2001), enquanto scFv 33 e scFv 36 possuem uma especificidade de ligação diferente de F19 e são de reação cruzada para proteína FAP de camundongo e humana (Brocks et al., Mol Med 7, 461 a 469 (2001)). Mais recentemente, outros anticorpos antiFAP de murina, bem como versões quiméricas e humanizadas dos mesmos, foram desenvolvidos (WO 2007/077173, Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584 a 4592 (2008)).
[006] As proteases no estroma tumoral, apesar da degradação proteolítica dos componentes da matriz extracelular (ECM), facilitam os processos tal como angiogênese e/ou migração tumoral de célula. Além disso, o estroma tumoral desempenha um importante papel em suprimento de oxigênio e nutriente de tumores, bem como em invasão e metástase tumoral. Essas funções essenciais tornam isso não apenas um diagnóstico, mas também um alvo terapêutico potencial.
[007] A evidência para a possibilidade do conceito de alvejamento de estroma tumoral in vivo com o uso de anticorpos antiFAP foi obtida em um estudo clínico de fase I com anticorpo F19 identificado com 131iodo, que demonstrou enriquecimento específico do anticorpo nos tumores e detecção de metástase (Welt et al., J Clin Oncol 12, 1193 a 1203 (1994). De modo similar, um estudo de fase I com sibrotuzumab demonstrou acúmulo de tumor específico do anticorpo identificado com 131I (Scott et al., Clin Cancer Res 9, 1639 a 1647 (2003)). Um ensaio anterior de fase II de sibrotuzumab não conjugado em pacientes com câncer colorretal metástico, entretanto, foi descontinuado devido à carência de eficácia do anticorpo na inibição de progressão tumoral (Hofheinz et al., Onkologie 26, 44 a 48 (2003)). Ademais, um anticorpo antiFAP mais recentemente desenvolvido falhou na apresentação efeitos antitumorais in vivo na forma não conjugada (WO 2007/077173).
[008] Dessa forma, perdura uma necessidade por abordagens terapêuticas intensificadas, que incluem anticorpos com eficácia aprimorada, que alvejam FAP para o tratamento de cânceres.
GLICOSILAÇÃO DE ANTICORPO
[009] O componente de oligossacarídeo pode afetar significativamente as propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína terapêutica, incluindo estabilidade física, resistência a ataque de protease, interações com o sistema imunológico, farmacocinética e atividade biológica específica. Tais propriedades podem depender não apenas da presença ou ausência, mas também das estruturas específicas, de oligossacarídeos. Algumas generalizações entre estrutura de oligossacarídeo e função de glicoproteína podem ser feitas. Por exemplo, certas estruturas de oligossacarídeo mediam o afastamento rápido da glicoproteína do fluxo sanguíneo através de interações com proteínas de ligação a carboidrato específicas, enquanto outras podem ser ligadas por anticorpos e disparar reações imunológicas indesejadas (Jenkins et al., Nature Biotechnol 14, 975 a 81 (1996)).
[010] Os anticorpos do tipo IgG1, os anticorpos mais comumente usados em imunoterapia de câncer, são glicoproteínas que possuem um sítio de glicosilação N-ligado conservado em Asn 297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos biantenários complexos fixados a Asn 297 são enterrados entra os domínios CH2, formando contatos extensos com a cadeia principal de polipeptídeo, e sua presença é essencial para que o anticorpo medeie as funções efetoras tal como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Lifely et al., Glicobiology 5, 813 a 822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59 a 76 (1998); Wright e Morrison, Trends Biotechnol 15, 26 a 32 (1997)). Os estudos de engenharia de proteína demonstraram que os FCYRS interagem com a região de articulação inferior do domínio CH2 de IgG. Lund et al., J. Immunol. 157:4963 a 69 (1996). Entretanto, a ligação de FCYR também requer a presença dos oligossacarídeos na região CH2. Lund et al., J. Immunol. 157:4963 a 69 (1996); Wright e Morrison, Trends Biotech. 15:26 a 31 (1997), sugerem que o oligossacarídeo e o polipeptídeo contribuem diretamente para o sítio de interação ou que o oligossacarídeo é requerido para manter uma conformação de polipetídeo de CH2 ativa. A modificação da estrutura do oligossacarídeo pode, portanto, ser explorada como um meio para aumentar a afinidade da interação entre IgG1 e FCYR, e para aumentar a atividade de ADCC de IgG1s.
[011] Uma maneira de obter grandes aumentos na potência de anticorpos monoclonais consiste em intensificar suas funções efetoras naturais mediadas por célula através do projeto de seu componente de oligossacarídeo conforme descrito em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176 a 180 (1999) e na patente n° US6.602.684 (WO 99/54342), cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Umana et al. mostrou que a sobrexpressão de β(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacarídeos bisseccionados em células de ovário de hamster chinês (CHO) aumenta significativamente atividade de ADCC in vitro de anticorpos produzidos naquelas células. A sobrexpressão de GnTIII na linhagens de célula de produção leva a anticorpos enriquecidos em oligossacarídeos bisseccionados, que são também geralmente não fucosilados e do tipo híbrido. Se houver uma adição a GnTIII, a manosidase II (ManII) é sobrexpressa em linhagens de célula de produção, os anticorpos enriquecidos em oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados do tipo complexo são obtidos (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851 a 861 (2006)). Ambos os tipos de anticorpos mostram ADCC fortemente enriquecido, em comparação a anticorpos com glicanos modificados, mas apenas os anticorpos em que a maioria dos N-glicanos são do tipo complexo são capazes de induzir citotoxicidade dependente de complemento significativa (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851 a 861 (2006)). As alterações na composição do carboidrato Asn 297 ou sua eliminação também afetam a ligação do domínio de anticorpo Fc ao receptor Fcy (FcyR) e à proteína C1q de complemento, que é importante para ADCC e CDC, respectivamente (Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176 a 180 (1999); Davies et al., Biotechnol Bioeng 74, 288 a 294 (2001); Mimura et al., J Biol Chem 276, 45539 a 45547 (2001); Radaev et al., J Biol Chem 276, 16478 a 16483 (2001); Shields et al., J Biol Chem 276, 6591 a 6604 (2001); Shields et al., J Biol Chem 277, 26733 a 26740 (2002); Simmons et al., J Immunol Methods 263, 133 a 147 (2002)).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[012] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente à Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP), que tem uma alta afinidade e/ou função efetora intensificada.
[013] Em um aspecto, a invenção é direcionada a um anticorpo que se liga especificamente à FAP, que compreende pelo menos um (isto é, um, duas, três, quatro, cinco ou seis) das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) apresentadas em SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177. Em uma realização, o anticorpo compreende três CDRs de cadeia pesada (isto é HCDR1, HCDR2, e HCDR3) e/ou três CDRs de cadeia leve (isto é LCDR1, LCDR2, e LCDR3) selecionadas a partir de SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177. Em uma realização mais específica, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo e/ou uma região variável de cadeia leve de anticorpo, particularmente, tanto uma região variável de cadeia leve quanto uma região variável de cadeia pesada, selecionadas a partir das sequências de região variável de cadeia leve e pesada apresentadas em SEQ ID NOs 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 e 311. Em uma realização, o anticorpo compreende uma região Fc, particularmente uma região Fc de IgG. Em uma realização adicional, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, particularmente um anticorpo de classe IgG. Em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região constante de anticorpo humano. Em uma realização, o anticorpo é humano. Em uma realização, o anticorpo é glicoprojetado para ter oligossacarídeos modificados na região Fc. Em uma realização, o anticorpo tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados e/ou bisseccionados na região Fc, em comparação a um anticorpo não glicoprojetado. Em uma realização adicional, o anticorpo tem função efetora aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor Fc aumentada. Em uma realização particular, a função efetora aumentada é citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo aumentada (ADCC). Em uma outra realização, o anticorpo se liga a FAP com um valor KD menor que cerca de 1 μM, de preferência, menor que cerca de 100 nM, com máxima preferência, menor que cerca de 1 nM ou ainda menor que cerca de 0,1 nM. Em uma realização, o anticorpo é maturado por afinidade. Em uma realização, o anticorpo se liga a FAP em tecidos humanos. Em uma realização, o anticorpo não induz internalização de FAP.
[014] Em outros aspectos, a invenção também é direcionada a polipeptídeos, polinucleotídeos, células hospedeiras e vetores de expressão relacionados aos anticorpos. Em um aspecto adicional, a invenção se refere a métodos de produção dos anticorpos. Em um aspecto adicional, a invenção é direcionada a métodos de uso dos anticorpos, particularmente, para o tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de FAP, tal como câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[015] A Figura 1 mostra análises cinéticas baseadas em Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR) de fragmentos Fab antiFAP maturados por afinidade. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para ligação de clone 19G1 a FAP humana (hu) (A) e FAP de camundongo (mu) (B), para ligação de clone 20G8 a FAP hu (C), FAP mu (D) e para ligação de clone 4B9 a FAP hu (E) e FAP mu (F). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[016] A Figura 2 mostra análises cinéticas baseadas em SPR de fragmentos Fab antiFAP maturados por afinidade. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para ligação de clone 5B8 a FAP hu (A) e FAP mu (B), para ligação de clone 5F1 a FAP hu (C), FAP mu (D) e para ligação de clone 14B3 a FAP hu (E) e FAP mu (F). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[017] A Figura 3 mostra análises cinéticas baseadas em SPR de fragmentos Fab antiFAP maturados por afinidade. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para ligação de clone 16F1 a FAP hu (A) e FAP mu (B), para ligação de clone 16F8 ligação a FAP hu (C), FAP mu (D) e para ligação de clone O3C9 a FAP hu (E) e FAP mu (F). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[018] A Figura 4 mostra análises cinéticas baseadas em SPR de fragmentos Fab antiFAP maturados por afinidade. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para ligação de clone O2D7 a FAP hu (A) e FAP mu (B), para ligação de clone 28H1 a FAP hu (C), FAP mu (D), FAP cino (E) e para ligação de clone 22A3 a FAP hu (F), FAP mu (G) e FAP de macaco (cino) (H). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[019] A Figura 5 mostra análises cinéticas baseadas em SPR de fragmentos Fab antiFAP maturados por afinidade. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados para ligação de clone 29B11 a FAP hu (A), FAP mu (B), FAP cino (C) e para ligação de clone 23C10 a FAP hu (D), FAP mu (E) e FAP cino (F). As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[020] A Figura 6 mostra análises cinéticas baseadas em SPR da ligação de anticorpos antiFAP 3F2 (A), 4G8 (B) e 3D9 (C) como fragmentos Fab a FAP humana, de camundongo e de macaco. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados, as linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[021] A Figura 7 mostra análises cinéticas baseadas em SPR de ligação de anticorpos antiFAP 3F2 (A), 4G8 (B) e 3D9 (C) como IgG humana a FAP humana, de camundongo e de macaco. Os conjuntos de dados cinéticos processados são apresentados, As linhas suaves representam um ajuste global dos dados para um modelo de interação 1:1.
[022] A Figura 8 mostra imagens representativas de amostras humanas de (A) câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC) imunohistoquimicamente manchadas para FAP que como uso de anticorpo de IgG2a de camundongo 2F3, (B) adenocarcinoma de colon imunohistoquimicamente manchado para FAP que usa anticorpo de IgG2a de camundongo 2F3, (C) adenocarcinoma de cólon imunohistoquimicamente manchado para FAP que usa anticorpo de IgG2a de camundongo 3D9, e (D) adenocarcinoma de cólon imunohistoquimicamente manchado para FAP que usa anticorpo de IgG2a de camundongo 4G8. A FAP é detectada no estroma tumoral em todas as amostras e por todos os anticorpos (painéis esquerdos), enquanto nenhum manchamento é observado para o anticorpo de controle isótipo (painéis direitos).
[023] A Figura 9 mostra a ligação de anticorpos antiFAP de IgG1 humana a FAP expressa em células HEK 293 estavelmente transfectadas com FAP humana (A) ou de camundongo (B) FAP, conforme determinado por FACS.
[024] A Figura 10 mostra a ligação de anticorpos antiFAP de IgG1 humana a DPPIV (CD26) ou HER2 expresso em células HEK 293 estavelmente transfectadas, conforme determinado por FACS. O anticorpo anti- HER2 trastuzumab e o anticorpo anti-CD26 foram usados como controles positivos. O anticorpo secundário, a IgG de controle ou nenhum anticorpo de fato (apenas células) foram usados como controles negativos.
[025] A Figura 11 mostra a ligação de anticorpos antiFAP de IgG1 humana a FAP em fibroblastos humanos (linhagem celular GM05389), conforme determinado por FACS. O anticorpo secundário ou nenhum anticorpo de fato foram usados como controles negativos.
[026] A Figura 12 mostra a ligação de anticorpos antiFAP de IgG1 humana a fibroblastos humanos (linhagem celular GM05389), linhagens de célula tumoral humanas diferentes ou células HEK 293 estavelmente transfectadas com FAP humana, conforme determinado por FACS.
[027] As Figuras 13 (A) e (B) mostram níveis de expressão de FAP sobre a superfície de fibroblastos do pulmão GM05389 em diferentes instantes de tempo após a incubação com os anticorpos anti-FAB humana de IgG1 3F2 ou 4G8, conforme determinado por FACS. Nenhuma diminuição significativa em expressão de níveis de FAP, indicando internalização de FAP, foi observada. O anticorpo secundário sozinho é mostrado como controle negativo.
[028] A Figura 14 apresenta imagens imunofluorescência representativas que mostram manchamento de membrana de plasma em fibroblastos de pulmão GM05389 obtidos após a ligação de IgG antiFAP 4G8 por 45 min. a 4°C (A), por 20 min. a 37°C (B), por 1 hora a 37°C (C) ou por 6 horas a 37°C (D). O anticorpo anti-CD20 GA101, usado como controle de isótipo, mostra manchamento anterior. Os EEA1 identifica endossomas precoces. Observa-se a persistência do manchamento de membrana de plasma de superfície de FAP até 6 horas após a ligação de anticorpo antiFAP 4G8.
[029] A Figura 15 mostra a purificação e a análise do IgG humana 28H1 do tipo selvagem. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[030] A Figura 16 mostra a purificação e a análise da IgG humana 28H1 glicoprojetada. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[031] A Figura 17 mostra a purificação e a análise da IgG humana 29B11 do tipo selvagem. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[032] A Figura 18 mostra a purificação e a análise da IgG humana 29B11 glicoprojetada. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[033] A Figura 19 mostra a purificação e a análise da IgG humana 3F2 do tipo selvagem. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[034] A Figura 20 mostra a purificação e a análise da IgG humana 3F2 glicoprojetada. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[035] A Figura 21 mostra a purificação e a análise da IgG humana 4G8 do ripo selvagem. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[036] A Figura 22 mostra a purificação e a análise da IgG humana 4G8 glicoprojetada. A) etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A. B) etapa de purificação por cromatografia por exclusão de tamanho. C) PAGE SDS Analítico. D) cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Os procedimentos experimentais são descritos no Exemplo 1.
[037] A Figura 23 mostra a ligação de anticorpo antiFAP 28H1 maturado por afinidade a FAP humana em células HEK293 em comparação à ligação do anticorpo antiFAP 4G8 parental.
[038] A Figura 24 mostra os resultados de um ensaio de liberação de LDH para testar ADCC mediado pelos anticorpos 28H1 de IgG antiFAP (maturados por afinidade) e 4G8, 3F8 (parentais) como versões do tipo selvagem (wt) e glicoprojetadas (ge), com HEK293-hFAP como células-alvo e PBMNCs como células efetoras (genótipo F/F FcYRIIIa).
DESCRIÇÃO DETALHADA DE REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
[039] Um “arcabouço humano aceptor” para os propósitos da presente invenção é um arcabouço que compreende a sequência de aminoácido de um arcabouço de domínio variável de cadeia leve (VL) ou um arcabouço de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivado de um arcabouço de imunoglobulina humana ou um arcabouço consensual humano, conforme definido abaixo. Um arcabouço humano aceptor “derivado de” um arcabouço de imunoglobulina humana ou um arcabouço consensual humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido do mesmo, ou pode conter as alterações de sequência de aminoácido. Em algumas realizações, o número de alterações de aminoácido são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em algumas realizações, o arcabouço humano aceptor VL é idêntico em sequência à sequência de arcabouço de imunoglobulina humana VL ou sequência de arcabouço consensual humano.
[040] “Afinidade” se refere à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo se indicado de outro modo, conforme usado na presente invenção, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (KD), que é a razão de constantes de taxa de dissociação e associação (kdissociação e kassociação, respectivamente). Dessa forma, as afinidades equivalentes podem compreender constantes de taxa diferentes, desde que a razão das constantes de taxa permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos na presente invenção. As realizações ilustrativas e exemplificativas específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.
[041] Um anticorpo “maturado por afinidade” se refere a um anticorpo com uma ou mais alterações (por exemplo, mutações de aminoácido) em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs) (por exemplo, CDRs), em comparação a um anticorpo que não possui tais alterações, tais alterações resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo com o antígeno. Tipicamente, o anticorpo maturado por afinidade se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo parental.
[042] Os termos “anticorpo antiFAP” e “um anticorpo que se liga à Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP)” se referem a um anticorpo que é capaz de ligação FAP com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico e/ou de diagnóstico no alvejamento de FAP. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo antiFAP com uma proteína não FAP não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo com FAP conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS). Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo antiFAP da invenção com DPPIV, uma proteína intimamente relacionada com FAP (também conhecida como CD26; número de acesso do GenBank P27487), é menor que cerca de 15%, cerca de 10% ou cerca de 5% da ligação do anticorpo com FAP conforme medido por FACS. Em certas realizações, um anticorpo que se liga a FAP tem uma constante de dissociação (KD)de <1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas realizações, um anticorpo antiFAP se liga a um epítopo de FAP que é conservado dentro de FAP a partir de diferentes espécies.
[043] O termo "anticorpo" da presente invenção é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo desde que exibam a atividade de ligação de antígeno desejada. Também são incluídos fragmentos de anticorpo com uma região Fc, e proteínas de fusão que compreendem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.
[044] Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), diacorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[045] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência se refere a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência a seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais, e adversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo a seu antígeno em um ensaio de competição por 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplificativo é fornecido na presente invenção.
[046] O termo "domínio de ligação de antígeno"se refere à parte de uma molécula de ligação de antígeno que compreende uma área que se liga especificamente e é complementar à parte ou todo um antígeno. Onde um antígeno for grande, uma molécula de ligação de antígeno pode apenas se ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é chamada de um epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser fornecido por, por exemplo, um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também chamados de regiões variáveis de anticorpo). De preferência, um domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).
[047] O termo anticorpo "quimérico"se refere a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente. Para anticorpos quiméricos, por exemplo, os componentes de componentes de ligação de não antígeno podem ser derivados de uma ampla variedade de espécies, incluindo primatas tais como chimpanzés e humanos. Os anticorpos humanizados são uma forma particularmente preferencial de anticorpos quiméricos.
[048] A “classe” de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversos desses podem ser adicionalmente divididos em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.
[049] O termo "agente citotóxico" conforme usado na presente invenção se refere a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou ocasiona o óbito ou a destruição celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não são se limitam a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes ou fármacos quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etoposídep), doxorubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes de intercalação); agentes inibidores de crescimento; enzimas e fragmentos das mesmas tais como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumorais ou anticancerosos revelados abaixo.
[050] As “funções efetoras” se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isótipo do anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q (CDC); ligação a receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; secreção de citocina; absorção de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam antígeno; regulação descendente de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.
[051] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[052] O termo “região Fc” da presente invenção é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui região de sequência nativa Fcs e região variante Fcs. Em uma realização, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226, ou a partir de Pro230, para a terminação carboxila da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C- terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. Salvo se especificado de outro modo na presente invenção, a numeração de resíduos de aminoácido na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5a edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA, 1991.
[053] Uma "região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina"é destinada a incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou deleções, mas que não diminuem substancialmente a capacidade de a imunoglobulina mediar as funções efetoras (tal como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados da terminação N ou da terminação C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial de função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica com a finalidade de ter o efeito mínimo na atividade (consulte, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306 a 10 (1990)).
[054] "Arcabouço"ou "FR" se refere a resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR) (ou CDR). O FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)- FR3-H3(L3)-FR4.
[055] Os termos “anticorpo de comprimento total,” “anticorpo intacto,” e “anticorpo inteiro” são usados na presente invenção de modo intercambiável para se referirem a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeia pesadas que contêm uma região Fc conforme definido na presente invenção.
[056] Os termos "célula hospedeira,""linhagem de célula hospedeira," e "cultura de célula hospedeira"são usados de modo intercambiável e se referem a células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas," que incluem a célula transformada primária e a progênie derivada disso sem relação ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme triado ou selecionado na célula originalmente transformada é incluída na presente invenção. Em uma realização, a célula hospedeira é projetada para permitir a produção de um anticorpo com oligossacarídeos modificados. Em certas realizações, as células hospedeiras foram adicionalmente manipuladas para expressar níveis aumentados de um ou mais polipeptídeos que têm atividade de β(1,4)-N- acetilglicosaminiltransferase III (GnTIII). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamífero, tais como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células levedura, células de inseto e células de planta, para citar a penas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal.
[057] Um “anticorpo humano” é um que possui uma sequência de aminoácido que corresponde a de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências que codificam anticorpo humano. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno não humano.
[058] Um “arcabouço consensual humano” é um arcabouço que reapresenta os resíduos de aminoácido de ocorrência mais natural em uma seleção de sequências de arcabouço de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Publicação NIH 91 a 3242, Bethesda MD, EUA (1991), volumes 1 a 3. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo kapa I como em Kabat et al., supra. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é o subgrupo III como em Kabat et al., supra.
[059] Um anticorpo “humanizado” se refere a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácido de HVRs não humanas e resíduos de aminoácido de FRs humanos. Em certas realizações, um anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àquelas de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo foi submetido à humanização.
[060] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, conforme usado na presente invenção, se refere a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam laços estruturalmente definidos (“laços hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). AS HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácido dos laços hipervariáveis e/ou das “regiões de determinação de complementaridade” (CDRs), sendo as últimas de maior variabilidade de sequência e/ou envolvidas em reconhecimento de antígeno. Com a exceção de CDR1 em VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácido que formam os laços hipervariáveis. As regiões hipervariáveis (HVRs) são também chamadas de regiões de determinação de complementaridade (CDRs), e esses termos são usados na presente invenção de modo intercambiável em referência às porções da região variável que formam as regiões de ligação de antígeno. Essa região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 a 917 (1987), onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados uns com os outros. Todavia, a aplicação da definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes dos mesmos se destina a estar incluída no escopo do termo conforme definido e usado da presente invenção. Os resíduos de aminoácido apropriados que abrangem as CDRs conforme definido por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de resíduo exatos que abrangem uma CDR particular irão variar dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Aqueles elementos versados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR particular em vista da sequência de aminoácido do anticorpo de região variável. TABELA 1. DEFINIÇÕES DE CDR
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[061] 1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 é de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et al. (consulte abaixo).
[062] 2"AbM" com um “b” minúsculo conforme usado na Tabela 1 se refere a CDRs conforme definido pelo software de modelagem de anticorpo "AbM" da Oxford Molecular.
[063] Kabat et al.Também definiu um sistema de numeração para sequências de região variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um elemento de conhecimento comum na técnica pode atribuir de forma não ambígua esse sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Conforme usado na presente invenção, "numeração de Kabat" se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo se especificado de outro modo, as referências à numeração de posições de resíduo de aminoácido específicas em uma região variável de anticorpo são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[064] As CDRs também compreendem “resíduos de determinação de especificidade,” ou “SDRs,” que são resíduos que entram em contato com o antígeno. Os SDRs são contidos dentro de regiões das CDRs chamadas de CDRs abreviadas, ou a-CDRs. Em geral, apenas um quinto a um terço dos resíduos em uma determinada CDR participa em ligação de antígeno. Os resíduos de determinação de especificidade em uma CDR particular podem ser identificados, por exemplo, por computação de contatos interatômicos de modelagem tridimensional e determinação da variabilidade de sequência em uma determinada posição de resíduo de acordo com os métodos descrito em Padlan et al., FASEB J. 9(1):133-139 (1995). As a-CDRs exemplificativas (a- CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, e a-CDR-H3) ocorrem em resíduos de aminoácido 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2, e 95-102 de H3 (consulte Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619 a 1633 (2008).)
[065] Um “conjugado de anticorpo” é um conjugado de anticorpo para um agente citotóxico.
[066] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelha, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[067] Um anticorpo "isolado"é um que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza conforme determinado por, por exemplo, métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese por capilaridade) ou cromatográficos (por exemplo, troca de íon ou HPLC de fase reversa). Para análise dos métodos para avaliação de pureza de anticorpo, consulte, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79 a 87 (2007).
[068] Um polinucleotídeo "isolado" se refere a uma molécula de polinucleotídeo que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula de polinucleotídeo contida em células que contêm comumente a molécula de polinucleotídeo, mas a molécula de polinucleotídeo está presente extracromossomicamente ou em um local cromossômico que é diferente de seu local cromossômico natural.
[069] “Polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo antiFAP” se refere a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos das mesmas), incluindo tais moléculas de polinucleotídeo em um único single vetor ou vetores separados, e tais moléculas de polinucleotídeo presentes em um ou mais locais em uma célula hospedeira.
[070] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado na presente invenção se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos de indivíduo que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, sendo tais variantes geralmente presentes em quantidades menores. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo conforme é obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerente da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a, método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fase e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm todo ou parte do local de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplificativos para produção de anticorpos monoclonais que são descritos na presente invenção.
[071] Um “anticorpo nu” se refere a um anticorpo que não é conjugado para uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção citotóxica) ou radiomarcação. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.
[072] Os "anticorpos nativos" se referem a moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variantes. Por exemplo, os anticorpos de IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 dáltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeia pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N para C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3), também chamados de região constante de cadeia pesada. De modo similar, a partir da terminação N para C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL), também chamado de região constante de cadeia leve. A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kapa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácido de seu domínio constante.
[073] “Nenhuma reatividade cruzada substancial” significa que uma molécula (por exemplo, um anticorpo) não reconhece ou se liga especificamente a um antígeno diferente do antígeno-alvo real da molécula (por exemplo, um antígeno intimamente relacionado ao antígeno-alvo), particularmente quando em comparação a do antígeno-alvo. Por exemplo, um anticorpo pode se ligar menos que cerca de 10% a menos que cerca de 5% a um antígeno diferente do antígeno-alvo real, ou pode se ligar ao dito antígeno diferente do antígeno-alvo real em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em menor que cerca de 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ou 0,1%, de preferência, menor que cerca de 2%, 1%, ou 0,5%, e com máxima preferência, menor que cerca de 0,2% ou 0,1% de antígeno diferente do antígeno-alvo real.
[074] O termo “inserto de pacote” é usado para se referir a instruções comumente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso de tais produtos terapêuticos.
[075] O termo anticorpo "parental" se refere a um anticorpo que é usado como o ponto ou base de partida para a preparação de um variante.
[076] “Percentual de (%) identidade de sequência de aminoácido"em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácido na sequência de polipeptídeo de referência, após o alinhamento das sequências e da introdução de lacunas, se necessário, para alcançar o percentual de identidade de sequência máximo, e não considerando quaisquer substituições conservantes como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de sequência de aminoácido pode ser alcançado de várias maneiras que estão inseridas no escopo da técnica, por exemplo, com o uso de software de computador publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles elementos versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para sequências de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências a serem comparadas. Para propósitos da presente invenção, entretanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácido são gerados com o uso do programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi autorizado por Genentech, Inc., e o código-fonte foi depositado com documentação de usuário em U.S. Copyright Office, Washington D.C., EUA, 20559, onde é registrado sob número U.S. Copyright Registration TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, California, EUA, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[077] Em situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácido, o % de identidade de sequência de aminoácido de uma determinada sequência de aminoácido A para, com ou contra uma determinada sequência de aminoácido B (que pode alternativamente ser fraseada como uma determinada sequência de aminoácido A que tem ou compreende um certo % de identidade de sequência de aminoácido para, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácido B) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y
[078] onde X é o número de resíduos de aminoácido classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 no alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será observado que onde o comprimento de sequência de aminoácido A não for igual ao comprimento de sequência de aminoácido B, o % de identidade de sequência de aminoácido de A para B não será igual ao % de identidade de sequência de aminoácido de B para A. Salvo se estabelecido especificamente de outro modo, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácido usados da presente invenção são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente precedente com o uso do programa de computador ALIGN-2.
[079] De modo similar, por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% de "idêntica"a uma sequência de nucleotídeo de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência exceto pelo fato de que a polisequência de nucleotídeo pode incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeo pelo menos 95% de idêntica a uma sequência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por um outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos in na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal 5’ ou 3’ da sequência de referência de nucleotídeo ou em qualquer lugar entre essas posições de terminal, espalhado individualmente dentre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Como um assunto prático, se qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de polipeptídeo da presente invenção, isso pode ser determinado convencionalmente com o uso de programas de computador conhecidos, tais como os mencionados acima.
[080] O termo "formulação farmacêutica"se refere a uma preparação que está em uma forma para permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nisso seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[081] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, além de um ingrediente ativo, que é não tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[082] O termo “Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP)” conforme usado na presente invenção, se refere a qualquer FAP nativa de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos, consulte número de acesso do GenBank AAC51668) e roedores (por exemplo, camundongos, consulte número de acesso do GenBank AAH19190), salvo se indicado de outro modo. O termo abrange “comprimento total,” FAP não processada bem como qualquer forma de FAP que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de FAP, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. De preferência, um anticorpo antiFAP da invenção se liga ao domínio extracelular de FAP. A sequência de aminoácido de ectodomínios de FAP exemplificativos de humano, camundongo e macaco (com uma polilisina C-terminal e 6x His-tag) é mostrada em SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, e SEQ ID NO: 321 respectivamente.
[083] Conforme usado na presente invenção, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo tal como “tratar” ou “tratando”) se refere à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural de doença do indivíduo a ser tratado, e pode ser executado para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não são limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência de doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão de doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico aprimorado. Em algumas realizações, os anticorpos da invenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para desacelerar a progressão de uma doença.
[084] O termo “região variável” ou “domínio variável” se refere ao domínio de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo que está envolvida em ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de arcabouço conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Consulte, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a edição, W.H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígeno. Adicionalmente, os anticorpos que se ligam a um antígeno podem ser isolados com o uso de um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para triar uma biblioteca de complementaridade de domínios VL ou VH, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880 a 887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624 a 628 (1991).
[085] O termo "vetor," conforme usado na presente invenção, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual isso foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais são ligados de modo funcional. Tais vetores são chamados de na presente invenção de "vetores de expressão."
[086] Conforme usado na presente invenção, o termo "polipeptídeo que tem atividade de GnTIII" se refere a polipeptídeos que são capazes de catalisar a adição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) em ligação β-1-4 ao manosídeo β-ligado do núcleo de trimanosila de oligossacarídeos N-ligados. Isso inclui polipeptídeos de fusão que exibem atividade enzimática similar a, mas não necessariamente idêntica, uma atividade de β(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III, também conhecida como β-1,4-manosil-glicoproteína 4-beta-N-acetilglicosaminil-transferase (EC 2.4.1.144), de acordo com o Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), conforme medido em um ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso em que a dependência de dose existe, isso não precisa ser idêntico a do GnTIII, mas, de preferência, substancialmente similar à dependência de dose em uma determinada atividade em comparação a GnTIII (isto é, o polipeptídeo candidato irá exibir maior atividade ou não mais que cerca de 25 vezes menos e, de preferência, não mais que cerca de dez vezes menos atividade, e com máxima preferência, não mais que cerca de três vezes menos atividade em relação a GnTIII).
[087] Conforme usado na presente invenção, o termo “domínio de localização de Golgi” se refere à sequência de aminoácido de um polipeptídeo residente em Golgi que é responsável pelo ancoragem do polipeptídeo a um local dentro do complexo de Golgi. Geralmente, os domínios de localização compreendem “caudas” de terminal amino de uma enzima.
[088] Conforme usado na presente invenção, os termos “projetar, projetado, projetando,” particularmente com o prefixo “glico-,” bem como o termo “projeto de glicosilação” são considerados por incluir qualquer manipulação do padrão de glicosilação de um polipeptídeo recombinante ou de ocorrência natural ou fragmento do mesmo. O projeto de glicosilação inclui projeto metabólico do mecanismo de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticas das rotas de síntese de oligossacarídeo para alcançar glicosilação alterada de glicoproteínas expressas em células. Adicionalmente, o projeto de glicosilação inclui os efeitos de mutações e ambiente de célula em glicosilação. Em uma realização, o projeto de glicosilação é uma alteração em atividade de glicosiltransferase. Em uma realização particular, o projeto resulta em atividade de glicosaminiltransferase e/ou atividade de fucosiltransferase alterada.
[089] Conforme usado na presente invenção, o termo “citotoxicidade celular mediada por Fc” inclui citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade celular mediada por uma proteína de fusão de Fc solúvel que contém uma região Fc humana. Isso é um mecanismo imunológico que leva à lise de “células alvejadas” por “células efetoras imunes humanas.”
[090] Conforme usado na presente invenção, o termo “células efetoras imunes humanas” se refere a uma população de leucócitos que exibem receptores Fc em suas superfícies, através da qual se ligam à região Fc de anticorpos ou proteínas de fusão Fc e executam funções efetoras. Tal população pode incluir, mas não se limita a, células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e/ou células exterminadoras naturais (NK).
[091] Conforme usado na presente invenção, o termo “células alvejadas” se refere a células às quais a molécula de ligação de antígenos que compreende uma região Fc (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma região Fc) ou proteínas de fusão de Fc se ligam especificamente. A molécula de ligação de antígenos ou proteínas de fusão de Fc se ligam às células-alvo através da parte de proteína que é N- terminal à região Fc.
[092] Conforme usado na presente invenção, o termo “citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada” é definido como um aumento no número de “células alvejadas” que são lisadas em determinado tempo, em uma determinada concentração de anticorpo ou de proteína de fusão de Fc no meio que circunda as células-alvo, pelo mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc definido acima, e/ou uma redução na concentração de anticorpo ou de proteína de fusão de Fc, no meio que circunda as células-alvo, necessária para alcançar a lise de um determinado número de “células alvejadas,” em um determinado tempo, pelo mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc. O aumento em citotoxicidade celular mediada por Fc é relativo à citotoxicidade celular mediada pela mesma molécula de ligação de antígeno ou proteína de fusão de Fc produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, com o uso dos mesmos métodos de produção, purificação, formulação e armazenamento padrões, (que são conhecidos por aqueles elementos versados na técnica), mas que não foram produzidos por células hospedeiras projetadas para terem um padrão alterado de glicosilação (por exemplo, para expressar a glicosiltransferase, GnTIII, ou outras glicosiltransferases) pelos métodos descritos na presente invenção.
[093] “Anticorpo que tem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo aumentada (ADCC)” significa um anticorpo, conforme o termo é definido na presente invenção, que tem ADCC aumentada conforme determinado por qualquer método adequado conhecido por aqueles de conhecimento comum na técnica. Um ensaio de ADCC in vitro aceito é o seguinte:
[094] 1)o ensaio usa células-alvo que são conhecidas por expressar o antígeno-alvo reconhecido pela região do anticorpo de ligação de antígeno;
[095] 2)o ensaio usa células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMCs), isoladas de sangue de um doador saudável de escolhido aleatoriamente, como células efetoras;
[096] 3)o ensaio é executado de acordo com o seguinte protocolo:
[097] i)as PBMCs são isoladas com o uso de procedimentos de centrifugação de densidade padrão e são suspensas 5 x 106células/ml em meio de cultura celular RPMI;
[098] ii)as células-alvo são crescidas por métodos de cultura de tecido padrão, colhidas a partir da fase de crescimento exponencial com uma viabilidade maior que 90%, lavadas em meio de cultura celular RPMI, marcadas com 100 micro-Curies de 51Cr, lavadas duas vezes com meio de cultura celular e ressuspensas em meio de cultura celular a uma densidade de 105células/ml;
[099] iii) 100 microlitros da suspensão de célula-alvo final acima são transferidos para cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades;
[0100] iv) o anticorpo é serialmente diluído de 4000 ng/ml para 0,04 ng/ml em meio de cultura celular e 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes são adicionados às células-alvo na placa de microtitulação de 96 cavidades, o teste em triplicata de várias concentrações de anticorpo abrange toda a faixa de concentração acima;
[0101] v) para os controles de liberação máxima (MR), 3 cavidades adicionais na placa que contém as células-alvo marcadas, recebem 50 microlitros de uma solução aquoso a 2% (V/V) de detergente não iônico (Nonidet, Sigma, St. Louis), em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima);
[0102] vi) para os controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidades adicionais na placa que contém as células-alvo marcadas, recebem 50 microlitros de meio de cultura celular RPMI em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima);
[0103] vii)a placa de microtitulação de 96 cavidades é, então, centrifugada em 50 x g por 1 minuto e incubada por 1 hora a 4°C;
[0104] viii)50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) são adicionados a cada cavidade para produzir uma razão de efetor:célula-alvo de 25:1 e as placas são colocadas em um incubador sob atmosfera de CO2 a 5% a 37°C por 4 horas;
[0105] ix) o sobrenadante isento de célula de cada cavidade é colhido e a radioatividade experimentalmente liberada (ER) é quantificada com o uso de um contador gama;
[0106] x) a porcentagem de lise específica é calculada para concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, em que ER é a radioatividade média quantificada (consulte ponto ix acima) para aquela concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (consulte ponto ix acima) para os controles MR (consulte ponto v acima), e SR é a radioatividade média quantificada (consulte ponto ix acima) para os controles SR (consulte ponto vi acima);
[0107] 4) “ADCC aumentada” é definida como um aumento na porcentagem máxima de lise específica observada dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima, e/ou uma redução na concentração de anticorpo necessária para alcançar metade da porcentagem máxima de lise específica observada dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima. O aumento em ADCC é relativo à ADCC, medida com o ensaio acima, mediado pelo mesmo anticorpo, produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, com o uso dos mesmos métodos de produção, purificação, formulação e armazenamento padrão, que são conhecidos por aqueles elementos versados na técnica, mas ainda não foram produzidos por células hospedeiras projetadas para sobrexpressar GnTIII.
II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS
[0108] A Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP) é expressa na maioria dos tumores, mas ausente essencialmente de tecidos adultos saudáveis, dessa forma anticorpos que alvejam esse antígeno possuem potencial terapêutico considerável. A presente invenção fornece anticorpos que se ligam a FAP, em particular, anticorpos com alta afinidade e funções efetoras fortes. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de FAP, tal como câncer.
A. ANTICORPOS ANTIFAP EXEMPLIFICATIVOS
[0109] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente à Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP). Particularmente, a presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente à FAP, em que os ditos anticorpos são glicoprojetados para ter função efetora aumentada.
[0110] Em uma realização, um anticorpo antiFAP da invenção compreende pelo menos uma (por exemplo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve ou pesada (CDR) selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177, ou um variante ou forma truncada das mesmas que contém pelo menos os resíduos de determinação de especificidade (SDRs) para a dita CDR.
[0111] Em uma realização, a dita pelo menos uma CDR é uma CDR de cadeia pesada, particularmente uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141. Em uma outra realização, o anticorpo compreende pelo menos um CDR de cadeia pesada e pelo menos um CDR de cadeia leve, particularmente a CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 e SEQ ID NO: 177.
[0112] Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de CDR de cadeia pesada (HCDR) selecionadas a partir de (a) HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; (b) HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 133; e (c) HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; (b) uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 133; e (c) uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, ou variantes ou formas truncadas das mesmas que contêm pelo menos as SDRs para as ditas CDRs.
[0113] Em uma realização, uma anticorpo da invenção compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de CDR de cadeia leve (LCDR) selecionadas a partir de (a) LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; (b) LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e (c) LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177. Em uma realização adicional, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que compreende (a) uma CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; (b) uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e (c) uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177, ou variantes ou formas truncadas das mesmas que contêm pelo menos as SDRs para as ditas CDRs.
[0114] Em uma realização mais específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 133; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177, ou variantes ou formas truncadas das mesmas que contêm pelo menos as SDRs para as ditas CDRs.
[0115] Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 133; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e uma CDR3 de cadeia leve selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177, em que pelo menos uma das ditas CDRs é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 177.
[0116] Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 133; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, e SEQ ID NO: 177, em que pelo menos uma das ditas CDRs não é uma CDR selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, e SEQ ID NO: 175.
[0117] Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 27; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, e SEQ ID NO: 107; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, e SEQ ID NO: 141, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 149; uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, e SEQ ID NO: 161; e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, e SEQ ID NO: 175, ou variantes ou formas truncadas das mesmas que contêm pelo menos as SDRs para as ditas CDRs.
[0118] Em uma realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69, e SEQ ID NO: 101; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 103; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 145, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 153, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 165. Ainda em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; a CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69, e SEQ ID NO: 101; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 147, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 155, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 167. Em uma outra realização específica, uma anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 73, e SEQ ID NO: 105; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 145, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 153, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 169. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69, e SEQ ID NO: 101; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 149, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 157, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 167. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 29; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, e SEQ ID NO: 131; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 31, e SEQ ID NO: 33; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 127, e SEQ ID NO: 133; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 147, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 155, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 167. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 69, e SEQ ID NO: 101; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 177. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 77, e SEQ ID NO: 109; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 79, e SEQ ID NO: 111; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 89, e SEQ ID NO: 131; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 81, e SEQ ID NO: 113; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 143, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 151, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 163. Em uma realização específica adicional, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, e SEQ ID NO: 31; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 95, e SEQ ID NO: 127; e a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137, e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 147, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 155, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 167.
[0119] Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade como uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311. Em uma realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311.
[0120] Em certas realizações, uma sequência VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservantes), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo antiFAP que compreende a sequência retém a capacidade de se ligar à FAP. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em SEQ ID NO 197, 201, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307 ou 311. Em certas realizações, as substituições, inserções, ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs ou CDRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, um anticorpo antiFAP de acordo com a invenção compreende a sequência VH em SEQ ID NO 197, 201, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307 ou 311, incluindo modificações pós- translacionais dessa sequência. Em uma realização particular, a VH compreende uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada selecionadas a partir das sequências apresentadas em SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 e 141 para HCDR1, HCDR2 e HCDR3.
[0121] Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade como uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309. Ainda em uma outra realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309.
[0122] Em certas realizações, uma sequência VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservantes), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo antiFAP que compreende essa sequência retém a capacidade de se ligar à FAP. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado em SEQ ID NO 193, 195, 199, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305 ou 309. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs ou CDRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, um anticorpo antiFAP da invenção compreende a sequência VL em SEQ ID NO 193, 195, 199, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305 ou 309, incluindo modificações pós-translacionais dessa sequência. Em uma realização particular, a VL compreende uma, duas ou três CDRs de cadeia leve selecionadas a partir de sequências apresentadas em SEQ ID NOs 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177 for the LCDR1, LCDR2 e LCDR3.
[0123] Em um outro aspecto, é fornecido um anticorpo antiFAP, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e uma VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em uma realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL em SEQ ID NO 197, 201, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307 ou 311, e SEQ ID NO 193, 195, 199, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305 ou 309, respectivamente, incluindo modificações pós-translacionais dessas sequências.
[0124] Em uma realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, em que pelo menos uma das ditas regiões variáveis não compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, e SEQ ID NO: 255.
[0125] Em uma realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia leve que compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo de: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, em que pelo menos uma das ditas regiões variáveis compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311.
[0126] Em uma realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, e SEQ ID NO: 255, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, e SEQ ID NO: 253.
[0127] Em uma realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:197, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 193 ou SEQ ID NO: 195. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 201 ou SEQ ID NO: 203, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 199. Ainda em uma outra realização específica um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209. Ainda em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 219, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217. Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 293. Em uma realização específica, os anticorpos da invenção compreendem a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 303, e SEQ ID NO: 307, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 195, ou b) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido ou SEQ ID NO: 299 ou SEQ ID NO: 311, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205, ou c) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido ou SEQ ID NO: 197, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 293. Em uma realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 259 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 195. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 263 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 195. Em uma realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 305. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 267 e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 265. Ainda em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 299, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205. Em uma realização particular, o anticorpo de acordo com qualquer uma das realizações acima compreende adicionalmente uma região Fc ou uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.
[0128] Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende uma região Fc, particularmente uma região Fc de IgG, com máxima particularidade uma região Fc de IgG1.
[0129] Em uma realização particular, o anticorpo da invenção é um anticorpo de comprimento total, particularmente um anticorpo de classe IgG, com máxima particularidade um anticorpo isótipo de IgG1. Em uma outra realização, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo, selecionado a partir do grupo de: um fragmento scFv, um fragmento Fv, um fragmento Fab e um fragmento F(ab’)2. Em uma realização adicional, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo que tem uma região Fc, ou uma proteína de fusão que compreende uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina. Em uma realização, o anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal.
[0130] Em uma realização, um anticorpo da invenção é quimérico, mais especificamente humanizado. Em uma realização particular, um anticorpo da invenção é humano. Em uma outra realização, um anticorpo da invenção compreende uma região constante humana. Em uma realização, o anticorpo da invenção compreende uma região Fc humana, particularmente uma região Fc de IgG humana, com máxima particularidade uma região Fc de IgG1 humana.
[0131] Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a dita região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG humana, particularmente uma região constante de IgG1 humana, que compreende uma região Fc. Em uma realização específica, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 313. Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região constante de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 315. Ainda em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 313, e uma região constante de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 315.
[0132] Em uma realização particular, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à FAP, em que o dito anticorpo compreende a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, ou uma combinação dos mesmos, e b) uma região Fc ou uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.
[0133] Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende uma região Fc, em que a dita região Fc é uma região Fc glicoprojetada. Em uma realização adicional, um anticorpo da invenção é glicoprojetado para ter oligossacarídeos modificados na região Fc. Em uma realização específica, o anticorpo tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados na região Fc, em comparação a um anticorpo não glicoprojetado. Em uma realização mais específica, pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 100%, de preferência, pelo menos cerca de 50%, com mais preferência, pelo menos cerca de 70%, dos oligossacarídeos N-ligados na região Fc do anticorpo são bisseccionados. Os oligossacarídeos bisseccionados podem ser do tipo híbrido ou do tipo complexo.
[0134] Em uma outra realização específica, um anticorpo da invenção tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc, em comparação a um anticorpo não glicoprojetado. Em uma realização mais específica, pelo menos cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 100%, de preferência, pelo menos cerca de 50%, com mais preferência, pelo menos cerca de 70%, dos oligossacarídeos N-ligados na região Fc do anticorpo são não fucosilados. Os oligossacarídeos não fucosilados pode ser do tipo híbrido ou do tipo complexo.
[0135] Em uma realização particular, um anticorpo da invenção tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados na região Fc, em comparação a um anticorpo não glicoprojetado. Especificamente, o anticorpo compreende uma região Fc em que pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 100%, de preferência, pelo menos cerca de 15%, com mais preferência, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 35% ou pelo menos cerca de 50%, dos oligossacarídeos N-ligados são bisseccionados e não fucosilados. Os oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados podem ser do tipo híbrido ou do tipo complexo.
[0136] Em uma realização, um anticorpo da invenção tem função efetora aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor Fc aumentada. A função efetora aumentada e/ou ligação a receptor Fc aumentada pode resultar, por exemplo, da glicoprojeção e/ou da maturação por afinidade de anticorpos. Em uma realização, a função efetora aumentada e/ou ligação a receptor Fc aumentada é um resultado de glicoprojeção da região Fc do anticorpo. Em uma outra realização, a função efetora aumentada e/ou ligação a receptor Fc aumentada é um resultado de uma combinação de afinidade aumentada e glicoprojeção. A função efetora aumentada pode incluir, mas não se limita a, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada (incluindo citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo aumentada (ADCC)), fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, absorção de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células que apresentam antígeno, ligação aumentada a células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a monócitos, ligação aumentada a células polimorfonucleares, apoptose de indução de sinalização direta aumentada, reticulação aumentada de anticorpos ligados por alvo, maturação de célula dendrítica aumentada ou iniciação de célula T aumentada. Em uma realização particular, a função efetora aumentada é ADCC aumentada. A ligação a receptor Fc aumentada de preferência, é ligação aumentada a um receptor Fc ativação, com máxima preferência, FcyRIIia.
[0137] Em uma realização, um anticorpo da invenção não ocasiona um nível clinicamente significativo de toxicidade quando administrado em um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[0138] Em uma realização, um anticorpo da invenção é maturado por afinidade. Em uma realização adicional, um anticorpo da invenção se liga à Proteína Ativadora de Fibroblasto com um valor de constante de dissociação (KD) menor que cerca de 1 μM a cerca de 0,001 nM, particularmente um valor KD menor que cerca de 100 nM, menor que cerca de 10 nM, menor que cerca de 1 nM, ou menor que cerca de 0,1 nM. Em uma realização, um anticorpo da invenção se liga à FAP humana, de camundongo e de macaco. Em uma realização, um anticorpo da invenção se liga se liga à FAP humana e de macaco. Em uma realização mais específica, um anticorpo da invenção se liga à FAP humana, de camundongo e de macaco com um valor KD menor que cerca de 200 nM, menor que cerca de 100 nM, mais particularmente menor que cerca de 10 nM ou menor que cerca de 1 nM, com máxima particularidade menor que 0,1 nM. Os valores KD são determinados por Ressonância de Plásmon de Superfície, com o uso dos anticorpos como Fab ou IgG, particularmente como IgG.
[0139] Em uma realização, um anticorpo antiFAP da invenção se liga à FAP em tecidos humanos. Em uma realização um anticorpo antiFAP da invenção é de reação cruzada para FAP humana e de camundongo. Em uma outra realização, um anticorpo da invenção não reatividade cruzada substancial com outros membros da família dipeptidil peptidase IV, em particular, a DPPIV/CD26. Em uma realização, um anticorpo antiFAP da invenção não induz internalização de FAP mediante a ligação do dito anticorpo à FAP expressa sobre uma superfície de a célula.
[0140] Em uma realização particular, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à FAP, em que o dito anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, e uma região Fc de IgG humana, e em que opcionalmente o dito anticorpo é glicoprojetado para ter função efetora aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor Fc. Em uma outra realização particular, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à FAP, em que o dito anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, e uma região Fc de IgG humana, e em que o dito anticorpo tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados e/ou uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados na dita região Fc.
[0141] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à FAP, em que o dito anticorpo é derivado de um anticorpo parental que compreende a CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3, a CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 35, uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 141, a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 145, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 153 e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 e SEQ ID NO: 175, e em que o dito anticorpo compreende pelo menos um aminoácido substituição ou deleção em pelo menos uma CDR de cadeia leve ou pesada do anticorpo parental. Por exemplo, o anticorpo pode compreender pelo menos uma, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez (isto é, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10), e particularmente de cerca de duas a cerca de cinco, substituições em uma ou mais regiões hipervariáveis ou CDRs (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 regiões hipervariáveis ou CDRs) do anticorpo parental. Em certas realizações, qualquer um ou mais aminoácidos do anticorpo parental conforme fornecido acima é substituído ou deletado nas seguintes posições de CDR:
[0142] CDR1 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 3): posições 2 e 3
[0143] CDR2 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 35): posições 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9
[0144] CDR1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 145): posições 7, 8 e 9
[0145] CDR2 de cadeia leve (SEQ ID NO: 153): posições 1, 2, 3, 4 e 5
[0146] CDR3 de cadeia leve (SEQ ID NO 165, 167, 169, 171, 173, ou 175): posições 4, 5, 6, e 7
[0147] Em certas realizações, as substituições são substituições conservantes, conforme fornecido na presente invenção. Em certas realizações, qualquer uma ou mais das seguintes substituições ou deleções pode ser feita em qualquer combinação:
[0148] CDR1 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 3): Y2F, H ou S, A3T
[0149] CDR2 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 35): A1G, S3G, I, W ou L, G4V, S, A ou T, S5G ou N, G6T ou A, G7R, S, A, E ou N, S8Y, L, R, I, N, Q, I ou deletado, T9 deletado
[0150] CDR1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 145): S7T, S8R ou S9N
[0151] CDR2 de cadeia leve (SEQ ID NO: 153): Y1N, I ou Q, G2V, A3G, S4T ou Y, S5R, T ou I
[0152] CDR3 de cadeia leve (SEQ ID NO 165, 167, 169, 171, 173, ou 175): G4A, Q, N, L ou H5I, L, V, Q, N ou I6M, I7L
[0153] Adicionalmente, os anticorpos também podem compreender uma ou mais adições, deleções e/ou substituições em uma ou mais regiões de arcabouço da cadeia pesada ou da cadeia leve, em comparação ao anticorpo parental. Em uma realização, a dito pela menos uma substituição de aminoácido em pelo menos uma CDR contribui para afinidade de ligação do anticorpo aumentada em comparação a seu anticorpo parental. Em uma outra realização, o dito anticorpo tem pelo menos cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes mais afinidade com FAP que o anticorpo parental (quando comparado o anticorpo da invenção e o anticorpo parental no mesmo formato, por exemplo, o formato Fab). Adicionalmente, o anticorpo derivado de um anticorpo parental pode incorporar qualquer um dos recursos, levemente ou em combinação, descritos nos parágrafos precedentes em relação aos anticorpos da invenção.
[0154] A presente invenção também fornece polinucleotídeos que codificam anticorpos que se ligam especificamente à FAP. Em um aspecto, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que forma parte de um anticorpo antiFAP de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção anteriormente. Em uma realização, o polinucleotídeo isolado codifica um anticorpo cadeia pesada e/ou um anticorpo cadeia leve que forma parte de um anticorpo antiFAP de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção anteriormente.
[0155] Em uma realização, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que codifica um ou mais (por exemplo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) das regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve ou pesada (CDRs) apresentadas em SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177, ou um variante ou forma truncada das mesmas que contém pelo menos os resíduos de determinação de especificidade (SDRs) para a dita CDR. Em uma outra realização, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica três CDRs de cadeia pesada (por exemplo, HCDR1, HCDR2, e HCDR3) ou três CDRs de cadeia leve (por exemplo LCDR1, LCDR2, e LCDR3) selecionadas a partir de SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177, ou variantes ou formas truncadas das mesmas que contêm pelo menos as SDRs para cada uma das ditas três regiões de determinação de complementaridade. Ainda em uma outra realização, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica três CDRs de cadeia pesada (por exemplo, HCDR1, HCDR2, e HCDR3) e três CDRs de cadeia leve (por exemplo LCDR1, LCDR2, e LCDR3) selecionadas a partir de SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 e 177. Em uma realização particular, o polinucleotídeo que codifica uma ou mais CDRs compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma ou mais das sequências de nucleotídeo de CDR mostradas em SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 e 192.
[0156] Em uma realização adicional, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e/ou uma sequência que codifica uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309. Em uma realização particular, o polinucleotídeo que codifica um região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve compreende uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências de nucleotídeo de região variável apresentadas em SEQ ID NOs 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310 e 312, ou uma combinação das mesmas.
[0157] Em uma realização específica, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e uma sequência que codifica uma região constante de cadeia pesada, particularmente uma região constante de cadeia pesada humana. Em uma realização particular, a dita região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG humana de cadeia pesada, especificamente uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana, que compreende uma região Fc. Em uma realização específica, a dita região constante de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ ID NO: 313. Em uma outra realização específica, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309, e uma sequência que codifica uma região constante de cadeia leve, particularmente uma região constante de cadeia leve humana. Em uma realização específica, a dita região constante de cadeia leve compreende a sequência de SEQ ID NO: 315.
[0158] Em uma realização, a invenção é direcionada a uma composição que compreende um primeiro polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307, e SEQ ID NO: 311, e um segundo polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, e SEQ ID NO: 309.
[0159] Em uma realização, a invenção é direcionada a uma composição que compreende um primeiro polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 308, e SEQ ID NO: 312, e um segundo polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 306, e SEQ ID NO: 310.
[0160] Em um aspecto adicional, a invenção também é direcionada a polipeptídeos isolados, codificados por qualquer um dos polinucleotídeos de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção anteriormente.
[0161] Em um aspecto adicional, um anticorpo antiFAP de acordo com qualquer uma das realizações acima pode incorporar qualquer um dos recursos, unicamente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 6 abaixo:
1. AFINIDADE DE ANTICORPO
[0162] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção tem uma constante de dissociação (KD) de <1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). De preferência, os anticorpos fornecidos na presente invenção se ligam à Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP), em particular FAP humana, com um valor KD menor que 1 nM, conforme determinado por Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR).
[0163] De acordo com um realização, KD é medida com o uso de Ressonância de Plásmon de Superfície. Tal ensaio pode ser executado, por exemplo, com o uso de uma máquina BIACORE®-T100 (GE Healthcare) a 25°C com chips CM5 para imobilização de antígeno. Em suma, os chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare.) são ativados com N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida clorídrico (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo Anti-His (Penta His, Qiagen) é diluído com acetato de sódio a 10 mM, pH 5, a 40 μg/ml antes da injeção a uma taxa de fluxo de 10 μl/minuto para alcançar aproximadamente 9000 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do anticorpo anti-His, etanolamina a 1 M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Subsequentemente, o antígeno identificado com His é injetado a 10 μl/min. a 10 nM por 20 s (para medições com fragmentos Fab) ou a 20 nM por 25 s (para medições com anticorpos de IgG) e é capturado através de sua identificação His pelo anticorpo anti-His imobilizado. As sequências de proteína e DNA de construtos de antígeno de FAP adequados são mostradas em SEQ ID NOs 317-322. Para medições de cinética, as diluições em série de anticorpo (diluições de duas vezes, se situam na faixa entre 6,25 nM e 200 nM para fragmentos Fab, ou diluições de cinco vezes, se situam na faixa entre 3,2 pM e nM para IgG) são injetadas em HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,05% de Tensoativo P20, pH 7,4 a 25°C a uma taxa de fluxo de 90 μl/min. Os seguintes parâmetros são aplicados: tempo de associação 180 s, dissociação 300 s (para Fab) ou 900 s (para IgG), regeneração com glicina a 10 mM pH 2 por 60 s entre cada ciclo. taxas de associação (kassociação) e as taxas de dissociação (kdissociação) são calculadas com o uso de um modelo de ligação simples Langmuir de um a um (BIACORE ® T100 Evaluation Software) por ajuste simultâneo dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) é calculada como a razão kdissociação/kassociação. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865 a 881 (1999).
2. FRAGMENTOS DE ANTICORPO
[0164] Em certas realizações, um anticorpo fornecido da presente invenção é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, e scFvos, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma análise de certos fragmentos de anticorpo, consulte Hudson et al. Nat. Med. 9:129 a 134 (2003), ou Carter, Nat. Rev. Immunol. 6:343 a 357 (2006).
[0165] Os fragmentos Fv ou scFvos de cadeia única compreendem um domínio de VH e um domínio de VL como uma cadeia de único polipeptídeo. Tipicamente, os domínios de VH e VL são unidos por uma sequência ligante. Para uma análise de fragmentos scFvos, consulte, por exemplo, Plückthun, in The Pharmacology of Monoclonal Anticorpos, volume 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, New York, EUA), páginas 269 a 315 (1994); consulte também WO 93/16185; e patentes numerous US5.571.894 e US5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab')2 que compreendem resíduos de epítopo de ligação a receptor de recuperação e que têm meia-vida in vivoaumentada, consulte a patente n° US5.869.046.
[0166] Os diacorpos são fragmentos de anticorpo com sítios de ligação de dois antígenos que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129 a 134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 a 6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129 a 134 (2003).
[0167] Um minicorpo é um derivado bivalente de scFv homodimérico que contém uma região constante, tipicamente a região CH3 de uma imunoglobulina, de preferência, IgG, com mais preferência, IgG1, como a região de dimerização. Geralmente, a região constante é conectada ao scFv através de uma região de articulação e/ou uma região ligante. Os exemplos de proteínas de minicorpo podem ser encontrados em Hu et al., Cancer Res. 56: 3055 a 61 (1996).
[0168] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente n° US6.248.516 B1).
[0169] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo E. coli ou fago), conforme descrito na presente invenção.
3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[0170] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente n° US4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 a 6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe comutada” em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.
[0171] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir imunogenicidade para humanos, enquanto retém a especificidade e a afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções dos mesmos) são derivados de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos pelos resíduos correspondentes a anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou aprimorar especificidade ou afinidade de anticorpo. A humanização pode ser alcançada por vários métodos incluindo, mas não se limita a (a) enxertar todos os domínios variáveis não humanos sobre as regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos, (b) enxertar apenas as CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) sobre o arcabouço humano (por exemplo, anticorpo recipiente) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos de arcabouço críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para reter boa afinidade de ligação de antígeno ou funções de anticorpo), (c) enxertar apenas as regiões de determinação de especificidade não humana (SDRs ou a-CDRs; os resíduos críticos para a interação anticorpo- antígeno) sobre arcabouço e regiões constantes humanas, ou (d) transplantar todos os domínios variáveis não humanos, mas “cobrindo” os mesmos com uma seção do tipo humana através da substituição dos resíduos de superfície. Os anticorpos humanizados e os métodos de produção dos mesmos são analisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619 a 1633 (2008), e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323 a 329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029 a 10033 (1989); patentes números US5.821.337, US7.527.791, US6.982.321 e US7.087.409; Jones et al., Nature 321:522 a 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851 a 6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol. 44:65 a 92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 a 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169 a 217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25 a 34 (2005) (que descreve enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489 a 498 (1991) (que descreve “reformação de superfície”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43 a 60 (2005) (que descreve “reorganização de FR”); e Osbourn et al., Methods 36:61 a 68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252 a 260 (2000) (que descreve a abordagem de “seleção guiada” para reorganização de FR).
[0172] As regiões de arcabouço humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não são limitados a: regiões de arcabouço selecionadas com o uso do método de "melhor ajuste" (consulte, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões de arcabouço derivadas da sequência consensual de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia pesada ou leve (consulte, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões de arcabouço maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões de arcabouço de linha de germe humano (consulte, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619 a 1633 (2008)); e regiões de arcabouço derivado de bibliotecas de FR de triagem (consulte, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678 a 10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611 a 22618 (1996)).
4. ANTICORPOS HUMANOS
[0173] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368 a 74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450 a 459 (2008).
[0174] Os anticorpos humanos podem ser preparados através da administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos intactos humanos ou anticorpo intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao estímulo de antígeno. Tais animais contêm tipicamente toda ou uma porção do local de imunoglobulina humana, que substitui o local de imunoglobulina endógeno, ou que está presente extracromossomicamente ou integrado aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tal camundongo transgênico, o local de imunoglobulina endógeno é geralmente inativado. Para análise de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, consulte Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117 a 1125 (2005). Consulte também, por exemplo, as patentes US6.075.181 e US6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSETM; patente n° US5.770.429 que descreve a tecnologia HUMAB®; a patente n° US7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®, e a publicação de pedido de patente n° US2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, através da combinação com uma região constante humana diferente.
[0175] os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos à base de hibridoma. As linhagens celulares de heteromieloma de humano-camundongo e mieloma humano para a produção de anticorpos humanos monoclonais têm sido descritas. (Consulte, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, EUA 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) os anticorpos humanos gerados por tecnologia de hibridoma de célula B humana também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557 a 3562 (2006). Os métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente n° Us7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens celulares de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265 a 268 (2006) (que descreve hibridomas humano- humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927 a 937 (2005) e Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185 a 191 (2005).
[0176] Os anticorpos humanos também podem ser gerados através do isolamento de sequências de domínio variável de clone Fv selecionadas a partir dos bibliotecas de exibição de fago derivado de humano. Tais sequências de domínio variável podem, então, ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para selecionar anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpo são descritas abaixo.
5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA
[0177] Os anticorpos da invenção podem ser isolados através da triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fago e triar tais bibliotecas em relação a anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Tais métodos são analisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1 a 37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, EUA, 2001) e adicionalmente descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552 a 554; Clackson et al., Nature 352: 624 a 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 a 597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology 248:161 a 175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, EUA, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299 a 310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073 a 1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467 a 12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119 a 132(2004).
[0178] Em certos métodos de exibição de fago, os repertórios de genes VH e VL são separadamente clonados por reação de cadeia de polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem, então, ser triadas em relação à fago de ligação de antígeno conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). O fago exibe tipicamente fragmentos de anticorpo, como fragmentos de cadeia única Fv (scFv) ou como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade com o imunógeno sem o requisito de hibridomas de construção. Alternativamente, o repertório primitivo pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla faixa de não autoantígenos e também autoantígenos sem qualquer imunização conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725 a 734 (1993). Finalmente, as bibliotecas primitivas também podem ser feitas sinteticamente através da clonagem de segmentos de gene V não rearranjados de células-tronco, e com o uso de iniciadores de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 a 388 (1992). As publicações de patente quem descreve as bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo: patente n° US5.750.373, e a publicação de patente sob os números US2005/0079574, US2005/0119455, US2005/0266000, US2007/0117126, US2007/0160598, US2007/0237764, US2007/0292936 e US2009/0002360.
[0179] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados das bibliotecas de anticorpo humano são considerados anticorpos humanos ou fragmentos anticorpo humano na presente invenção.
6. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[0180] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação com pelo menos dois sítios diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é com FAP e a outra é com qualquer outro antígeno. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos de FAP diferentes. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam FAP. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo.
[0181] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não são limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm diferentes especificidades (consulte Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829, e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e projeto de “knob-in-hole” (consulte, por exemplo, patente n° US5.,731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por projeto de efeitos de direção eletrostática para produzir moléculas heterodiméricas de anticorpo de Fc (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente n° US4.676.980, e Brennan et al., Science 229:81 (1985)); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547 a 1553 (1992)); com o uso de tecnologia de "diacorpo" para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444 a 6448 (1993)); e com o uso de dímeros Fv (scFv) de cadeia única (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparar anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0182] Os anticorpos projetados com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo “anticorpos octopus,” também são incluídos na presente invenção (consulte, por exemplo US 2006/0025576A1).
[0183] O anticorpo ou fragmento na presente invenção também inclui um “FAb de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que se liga à FAP bem como um outro antígeno diferente (consulte, US 2008/0069820, por exemplo).
7. VARIANTES DE ANTICORPO
[0184] Em certas realizações, as variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos fornecidos na presente invenção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de sequência de aminoácido de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação de antígeno.
A) SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO, E DELEÇÃO DE VARIANTES
[0185] Em certas realizações, as variantes de anticorpo que têm uma ou mais substituições de aminoácido são fornecidas. Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs.
[0186] As substituições de aminoácido podem resultar na substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares, por exemplo, substituições de aminoácido conservantes. As substituições de aminoácido "conservantes" podem ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos neutros polares incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As substituições conservantes são mostradas na Tabela 2 sob o cabeçalho de "substituições preferenciais." Mais alterações substanciais são fornecidas na Tabela 2 sob o cabeçalho de "substituições exemplificativas," e conforme adicionalmente descrito abaixo em referencia às classes de cadeia lateral de aminoácido. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos triados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/aprimorada, imunogenicidade diminuída, ou ADCC ou CDC aprimorada. TABELA 2.
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[0187] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades de cadeia lateral comuns:
[0188] (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0189] (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0190] (3) ácidos: Asp, Glu;
[0191] (4) básicos: His, Lys, Arg;
[0192] (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro;
[0193] (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0194] As substituições não conservantes irão herdar a troca de um membro de um dessas classes por uma outra classe. Por exemplo, as substituições de aminoácido também podem resultar na substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tem diferentes propriedades estruturais e/ou químicas, por exemplo, substituição de um aminoácido de um grupo (por exemplo, polar) por um outro aminoácido de um diferente grupo (por exemplo, básico). A variação permitida pode ser experimentalmente determinada por realização sistemática de inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo com o uso de técnicas de DNA recombinante e ensaio das variantes recombinantes resultantes para atividade.
[0195] Um tipo de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, as variantes resultantes selecionadas para estudo adicional terão modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terão certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Uma variante de substituição exemplificativa é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, com o uso de técnicas maturação por afinidade à base de exibição de fago tais como aquelas descritas na presente invenção. Em suma, um ou mais resíduos HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos em fago e triados por uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).
[0196] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar afinidade de anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em pontos certos de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que foram submetidos à mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (consulte, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179 a 196 (2008)), e/ou SDRs (a-CDRs), com a variante VH ou VL resultante sendo testada por afinidade de ligação. A maturação por afinidade através da construção e da nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1 a 37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, EUA (2001).) Em algumas realizações de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um dentre uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, reorganização de cadeia ou mutagênese direcionada a oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é, então, criada. A biblioteca é, então, triada para identificar quaisquer variantes de anticorpo com a afinidade desejada. Um outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, em que diversos resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos por vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos em ligação de antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, com o uso de mutagênese ou modelagem de triagem de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente alvejadas.
[0197] Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs desde que tais alterações não substancialmente reduzam a capacidade de o anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, as alterações conservantes (por exemplo, substituições conservantes conforme fornecido na presente invenção) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem ser fora de pontos certos de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é não alterada, ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácido.
[0198] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser alvejado para mutagênese é chamado de "mutagênese de triagem de alanina" conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081 a 1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos-alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com antígeno é afetada. As substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional para substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser alvejados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser triadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.
[0199] As inserções de sequência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila na faixa de comprimento de um resíduo para polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequência de resíduos de aminoácido múltiplos ou únicos. Os exemplos de inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.
8. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0200] Em algumas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades aprimoradas.
[0201] Em um aspecto, a presente invenção fornece glicoformas de anticorpos antiFAP que têm função efetora aumentada, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo. O projeto de glicosilação de anticorpos foi anteriormente descrito. Consulte, por exemplo, a patente n° US6.602.684, incorporada na presente invenção a título de referência em sua totalidade. Os métodos de produção de anticorpos antiFAP a partir de células hospedeiras que têm atividade de genes alteradas envolvidas em gliocosilação também são descritos na presente invenção em detalhes (consulte, por exemplo, seção intitulada “Métodos e Composições Recombinantes” abaixo).
[0202] Uma molécula de IgG porta dois oligossacarídeos N- ligados em sua região Fc, um em cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína, um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas que compartilha a mesma cadeia principal de polipeptídeo, mas tem diferentes oligossacarídeos fixados aos sítios de glicosilação. Os oligossacarídeos normalmente encontrados na região Fc de IgG de soro são do tipo complexo biantenário (Wormald et al., Biochemistry 36:130 a 38 (1997), com um baixo nível de ácido salicílico terminal e N-acetilglicosamina de biseccionamento (GlcNAc), e um grau variável de galactosilação de terminal e fucosilação de núcleo (fucose fixada a um resíduo de GlcNAc no “tronco” da estrutura de oligossacarídeo biantenária). Alguns estudos sugerem que a estrutura de carboidrato mínima requerida para ligação de FCYR se situe dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund et al., J. Immunol. 157:4963 a 69 (1996).
[0203] As linhagens celulares derivadas de camundongo ou hamster usadas na indústria e na academia para produção de anticorpos normalmente fixam o oligossacarídeo requerido para determinantes aos sítios Fc. As IgGs expressas nessas linhagens celulares carecem, entretanto, de GlcNAc de bissecção encontrado em baixas quantidades nas IgGs de soro. Lifely et al., Glicobiology 318:813 a 22 (1995). Na rota de glicosilação N-ligada, uma bissecção de GlcNAc é adicionada por GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163 a 81 (1986).
[0204] Umana et al. usou uma única linhagem celular CHO que produz anticorpo que foi anteriormente projetada para expressar, de uma maneira externamente regulada, diferentes níveis de um gene de enzima GnTIII clonado (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176 a 180 (1999)). Essa abordagem estabeleceu pela primeira vez uma correlação rigorosa entre a expressão de uma glicosiltransferase (por exemplo, GnTIII) e a atividade de ADCC do anticorpo modificado. Dessa forma, a invenção contempla anticorpos antiFAP, que compreendem uma região Fc ou região equivalente a uma região Fc que têm glicosilação alterada resultante da alteração do nível de expressão de um gene de glicosiltransferase na célula hospedeira que produz anticorpo. Em uma realização específica, a alteração em nível de expressão de gene é um aumento em atividade de GnTIII. A atividade aumentada de GnTIII resulta em um aumento na porcentagem de oligossacarídeos bisseccionados, bem como uma diminuição na porcentagem de oligossacarídeos fucosilados, na região Fc do anticorpo. Esse anticorpo, ou fragmento do mesmo, tem afinidade de ligação a receptor Fc aumentada e função efetora aumentada.
[0205] Os anticorpos são fornecido com oligossacarídeos bisseccionados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário fixado à região Fc do anticorpo é bisseccionado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aprimorada. Os exemplos de tais variantes de anticorpo são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente n° US6.602.684 (Umana et al.); e US2005/0123546 (Umana et al.).
[0206] Em uma realização, os anticorpos antiFAP da invenção possuem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados na região Fc como um resultado da modificação de seus oligossacarídeos pelos métodos da presente invenção. Em uma realização, a porcentagem de oligossacarídeos N-ligados bisseccionados na região Fc dos anticorpos antiFAP da invenção é pelo menos cerca de 10% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 50%, mais especificamente, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90 a 95% do total de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos bisseccionados podem ser do tipo híbrido ou do tipo complexo.
[0207] Em uma outra realização, os anticorpos antiFAP da invenção possuem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc como um resultado da modificação de seus oligossacarídeos pelos métodos da presente invenção. Em uma realização, a porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é pelo menos cerca de 20% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% a cerca de 70%, e mais especificamente, pelo menos cerca de 75%. Os oligossacarídeos não fucosilados podem ser do tipo híbrido ou do tipo complexo.
[0208] A quantidade de fucose é determinada através do cálculo da quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas fixadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e alto teor de manose) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito por exemplo em WO 2008/077546. Asn297 se refere ao resíduo de asparagina localizado em cerca de posição 297 na região Fc (resíduos de região Fc de numeração EU); entretanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a variações de sequência menos importantes em anticorpos. A quantidade relativa de fucose é a porcentagem de estruturas que contêm fucose relacionadas a todas as glicoestruturas identificadas em uma amostra tratada com N-Glicosidase F (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) por MALDI-TOF MS. Tais variantes de fucosilação podem ter função de ADCC aprimorada.
[0209] A metodologia de glicoprojeção que pode ser usada com os anticorpos antiFAP da presente invenção foi descrita em maiores detalhes na patente n° US6.602.684, publicação de pedido de patente US2004/0241817 A1, publicação de pedido de patente n° US2003/0175884 A1, publicação de patente provisório n° US60/441.307 e WO 2004/065540, cujos conteúdos são incorporados na presente invenção a título de referência em sua totalidade. Os anticorpos antiFAP da presente invenção podem alternativamente ser glicoprojetados para ter resíduos de fucose reduzidos na região Fc de acordo com as técnicas reveladas na publicação de pedido de patente n° US2003/0157108 (Genentech), ou em EP 1176195 A1 , WO 03/084570, WO 03/085119 e publicações de pedido de patente n° US2003/0115614, US2004/093621, US2004/110282, US2004/110704, US2004/132140, Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151/160 (2006), patente n° US6.946.292 (Kyowa). Os anticorpos antiFAP glicoprojetados da invenção também podem ser produzidos em sistemas de expressão que produzem glicoproteínas modificadas, tais como aquelas ensinadas na publicação de pedido de patente n° US60/344.169 e WO 03/056914 (GlicoFi, Inc.) ou em WO 2004/057002 e WO 2004/024927 (Greenovation).
[0210] Os exemplos adicionais de publicações relacionadas a variantes de anticorpo “defucosiladas” ou “deficientes de fucose” incluem: WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2002/0164328; US 2004/0109865; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239 a 1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Os exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533 a 545 (1986); pedido de patente US2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no exemplo 11), e linhagens celulares de exclusão, tal como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO de exclusão (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680 a 688 (2006); e WO2003/085107).
[0211] Em uma realização particular, os anticorpos antiFAP da invenção possuem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados na região Fc. Os oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados podem ser híbridos ou complexos. Especificamente, os métodos da presente invenção podem ser usados para produzir anticorpos antiFAP em que pelo menos cerca de 10% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 15%, mais especificamente pelo menos cerca de 20% a cerca de 25%, e mais especificamente pelo menos cerca de 30% a cerca de 35% dos oligossacarídeos na região Fc da molécula de ligação de antígeno são bisseccionados e não fucosilados. Os anticorpos antiFAP da presente invenção também podem compreender uma região Fc em que pelo menos cerca de 10% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 15%, mais especificamente pelo menos cerca de 20% a cerca de 25%, e mais especificamente pelo menos cerca de 30% a cerca de 35% dos oligossacarídeos na região Fc do anticorpo são bisseccionados, híbridos e não fucosilados.
[0212] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir a glicosilação do anticorpo. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada pela alteração da sequência de aminoácido de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação seja criado ou removido.
[0213] As variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo fixado à região Fc também são fornecidas. Taus variantes de anticorpo podem ter função de CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0214] Os aumentos em ADCC ou outras funções efetoras dos anticorpos antiFAP da presente invenção também podem ser alcançados através do aumento da afinidade da molécula de ligação de antígeno com FAP, por exemplo, por maturação por afinidade ou outros métodos de aprimoramento de afinidade (consulte, Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815 a 2823), ou por modificações de aminoácido na região Fc conforme descrito abaixo. As combinações dessas abordagens são também abrangidas pela presente invenção.
c) VARIANTES DE REGIÃO FC
[0215] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácido podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando por meio disso uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequencia de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.
[0216] Em certas realizações, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possuem algumas, mas não todas as funções efetoras, que tornam isso um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivoé importante, ainda certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Os ensaio de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação a receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo carece de ligação FcyR (por conseguinte, carece de atividade de ADCC), mas retém capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FCYRIII, enquanto que os monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457 a 492 (1991). Os exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente n° US5.500.362 (consulte, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059 a 7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499 a 1502 (1985); US5.821.337 (consulte Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351 a 1361 (1987)). Alternativamente, os métodos não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA, EUA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96® (Promega, Madison, WI, EUA). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativa adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652 a 656 (1998). Os ensaio de ligação de C1q também podem ser executados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, por conseguinte, carece de atividade de CDC. Consulte, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser executado (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045 a 1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). As determinações de ligação FcRn e libertação/meia-vida in vivo também podem ser executadas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759 a 1769 (2006)).
[0217] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos de região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente n° US6.737.056). Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais de posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante de Fc “DANA” com substituição de resíduos 265 e 297 para alanina (patente n° US7.332.581).
[0218] Certas variantes de anticorpo com ligação diminuída ou aprimorada a FcRs são descritas. (Consulte, por exemplo, patente n° US6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591 a 6604 (2001).)
[0219] Em certas realizações, um variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácido que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições em posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).
[0220] Em algumas realizações, as alterações são feitas na região Fc que resulta em ligação C1q alterada (isto é, aprimorada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na patente US6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178 a 4184 (2000).
[0221] Os anticorpos com meias-vida aumentadas e ligação aprimorada com o receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nisso que aprimoram a ligação da região Fc com FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos de região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição de resíduo de região Fc 434 (patente n° US7.371.826).
[0222] Para exemplos adicionais relacionados às variantes de região Fc consulte também os pedidos de patente n° US60/439.498; US60/456.041; US60/514.549; ou WO 2004/063351 (variantes de região Fc com afinidade de ligação aumentada devido à modificação de aminoácido); ou pedido de patente n° US10/672.280 ou WO 2004/099249 (variantes Fc com ligação alterada a FCYR devido à modificação de aminoácido), Duncan &Winter, Nature322:738 a 40 (1988); patente n° US5.648.260; patente n° US5.624.821; e WO 94/29351.
D) VARIANTES DE ANTICORPO PROJETADAS COM CISTEÍNA
[0223] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos projetados com cisteína, por exemplo, “tioMAbs,” em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituído por resíduos de cisteína. Em realizações particulares, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Através da substituição desse resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são, por meio disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo para outras porções, tais como porções de fármaco ou porções de fármaco-ligante, para criar um conjugado de anticorpo, conforme descrito adicionalmente na presente invenção. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (Numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Os anticorpos projetados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na patente n° US7.521.541.
E) DERIVADOS DE ANTICORPO
[0224] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As porções adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não são limitadas a, polímeros solúveis em água. Os exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de anidreto de etileno/maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno oxide/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero for fixado, isso pode ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou o tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações incluindo, mas não se limitando a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia em condições definidas, etc.
[0225] Em uma outra realização, os conjugados de um anticorpo e uma porção não proteinácea que pode ser seletivamente aquecido por exposição à radiação são fornecidos. Em uma realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600 a 11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas que aquecem a porção não proteinácea para uma temperatura em que as células próximas à porção não proteinácea do são exterminadas.
B. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES
[0226] Os anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos e composições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na patente n° US4.816.567. Em uma realização, o polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo antiFAP descrito na presente invenção é fornecido. Tal polinucleotídeo pode codificar uma sequência de aminoácido que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácido que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em uma realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de clonagem ou vetores de expressão) que compreendem tal polinucleotídeo são fornecidos. Em uma realização adicional, uma célula hospedeira que compreende tal polinucleotídeo ou tal vetor é fornecida. Em tal realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácido que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, um vetor policistrônico), ou (2) um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido que compreende a VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente, uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula de rim de hamster bebê (BHK) ou uma célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em uma realização, u método de produção de um anticorpo antiFAP é fornecido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, em condições adequadas para expressão do anticorpo, e opcionalmente recuperar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[0227] Para produção recombinante de um anticorpo antiFAP, um ou mais polinucleotídeos que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para clonar e/ou expressar adicionalmente em uma célula hospedeira. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles elementos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contêm a sequência de codificação de um anticorpo antiFAP junto com sinais de controle transcricionais/translacionais apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. Consulte, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989).
[0228] Em uma realização, um ou diversos polinucleotídeos que codificam um anticorpo antiFAP podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulada. Os sistemas de expressão regulada adequados incluem, mas não são limitados a, um sistema de expressão regulada por tetraciclina, um sistema de expressão induzível por ecdisona, um sistema de expressão de comutação lac, um sistema de expressão induzível por glicocorticoide, um sistema promotor induzível por temperatura, e um sistema de expressão induzível por metal de metalotioneina. Se diversos polinucleotídeos diferentes que codificam um anticorpo da presente invenção forem compreendidos dentro do sistema de célula hospedeira sistema, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado.
[0229] As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar os vetores que codificam anticorpo incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, as patentes n° US5.648.237, US5.789.199, e US5.840.523. (Consulte também Charlton, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245 a 254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.) Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[0230] Além dos procariotas, os micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas rotas de glicosilação foram “humanizadas,” resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou completamente humano. Consulte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409 a 1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210 a 215 (2006). Tais sistemas de expressão são também ensinados no pedido de patente n° US60/344.169 e WO 03/056914 (métodos para produzir glicoproteína do tipo humano em uma célula eucariótica hospedeira não humana).
[0231] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Os exemplo de células invertebradas incluem células de planta e inseto. Diversas cepas bacilovirais foram identificadas, as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente, para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[0232] As culturas de célula de planta também podem ser utilizadas como hospedeiras. Consulte, por exemplo, as patentes números US5.959.177, US6.040.498, US6.420.548, US7.125.978, e US6.417.429 (que descreve tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas).
[0233] As células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, as linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de hospedeiras de linhagem de célula de mamífero são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293T conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243 a 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK); células de fígado de búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44 a 68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras hospedeiras de linhagem de célula de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tal como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma análise de certas hospedeiras de linhagem de célula de mamífero adequadas para produção de anticorpo, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, EUA), páginas 255 a 268 (2003).
[0234] A expressão adequada é geralmente preferencial para expressão transiente, pois alcança tipicamente resultados mais reprodutíveis e também é mais passível à produção em grande escala; entretanto, é pertinente ao versado na técnica determinar se a expressão transiente é melhor para uma situação particular.
[0235] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um método para modificar o perfil de glicosilação dos anticorpos antiFAP da presente invenção que são produzidos por uma célula hospedeira, que compreende expressar na dita célula hospedeira um ou mais polinucleotídeos que codificam um anticorpo antiFAP e um ou mais polinucleotídeos que codificam uma polipeptídeo com uma atividade de glicosiltransferase, ou um vetor que compreende tais polinucleotídeos. Geralmente, qualquer tipo de linhagem celular cultivada, incluindo as linhagens celulares discutidas acima, pode ser usado para gerar as linhagens celulares para a produção de anticorpos antiFAP com padrão de glicosilação alterado. As linhagens celulares preferenciais incluem células CHO, células BHK, células SP2, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, e outras células de mamíferos. Os polipeptídeos com atividade de glicosiltransferase incluem β(1,4)-N- acetilglicosaminiltransferase III (GnTIII), α-manosidase II (ManII), β(1,4)- galactosiltransferase (GalT), β(1,2)-N-acetilglicosaminiltransferase I (GnTI), e β(1,2)-N-acetilglicosaminiltransferase II (GnTII). Em uma realização, uma combinação de polinucleotídeos que codificam os polinucleotídeos com atividade de glicosiltransferase é expressa na célula hospedeira (por exemplo, GnTIII e Man II). Do mesmo modo, o método também abrange a expressão de um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo antiFAP em uma célula hospedeira em que um gene glicosiltransferase foi interrompido ou de outro modo desativado (por exemplo, uma célula hospedeira em que a atividade do gene que codifica fucosiltransferase de núcleo α1,6 foi excluída). Em uma realização particular, os anticorpos antiFAP da presente invenção podem ser produzidos em uma célula hospedeira que expressa adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de GnTIII para modificar o padrão de glicosilação dos ditos anticorpos. Em uma realização específica, o polipeptídeo que tem atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi. Em uma outra realização particular, a expressão do anticorpo antiFAP da presente invenção em uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de GnTIII resulta em anticorpos antiFAP com afinidade de ligação a receptor Fc aumentada e/ou função efetora aumentada. Consequentemente, em uma realização, a presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira que compreende (a) um ou mais polinucleotídeos isolados que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo que tem atividade de GnTIII; e (b) um ou mais polinucleotídeos isolados que codifica um anticorpo antiFAP da presente invenção. Em uma realização particular, o polipeptídeo que tem atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio catalítico de GnTIII e o domínio de localização de Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo. Particularmente, o dito domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de Golgi de manosidase II. Os métodos para gerar tais polipeptídeos de fusão e com o uso dos mesmos para produzir anticorpos com função efetora aumentadas são revelados em WO2004/065540, pedido de patente provisório n° US60/495.142 e publicação de pedido de patente n° US2004/0241817, cujos conteúdos são expressamente incorporados na presente invenção a título de referência. Em uma outra realização, a célula hospedeira compreende adicionalmente um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo que tem atividade de manosidase II (ManII). Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos, como os polinucleotídeos que codificam o anticorpo antiFAP, podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulada. Tais sistemas são bem conhecidos na técnica, e incluem os sistemas discutidos acima.
[0236] As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação do anticorpo antiFAP e/ou a sequência de codificação de polipeptídeos que tem atividade de glicosiltransferase, e que expressam os produtos gênicos biologicamente ativos podem ser identificados, por exemplo, por hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA; a presença ou ausência das funções de gene "marcador"; avaliar o nível de transcrição conforme medido pela expressão dos respectivos transcritos de mRNA na célula hospedeira; ou detecção do produto gênico conforme medido pelo imunoensaio ou por sua atividade biológica - os métodos são bem conhecidos na técnica. A atividade de GnTIII ou Man II pode ser detectada, por exemplo, através do emprego de um lectina que se liga aos produtos biossintéticos de GnTIII ou ManII, respectivamente. Um exemplo para tal lectina é a lectina E4-PHA que se liga preferencialmente a oligossacarídeos que contêm bissecção de GlcNAc. Os produtos biossintéticos (isto é, estruturas de oligossacarídeo específicas) de polipeptídeos que têm GnTIII ou atividade de ManII também podem ser detectados por análise espectrométrica de massa de oligossacarídeos liberados de glicoproteínas produzidas por células que expressam os ditos polipeptídeos. Alternativamente, um ensaio funcional que mede a ligação a receptor Fc aumentada ou função efetora aumentada mediada por anticorpos produzidos pelas células projetadas com o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de GnTIII pode ser usado.
[0237] A presente invenção também é direcionada a um método para produzir um anticorpo antiFAP que tem oligossacarídeos modificados, que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira projetada para expressar pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de glicosiltransferase em condições que permitem a produção de um anticorpo antiFAP de acordo com a presente invenção, em que o dito polipeptídeo que tem atividade de glicosiltransferase é expresso em uma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fc do dito anticorpo antiFAP produzido pela dita célula hospedeira; e (b) isolar o dito anticorpo antiFAP. Em uma realização, o polipeptídeo que tem atividade de glicosiltransferase é GnTIII. Em uma outra realização, existem dois polipeptídeos que têm atividade de glicosiltransferase. Em uma realização particular, os dois peptídeos que têm atividade de glicosiltransferase são GnTIII e ManII. Em uma outra realização, o polipeptídeo que tem atividade de glicosiltransferase é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio catalítico de GnTIII. Em uma realização mais específica, o polipeptídeo de fusão compreende adicionalmente o domínio de localização de Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi. Particularmente, o domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de manosidase II ou GnTI, com máxima particularidade o domínio de localização de manosidase II. Alternativamente, o domínio de localização de Golgi é selecionado a partir do grupo que consiste em: domínio de localização de manosidase I, domínio de localização de GnTII e domínio de localização de fucosiltransferase de núcleo α1,6.
[0238] Em uma realização particular, o anticorpo antiFAP modificado produzido pela célula hospedeira ou método descrito acima tem uma região constante de IgG ou um fragmento do mesmo que compreende a região Fc. Em uma outra realização particular, o anticorpo antiFAP é um anticorpo humanizado ou humano ou um fragmento do mesmo que compreende uma região Fc.
[0239] O anticorpo antiFAP com glicosilação alterada produzido pela célula hospedeira ou método descrito acima exibe tipicamente afinidade de ligação a receptor Fc aumentada e/ou função efetora aumentada como um resultado da modificação da célula hospedeira (por exemplo, pela expressão de um gene de glicosiltransferase). De preferência, a afinidade de ligação a receptor Fc aumentada é aumentada em ligação para um receptor FCY de ativação, com máxima preferência, o receptor FcYRIIIa. A função efetora aumentada é de preferência um aumento em um ou mais dos seguintes: citotoxicidade celular dependente de anticorpo aumentada, fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, absorção de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células que apresentam antígeno, citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada, ligação aumentada a células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a células polimorfonucleares (PMNCs), ligação aumentada a monócitos, reticulação aumentada de anticorpos ligados a alvo, apoptose de indução de sinalização direta aumentada, maturação de célula dendrítica aumentada e iniciação de célula T aumentada.
C. ENSAIOS
[0240] Os anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção podem ser identificados, triados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS
[0241] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado em relação a sua atividade ligação de antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos tal como ELISA, Western blot, etc.
[0242] Em um outro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete por um outro anticorpo antiFAP específico para ligação à FAP. Em certas realizações, tal anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou de conformação) que é ligado pelo dito outro anticorpo antiFAP específico. Os métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” em Methods in Molecular Biology volume 66 (Humana Press, Totowa, NJ, EUA).
[0243] Em um ensaio de competição exemplificativo, a FAP imobiliza é incubada em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga à FAP (por exemplo, o anticorpo 3F2 descrito nos Exemplos) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado em relação a sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para ligação à FAP. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, a FAP imobilizada é incubada em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação em condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo à FAP, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcação associada à FAP imobilizada é medida. Se a quantidade de marcação associada à FAP imobilizada for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então, isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação à FAP. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. ENSAIOS DE ATIVIDADE
[0244] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos antiFAP dos mesmos que têm atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, lise de células alvejadas, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ou indução de apoptose. Os anticorpos que têm tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são fornecidos.
[0245] Em certas realizações, um anticorpo da invenção é testado em relação a tal atividade biológica. Os ensaios exemplificativos para testar ADCC são descritos na presente invenção anteriormente (consulte sob “Definições”: “anticorpo que tem ADCC aumentada”) e no Exemplo 11. Os ensaios para detectar lise celular (por exemplo, por medição de liberação de LDH) ou apoptose (por exemplo, com o uso do ensaio TUNEL) são bem conhecidos na técnica. Os ensaios para medir ADCC ou CDC são também descritos em WO 2004/065540 (consulte o Exemplo 1 na presente invenção), cujo conteúdo é incorporado na presente invenção a título de referência.
D. ANTICORPOS CONJUGADOS
[0246] A invenção também fornece conjugados que compreendem um anticorpo antiFAP na presente invenção conjugados para um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes ou fármacos quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas de proteína, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isótopos radioativos.
[0247] Em uma realização, em um conjugado de fármaco- anticorpo (ADC) um anticorpo é conjugado para um ou mais fármacos, incluindo, mas não se limitando a, um maytansinoide (consulte a patente n° US5.208.020, US5.416.064 e a patente europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina tal como porções de fármaco de monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (consulte as patentes números US5.635.483, US5.780.588 e US7.498.298); uma dolastatina; uma caliceamicina ou derivado da mesma (consulte as patentes números US5.712.374, US5.714.586, US5.739.116, US5.767.285, US5.770.701, US5.770.710, US5.773.001, e US5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336 a 3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (consulte Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477 a 523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358 a 362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717 a 721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829 a 834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529 a 1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336 a 4343 (2002); e patente n° US6,630,579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; a tricoteceno; e CC1065.
[0248] Em uma outra realização, um conjugado de anticorpo compreende um anticorpo conforme descrito na presente invenção conjugado para uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento do mesmo, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A de difteria A, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas americanas Phytolaca (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica carantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[0249] Em uma outra realização, um conjugado de anticorpo compreende um anticorpo conforme descrito na presente invenção conjugado para um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos é disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, isso pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou uma marcação de giro para imageamento de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecido como imageamento de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio- 111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0250] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-di-isocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapentacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplificativo para conjugação de radionucleotídeo para o anticorpo. Consulte WO94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante instável de ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante que contém bissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52:127 a 131 (1992); patente n° US5.208.020) pode ser usado.
[0251] Os conjugados de anticorpo na presente invenção expressamente contemplam, mas não são limitados a tais conjugados preparados com reagentes reticuladores incluindo, mas não se limita a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfone)benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
E. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO
[0252] Em certas realizações, qualquer um dos anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção é útil para detectar a presença de FAP em uma amostra biológica. O termo “detectar” conforme usado na presente invenção abrange detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas realizações, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tais como células ou tecidos do cérebro, seio, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, próstata, musculoesqueletal, pele, intestino delgado, estômago ou útero, incluindo também tumores de células ou tecidos desses órgãos.
[0253] Em uma realização, um anticorpo antiFAP para uso em um método de diagnóstico ou detecção é fornecido. Em um aspecto adicional, um método para detectar a presença de FAP em uma amostra biológica é fornecido. Em certas realizações, o método compreende colocar em contato a amostra biológica, opcionalmente com uma amostra de controle, com um anticorpo antiFAP conforme descrito na presente invenção em condições permissivas para ligação do anticorpo antiFAP à FAP, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo antiFAP e FAP. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma realização, um anticorpo antiFAP é usado para selecionar sujeitos elegíveis para terapia com um anticorpo antiFAP, por exemplo, em que FAP é um biomarcador para seleção de pacientes.
[0254] Os transtornos exemplificativos que podem ser diagnosticados com o uso de um anticorpo da invenção incluem transtornos associados à expressão de FAP, tais como câncer e certas condições inflamatórias.
[0255] Em um aspecto, é fornecido um método de diagnóstico de doença em um sujeito, em que o dito método compreende administrar ao dito sujeito uma quantidade eficaz de um agente de diagnóstico, em que o dito agente de diagnóstico compreende um anticorpo antiFAP conforme descrito na presente invenção e uma marcação, tipicamente um agente de imageamento, que permite a detecção de um complexo do dito agente de diagnóstico e FAP.
[0256] Em certas realizações, os anticorpos antiFAP marcados são fornecidos. As marcações incluem, mas não são limitadas a, marcações ou porções que são detectadas diretamente (tais como marcações fluorescentes, cromofóricas, com densidade de elétron, quimioluminescentes e radioativas), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. As marcações exemplificativas incluem, mas não são limitados a, radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, e 131I, fluoróforos tais como quelantes ou fluoresceína de terra rara e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbelliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacterianas (patente n° US4.737.456), luciferina, 2,3-di-idroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, acoplada a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de matriz tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, marcações de giro, marcações de bacteriófago, radicais livres adequados e similares.
F. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0257] As formulações farmacêuticas de um anticorpo antiFAP conforme descrito na presente invenção são preparadas através da mistura de tal anticorpo que tem o grau desejado de pureza com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilziadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não são limitados a: tampões tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, butila ou álcool benzílico; alquil parabenos tal como metila ou propila parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menor que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons de formação de sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos tal como polietileno glicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos da presente invenção incluem adicionalmente agentes de dispersão de fármaco tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas-neutras solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tal como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplificativas e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas publicações de patente n° US2005/0260186 e US2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com um ou mais glicosaminoglicanoases adicionais tais como condroitinases.
[0258] As formulações de anticorpo liofilizado exemplificativas são descritas na patente n° US6.267.958. As formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na patente n° US6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluem um tampão de histidina- acetato.
[0259] A formulação da presente invenção também pode conter mais de um ingrediente ativos conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência, aqueles com atividades de complementaridade que não afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, se a doença a ser tratada for câncer, pode ser desejável fornecer adicionalmente um ou mais agentes anticâncer, por exemplo, um agente quimioterápico, um inibidor de proliferação de célula tumoral, ou um ativador de apoptose de célula tumoral. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0260] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, albumina, microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0261] As preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[0262] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[0263] As moléculas descritas na presente invenção podem estar em uma variedade de formas de dosagem que incluem, mas não são limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, tabletes, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas poliméricas ou microvesículas, lipossomas e soluções injetáveis ou infusíveis. A forma preferencial depende do modo de administração e da aplicação terapêutica, mas será tipicamente soluções injetáveis ou infusíveis.
G. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS
[0264] Qualquer um dos anticorpos antiFAP ou formulações farmacêuticas que compreendem os anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção pode ser usado em métodos terapêuticos.
[0265] Os anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção podem ser usados para tratar doenças caracterizadas pela expressão de FAP, particularmente, por expressão anormal (por exemplo, sobrexpressão, ou expressão em um padrão diferente na célula) de FAP em comparação a tecido normal do mesmo tipo de célula. A FAP é anormalmente expressa (por exemplo, sobrexpressa) em muitos tumores humanos em comparação a tecido não tumoral do mesmo tipo de célula. Dessa forma, os anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção são particularmente úteis na prevenção de formação de tumor, erradicação de tumores e inibição de crescimento tumoral ou metástase. Os anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção podem ser usados para tratar qualquer tumor que expressa FAP. As malignidades particulares que podem ser tratadas pelos anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção incluem, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer hepático, câncer renal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer cerebral, câncer do músculo esqueletal.
[0266] Os anticorpos antiFAP revelados na presente invenção podem ser usados para inibir crescimento tumoral ou células tumorais de extermínio. Por exemplo, os anticorpos antiFAP podem se ligar à FAP que está na superfície de membrana ou célula de células cancerígenas (células tumorais ou células do estroma tumoral) e obtêm, por exemplo, ADCC ou outro extermínio mediado por efetor das células cancerígenas.
[0267] Os anticorpos antiFAP podem alternativamente ser usados a fim de bloquear a função de FAP, particularmente através da interferência física com sua ligação de um outro composto. Por exemplo, as moléculas de ligação de antígeno pode ser usadas para bloquear a atividade enzimática de FAP (por exemplo, atividade de serina peptidase, gelatinase, colagenase), degradação de ECM mediada por FAP, e/ou migração ou invasão celular mediada por FAP.
[0268] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo antiFAP para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, um anticorpo antiFAP para uso na tratamento de uma doença caracterizada pela expressão de FAP é fornecido. Em certas realizações, um anticorpo antiFAP para uso em um método de tratamento é fornecido. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo antiFAP para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença caracterizada pela expressão de FAP, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo antiFAP. Em tal realização, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Em realizações adicionais, a invenção fornece um anticorpo antiFAP para uso na indução de lise de uma célula. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo antiFAP para uso em um método de indução de lise de uma célula em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo antiFAP para induzir lise de uma célula. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência um humano. Uma “doença caracterizada pela expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência câncer, com máxima preferência, um câncer selecionado a partir do grupo de câncer pulmonar, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pescoço e cabeça, câncer de pele, câncer hepático, câncer renal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer cerebral, câncer do músculo esqueletal. Uma “célula” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência, uma célula presente em um tumor, tal como uma célula tumoral ou uma célula do estroma tumoral, com máxima preferência, uma célula tumoral. A “expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima de preferência, é expressão anormal, tal como sobrexpressão ou expressão em um padrão diferente na célula, em comparação a tecido normal do mesmo tipo de célula.
[0269] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo antiFAP na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento é para tratamento de uma doença caracterizada pela expressão de FAP. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença caracterizada pela expressão de FAP que compreende administrar a um indivíduo que tem uma doença caracterizada pela expressão de FAP uma quantidade eficaz do medicamento. Em tal realização, o método adicionalmente compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Em uma realização adicional, o medicamento é para induzir lise de uma célula. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de indução de lise de uma célula em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para induzir lise de uma célula. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência um humano. Uma “doença caracterizada pela expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência, câncer, com máxima preferência, um câncer selecionado a partir do grupo de câncer pulmonar, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pescoço e cabeça, câncer de pele, câncer hepático, câncer renal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer cerebral, câncer do músculo esqueletal. Uma “célula” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência uma célula presente em um tumor, tal como uma célula tumoral ou uma célula do estroma tumoral, com máxima preferência, uma célula tumoral. A “expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima de preferência é expressão anormal, tal como sobrexpressão ou expressão em um padrão diferente na célula, em comparação ao tecido normal do mesmo tipo de célula.
[0270] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar uma doença caracterizada pela expressão de FAP. Em uma realização, o método compreende administrar a um indivíduo que tem tal doença caracterizada pela expressão de FAP uma quantidade eficaz de um anticorpo antiFAP. Em tal realização, o método adicionalmente compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, conforme descrito abaixo. Em uma realização adicional, a invenção fornece um método para induzir a lise de uma célula em um indivíduo. Em uma realização, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antiFAP para induzir a lise de uma célula. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano. Uma “doença caracterizada pela expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência, câncer, com máxima preferência, um câncer selecionado a partir do grupo de câncer pulmonar, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pescoço e cabeça, câncer de pele, câncer hepático, câncer renal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer cerebral, câncer do músculo esqueletal. Uma “célula” de acordo com qualquer uma das realizações acima é de preferência, uma célula presente em um tumor, tal como uma célula tumoral ou uma célula do estroma tumoral, com máxima preferência, uma célula tumoral. A “expressão de FAP” de acordo com qualquer uma das realizações acima de preferência é expressão anormal, tal como sobrexpressão ou expressão em um padrão diferente na célula, em comparação a tecido normal do mesmo tipo de célula.
[0271] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção e um ou mais veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos antiFAP fornecidos na presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[0272] Os anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, por exemplo, um agente quimioterápico, um inibidor de proliferação de célula tumoral, ou um ativador de apoptose de célula tumoral.
[0273] Tais terapias de combinação observadas acima abrangem administração combinada (em que dois ou mais agente terapêuticos são incluídos na mesma ou em formulações separadas), e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com terapia de radiação.
[0274] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. A administração parenteral inclui administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração intravenosa é tipicamente preferencial. Entretanto, espera-se que a rota intraperitoneal seja particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores de colorretal. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários cronogramas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas em vários instantes de tempo, administração de bolo e infusão de pulso são contemplados na presente invenção.
[0275] Os anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados de uma maneira consistente com boa prática médica. Os fatores para consideração nesse contexto incluem o transtorno particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do transtorno, o sítio de entrega do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos por médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o transtorno em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de transtorno ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito na presente invenção, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas na presente invenção, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que é empírica/clinicamente determinada como apropriada.
[0276] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) irá depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo e a discrição do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou por uma série de tratamento. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1mg/kg a 10mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por um ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente sustentado até que uma supressão desejada dos sintomas de doença ocorra. Uma dosagem exemplificativa do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) pode ser administrada ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, cada semana ou cada três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de carregamento superior inicial, seguida por uma ou mais doses inferiores pode ser administrada. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[0277] Deve ficar entendido que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um conjugado de anticorpo da invenção no lugar de ou além de um anticorpo antiFAP.
H. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0278] Em um outro aspecto da invenção, um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos transtornos descrito acima é fornecido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e UMA marcação ou inserto de pacote em ou associada ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é independente ou combinada com uma outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco que tem um batente perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. A marcação ou inserto de pacote indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida nisso, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida nisso, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode compreender adicionalmente um inserto de pacote que indica que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Isso pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0279] Deve ficar entendido que qualquer um dos artigos de fabricação acima pode incluir um conjugado de anticorpo da invenção no lugar ou além de um anticorpo antiFAP.
III. EXEMPLOS
[0280] Os seguintes são exemplos de métodos e composições da invenção. Deve ficar entendido que várias outras realizações podem ser colocadas em prática, em vista da descrição geral fornecida acima.
EXEMPLO 1 TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
[0281] Os métodos padrões foram usados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de filamento duplo. Em alguns casos, os segmentos de gene desejados foram preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos PCR por síntese de gene automatizada. Os segmentes de gene que são flanqueados por sítios de clivagem de endonuclease de redução singular foram clonados em plasmídeos pGA18 (ampR). O DNA de plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e concentração determinada por espectroscopia de UV. A sequência de DNA dos fragmentos de gene subclonados foi confirmada por sequenciamento de DNA. Os segmentos de gene foram designados com sítios de restrição adequados para permitir a subclonagem em respectivos vetores de expressão.
[0282] A informação geral a respeito da sequência de nucleotídeos de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina humana é dada em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Publicação NIH n° 91-3242. Para expressão, todos os construtos contiveram uma sequência de DNA de extremidade 5’ que codifica um peptídeo líder que alveja proteínas para secreção em células eucarióticas. SEQ ID NOs 323-331 geram peptídeos líderes exemplificativos e sequências de polinucleotídeo que codificam os mesmos.
PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS (GLICOPROJETADOS)
[0283] As sequências de DNA completas de cadeia leve e pesada de anticorpo foram obtidas através da subclonagem das regiões variáveis no quadro com a cadeia pesada constante ou a cadeia leve constante pré-inserida no respectivo vetor de expressão de mamífero recipiente. A expressão de anticorpo foi acionada por um promotor de MPSV e o vetor porta uma sequência de sinal poliA sintética na extremidade 3’ da CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP.
[0284] Os anticorpos são produzidos por cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de anticorpo de mamífero com o uso de uma transfecção de fosfato de cálcio. As células HEK293-EBNA que crescem exponencialmente células são transfectadas pelo método de fosfato de cálcio. Alternativamente, as células HEK293 que crescem em suspensão são transfectadas por polietilenimina. Para a produção de anticorpo não glicoprojetado não modificado, as células são transfectadas apenas com vetores de expressão de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo em uma razão 1:1.
[0285] Para a produção do anticorpo glicoprojetado, as células são cotransfectadas com dois plasmídeos adicionais, um para uma expressão de polipetídeo GnTIII de fusão (um vetor de expressão GnT-III), e um para expressão de manosidase II (um vetor de expressão de manosidase II de Golgi) a uma razão de 4:4:1:1, respectivamente. As células são crescidas como culturas de monocamada aderente em frascos T com o uso de meio de cultura DMEM suplementado com 10% de FCS, e são transfectadas quanto estão entre 50 e 80% de confluência. Para a transfecção de um frasco T150, 15 milhões de células são consultadas 24 horas antes da em meio de cultura DMEM de 25 ml suplementado com FCS (a 10% V/V final), e as células são colocadas a 37°C em um incubador com uma atmosfera de 5% de CO2 de um dia para o outro. Para cada frasco T150 a ser transfectado, uma solução de DNA, CaCl2 e água é preparada através da mistura de 94 μg de DNA de vetor de plasmídeo total dividida igualmente entre os vetores de expressão de cadeia pesada e leve, água para um volume final de 469 μl e 469 μl de uma solução de CaCl2 a 1M. À essa solução, 938 μl de um HEPES a 50 mM, NaCl a 280 mM, solução de Na2HPO4 a 1,5 mM com pH 7,05 são adicionados, misturados imediatamente por 10 s e deixados permanecer em temperatura ambiente por 20 s. A suspensão é diluída com 10 ml de DMEM suplementado com 2% de FCS, e adicionado ao T150 no lugar do meio existente. Então, 13 ml adicionais de meio de transfecção são adicionados. As células são incubadas a 37°C, 5% de CO2 por cerca de 17 a 20 horas, então, o meio é substituído por 25 ml de DMEM, 10% de FCS. O meio de cultura condicionado é colhido por aproximadamente 7 dias após a troca de meios por centrifugação por 15 min. a 210 x g, a solução é estéril, filtrada (filtro de 0,22 um) e azida de sódio em uma concentração final de 0,01 % p/v é adicionada e mantida a 4°C.
[0286] Os anticorpos não fucosilados glicoprojetados ou secretados do tipo selvagem são purificados a partir de sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de cromatografia de Proteína A (HiTrap ProtA, GE Healthcare). Em suma, a coluna foi equilibrada com fosfato de sódio a 20 mM, citrato de sódio a 20 mM pH 7,5, o sobrenadante celular foi carregado, seguido por uma primeira lavagem com fosfato de sódio a 20 mM, citrato de sódio a 20 mM pH 7,5, e uma segunda lavagem com fosfato de sódio a 13,3 mM, citrato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 500 mM pH 5,45. Os anticorpos foram eluídos com citrato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 100 mM, glicina a 100 mM pH 3. Em uma etapa subsequente cromatográfica com exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), o tampão foi trocado para fosfato de potássio a 25 mM, cloreto de sódio a 125 mM, solução de glicina a 100 mM de pH 6,7 ou alternativamente cloreto de sódio a 140 mM, histidina a 20 mM, pH 6,0 e os anticorpos de IgG1 monoméricos puros foram coletados. Se requerido, uma etapa de cromatografia de troca de cátion adicional é incluída entre as duas etapas de purificação padrão.
[0287] A concentração de proteína de amostras de proteína purificadas é determinada através da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, com o uso do coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácido. A pureza e o peso molecular de anticorpos são analisados por SDS-PAGE na presença e ausência de um agente de redução (1,4-ditiotreitol a 5 mM) e manchamento com Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain da Invitrogen). O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, EUA) é usado de acordo com a instrução do fabricante (4 a 20% de géis Tris- Glicina ou 3-12% Bis-Tris). O teor agregado de amostras de anticorpo é analisado com o uso de uma coluna analítica de exclusão de tamanho Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Suécia) em MOPS a 2 mM, NaCl a 150 mM, 0,02% de NaN3, pH 7,3 com tampão a 25°C. A integridade da cadeia principal de aminoácido de cadeias pesadas e leves de anticorpo reduzida é verificada por espectrometria de massa NanoElectrospray Q-TOF após a remoção de N-glicanos por tratamento enzimático com Peptide-N Glicosidase F (Roche Molecular Biochemicals).
[0288] Os resultados da purificação e da análise dos anticorpos de IgG humana do tipo selvagem e glicoprojetados 28H1, 29B11, 3F2 e 4G8 são mostrados na Figuras 15 a 22. Os rendimentos são dados na seguinte Tabela:
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[0289] Os oligossacarídeos fixados à região Fc dos anticorpos são analisados por MALDI TOF-MS conforme descrito abaixo. Os oligossacarídeos são enzimaticamente liberados dos anticorpos por digestão de PNGaseF. A solução de digestão resultante que contém os oligossacarídeos liberados é preparada diretamente para análise MALDI TOF- MS ou é adicionalmente digerida com EndoH glicosidase antes da preparação de amostra para análise MALDI TOF-MS.
ANÁLISE DE GLICOESTRUTURA DE ANTICORPOS (GLICOPROJETADOS)
[0290] Para determinação das razões relativas de estruturas de oligossacarídeos que contêm fucose e não fucose (a-fucose), os glicanos liberados de material de anticorpo purificado são analisados por espectrometria de massa MALDI-Tof. A amostra de anticorpo (cerca de 50 μg) é incubada de um dia para o outro a 37°C com 5 mU de N-Glicosidase F (QAbio; PNGaseF: E-PNG01) em Tris a 2 mM, pH 7,0, a fim de liberar o oligossacarídeo da cadeia principal de proteína. Para desaminação de glicanos, o ácido acético a uma concentração final de 150 mM é adicionado e incubado por 1h a 37°C. Para análise por espectrometria de massa MALDI TOF, 2 μL da amostra são misturados no alvo MALDI com 2 μL de solução de matriz DHB (ácido 2,5-di- idroxibenzoico [Bruker Daltonics n°201346] dissolvida em 50 % de etanol/NaCl a 5 mM em 4 mg/ml) e analisada com o instrumento MALDI TOF Mass Spectrometer Autoflex II [Bruker Daltonics]. Rotineiramente, 50 a 300 disparos são registrados e somados para um único experimento. Os espectros obtidos são avaliados pelo software Flex Analysis (Bruker Daltonics) e as massas são determinadas para cada um dos picos detectados. Subsequentemente, os picos são atribuídos a estruturas de carboidrato que contêm fucose ou a-fucose (não fucose) através da comparação das massas calculadas e das massas teoricamente esperadas para as respectivas estruturas (por exemplo, complexo, híbrido e oligo ou manose alta, respectivamente, com e sem fucose).
[0291] Para determinação da razão de estruturas híbridas, as amostras de anticorpo são digeridas com N-Glicosidase F e Endo-Glicosidase H [QAbio; EndoH: E-EH02] concomitantemente. A N-Glicosidase F libera todas as estruturas de glicano N-ligadas (estruturas de complexo, híbridas e oligo e manose alta) da cadeia principal de proteína e a Endo-Glicosidase H cliva todos os glicanos do tipo híbrido adicionalmente entre os dois resíduos de N- acetilglicosamina (GlcNAc) na extremidade de redução do glicano. Essa digestão é subsequentemente tratada e analisada por espectrometria de massa MALDI TOF da mesma maneira conforme descrito acima apara a amostra digerida com N-Glicosidase F. Através da comparação do padrão da digestão de N-Glicosidase F e da digestão combinada de N-glicosidase F/Endo H, o grau de redução dos sinais de uma estrutura de carboidrato específica é usada para estimar o teor relativo de estruturas híbridas. A quantidade relativa de cada estrutura de carboidrato é calculada a partir da razão da altura de pico de uma estrutura individual e da soma das alturas de pico de todos os oligossacarídeos detectados. A quantidade de fucose é a porcentagem de estruturas que contêm fucose relacionadas a todas as estruturas de carboidrato identificadas na amostra tratada com N-Glicosidase F (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e oligo e manose alta, respectivamente) a quantidade de non-fucosilação é a porcentagem de estruturas que carecem de fucose relacionadas a todos os carboidratos identificados na amostra tratada com N- Glicosidase F (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e oligo e de manose alta, respectivamente).
[0292] Os graus de não fucosilação dos diferentes anticorpos antiFAP glicoprojetados e do tipo selvagem são dados na seguinte Tabela:
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EXEMPLO 2 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE FAB GENÉRICAS
[0293] As bibliotecas de anticorpo genéricas no formato Fab foram construídas com base em genes de linhagem de germe humano com o uso dos seguintes pareamentos de domínio V: Vk3_20 kapa cadeia leve com VH3_23 cadeia pesada para a biblioteca DP47-3 e Vk1_17 kapa cadeia leve com VH1_69 cadeia pesada para a biblioteca DP88-3. Consulte SEQ ID NOs 1 e 2.
[0294] Ambas as bibliotecas foram randomizadas em CDR3 da cadeia leve (L3) e CDR3 da cadeia pesada (H3) e foram montadas a partir de 3 fragmentos por biblioteca através da emenda por PCR de extensão de sobreposição (SOE). O Fragmento 1 compreende a extremidade 5’ do gene de anticorpo incluindo L3 randomizado, fragmento 2 é um fragmento constante central que vai de L3 a H3, enquanto que o fragmento 3 compreende H3 randomizada e a porção 3’ do gene de anticorpo.
[0295] As seguintes combinações de iniciador foram usadas para gerar fragmentos de biblioteca para for biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - LibL1b_new), fragmento 2 (MS63 - MS64), fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong). Consulte Tabela 3. As seguintes combinações de iniciador foram usadas para gerar biblioteca fragmentos para a biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3 - RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31 - RJH32) e fragmento 3 (LIB88_2 - fdseqlong). Consulte Tabela 4. TABELA 3.
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TABELA 4.
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[0296] O protocolo de PCR para a produção de fragmentos de biblioteca inclui: 5 minutos de desnaturação inicial a 94°C; 25 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C, e 1 minuto a 72°C; e alongamento terminal por 10 minutos a 72 °C. Para a PCR de montagem, as razões equimolares dos 3 fragmentos foram usadas como modelo. O protocolo DE PCR de montagem incluiu: 3 minutos de desnaturação inicial a 94°C; e 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 58°C, e 2 minutos a 72°C. Nesse estágio, a complementaridade de iniciadores para sequência fora dos fragmentos 1 a 3 foi adicionada e 20 ciclos adicionais foram executados antes de um alongamento terminal por 10 min. a 72 °C.
[0297] Após a montagem de quantidades suficientes de construtos Fab randomizados de comprimento total, os construtos Fab foram digeridos com NcoI/NotI para a biblioteca DP47-3 e com NcoI/NheI para a biblioteca DP88-3 ao lado de vetor de fagemídeo aceptor tratado de modo similar. Para a biblioteca DP47-3, 22,8 μg de biblioteca Fab foram ligados com 16,2 μg de vetor de fagemídeo. Para a biblioteca DP88-3, 30,6 μg de biblioteca Fab foram ligados com 30,6 μg de vetor de fagemídeo.
[0298] As ligações purificadas foram usadas para 68 transformações para a biblioteca DP47-3 e 64 transformações para a biblioteca DP88-3, respectivamente, para obter tamanhos de biblioteca finais de 4,2 x 1010 para DP47-3 e 3,3 x 109 para DP88-3. As partículas de fagemídeo que exibem as bibliotecas Fab foram resgatadas e purificadas por purificação PEG/NaCl a ser usada para seleções.
EXEMPLO 3 SELEÇÃO DE CLONES ANTIFAP (SELEÇÕES PRIMÁRIAS)
[0299] As seleções foram executadas contra o ectodomínio de Proteína Ativadora de Fibroblasto humana ou de camundongo (FAP) que foram clonadas a montante de uma polilisina e uma identificação 6xhis. Consulte SEQ ID NOs: 317 e 319. Antes das seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos a uma concentração de 10 μg/ml ou 5 μg/ml, dependendo da rodada de seleção. As seleções foram executadas de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de ~ 1012 partículas de fagemídeo de biblioteca DP47-3 a FAP imobilizada humana ou de camundongo por 2 horas; (ii) lavagem de imunotubos com o uso de 5 x 5ml PBS/Tween20 e 5 x 5ml PBS; (jjj) eluição de partículas de fago por adição de 1ml de TEA a 100mM (trietilamina) por 10 minutos e neutralização pela adição de 500 μl de Tris/HCl a 1M pH 7,4; e (iv) reinfecção de células TG1 de E. coli de fase log, infecção com fago auxiliar VCSM13 e precipitação de PEG/NaCl subsequente de partículas de fagemídeo a serem usadas em rodadas de seleção subsequentes.
[0300] As seleções foram executadas por três ou quatro rodadas com o uso de concentrações de antígeno decrescentes de FAP humana e em alguns casos com o uso FAP de camundongo a 5 μg/ml na rodada de seleção final. Os ligantes específicos foram definidos como sinais 5 vezes maiores que o anterior e foram identificados por ELISA. As placas NUNC maxisorp foram revestidas com 10 μg/ml de FAP humana ou de camundongo seguido pela adição de sobrenadantes bacterianos que contêm Fab e detecção de Fabs de ligação específica através de identificações Flag através do uso de um anticorpo secundário antiFlag/HRP.
[0301] Os clones positivos de ELISA foram expressos em bactérias como 1 ml de culturas em formato de 96 cavidades e os sobrenadantes foram submetidos a um experimento de triagem cinética com o uso de BIACORE T100. KD foi medido por Ressonância de Plásmon de Superfície com o uso de uma máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25°C com anticorpo de captura específico de fragmento F(ab’)2 anti-humano (Jackson ImmunoResearch n° 109-005-006) imobilizado por acoplamento de amina em chips CM5 e captura subsequente de Fabs de sobrenadante bacteriano ou de preparações de Fab purificadas. Em suma, os chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) foram ativados com N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida clorídrico (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo de captura específico de fragmento F(ab’)2 anti-humano foi diluído com acetato de sódio a 10 mM, pH 5,0 a 50 μg/ml antes da injeção a uma taxa de fluxo de 10 μl/minuto para alcançar aproximadamente até 10.000 unidades de resposta (RU) de anticorpo de captura acoplado. Após a injeção do anticorpo de captura, a etanolamina a 1 M foi injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, os Fabs de sobrenadante bacteriano ou os Fabs purificados foram injetados a uma taxa de fluxo de 10 μl/min. por 300 s e uma dissociação de 300 s para estabilização de linha de base de captura. Os níveis de captura estiveram na faixa de 100 a 500 RU. Em uma etapa subsequente, o analito de FAP humana ou FAP de camundongo foi injetado como uma única concentração ou como uma série de concentração (dependendo de afinidade de clone em uma faixa entre 100 nM e 250 pM) diluída em HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,05% de Tensoativo P20, pH 7,4) a 25°C a uma taxa de fluxo de 50 μl/min. O tempo de associação foi 120 ou 180 s, o tempo de dissociação foi 300 a 600 s. A superfície do chip do sensor é regenerada através da injeção de glicina pH 1,5 por 30 s a 90 μl/min. seguido por injeção de NaOH por 20s na mesma taxa de fluxo. As taxas de associação (kassociação) e as taxas de dissociação (kdissociação) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação simples Langmuir um a um (BIACORE ® T100 Evaluation Software ou Scrubber Software (BioLogic)) por ajuste simultâneo os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão kdissociação/kassociação.
EXEMPLO 4 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO POR AFINIDADE DE ANTIFAP
[0302] Três bibliotecas de maturação por afinidade foram construídas com base em anticorpos pré-selecionados a partir das seleções antiFAP primárias. Mais precisamente, foram baseadas em (i) clone de FAP anti-humano 2D9 (biblioteca a.m.FAP2D9) (consulte SEQ ID NOs: 229 e 231), (ii) clone de FAP anticamundongo 4B8 (biblioteca a.m.FAP4B8) (consulte SEQ ID NOs: 233 e 235) e (iii) clones de reação cruzada 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 e 17A11 (biblioteca a.m.FAPpool) (consulte SEQ ID NOs: 237 e 239 correspondentes às sequências de região variável de 7A1; SEQ ID NOs: 241 e 243 correspondentes às sequências de região variável de 13C2; SEQ ID NOs: 245 e 247 correspondentes às sequências de região variável de 13E8; SEQ ID NOs: 249 e 251 correspondentes às sequências de região variável de 14C10; e SEQ ID NOs: 253 e 255 correspondentes às sequências de região variável de 17A11).
[0303] Cada uma dessas bibliotecas consiste em duas sub- bibliotecas, randomizadas em CDR1 e CDR2 da cadeia leve (L1/L2) ou CDR1 e CDR2 da cadeia pesada (H1/H2), respectivamente. Essas sub-bibliotecas foram reunidas mediante a transformação. Cada uma dessas sub-bibliotecas foi construída por quatro etapas subsequentes de amplificação e montagem.
[0304] Para bibliotecas L1/L2, o protocolo de amplificação e montagem incluiu: (i) amplificação de fragmento 1 (LMB3 - DPK22_CDR1_rand_ba_opt) e fragmento 2 (DPK22_CDR1_fo - DPK22_Ck_BsiWI_ba); (ii) montagem de fragmentos 1 e 2 com o uso de iniciadores externos LMB3 e DPK22_Ck_BsiWI_ba para criar o modelo para o fragmento 3; (iii) amplificação de fragmento 3 (LMB3 - DPK22_CDR2_rand_ba) e fragmento 4 (DPK22_CDR2_fo - DPK22_Ck_BsWI_ba); e (iv) final montagem de fragmentos 3 e 4 com o uso dos mesmos iniciadores externos conforme acima. Consulte Tabela 5 para sequências de iniciador. TABELA 5
Figure img0009
[0305] negrito: 60% base original e 40% randomização como M
[0306] subscrito: 60% base original e 40% randomização como N
[0307] Para bibliotecas H1/H2, o protocolo de amplificação e montagem incluiu: (i) amplificação de fragmento 1 (RJH53 - DP47_CDR1_rand_ba_opt) e fragmento 2 (DP47_CDR1_fo - MS52); (ii) montagem de fragmentos 1 e 2 com o uso de iniciadores externos RJH53 e MS52 para criar o modelo para o fragmento 3; (iii) amplificação de fragmento 3 (RJH53 - DP47_CDR2_rand_ba) e fragmento 4 (DP47_CDR2_fo - MS52); e (iv) montagem final de fragmentos 3 e 4 com o uso dos mesmos iniciadores externos conforme acima. Consulte Tabela 6 for primer sequências. TABELA 6
Figure img0010
[0308] negrito: 60% base original e 40% randomização as M
[0309] subscrito: 60% base original e 40% randomização as N
[0310] Os produtos de montagem final foram digeridos com NcoI/BsiWI para sub-bibliotecas L1/L2 de a.m.FAP2D9 e a.m.FAP4B8, com MunI e NheI para sub-bibliotecas H1/H2 de a.m.FAP2D9 e a.m.FAP4B8 bem como com NcoI/BamHI para biblioteca L1/L2 de a.m.FAPpool e com BspEI/PstI para bibliotecas H1/H2 de a.m.FAPpool, respectivamente, junto com vetores aceptores tratados de modo similar com base em preparações de clones de plasmídeo 2D9, 4B8 ou uma mistura equimolar de clones 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 e 17A11, respectivamente. As seguintes quantidades de domínios V randomizados digeridos (parcial) e vetores aceptores digeridos foram ligadas para as respectivas bibliotecas (μg de domínio V/μg de vetor): a.m.FAP2D9 sub-biblioteca L1/L2 (5,7/21,5), a.m.FAP2D9 sub-biblioteca H1/H2 (4,1/15,5), a.m.FAP4B8 sub-biblioteca L1/L2 (6,5/24,5), a.m.FAP4B8 sub-biblioteca H1/H2 (5,7/21,5), a.m.FAPpool sub-biblioteca L1/L2 (4,4/20), a.m.FAPpool sub-biblioteca H1/H2 (3,4/15,5).
[0311] As ligações purificadas de sub-bibliotecas L1/L2 e H1/H2 foram reunidas e usadas para 60 transformações para cada uma das 3 bibliotecas de maturação por afinidade, para obter tamanhos de biblioteca finais de 6,2 x 109 para a.m.FAP2D9, 9,9 x 109 para a.m.FAP4B8 e 2,2 x l09para a.m.FAPpool.
[0312] As partículas de fagemídeo que exibem essas bibliotecas de Fab foram resgatadas e purificadas por purificação de PEG/NaCl a ser usada para seleções secundárias.
CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MATURAÇÃO POR AFINIDADE DE ANTIFAP ADICIONAIS (COM BASE EM CLONES3F2, 3D9, 4G8, 4B3 E 2C6)
[0313] Quatro bibliotecas de maturação por afinidade adicionais foram construídas com base em anticorpos de reação cruzada pré- selecionados a partir da primeira campanha de maturação por afinidade de anticorpos antiFAP, a saber clones 3F2, 3D9, 4G8, 4B3 e 2C6 (consulte SEQ ID NOs: 195 e 197 correspondentes às sequências de região variável de 3F2; SEQ ID NOs: 199 e 201 correspondentes às sequências de região variável de 3D9; SEQ ID NOs: 205 e 207 correspondentes às sequências de região variável de 4G8; SEQ ID NOs: 209 e 211 correspondentes às sequências de região variável de 4B3; SEQ ID NOs: 217 e 219 correspondentes às sequências de região variável de 2C6). Mais precisamente, as quatro bibliotecas foram baseada em 1) clones antiFAP 3F2, 4G8 e 4B3 (VH biblioteca, randomizada em CDRs 1 e 2 de cadeia pesada variável, isto é, biblioteca H1/H2), 2) clones antiFAP 3D9 e 2C6 (biblioteca VL, randomizada em CDRs 1 e 2 de cadeia leve variável, isto é, biblioteca L1/L2), 3) clone antiFAP 3F2 (biblioteca L3 com randomização suave em CDR3 de cadeia leve, isto é, biblioteca L3) e 4) clone antiFAP 3F2 (biblioteca H3 com randomização suave em CDR3 de cadeia pesada, isto é, biblioteca H3). As primeiras duas bibliotecas foram construídas exatamente da mesma maneira conforme esboçado para a primeira campanha de maturação por afinidade de anticorpos antiFAP, para as bibliotecas L1/L2 e H1/H2, respectivamente. Em contraste, para as bibliotecas de maturação por afinidade L3 e H3 com base em clone 3F2, dois novos iniciadores foram usados para introduzir randomização suave em L3 (AM_3F2_DPK22_L3_ba: CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC com bases sublinhadas sendo 60% e 40% de mistura N (mistura dos quatro nucleotídeos A, C, G e T)) e H3 (AM_3F2_DP47_H3_fo: GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TT T GGT GGT TTT A AC TACTGGGGCCAAGGAAC com bases sublinhadas sendo 60% e 40% mistura N, bases em itálico sendo 60% e 40% G, bem como bases sublinhadas em itálico sendo 60% e 40% mistura K (mistura dos dois nucleotídeos G e T)) do clone parental. Os tamanhos de biblioteca foram da seguinte forma: biblioteca H1/H2 (1,13 * 1010), biblioteca L1/L2 (5,6 * 109), biblioteca L3 (2,3 * 1010) e biblioteca H3 (2,64 * 1010).
EXEMPLO 5 SELEÇÃO DE CLONES ANTIFAP MATURADOS POR AFINIDADE
[0314] As seleções foram executadas contra o ectodomínio de Proteína Ativadora de Fibroblasto humana ou de camundongo (FAP) que foram clonada 5' de uma polilisina e uma identificação 6*his. Consulte SEQ ID NOs: 317 e 319. Antes das seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos a uma concentração de 10 μg/ml, 5 μg/ml ou 0.2 μg/ml, dependendo da biblioteca e da rodada de seleção. As seleções foram executadas de acordo com o seguinte protocolo: (i) ligação de ~ 1012 partículas de fagemídeo de biblioteca a.m.FAP2D9, a.m.FAP4B8 ou a.m.FAPpool com FAP imobilizada humana ou de camundongo por 2 horas; (ii) lavagem de imunotubos com o uso de 10 a 20 * 5 ml de PBS/Tween20 e 10 a 20 * 5 ml de PBS (dependendo da biblioteca e da rodada de seleção); (iii) eluição de partículas de fago por adição de 1 ml de TEA a 100m M (trietilamina) por 10 minutos e neutralização por adição de 500 μl de Tris/HCl a 1M pH 7,4; e (iv) reinfecção de células TG1 de E. coli de fase log, infecção com fago auxiliar VCSM13 e precipitação de PEG/NaCl subsequente de partículas de fagemídeo a ser usada em rodadas de seleção subsequentes.
[0315] As seleções foram executadas por 2 rodadas e as condições foram ajustadas para cada uma das 3 bibliotecas individualmente. Em detalhes, os parâmetros de seleção foram: a.m.FAP2D9 (5 μg /ml FAP humana e 20 lavagens no total para a rodada 1, 1 μg/ml de FAP humana e 30 lavagens no total para a rodada 2), a.m.FAP4B8 (1 μg/ml FAP de camundongo e 30 lavagens no total para rodada 1, 0,2 μg/ml de FAP humana e 40 lavagens no total para rodada 2) e a.m.FAPpool (5 μg/ml de FAP humana e 30 lavagens no total para rodada 1, 5 μg/ml de FAP de camundongo e 30 lavagens no total para rodada 2). Os ligantes específicos foram definidos como sinais 5 vezes maiores que os anteriores e foram identificados por ELISA. As placas NUNC maxisorp foram revestidas com 1 μg/ml ou 0,2 μg/ml de FAP humana ou de camundongo seguido por adição de sobrenadantes bacterianos que contêm Fab e detecção de Fabs de ligação específica através de suas identificações Flag através do uso de um anticorpo secundário antiFlag/HRP.
[0316] Os clones positivos de ELISA foram expressos como bactérias como culturas de 1 ml em formato de 96 cavidades e os sobrenadantes foram submetidos a um experimento de triagem cinética com o uso de BIACORE T100, conforme descrito acima (consulte Exemplo 3).
SELEÇÃO ADICIONAL DE CLONES ANTIFAP MATURADOS POR AFINIDADE
[0317] As seleções foram executadas contra o ectodomínio de Proteína Ativadora de Fibroblasto humana e de camundongo (FAP) que foram clonadas a montante de uma identificação de 6x-lisina e 6x-his (consulte SEQ ID NOs: 317 e 319). Antes das seleções, os antígenos foram revestidos em imunotubos a uma concentração de 1 μg/ml, 0,2 μg/ml ou 0,02 μg/ml, dependendo da biblioteca e da rodada de seleção. As seleções e as triagens à base de ELISA foram executadas conforme descrito para a primeira campanha de maturação por afinidade de anticorpos antiFAP. As triagens secundárias foram executadas com o uso de um biosensor ProteOn XPR36 (Biorad), e as constantes e afinidades de taxa cinética foram determinadas através da análise de preparações Fab purificadas por afinidade no mesmo instrumento. KD foi medido por Ressonância de Plásmon de Superfície com o uso de uma máquina ProteOn XPR36 (Biorad) a 25°C com anticorpo de captura específico fragmento F(ab’)2 anti-humano (Jackson ImmunoResearch n° 109-005-006) imobilizado em chips GLM e captura subsequente de Fabs de sobrenadante bacteriano ou de preparações Fab purificadas. Em suma, os chips de biosensor GLM (Biorad) foram ativados por 5 min. com uma mistura recém-preparada de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida clorídrico (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). O anticorpo de captura específico fragmento F(ab’)2 anti-humano foi diluído para 24 μg/ml com acetato de sódio a 10 mM, pH 5,0 antes da injeção por 5 min. para alcançar aproximadamente até 10.000 unidades de resposta (RU) de anticorpo de captura acoplado. Após a injeção do anticorpo de captura, a etanolamina a 1 M foi injetada por 5 min. para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, as Fabs de sobrenadante bacteriano foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. por 100 s. Os níveis de captura estiveram na faixa de 250 RU. Em uma etapa subsequente, as diluições em série de analito de FAP humana, de camundongo ou de macaco foram injetadas (diluição de duas vezes, concentração mais alta 25 nM) diluídas em PBS/0,005% de Tween-20 a 25°C a uma taxa de fluxo de 50 μl/min. O tempo de associação foi 240 s, o tempo de dissociação 600 a 1800 s. O chip do sensor foi regenerado por injeção de 0,85% de H3PO4 por 30 s a 100 μl/min. seguido da injeção de NaOH a 50 mM por 30s na mesma taxa de fluxo. As taxas de associação (kassociação) e as taxas de dissociação (kdissociação) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação simples Langmuir um a um (ProteOn manager software versão 2.1) por ajuste simultâneo dos sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) é calculada como a razão kdissociação/kassociação.
[0318] Os seguintes clones maturados por afinidade foram identificados: 19G1 (consulte SEQ ID NOs: 257 e 259), 20G8 (consulte SEQ ID NOs: 281 e 263), 4B9 (consulte SEQ ID NOs: 265 e 267), 5B8 (consulte SEQ ID NOs: 269 e 271), 5F1 (consulte SEQ ID NOs: 273 e 275), 14B3 (consulte SEQ ID NOs: 277 e 279), 16F1 (consulte SEQ ID NOs: 281 e 283), 16F8 (consulte SEQ ID NOs: 285 e 287), O3C9 (consulte SEQ ID NOs: 289 e 291), 22A3 (consulte SEQ ID NOs: 301 e 303) e 29B11 (consulte SEQ ID NOs: 305 e 307) (todos esses clones foram selecionados a partir da biblioteca H1/H2 e são derivados de clone parental 3F2), O2D7 (consulte SEQ ID NOs: 293 e 295) (selecionados a partir da biblioteca L3 com base em clone parental 3F2), e 28H1 (consulte SEQ ID NOs: 297 e 299) e 23C10 (consulte SEQ ID NOs: 309 e 311) (esses dois clones foram selecionados a partir da biblioteca H1/H2 e são derivados de clone parental 4G8).
[0319] As Figuras 1 a 5 mostram os sensorgramas de Ressonância de Plásmon de Superfície de ligação de Fabs maturados por afinidade selecionados à FAP imobilizada e a Tabela 7 dá as respectivas afinidades derivadas. Os Fabs selecionados se expandem por uma faixa de alta afinidade na faixa de pM a nM e apresentam reação cruzada para FAP humana (hu) e de camundongo (mu), bem como FAP de macaco (cino) FAP conforme determinado para clones selecionados. Os Fabs antiFAP maturados por afinidade foram convertidos para o formato Fab-IL2-Fab e para os anticorpos de IgG para análise de especificidade. A especificidade de ligação foi mostrada por carência de ligação a DPPIV como homólogo próximo de FAP, expresso em células HEK293 ou CHO (consulte Exemplo 9). TABELA 7 SUMÁRIO DE CONSTATES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (KD) DE ANTICORPOS ANTIFAP MATURADOS POR AFINIDADE COMO FRAGMENTOS FAB (LIGAÇÃO MONOVALENTE).
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EXEMPLO 6 CONVERSÃO DE IGG DE FAP DE LIGAÇÃO A FABS
[0320] Os Fabs parentais 3F2, 4G8 e 3D9 e os derivados de Fab maturados por afinidade 3F2 e 4G8 foram convertidos em um formato de IgG1 humana, um formato de IgG2a de camundongo e um formato de IgG1 humana.
[0321] As sequências de DNA completas de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo foram obtidas através da subclonagem das regiões variáveis no quadro com as respectivas regiões constantes de cadeia pesada e as regiões constantes de cadeia leve pré-inseridas em diferentes vetores de expressão de mamífero recipientes ou foram recombinadas através do foco em um estiramento de sequência curta homólogo ao sítio de inserção de vetores recipientes. A recombinação foi executada de acordo com o “Sistema de Clonagem Em Fusão” da Invitrogen.
[0322] Em todos os vetores, a expressão de anticorpo é acionada por um promotor MPSV e todos os vetores portam uma sequência de sinal poliA sintética na extremidade 3’ da CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência EBV OriP.
EXEMPLO 7 ANÁLISE BIACORE DE ANTICORPOS ANTIFAP DE IGG
[0323] A afinidade dos fragmentos Fab antiFAP 3F2, 4G8 e 3D9 bem como de dos anticorpos antiFAP convertidos em IgG1 humana foi subsequentemente determinada e confirmada para FAP humana, de camundongo e de macaco por análise de Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR) a 25°C com o uso de uma máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare). Para esse propósito, o domínio extracelular de FAP humana, de camundongo ou de macaco (SEQ ID NOs 317-322) foi capturado por um anticorpo anti-His imobilizado (Penta His Qiagen 34660) e os anticorpos foram usados como analitos. Para imobilização, os chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) foram ativados com N-etil-N’-(3- dimetilaminopropil)-carbodi-imida clorídrico (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo Penta His foi diluído com acetato de sódio a 10 mM, pH 5, para 40 μg/ml antes da injeção a uma taxa de fluxo de 10 μl/minuto para alcançar aproximadamente 9.000 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do ligante, a etanolamina a 1 M foi injetada para bloquear grupos não reagidos.
[0324] Para medições cinéticas, o domínio extracelular de FAP humana, de camundongo ou de macaco foi injetado a 10 μl/min. a 10 nM por 20 s (para fragmentos Fab) ou em 20 nM por 25 s (para IgG) e foi capturado através de sua identificação His pelo anticorpo penta His imobilizado. As diluições seriais de anticorpo (diluições de duas vezes, na faixa entre 6,25 nM e 200 nM para fragmentos Fab ou diluições de cinco vezes, na faixa entre 3,2 pM e nM para IgG) foram injetadas em HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,05% a Tensoativo P20, pH 7,4) a 25°C a uma taxa de fluxo de 90 μl/min. Os seguintes parâmetros foram aplicados: tempo de associação 180 s, dissociação 300 s (para Fab) ou 900 s (para IgG), regeneração com glicina a 10 mM pH 2 por 60 s entre cada ciclo. As taxas de associação (kassociação) e as taxas de dissociação (kdissociação) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação simples Langmuir um a um (BIACORE ® T100 Evaluation Software versão 1.1.1) por ajuste simultâneo dos sensorgramas de associação e dissociação (os parâmetros de modelo foram Rmax local e RI=0). A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão kdissociação/kassociação.
[0325] Os valores KD de ligação são dados na Tabela 8. As Figure 6 A a C mostram as análises cinéticas correspondentes baseadas em SPR para fragmentos Fab, as Figuras 7 A a C para anticorpos de IgG. TABELA 8. SUMÁRIO DE CONSTANTES DE EQUILÍBRIO CINÉTICO (KD) DE ANTICORPOS ANTIFAP3F2, 4G8 E 3D9 COMO FRAGMENTOS FAB E COMO IGG
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EXEMPLO 8 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP3F2, 4G8 E 3D9 EM SEÇÕES DE TECIDO TUMORAL HUMANO
[0326] Foram executados experimentos para detectar e comparar a expressão de FAP em tecidos tumorais humanos congelados e frescos (câncer de mama, adenocarcinoma de cólons e tecidos NSCLC) com o uso dos clones de anticorpos antiFAP 3F2,4G8 e 3D9 como IgG2a de camundongo.
[0327] Um microarranjo de tecido congelado fresco (TMA) (AST 274), que contém trinta tumores diferentes com dois pontos cada, foi usado a partir do banco de tumor Roche TRS Pathology & Tissue Biomarkers. O TMA que contém 10 carcinomas ductais invasivos do seio, 10 adenocarcinomas colorretais e 10 cânceres pulmonares de célula na pequena foi obtido junto à Asterand Ltd, Royston, Reino Unido.
[0328] Para os manchamentos imunohistoquímicos (IHC), os seguintes anticorpos foram usados: clone monoclonal antiFAP de camundongo 3F2 (15,8 ng/ml, diluído em Diluente de Anticorpo Ventana), clone monoclonal antiFAP de camundongo 4G8 (1000 ng/ml, diluído em Diluente de Anticorpo Ventana), e clone monoclonal antiFAP de camundongo.3D9 (1000 ng/ml, diluído em Diluente de Anticorpo Ventana). Uma IgG2a de camundongo monoclonal, concentração 100μg/ml (Fornecedor: DAKO, X0943, lote n° 00058066) foi usada como controle de isótipo.
[0329] Os manchamentos foram executados de acordo com protocolos padrões em um instrumento Ventana Benchmark XT, com o uso do kit de detecção Ventana Ultra-View com sistema HRP para detecção (que contém Universal HRP Multimer, e DAB para manchamento). O contramanchamento foi feito com Hematoxilina II (Ventana, Mayer's Hematoxilin) e Reagente Azul (Ventana) por 8 min.
[0330] O TMA foi analisado semiquantitativamente e a expressão total de FAP (intensidade de manchamento) bem como a localização da expressão de FAP no tecido tumoral foi avaliada.
[0331] Com todos os três anticorpos antiFAP, todas as amostras de tecido tumoral (câncer de mama, câncer colorretal e câncer pulmonar) que puderam ser avaliadas mostraram uma intensidade de sinal de FAP moderada a forte no componente de estroma do tumor. Pelo menos 7 das 10 amostras para cada tumor e anticorpo puderam ser avaliadas. As amostras remanescentes não puderam ser avaliadas, devido ao fato de que os núcleos de tecido tiveram artefatos de dobradura, contiveram apenas tecido normal ou estavam ausentes.
[0332] Conforme esperado, o sinal de FAP foi invariavelmente localizado no componente de estroma de tumores. Houve uma leve diferença em intensidade de sinal entre o clone 3F2 e os clones 3D9 e 4G8. Um sinal levemente mais forte foi visto com os clones 3D9 e 4G8, a diferença, no entanto, foi desprezível.
[0333] As Figuras 8 A a D mostram micrógrafos representativos de tecido amostras tumorais humanas imunohistoquimicamente manchadas para FAP com o uso da IgG2a de camundongo antiFAP 3F2, 3D9 ou 4G8, ou um anticorpo de controle isótipo.
EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP A FAP EM CÉLULAS
[0334] Os anticorpos ligação de IgG1 humana 3F2, 4B3 e 4G8 a FAP humana e de camundongo expresso em células HEK293 estavelmente transfectadas conforme medido por FACS. Sucintamente, 150.000 células por cavidade foram incubadas com a concentração indicada dos anticorpos antiFAP 3F2, 4B3 e 4G8 em uma placa de 96 blocos de fundo redondo, incubada por 30 minutos a 4°C e lavada uma vez com PBS/0,1 % de BSA. O anticorpo ligado foi detectado F(ab’)2 anti- humano de cabra de Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado por FITC específico (Jackson Immuno Research Lab n°109-096-097, solução de trabalho: diluído em 1:20 em PBS/0.1% BSA, recentemente preparada) após incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os resultados são mostrados na Figura 9. Os valores de EC50 em ligação de metade do máximo para ligação a FAP humana e de camundongo foram determinados e são dados na Tabela 9. TABELA9. LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP A FAP EM CÉLULAS (VALORES DE EC50).
Figure img0014
ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOSFAP
[0335] A fim de avaliar a especificidade de ligação da exibição de fago derivada de anticorpos, a ligação às células HEK293 que expressam estavelmente DPPIV (um homólogo próximo de FAP que é expresso em tecidos saudáveis) ou HER2 conforme medido para os anticorpos anti-FAB humana de IgG1 3F2, 4B3 e 4G8. Sucintamente, 200.000 células por foto (HEK293-DPPIV ou HEK293-HER2 como controle) foram incubadas com 30 μg/ml de os anticorpos antiFAP 3F2, 4B3 ou 4G8 em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo, incubadas por 30 minutos a 4°C e lavadas uma vez com PBS/0,1 % BSA. Trastuzumab (anti- HER2 anticorpo) ou um anticorpo anti-humano de camundongo conjugado por ficoeritrina (PE) anti-CD26/DPPIV (CD26 = DPPIV, IgG1 de camundongo, k, BD Biosciences, n°555437, clone M-A261) foram usados como controles positivos. O anticorpo ligado foi detectado com IgG FCY anti-humana de cabra de Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado por PE específico (Jackson Immuno Research Lab n°109-116-170, solução de trabalho: diluído em 1:20 em PBS/0.1% BSA, recentemente preparada) após incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 10. Nenhum dos anticorpos antiFAP mostraram ligação significante a DPPIV ou HER2, mas os sinais na faixa dos controles negativos (anticorpo secundário sozinho, anticorpo de controle isótipo, ou nenhum anticorpo).
LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP A FAP EM FIBROBLASTOS HUMANOS
[0336] A ligação de anticorpos de IgG1 humana a FAP humana expressa em linhagem celular de fibroblasto humano GM05389 (derivado de pulmão fetal humano, National Institute of General Medical Sciences, Camden, NJ) conforme medido por FACS. Sucintamente, 200.000 células por cavidade foram incubadas com 30 μg/ml dos anticorpos antiFAP 3F2 ou 4G8 em uma placa de 96 blocos de fundo redondo, incubada por 30 minutos a 4°C e lavada uma vez com PBS/0,1 % de BSA. O anticorpo ligado foi detectado com IgG FCY anti-humana de cabra de Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado por FITC específico (Jackson Immuno Research Lab n°109-096-098, solução de trabalho: diluído em 1:20 em PBS/0.1% BSA, recentemente preparada) após incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 11. Ambos os anticorpos antiFAP se ligaram fortemente a FAP expressa em fibroblastos humanos.
LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP A FAP EM CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS
[0337] A ligação de anticorpos de IgG1 humana a FAP humana expressa em linhagem celular de fibroblastos humanos GM05389 e em células HEK293 estavelmente transfectadas em comparação à expressão de FAP em linhagens celulares cancerosas humanas ACHN, Colo205, MDA-MB231, MDA- MB435 e KPL4 por FACS.
[0338] Sucintamente, 200.000 células por cavidade foram incubadas com 10 μg/ml dos anticorpos antiFAP 3F2 ou 4G8 em uma placa de 96 blocos de fundo redondo, incubada por 30 minutos a 4°C e lavada uma vez com PBS/0,1 % de BSA. O anticorpo ligado foi detectado F(ab’)2 anti-humano de cabra de Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado por específico (Jackson Immuno Research Lab n°109-096-097, solução de trabalho: diluído em 1:20 em PBS/0.1% BSA, recentemente preparada) após incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 12. Os dados mostram que os anticorpos 3F2 e 4G8 se ligam especificamente a FAP que é fortemente superexpressa em fibroblastos e células HEK293 estavelmente transfectadas; enquanto apenas uma ligação fraca pode ser detectada em linhagens de células tumorais humanas ACHN, Colo205, MDA- MB231, MDA-MB435 e KPL4.
EXEMPLO10 ANÁLISE DE INTERNALIZAÇÃO DE FAP MEDIANTE LIGAÇÃO DE ANTICORPO ANTIFAP PORFACS
[0339] Para diversos anticorpos FAP conhecidos na técnica, é descrito que os mesmos reduzem a internalização de FAP mediante ligação (descrito, por exemplo, em Baum et al., J Drug Target 15, 399 a 406 (2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Edição Pós-reunião), volume 28 (20 de maio Suplemento), resumo n° 13062 (2010); Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4.584 a 4.592 (2008)).
[0340] Dessa forma, analisaram-se as propriedades de nossos anticorpos. Sucintamente, as células GM05389 (fibroblastos de pulmão humano) cultivadas em meio EMEM + 15% de FCS, foram destacadas, lavadas, contadas, verificadas por viabilidade e consultadas a uma densidade de 0,2 células de mieloma/cavidade em placas 12 cavidades. No dia seguinte, os anticorpos FAP 4G8 e 3F2 (Figura 13A) ou 4G8 apenas (Figura 13B) foram diluídos em 10 μg/ml em meio frio, as células foram resfriadas em gelo e os anticorpos diluídos (0,5 ml/cavidade) ou meio sozinho foram adicionados conforme indicado. Subsequentemente, as células foram incubadas por 30 minutos no ambiente frio com agitação suave, seguida por adição de 0,5 ml meio morno e adicionalmente incubação das células a 37°C pelos períodos de tempo indicados. Quando diferentes instantes de tempo foram atingidos, as células foram transferidas para gelo, lavadas uma vez com PBS frio e incubadas com 0,4 ml do anticorpo secundário (IgG anti-humana de cabra conjugada por Alexa Fluor 633, Sondas Moleculares n°A-21091, 2 mg/ml, uso 1:500) por 30 minutos a 4°C. As células foram então lavadas duas vezes com PBS/0,1% de BSA, transferidas para uma placa de 96 cavidades, centrifugadas por 4 minutos a 4°C, 400 x g e péletes de célula fora ressuspensos por vórtice. As células foram fixadas com o uso de 100 μl de PFA a 2%. Para medição de FACS, as células foram ressuspensas em 200 μl/amostra PBS/0,1% de BSA e medidas com o protocolo de placa em FACS CantoII (Software FACS Diva). Os resultados desses experimentos são apresentados na Figura 13 A e B e mostram que os anticorpos antiFAP 4G8 e 3F2 não induzem a internalização de FAP em fibroblastos.
ANÁLISE DE INTERNALIZAÇÃO DE FAP MEDIANTE LIGAÇÃO DE ANTICORPO ANTIFAP POR IMUNOFLUORESCÊNCIA
[0341] As células GM05389 (fibroblastos de pulmão humano) foram cultivadas em lamelas de vidro em meio EMEM + 15 % de FCS. Antes do tratamento, as células foram lavadas três vezes com PBS e sofreram jejum em meio EMEM + 0,1 % de BSA por 2 horas. O anticorpo antiFAP (4G8 IgG) ou um anticorpo anti-CD20 (GA101, usado como controle de isótipo) foram diluídos em meio EMEM frio até a concentração final de 10 μg/ml. Após o jejum, as células foram resfriadas em gelo, lavadas duas vezes com PBS frio e incubadas com os anticorpos diluídos (0,5 ml/cavidade) por 45 minutos a 4°C sob agitação constante para permitir a ligação de superfície. As células foram então lavadas duas vezes com PBS frio e ou fixadas com PFA fio (T0, paraformaldeído 4 % em PBS pH 7,4) ou adicionalmente incubadas a 37°C por 20 minutos, 1 hora, 3 horas e 6 horas em EMEM + 10 % de FCS. Em cada ponto de tempo, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e fixadas por PFA por 20 minutos em gelo. Após a fixação, as células foram lavadas quatro vezes com PBS frio, permeabilizadas com Triton 0,03% e incubadas com anticorpo anti-EEA1 (marcador de endossomo anterior) por 45 minutos à temperatura ambiente em tampão de bloqueio (PBS + 10% de FCS). As células foram então lavadas três vezes com PBS e incubadas com anticorpos secundários marcados por fluorescência (anticorpo conjugado por Alexa Fluor 594 anti-camundongo de burro e anticorpo conjugado por Alexa Fluor 488 anti- humano de cabra) em temperatura ambiente por adicionalmente 45 minutos. As células foram finalmente lavadas e colocadas em lâminas de suporte de vidro com o uso de meio de montagem Immuno Mount.
[0342] A Figura 14 A a D apresenta imagens de imunofluorescência representativas que mostram manchamento de FAP de membrana de plasma em fibroblastos de pulmão GM05389 obtidos após a ligação de antiFAP 4G8 IgG por 45 minutos a 4°C (A), por 20 minutos a 37°C (B), por 1 hora a 37°C (C) ou por 6 horas a 37°C (D). O anticorpo anti-CD20 GA101, usado como controle de isótipo, mostra o manchamento anterior. EEA1 marcações endossomas precoces. Nota-se a persistência do manchamento de superfície de FAP de membrana de plasma até 6 horas após a ligação de anticorpo antiFAP 4G8.
EXEMPLO 11 ANÁLISE BIACORE DE ANTICORPOS ANTIFAP IGG MATURADOS POR AFINIDADE
[0343] Os fragmentos maturados por afinidade Fab antiFAP derivados de 3F2 e 4G8 foram convertidos em anticorpos IgG de coelho. A afinidade dos anticorpos antiFAP convertidos em IgG1 de coelho baseado em 3F2 e 4G8 maturado por afinidade a FAP é subsequentemente determinada e conformada para FAP humana, de camundongo e de macaco por análise SPR a 25°C (Biacore). Para esse propósito, o domínio extracelular de FAP de humano, camundongo e macaco (SEQ ID NOs 317 a 322) é capturado por um anticorpo anti-His imobilizado (Penta His Qiagen 34660) e os anticorpos são usado como analitos. IgGs são diluídas 1:5 de 10 nM para 3,2 pM. Os seguintes parâmetros são aplicados: tempo de associação 180 s, dissociação 900 s, fluxo 90 μl/min. Regeneração com glicina a 10 mM pH 2 por 60 s. As curvas foram adequadas com o modelo 1:1 para chegar aos valores KD (Rmax local, RI=0).
EXEMPLO 12 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFAP MATURADOS POR AFINIDADE A FAP EM CÉLULAS
[0344] A ligação de anticorpo parental derivado de 4G8 marcado com Alexa-647 de anticorpo 28H1 de IgG1 humana maturado por afinidade (1,89 mg/ml, 1,83 mol corante/mol proteína) a FAP humana expressa em células HEK293 estavelmente transfectadas conforme medido por FACS. Sucintamente, 200.000 células por cavidade foram incubadas com a concentração de 2 μg/ml e 10 μg/ml dos anticorpos antiFAP parentais 4G8 maturados por afinidade 28H1 em uma placa de 96 blocos de fundo redondo, incubada por 30 minutos a 4°C e lavada uma vez com PBS/0,1 % de BSA. O anticorpo ligado foi detectado após a incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os dados mostram que ambos os anticorpos se ligam fortemente a células HEK293 transfectadas com FAP humana (Figura 23).
EXEMPLO 13 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MATURADOS POR AFINIDADE ANTIFAP A FAP EM FIBROBLASTOS HUMANOS
[0345] A ligação de anticorpos de IgG1 humana maturados por afinidade derivados de 3F2 a FAP humana expressa em linhagem celular de fibroblasto humano GM05389 (derivado de pulmão fetal humano, National Institute of General Medical Sciences, Camden, NJ) é medida por FACS. Sucintamente, 200.000 células por cavidade foram incubadas com 30 μg/ml dos anticorpos antiFAP 3F2 maturados por afinidade em uma placa de 96 blocos de fundo redondo, incubada por 30 minutos a 4°C e lavada uma vez com PBS/0,1 % de BSA. O anticorpo ligado foi detectado com IgG FCYantihumana de cabra de Fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado por FITC específico (Jackson Immuno Research Lab n°109-096-098, solução de trabalho: diluído em 1:20 em PBS/0.1% BSA, recentemente preparada) após incubação por 30 minutos a 4°C com o uso de um FACS CantoII (Software FACS Diva). Os valores de EC50 em ligação em metade do máximo para ligação a FAP humana e de camundongo são determinados.
EXEMPLO 14 ClTOTOXICIDADE MEDIADA POR CÉLULA DEPENDENTE DE ANTICORPO MEDIADA POR ANTICORPOS IGG1 ANTIFAP GLICOPROJETADOS
[0346] Os anticorpos de IgG1 humana antiFAP derivados de 4G8 ou 3F2 foram glicoprojetados por cotransfecção com plasmídeos que codificam GnTIII e ManII conforme descrito no Exemplo 1. Subsequentemente, os anticorpos de IgG1 humana maturados por afinidade 28H1 e parentais 4G8 e 3F2 glicoprojetados foram comparados em um ensaio ADCC por seu potencial de mediar citotoxicidade celular mediada por anticorpo superior em comparação a suas versões de tipo selvagem não glicoprojetadas.
[0347] Sucintamente, as células estavelmente transfectadas HEK293 com FAP humana como células-alvo foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meio de cultura, manchadas com Calceína AM recentemente preparada (Sondas Moleculares) a 37°C por 30 minutos, lavadas três vezes, contadas e diluídas a 300.000 células/ml. Essa suspensão foi transferida a uma placa de 96 cavidades de fundo redondo (=30.000 células/cavidade), a respectiva diluição de anticorpo foi adicionada e incubada por 10 minutos para facilitar a ligação do anticorpo testado às células antes do contato com células efetoras. O efetor à razão alvo foi 25 a 1 para PBMCs. A co-incubação foi realizada por 4 horas. Como leitura, a liberação de lactato desidrogenase (LDH) em sobrenadante após a disintegração das células atacadas foi determinada. LDH de sobrenadante de co-cultura foi coletado e analisado com um Kit de detecção de LDH (Roche Applied Science). A conversão de substrato pela enzima LDH conforme medida com um leitor de absorvência ELISA (software SoftMaxPro, comprimentos de onda de referência: 490 nm versus 650 nm). Conforme mostrado na Figura 24, todos os anticorpos antiFAP testados foram capazes de induzir ADCC em células HEK293-hFAP. As versões glicoprojetadas (ge) se desempenharam sempre melhor que a versão do tipo selvagem (wt) não glicoprojetada correspondente.
[0348] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de esclarecimento de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. As revelações de toda a literatura de patente e científica citada na presente invenção são expressamente incorporadas em sua totalidade a título de referência.

Claims (22)

1. ANTICORPO, que se liga especificamente a Proteína Ativadora de Fibroblasto (FAP), caracterizado por dito anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 267 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 265, ou uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 299, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito anticorpo compreender uma região Fc ou uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por dita região Fc ser uma região Fc de IgG.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo de classe IgG de comprimento total.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito anticorpo compreender uma região constante humana.
6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo humano.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo dito anticorpo compreender uma região Fc glicoprojetada.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo dito anticorpo ter uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados em dita região Fc em comparação a um anticorpo não glicoprojetado.
9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado por pelo menos 20% a 100% dos oligossacarídeos N-ligados em dita região Fc serem não fucosilados.
10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado por dito anticorpo ter uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados em dita região Fc em comparação a um anticorpo não glicoprojetado.
11. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado por pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% dos oligossacarídeos N-ligados em dita região Fc serem bisseccionados.
12. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado por pelo menos cerca de 20% a cerca de 50% dos oligossacarídeos N-ligados em dita região Fc serem bisseccionados, não fucosilados.
13. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por dito anticorpo ter função efetora aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor Fc aumentada.
14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por dita função efetora aumentada ser ADCC aumentada.
15. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para uso como um medicamento.
16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para o tratamento de uma doença assinalada pela expressão de FAP.
17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por dita doença ser câncer.
18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para uso na indução de lise celular de uma célula tumoral ou uma célula estromal de um tumor.
19. CONJUGADO DE ANTICORPO, caracterizado por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um agente citotóxico.
20. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
21. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença assinalada pela expressão de FAP.
22. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por dita doença ser câncer.
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