WO2005112542A2 - Composición para la reparación ósea y cartilaginosa - Google Patents

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Definitions

  • the present invention has its application within the biomedical industry dedicated to the manufacture of agents involved in skeletal repair and, more specifically, in the processes of cartilage and bone repair of any etiology, spinal fusions or arthrodesis, osteosynthesis, prostheses' for arthroplasties, osteoporosis, etc., and any others that require repair or regeneration of bone or cartilaginous tissues and in which a supplementary contribution of cells in differentiation supposes an effective aid for the achievement of the tissue repair in question.
  • Tissue regeneration is a complex process that involves the culmination of the work of a wide variety of cells that were either present or have been recruited at the site of the lesion. All events that occur in the repair process are guided by a series of interactions between growth factors and cytokines, cells and the molecules that constitute the extracellular matrix.
  • inductive signals and growth factors coexist in bone, including TGF- ⁇ , PDGF, BMPs, IGFs and FGFs (Becerra et al. Med Clin 2001; 116: 23-34.). Of all of them, only BMPs are osteoinductors, however all are involved in the repair of a particular fracture (Reddi Nature Medicine 1998, 3: 837-839; Groeneveld and Burger Eur J Endocrinol 2000; 142: 9-21) Also in the bone there are osteogenic precursor cells that respond to the stimulation of the fracture, activating and producing BMPs that induce the migration of mesenchymal stem cells (CMMs), which proliferate and differentiate into bone-forming cells (Guerado et al.
  • CCMs mesenchymal stem cells
  • TGF- ⁇ s constitute a group of growth factors, encoded by a gene family that is expressed in numerous tissues and species (Kingsley Genes Dev; 1994; 8: 133-146; Bostrom and Asnis, Clin Orthop Relat R, 1998; 355S : 124-131). Bone was one of the first tissues in which local production of a TGF- ⁇ was observed with the ability to regulate cell function (Centrella et al. J Bone Joint Surg 1991; 73-A: 1418-1428). Although the main source of TGF- ⁇ is platelets, bone is the most important deposit, 100 times greater than that of other soft tissues, where there is also a shared presence of BMPs (Roberts et al. Biochemistry 1983; 22: 5692- 5698).
  • the transplantation of trained cells should be done on a microenvironment that promotes osteogenesis, when the consolidation of two or more bone fragments is what is required.
  • the fracture or non-consolidation focus prseudoarthrosis
  • the simple non-dynamic rigid stabilization of the focus by intra or extramedullary implants should promote consolidation.
  • the transplantation of trained cells into osteogenic lineage on a carrier ("carrier") of hydroxyapatite or collagen finds a hypervascular and stable bed after osteosynthesis, ideal microenvironment for the development of the osteogenic callus.
  • the present invention has an obvious application for the preparation of agents and compositions that serve for skeletal repair, and more specifically in the processes of repairing cartilage, bone, osteoporosis, prostheses for arthroplasties, etc., which can be injected in situ in small fracture that does not join or in cartilaginous lesions, in the systemic circulation of osteoporotic individuals or implanted adsorbed in the appropriate biomaterial (collagen, hydroxyapatite, etc.) to promote the formation of cartilage or bone in lesions of a certain entity. They can also be adsorbed on the hydroxyapatite (periapatite) that covers the prostheses for hip, knee, etc. arthroplasties to facilitate the biological integration of these prostheses in the host, extending their life. These preparations can also be used in spinal fusion to promote spinal fusions and improve the efficiency of such operations performed by the usual procedures with autograft or bench bone.
  • the present invention provides a method for increasing bone and / or cartilage formation in a human in need thereof by administering to it human mesenchymal stem cells, differentiated into the chondroosteogenic lineage by their amplification with human serum and a transforming growth factor beta 1 with a molecular domain of binding to collagen I (TGF- ⁇ -DUC) obtained in eukaryotic expression systems.
  • human mesenchymal stem cells differentiated into the chondroosteogenic lineage by their amplification with human serum and a transforming growth factor beta 1 with a molecular domain of binding to collagen I (TGF- ⁇ -DUC) obtained in eukaryotic expression systems.
  • the administration of said trained cells is carried out by injection in situ, in the systemic circulation or by implants, adsorbed in the appropriate biomaterial.
  • it is done through the use of implants, adsorbed cells in the appropriate material, the use of reabsorbable hydroxyapatite, with 50% porosity, diffusion chambers or collagen gels being even more preferred.
  • human CMMs have been aided in their induction into the chondroostegenic lineage using a glucocorticoid.
  • dexamethasone being preferred.
  • this induction is carried out in the presence of dexamethasoxane and ⁇ -glycerophosphate.
  • the transforming growth factor beta 1 fused with a molecular domain of collagen binding I has been expressed in eukaryotic expression systems. Expression is preferably carried out using insect cells, and even more preferred is the use of insect cells transfected with baculovirus.
  • a method of in vitro training of chondroosterogenic cells from human CMMs which comprises the following steps:
  • TGF- ⁇ -DUC transforming growth factor beta 1 with a molecular domain of binding to collagen I
  • Human CMMs can be obtained from different tissues and locations of the patient himself, as well as from the bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood or the internal mass of frozen human blastocysts.
  • the transforming growth factor beta 1 fused with a molecular domain of binding to collagen I has been expressed in eukaryotic expression systems. More preferably, insect cells are used for expression. The use of insect cells transfected with baculovirus is even more preferred.
  • the primary culture is performed on a human type I collagen gel.
  • the selection of the bone marrow CMMs is carried out in a culture supplemented with an amount between 0.1 and 1% of human serum, preferably 0.5%.
  • the amplification takes place over a period between 1 to 25 days, during which the culture medium is supplemented with an amount between 5% and 25% of human serum, preferably 20%.
  • a third aspect of the present invention provides cells with chondroosterogenic capacity obtainable according to the above training procedure, which comprises the selection, amplification and chondroosterogenic induction of CMMs.
  • chondroosterogenic capacity cells obtainable in accordance with the above training procedure is provided in the preparation of a composition for bone and / or cartilaginous repair in humans.
  • a composition capable of inducing osteogenesis comprising a material is provided biocompatible and osteoconductive, and a set of cells with chondroostegenic capacity obtainable according to the previous training procedure.
  • FIG. 1 MO cells cultured in vitro for 10 days in collagen gel, in the presence of rhTGF- ⁇ -DUC. Few isolated cells are observed. MO cells cultured 35 days in collagen gel (b and c), in the presence of rhTGF- ⁇ 1-DUC and induced with dexamethasone and ⁇ -glycerophosphate, respectively. A higher density of cells and some colonies thereof are observed. x60
  • Figure 2. In a) radiographs of four diffusion chambers are shown after the implantation period in the subcutaneous tissue of the rat. Different densities indicate different quality and quantity of neoformed tissue. b) Shows a histological section of a chamber after the implantation period, in which cultured cells were placed under control conditions, without rhTGF- ⁇ -DUC; Its interior is full of more or less fibrous material, without the accumulation of chondro-osteoid tissue (asterisk, chamber filter). Syrium-hematoxylin red. xlO.
  • x40 e Section parallel to the previous one, stained with Goldner's trichrome showing an intense blue color (empty circle) the densest tissue (osteoid) and a pale color which resembles cartilage (full circle). Surrounding the accumulation appear bluish fibers that seem to constitute a layer of perichondrium (arrows).
  • x40 f When another parallel section is colored with Alcian Blue, the cartilaginous tissue appears blue (full circle), while the osteoid appears colorless (empty circle), as well as the perichondrium.
  • Figure 3 Sections of tissue formed in the place where hydroxyapatite implants were performed with processed cells as indicated in the text. Since the material was descaled before being cut and colored, the empty spaces (asterisks) correspond to the walls of the hydroxyapatite trabeculae. The gaps between these walls are now filled with a tissue that can be called medullary (full circles), while thin sheets of neoformed tissue (arrows) appear attached to these trabeculae.
  • Example 1 Design and obtaining of the recombinant human fusion protein TGF- ⁇ 1 with a collagen I binding domain (rhTGF- ⁇ 1-DUC).
  • the cDNA for the TGF- ⁇ 1 gene was obtained by RT-PCR, using a DNA polymerase with correction capability.
  • Total RNA extracted by the method of Chomczynski and Sacchi (1987), was used as a template from MG63 human osteosarcoma cells (ref. In ATCC: CRL-1427).
  • Primers are designed with the help of software (Oligo v6.6), based on the sequences of mRNAs published in the genbank.
  • the PCR products were cloned "in blunt", in a maintenance plasmid (pBSK II, Stratagene). Once the genes were cloned, they were checked by sequencing of both strands.
  • plasmids were amplified by PCR with pfu-AND-polymerase, the region that codes for the mature peptide.
  • the primers used incorporate the Collagen Binding Domain (DUC) and restriction sites suitable for directional cloning in a transfer plasmid of a baculovirus expression system, which contains a sequence for a cell-specific secretion signal peptide of insect (pAcGP67B, Pharmingen). To obtain the factor without DUC, the primers had only restriction sites.
  • DUC Collagen Binding Domain
  • the primer for the sense chain had the following structure: 5 '- (BamHI) -sequence of the DUC-GGAGGA- (NheI) -6 first nucleotide mature peptide TGF- ⁇ 1.
  • the primer for the chain antisense consisted of several nucleotides at the 5 'end of the gene and that comprised the stop codon. It also had the Not I site. In all cases, the construction was checked by sequencing the PCR product or the transfer plasmid containing it.
  • insect cells were co-transfected with a mixture composed of the transfer plasmid and a commercial baculovirus DNA (BacVector3000, Novagen), which has been removed in addition to the polyhedrin gene, other genes that code for cysteine proteases.
  • BocVector3000 commercial baculovirus DNA
  • liposomes lipofectin, Novagen
  • the DNA was transferred to the cells, they were cultured in TNM-FH medium for several days, until affectation was observed in the cells. During this time, homologous recombination occurs inside the cells, transferring viral DNA, "downstream" of the polyhedrin promoter, a region of the plasmid comprising the sequence of the signal peptide plus that of the factor with or without DUC. This process generates infective viruses that kill the cell, are released into the environment and infect other cells.
  • a recombinant virus was selected from the mixture of recombinant viruses in the culture supernatant. This was done by plaque assay, which consists of sowing a culture of semi-confluent cells with dilutions of the transfection supernatant. After the infection period (lh), the plate was covered with agarose dissolved in culture medium and allowed to grow for 4 days. This allowed the spread of the infection to occur in the environment of some cells, which generated a lysis plate. These lysis plates were removed individually and deposited in a small volume of medium to extract the viruses.
  • this procedure was repeated once again from an anterior lysis plate and This way we will make sure we have a recombinant virus cloned.
  • this virus was amplified, it was analyzed by PCR with the specific primers for the factor, to verify that it contained the gene of interest. Next, it was necessary to generate a large volume stock that had to be titled, to know the number of pfu / ml (plate forming units / ml).
  • MOI virus / cell number
  • the well cells were broken by freezing-thawing and an extract was made with PBS. Both samples were analyzed by SDS-electrophoresis (denaturing conditions) and without reducing agents. The polyacrylamide gel was stained with Coomasie Blue (if it was not sensitive enough, silver staining can be performed). The different samples were also analyzed by immunoblot using antibodies specific for TGF- ⁇ 1. We used a secondary antibody labeled with peroxidase and detected its presence by chemiluminescence (CSPD, Amersham). With this information we evaluate the proportion of monomer / dimer that was produced and the performance of the system.
  • SDS-electrophoresis denaturing conditions
  • Coomasie Blue if it was not sensitive enough, silver staining can be performed.
  • the different samples were also analyzed by immunoblot using antibodies specific for TGF- ⁇ 1. We used a secondary antibody labeled with peroxidase and detected its presence by chemiluminescence (CSPD, Amersham). With this information we evaluate the proportion of
  • a liquid culture of approximately 250ml was started, with about 500,000 cels / ml. When reached a growth of about 2x106 cels / ml, was inoculated with the virus, using the highest MOI and whose yield was higher. At 24 hours the medium was removed with serum and the cells were continued to be cultured with serum-free medium, the number of days determined by previous tests. After this time, the proteins were purified according to the protocol described by Aono et al. (nineteen ninety five). The method uses cation exchange chromatography, using a SP-Sepharose column (Amesham-Pharmacia).
  • the culture medium was equilibrated to pH 8 and 4M urea was added.
  • the column was equilibrated with a 20 mM Tris-HCl buffer pH8, 4M urea. After the medium passed through the column, it was washed with the buffer and the proteins were eluted with a linear NaCl gradient between 0 and 0.7M.
  • the absorbance at 280 nm was measured at the different fractions and those that had proteins were analyzed by electrophoresis, following the technique described above.
  • the positive fractions were collected and concentrated by ultrafiltration and used in biological activity assays. The protein concentration of this final fraction was measured by Bradford.
  • Example 2 Obtaining and preparing human mesenchymal stem cells.
  • Human mesenchymal stem cells were obtained from human bone marrow (MO) after surgical removal of the iliac crest from informed donors.
  • the spinal tissue was washed in complete medium (D-MEM GD3CO, HD, USA). with antibiotics (100 mg / ml penicillin G (sigma), 50 mg / ml gentamicin (sigma) and 0.3 mg / ml fungizone (Flow-ICN)).
  • the individualized cell suspension was obtained after sequential disintegration through 18, 20 and 22 gauge needles, and finally filtered through sterile 20 micrometer Teflon filters (Cell Strainer, Falcon, Lincoln Park, NJ) to separate debris from tissue and cell clusters.
  • the cell suspension obtained according to example 2 was centrifuged at 100 g for 5 min. The centrifuge was resuspended in culture medium with very low serum concentration of the patient (SH, 0.5%).
  • plates 48 was deposited in the bottom of the same 100 ml. of a solution of human collagen I (Sigma-Aldrich), at a concentration of 0.35 mg / ml. at pH 7.4.
  • the culture plates were introduced into the culture oven at 37 ° C, for 15 min. to allow the formation of the collagen gel, which until now liquid was maintained.
  • 150 ml were deposited per well of culture medium also containing the same concentration of TGF- ⁇ 1.
  • the cultures thus arranged were cultured in an atmosphere of 95% air and 5% CO 2 at 37 ° C and 100 % relative humidity.
  • the culture medium was changed every 3 days, adding in each case the same concentration of TGF- ⁇ 1.
  • TGF- ⁇ 1 The optimal concentration of TGF- ⁇ 1 was investigated in previous trials of chemotactic response.
  • 150 ml of collagen (0.35 mg / ml) was mixed with the concentration of the previously selected factor as the one with the highest chemotactic capacity.
  • Confluent rat bone marrow cultures were dissociated and the cells were placed in the upper compartment of the Boyden chambers (Neuroprobe, Rockville, MD) at a concentration of 2x10 5 cells / ml of D-MEM.
  • the lower chamber compartment contained the medium with the different concentrations of the factor to be tested.
  • the filters were removed and fixed in methanol; they washed, stained and mounted on doors. Chemotaxis was quantified by counting the number of cells that migrated in 20 microscope fields (x400) in each filter.
  • Example 4.- Experimental procedure for cell training selection, amplification and induction).
  • the MO cells were maintained under the experimental conditions described above for 10 days, changing the culture medium, and therefore TGF- ⁇ 1, every 3 days. After 10 days, the culture medium with 10% of the patient's own serum (SH 10%) was implemented. Thus ending the so-called selection period and the amplification period begins, which was maintained for the time necessary to obtain a quantity of cells that makes transplantation possible, but in any case, this period should not exceed 25 days. After this period, the medium was implemented with dexamethasone (10 " M) and ⁇ -ghcerophosphate (2 mM) that act as osteoinductive chemical agents. This period of only 2 days is called induction.
  • Tables I, II, III represent the values obtained. They show how TGF- ⁇ 1-DUC increases the number of cells compared to the control. The same happens with the synthesis of alkaline phosphatase.
  • the calcium content is also increasing with the days of cultivation, while in the control the values are imperceptible.
  • the data correspond to the mean values and their ⁇ SD for every four samples.
  • ND not detected, p ⁇ 0.01 compared to the control cultures.
  • the data correspond to the mean values and their ⁇ SD for every four samples.
  • Example 5 Transfer of the trained cells.
  • the collagen gels were digested with collagenase and the cells were broken down with 0.05% trypsin and 0.02% EDTA, at 37 ° C.
  • the cells were centrifuged, washed and resuspended in serum free medium. After the corresponding count, part of them were introduced into Millipore diffusion chambers that were implanted in the rat's subcutaneous tissue, and another part was absorbed into hydroxyapatite fragments that are implanted in a specific bone lesion ( Figure 3).
  • Example 6 Subcutaneous implantation. Ectopic bone formation.
  • the diffusion chambers with lxl O 6 human cells trained by the described procedure and suspended in serum-free medium were implanted subcutaneously in the back of 344 female Fischer rats 7 months of age, prior anesthesia with subcutaneous injection of sodium pentobarbital 3.5 mg / 100 g body weight. A 2 cm incision was made. in the midline of the back to introduce the cameras.
  • Each rat housed several chambers with cells treated with TGF- ⁇ -DUC and other controls, with cells that passed the culture period without treatment or with commercial TGF- ⁇ 1.
  • the wounds were sutured and disinfected with Betadine. Four weeks later (implantation period), the rats were sacrificed by anesthetic overdose and the cameras removed for histological and radiographic study.
  • the latter was practiced with low intensity X-rays.
  • the cameras were fixed in Bounin or 10% Buffered Formalin. After fixing, the plastic ring of the chambers was dissolved by immersion in acetone. After dehydration, they were included in paraffin and cut sagittally at various levels, 5 micrometers thick. Sections were stained by different histochemical or immunocytochemical techniques with antibodies against different types of collagen, with in order to analyze the tissue formed inside the chambers during the implantation period.
  • Figure 2 shows radiographic and histological images of different chambers that demonstrate the cartilaginous and bone nature of the tissue formed in them.
  • the cartilaginous tissue seems to transform into osteoid-bone, so it seems to indicate that inside the chambers there is a genuine process of endochondral ossification.
  • Example 7 Example of Implantation in a tibial fracture. Fragments of Proosteon 500 hydroxyapatite (hiterpore) of about 0.5 cm in diameter were embedded with the cell suspension, dripping on them several microliters, and changing their position to ensure that most of their cavities were filled with cells. The cells thus arranged were transferred to the operating room, taking care of the asepsis and the temperature slightly above 0 ° C. Anesthetized the patient, the fracture surfaces were prepared and hydroxyapatite fragments were introduced separately. This fracture was really a non-union or atrophic pseudoarthrosis, characterized by an avascular focus with fibrous tissue, without proliferation of vascularized chondro-osteogenic tissue.
  • Figure 3 shows images of histological sections performed on biopsy after six weeks of implantation. They show the neoformed tissue in contact with the walls of the hydroxyapatite with bone tissue qualities, as well as the formation of spinal tissue in the gaps that remain between the ore trabeculae. The evidence presented shows that the tissue formed has characteristics of bone in the process of maturation. Likewise, the images show that osteoinduction extends near the implants but not much further, which can be explained because the transplanted cells are responsible for such osteoinduction, extending there where the cells spontaneously spread in the implant area. The areas farthest from the implant have no symptoms of osteoinduction.

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Abstract

Composición para la reparación ósea y cartilaginosa que comprende un conjunto de células madre mesenquimáticas humanas diferenciadas hacia el linaje condroosteogénico, mediante su amplificación con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-ß1-DUC) obtenido en sistemas de expresión eucarióticos, y un material biocompatible al que se absorben las células así procesadas. Esta composición puede usarse mediante implantes en la zona a reparar o directamente por inyección de las células en suspensión, bien en el lugar de la lesión o incluso en la circulación sistémica para procurar su distribución generalizada.

Description

COMPOSICIÓN PARA LA REPARACIÓN OSEA Y CARTILAGINOSA
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención tiene su aplicación dentro de la industria biomédica dedicada a la fabricación de agentes que intervienen en la reparación esquelética y, más concretamente, en los procesos de reparación de cartílago y hueso de cualquier etiología, fusiones o artrodesis espinales, osteosíntesis, prótesis 'para artroplastias, osteoporosis, etc., y cualesquiera otros que precisen reparación o regeneración de tejidos óseo o cartilaginoso y en los que un aporte suplementario de células en diferenciación suponga una ayuda efectiva para la consecución de la reparación tisular de que se trate.
ESTADO DE LATÉCNICAANTERIOR
La regeneración tisular es un proceso complejo que supone la culminación del trabajo de una gran variedad de células que, o estaban presentes, o han sido reclutadas en el lugar de la lesión. Todos los sucesos que ocurren en el proceso reparador son guiados por una serie de interacciones entre factores de crecimiento y citoquinas, células y las moléculas que constituyen la matriz extracelular.
En el hueso coexisten una variedad de señales inductoras y de factores de crecimiento que incluye TGF-β, PDGF, BMPs, IGFs y FGFs (Becerra y col. Med Clin 2001; 116:23-34.). De todos ellos, sólo las BMPs son osteoinductores, sin embargo todos se ven implicados en la reparación de una fractura determinada (Reddi Nature Medicine 1998, 3: 837-839; Groeneveld y Burger Eur J Endocrinol 2000; 142:9-21) También en el hueso existen células precursoras osteogénicas que responden al estímulo de la fractura, activándose y produciendo BMPs que inducen la migración de células madre mesenquimáticas (CMMs), las cuales proliferan y se diferencia en células formadoras de hueso (Guerado y col. Rev Ortop Traumatol. 2003; 47, 362-374). No obstante, el conocimiento de la compleja interrelación entre las células madre mesenquimáticas y las precursoras osteoprogenitoras con las señales bioquímicas que modulan su migración, proliferación y diferenciación hacia el linaje osteogénico, presenta todavía importantes lagunas.
Los TGF-βs constituyen un grupo de factores de crecimiento, codificados por una familia génica que se expresa en numerosos tejidos y especies (Kingsley Genes Dev; 1994; 8: 133-146; Bostrom y Asnis, Clin Orthop Relat R, 1998; 355S: 124- 131). El hueso fue uno de los primeros tejidos en los que se observó la producción local de un TGF-β con capacidad para regular la función celular (Centrella y col. J Bone Joint Surg 1991; 73-A: 1418-1428). Aunque la fuente principal de TGF-β son las plaquetas, el hueso es el depósito más importante, 100 veces mayor que la de otros tejidos blandos, donde también existe una presencia compartida de BMPs (Roberts y col. Biochemistry 1983; 22:5692-5698).
En los últimos años se han obtenido importantes resultados, a veces contradictorios, cuando se añade TGF-β a células osteoblásticas en cultivo. Su efecto mitogénico u osteodiferenciador, o lo contrario, se ha achacado a heterogeneidad celular en los cultivos, presencia de otros factores de crecimiento, densidad celular, condiciones de cultivo o a un posible efecto bifásico del factor (Noda y col., Endocrinology 1988; 124: 612-617; Stein y Lian, Cellular and Molecular Biology of Bone. San Diego: Academic Press; 47-95 1993). Estudios recientes consideran también la posible existencia de células diana diferentes para TGF-β o BMPs: mientras que los primeros parecen actuar sobre células madre ya comprometidas en el linaje osteogénico, las BMPs pueden actuar sobre células no comprometidas (Ballock y col., J. Oprthop. Res. 1997; 15:463-467). En cualquier caso, parece claro que las CMMs son capaces de auto-renovación y amplificación en presencia del TGF-βl (Andrades y col., Cells. Exp Cell Res, 1999; 250: 485- 498). Para controlar la biodisponibilidad y asegurar la presencia con cierto control de TGF-β 1 en cultivos de CMMs, recientemente se ha desarrollado un procedimiento experimental por el que, a partir de médula ósea de rata, se ha podido aislar, amplificar e inducir hacia el linaje osteogénico, una población de células, cuando se las cultiva en geles de colágeno, en presencia de un TGF-β 1 con un dominio molecular de unión específica al colágeno I. Se ha propuesto que el dominio de unión al colágeno permite una lenta liberación del factor activo dentro del gel al que está unido, alargando su vida media y mejorando su disponibilidad para actuar sobre las células diana (Andrades y col. Cells. Exp Cell Res, 1999; 250: 485-498).
Es un hecho comprobado que la capacidad de regeneración ósea disminuye con la edad. Mientras el número de células madre hematopoyéticas de la médula ósea permanece a lo largo de la vida, las CMMs de la misma disminuyen enormemente, además de apreciarse una cierta dificultad de progreso por falta de factores osteoinductores o por incapacidad de las propias células para producirlos o responder a ellos (Haynesworth y col., Musculoskeletal Soft-Tissue Aging: Impact on Mobility. Section 1, Chapter 7. Rosemont: AAOS, 80-86, 1994). Es deseable, por tanto, desarrollar procedimientos que posibiliten la selección de CMMs de individuos afectados de incapacidad de reparación ósea, su amplificación in vitro y su capacitación hacia el linaje osteogénico.
Realizado fehacientemente lo anterior, es preciso transferir las células así tratadas hasta los lugares donde el paciente necesita de reparación esquelética, vehiculizándolas con el biomaterial adecuado, desarrollando así una suerte de terapia celular autóloga que permita establecer con eficacia la función osteo- reparadora perdida o seriamente comprometida. De esta forma se evitan, además, los efectos indeseables de la inyección sistémica o local de factores bioactivos, cuyo control más allá del lugar de reparación, de momento, presenta dificultades y cuyos efectos pleitrópicos son una amenaza que no debe ser obviada.
En cualquier caso, el transplante de células capacitadas debe hacerse sobre un microambiente que propicie la osteogénesis, cuando la consolidación de dos o más fragmentos óseos es lo que se requiere. En este sentido cuando el foco fracturario o de no consolidación (pseudoartrosis) se caracterice por ser hipervascular con proliferación de tejido condro-osteogénico (no unión o pseudoartrosis hipertrófica), la simple estabilización rígida no dinámica del foco mediante implantes intra o extramedulares debe propiciar la consolidación. En estos casos, el transplante de células capacitadas hacia linaje osteogénico sobre un transportador ("carrier") de hidroxiapatita o colágeno encuentra un lecho hipervascular y estable tras la osteosíntesis, microambiente ideal para el desarrollo del callo osteogénico. En los casos de no consolidación o pseudoartrosis atrófica es preciso extirpar el tejido fibroso interpuesto entre los fragmentos, dejando hueso con hueso y buscar una fuente vascular mediante perforaciones óseas y cubrimiento con tejido vascularizado (generalmente músculo). Ambos fragmentos tienen que estabilizarse mediante osteosíntesis rígida que evite la movilidad en la interfaz ósea, ya que en caso de movimiento en la interfaz, se destruirá e impedirá la proliferación vascular, así como se estimulará la expresión de mediadores químicos que inducen condrogénesis en vez de osteogénesis (Rüedi y Murphy, AO Principies of fracture management. Sttugart, Georg Thieme Verlag. 2000; Browne y col., Skeletal Trauma, Basic Science, Management, and Reconstruction. Philadelphia, Saunders, 2003).
Es deseable también, desarrollar procedimientos para incrementar la capacidad de formación de masa ósea en individuos osteoporóticos, por procedimientos que supongan actuar en el desequilibrio existente en estos pacientes entre la formación y la reabsorción ósea, en perjuicio de la primera. La inyección sistémica de células capacitadas in vitro hacia el linaje osteogénico peπnitirá equilibrar esta ecuación.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene una evidente aplicación para la preparación de agentes y composiciones que sirven para la reparación esquelética, y más concretamente en los procesos de reparación de cartílago, hueso, osteoporosis, prótesis para artroplastias, etc., que pueden inyectarse in situ en pequeñas fractura que no unen o en lesiones cartilaginosas, en la circulación sistémica de individuos osteoporóticos o implantarse adsorbidas en el biomaterial adecuado (colágeno, hidroxiapatita, etc) para promover la formación de cartílago o hueso en lesiones de cierta entidad. Así mismo pueden adsorberse en la hidroxiapatita (periapatita) que recubre a las prótesis para artroplastias de cadera, rodilla, etc, para facilitar la integración biológica de dichas prótesis en el huésped, alargando la vida de las mismas. Estos preparados pueden emplearse también en artrodesis del raquis para promover las fusiones espinales y mejorar la eficiencia de tales operaciones realizadas por los procedimientos habituales con autoinjerto o hueso de banco.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, ésta proporciona un método para aumentar la formación de hueso y/o cartílago en un humano con necesidad de ello mediante la administración a éste de células madre mesenquimáticas humanas, diferenciadas hacia el linaje condroosteogénico mediante su amplificación con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-βl- DUC) obtenido en sistemas de expresión eucarióticos.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la administración de dichas células capacitadas se realiza mediante inyección in situ, en la circulación sistémica o mediante implantes, adsorbidas en el biomaterial adecuado. De modo preferido se realiza mediante el empleo de implantes, adsorbidas las células en el material adecuado, siendo aún más preferido el empleo de hidroxiapatita reabsorbuble, con un 50% de porosidad, cámaras de difusión o géles de colágeno.
En una realización preferida de la presente invención, las CMMs humanas han sido ayudadas en su inducción hacia el linaje condroosteogénico utilizando un glucocorticoide. Siendo preferido el empleo de dexametaxona. De un modo aún más preferido, esta inducción se realiza en presencia de dexametasoxa y β- glicerofosfato.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el factor de crecimiento transformante beta 1 fusionado con un dominio molecular de unión al colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión eucarióticos. De modo preferido se realiza la expresión empleando células de insecto, y aún más preferido es el empleo de células de insecto transfectadas con baculovirus.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de capacitación in vitro de células condroosteogénicas a partir de CMMs humanas, el cual comprende las siguientes etapas:
" el cultivo primario de las células madre en un medio suplementado con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-βl-DUC); " posterior amplificación mediante la suplementación con suero humano y TGF-βl-DUC;
" la inducción condro-osteogénica con dexametasona y β-glicerofosfato.
Las CMMs humanas pueden obtenerse de diferentes tejidos y localizaciones del propio paciente, así como de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica o de la masa interna de blastocistos humanos congelados. En una realización preferida de dicho procedimiento de capacitación, el factor de crecimiento transformante beta 1 fusionado con una dominio molecular de unión al colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión eucarióticos. De modo más preferido se emplean células de insecto para la expresión. Siendo aún más preferido el empleo de células de insecto transfectadas con baculovirus.
De acuerdo con otra realización preferida, el cultivo primario se realiza en un gel de colágeno tipo I humano.
Según otra realización preferida, la selección de las CMMs de la médula ósea se realiza en un cultivo suplementado con una cantidad entre el 0,1 y el 1% de suero humano, preferiblemente el 0,5%.
Según una realización preferida, la amplificación tiene lugar durante un periodo comprendido entre 1 a 25 días, durante los que el medio de cultivo se suplementa con una cantidad entre el 5% y el 25% de suero humano, preferiblemente el 20%.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, ésta proporciona células con capacidad condroosteogénica obtenibles de acuerdo con el procedimiento de capacitación anterior, que comprende la selección, amplificación e inducción condroosteogénica de las CMMs.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de las células con capacidad condroosteogénica obtenibles de acuerdo con el procedimiento de capacitación anterior, en la preparación de una composición para la reparación ósea y/o cartilaginosa en humanos.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición capaz de inducir osteogénesis que comprende un material biocompatible y osteoconductor, y un conjunto de células con capacidad condroosteogénica obtenibles según el procedimiento de capacitación anterior.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1.- a) Células de MO cultivadas in vitro 10 días en gel de colágeno, en presencia de rhTGF-βl-DUC. Se observan escasas células aisladas. Células de MO cultivadas 35 días en gel de colágeno (b y c), en presencia de rhTGF-βl-DUC e inducidas con dexametasona y β-glicerofosfato, respectivamente. Se observa una mayor densidad de células y algunas colonias de las mismas. x60.
Figura 2.- En a) se muestran radiografías de cuatro cámaras de difusión tras el periodo de implantación en el tejido subcutáneo de la rata. Las distintas densidades indican diferente calidad y cantidad de tejido neoformado. b) Muestra una sección histológica de una cámara tras el periodo de implantación, en la que se pusieron células cultivadas en condiciones de control, sin rhTGF-βl-DUC; su interior está lleno de material más o menos fibroso, sin que se encuentren acúmulos de tejido condro-osteoide (asterisco, filtro de la cámara). Rojo sirio- hematoxilina. xlO. c) Aspecto que presenta la sección de una cámara a baja magnificación, en la que se pusieron células procesadas in vitro en presencia de rhTGF-βl-DUC, en la que se detectan varias condensaciones de tejido neoformado (flechas) junto a los filtros (asterisco) que destacan del resto. Rojo sirio-hematoxilina. lO. d) Detalle de uno de esas condensaciones donde se distinguen dos clases de tejido, uno con aspecto cartilaginoso (circulo lleno), poco teñido, y otro intensamente teñido con aspecto osteoide (circulo vacío). Por fuera del tejido pálido se observan unas fibras más teñidas que semejan un pericondrio (flechas). Rojo sirio-hematoxilina. x40. e) Sección paralela a la anterior, teñida con tricrómico de Goldner que muestra de color azul intenso (circulo vacío) el tejido mas denso (osteoide) y en color pálido lo que se asemeja a cartílago (circulo lleno). Rodeando el acumulo aparecen unas fibras azuladas que parecen constituir una capa de pericondrio (flechas). x40. f) Cuando se colorea otra sección paralela con Azul alciano, el tejido cartilaginoso aparece de color azul (circulo lleno), mientras que el osteoide aparece sin color (circulo vacío), así como el pericondrio. x40. Estos hechos son congruentes con una neo-formación condro-osteoide. Tanto el Rojo sirio como el tricrómico tiñen intensamente el colágeno, sobre todo el del tipo I, propio del tejido óseo y el pericondrio, mientras que el Azul alciano tiñe los restos ácidos y sulfatados de los proteoglucanos, abundantes en la matriz cartilaginosa.
Figura 3.- Secciones de tejido formado en el lugar donde se practicaron los implantes de hidroxiapatita con células procesadas como se indica en el texto. Dado que el material se descalcificó antes de ser cortado y coloreado, los espacios vacíos (asteriscos) corresponden a las paredes de las trabéculas de hidroxiapatita. Los huecos entre dichas paredes ahora se encuentran llenos de un tejido que puede denominarse medular (círculos llenos), mientras que adosado a dichas trabéculas aparecen unas láminas finas de tejido neoformado (flechas). En a) se observa cómo el tejido que tapiza las paredes de la hidroxiapatita se ha es abundante en colágeno (rojo intenso con el Rojo sirio) (flechas), como se demuestra por la birrefringencia que aparece en b) al iluminar la misma sección con luz polarizada. Ese colágeno resulta ser del tipo I, como lo demuestra la positividad (flechas) que aparece cuando se tratan estos cortes de tejido con el antisuero anti-colágeno I, mostrado en c). x20. En d) se muestra, con mayores aumentos, que el nuevo tejido tiene células en su interior a modo de osteoblastos que quedan atrapados en la matriz que ellos mismos van sintetizando (Tricrómico de Goldner). El nuevo tejido se presenta con una coloración roja (tejido más maduro) o verdosa (tejido inmaduro). X40. En e) se presenta una sección de una zona próxima a la hidroxiapatita implantada (asteriscos) donde puede observarse que varias trabéculas de tejido del huésped presentan nuevas aposiciones de hueso joven de color verde-azulado, lo que indica cierta actividad osteogénica, no sólo donde pusimos la HA, sino también en los alrededores, lo que indica una "cierta osteoinducción a distacia" provocada, probablemente, por las células que "difunden" de la HA (Tricrómico de Goldner). x20. Por el contrario, en f) se muestra la sección de una zona del mismo hueso del huésped, alejada de donde fueron colocadas los fragmentos de HA, donde se ve que las trabéculas óseas no muestran adición de tejido nuevo, y por tanto que la osteoinducción no fue mucho más allá de la zona de los implantes. x20.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1.- Diseño y obtención de la proteína recombinante de fusión humana TGF-β 1 con un dominio de unión al colágeno I (rhTGF-βl-DUC).
El ADNc para el gen de TGF-β 1 se obtuvo mediante RT-PCR, usando una ADN- polimerasa con capacidad de corrección. Como molde se utilizó ARN total, extraído mediante el método de Chomczynski y Sacchi (1987), a partir de células de osteosarcoma humano MG63 (ref. en ATCC: CRL-1427). Los cebadores (primers) son diseñados con ayuda de un software (Oligo v6.6), a partir de las secuencias de los ARNm publicadas en el genbank. Los productos de PCR fueron clonados "en romo", en un plásmido de mantenimiento (pBSK II, Stratagene). Una vez clonados los genes, se comprobaron mediante secuenciación de ambas hebras. Usando como molde estos plásmidos, se amplificaron por PCR con pfu- AND-polimerasa, la región que codifica para el péptido maduro. Los cebadores que se utilizan incorporan el Dominio de Unión al Colágeno (DUC) y sitios de restricción adecuados para clonar direccionalmente en un plásmido de transferencia de un sistema de expresión en baculovirus, que contiene una secuencia para un péptido señal de secreción, específico para células de insecto (pAcGP67B, Pharmingen). Para obtener el factor sin DUC, los cebadores tenían sólo los sitios de restricción. El cebador para la cadena con sentido tenía la siguiente estructura: 5 '- (BamHI)-secuencia del DUC-GGAGGA-(NheI)-6 primeros nucleόtidos péptido maduro TGF-β 1. El cebador para la cadena antisentido estaba constituido por varios nucleótidos del extremo 5' del gen y que comprendían el codón de paro. Además tenía el sitio Not I. En todos los casos, se comprobó la construcción mediante secuenciación del producto de PCR o del plásmido de transferencia que lo contiene.
Una vez que tuvimos el plásmido de transferencia para el factor con y sin DUC, se cotransfectaron células de insecto (sf9) con una mezcla compuesta por el plásmido de transferencia y un ADN de baculovirus comercial (BacVector3000, Novagen), que tiene eliminado además del gen de la poliedrina, otros genes que codifican para cistein-proteasas. Usamos un método de transferencia mediado por liposomas (lipofectina, Novagen), según las instrucciones de la casa comercial.
Una vez transferidos los ADN a las células, se cultivaron en medio TNM-FH durante varios días, hasta que se observó afectación en las células. Durante este tiempo, en el interior de las células ocurre una recombinación homologa por la que se transfiere al ADN vírico, "río abajo" del promotor de la poliedrina, una región del plásmido que comprende la secuencia del péptido señal más la del factor con o sin DUC. Este proceso genera virus infectivos que matan a la célula, se liberan al medio e infectan a otras células.
De la mezcla de virus recombinantes que había en el sobrenadante del cultivo se seleccionó un virus recombinante. Esto se realizó mediante el ensayo de placa, el cual consiste en sembrar un cultivo de células semiconfluente con diluciones del sobrenadante de transfección. Tras el periodo de infección (lh), se cubrió la placa con agarosa disuelta en medio de cultivo y se dejó cultivando 4 días. Con esto se consiguió que la dispersión de la infección ocurra en el entorno de algunas células, lo cual generó una placa de lisis. Estas placas de lisis fueron sacadas individualmente y depositadas en un pequeño volumen de medio para extraer los virus. En función del n° y tamaño de las placas de lisis de la primera selección, este procedimiento se repitió una vez más a partir de una placa de lisis anterior y así nos aseguraremos de tener un virus recombinante clonado. Una vez amplificado este virus se analizó por PCR con los cebadores específicos para el factor, para comprobar que contenía el gen de interés. A continuación fue necesario generar un stock de gran volumen que había de ser titulado, para saber el n° de pfu/ml (unidades formadoras de placa/ml).
A partir de este punto, para cada virus recombinante, se establecieron las condiciones adecuadas de infección, con objeto de obtener una producción óptima. Para ello, se sembraron con un número conocido de células, placas de 12 pocilios. En ellas se planificó sembrar distintas proporciones de n° de virus/célula (MOI, multiplicity of infection), además de distintos tiempos de cultivo. Se probaron MOI de 0.1, 1 ó 10, muestreando a 48, 72 y 96 h de incubación. Con objeto de que el suero del medio de cultivo no contaminase con proteínas no deseadas, tras las primeras 24 horas después de la infección, el cultivo se continuó con medio sin suero o un porcentaje muy pequeño. Una vez finalizada cada situación experimental, se recogió el sobrenadante y se centrifugó para eliminar restos celulares.
Las células del pocilio se rompieron por congelación-descongelación y se realizó un extracto con PBS. Ambas muestras se analizaron por SDS-electroforesis (condiciones desnaturalizantes) y sin agentes reductores. El gel de poliacrilamida se tiñó con Azul de Coomasie ( si no fuese lo suficientemente sensible, se puede realizar una tinción con plata). También se analizaron las distintas muestras mediante inmunoblot utilizando anticuerpos específicos para TGF-β 1. Utilizamos un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y detectamos su presencia por quimioluminiscencia (CSPD, Amersham). Con esta infoπnación evaluamos la proporción de monómero/dímero que se produjo y el rendimiento del sistema.
Para obtener una cantidad importante de proteínas recombinantes, se inició un cultivo líquido de aproximadamente 250ml, con unas 500.000 cels/ml. Cuando alcanzó un crecimiento de unos 2x106 cels/ml, se inoculó con el virus, usando el MOI más alto y cuyo rendimiento fue mayor. A las 24 horas se retiró el medio con suero y se siguió cultivando las células con medio sin suero, el número de días determinado por los ensayos previos. Transcurrido este tiempo, se purificaron las proteínas según el protocolo descrito por Aono y col. (1995). El método utiliza cromatografía de intercambio catiónico, usando una columna de SP-Sepharosa (Amesham-Pharmacia). El medio de cultivo se equilibró a pH 8 y se añadió urea 4M. La columna se equilibró con un tampón Tris-HCl 20 mM pH8, urea 4M. Tras pasar por la columna el medio, se lavó con el tampón y se eluyeron las proteínas con un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0.7M. A las distintas fracciones se midió la absorbancia a 280 nm y aquellas que tenían proteínas fueron analizadas por electroforesis, siguiendo la técnica descrita anteriormente. Las fracciones positivas, fueron reunidas y concentradas por ultrafiltración y utilizadas en ensayos de actividad biológica. La concentración de proteínas de esta fracción final se midió por Bradford.
Ejemplo 2.- Obtención y preparación de células madre mesenquimáticas humanas.
Las células madre mesenquimáticas humanas se obtuvieron de médula ósea (MO) humana tras extracción quirúrgica de la cresta ilíaca de donantes informados. El tejido medular se lavó en medio completo (D-MEM GD3CO, HD, EE.UU). con antibióticos (100 mg/ml penicilina G (sigma), 50 mg/ml gentamicina (sigma) y 0,3 mg/ml de fungizona (Flow- ICN)). La suspensión de células individualizadas se obtuvo tras disgregación secuencial a través de agujas de calibre 18, 20 y 22, y finalmente filtradas a través de filtros estériles de teflón de 20 micrómetros (Cell Strainer, Falcon, Lincoln Park, NJ) para separar restos de tejido y acúmulos celulares.
Ejemplo 3.- Cultivo de MSCs en geles de colágeno
La suspensión celular obtenida según el ejemplo 2, se centrifugó a 100 g durante 5 min. El centrifugado se resuspendió en medio de cultivo con muy baja concentración de suero del propio paciente (SH, 0,5%).
Antes de disponer las células en los pocilios de cultivo, placas de 48, se depositó en el fondo de los mismos 100 mi. de una solución de colágeno I humano (Sigma- Aldrich), a una concentración de 0,35 mg/ml. a pH 7.4. Sobre una capa se depositaron 150 mi por pocilio, de una mezcla de colágeno I, TGF-β 1 a una concentración de lmg/ml. y 2xl06 células de médula ósea. Las placas de cultivo se introdujeron en la estufa de cultivo a 37°C, durante 15 min. para permitir la formación del gel de colágeno, que hasta este momento se mantenía líquido. A continuación se depositaron 150 mi por pocilio de medio de cultivo que también contenía la misma concentración de TGF-β 1. Los cultivos así dispuestos se cultivaron en atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2, a 37°C y 100% de humedad relativa. Cada 3 días se cambió el medio de cultivo, añadiendo en cada caso, la misma concentración de TGF-β 1.
La concentración óptima de TGF-β 1 fue investigada en ensayos previos de respuesta quimiotáctica. Para cada condición experimental se mezclaron 150 mi de colágeno (0,35 mg/ml) con la concentración del factor previamente seleccionado como la de mayor capacidad quimiotáctica. Cultivos confluentes de médula ósea de rata se disociaron y las células se colocaron en el compartimento superior de las cámaras Boyden (Neuroprobe, Rockville, MD) a una concentración 2x105 células/ml de D-MEM. El compartimiento inferior de la cámara contenía el medio con las distintas concentraciones del factor a ensayar. Después de 4 h. de incubación a 37 °C en 5% de CO2, se sacaron los filtros y se fijaron en metanol; se lavaron, se tiñeron y se montaron en portas. La quimiotaxis se cuantificó contando el número de células que migraban en 20 campos del microscopio (x400) en cada filtro. Ejemplo 4.- Procedimiento experimental para la capacitación de las células (selección, amplifiación e inducción).
Las células de MO se mantuvieron en las condiciones experimentales descritas antes durante 10 días, cambiando el medio de cultivo, y por tanto el TGF-β 1, cada 3 días. Transcurridos esos 10 días se implemento el medio de cultivo con 10% de suero del propio paciente (SH 10%). Terminando así el período denominado de selección y comienza el de amplificación, que se mantuvo durante el tiempo necesario para obtener una cantidad de células que haga posible el transplante, pero en todo caso, este período no debe superar los 25 días. Terminado este período el medio se implemento con dexametasona (10" M) y β-ghcerofosfato (2 mM) que actúan como agentes químicos osteoinductores. A este período de sólo 2 días se le llama de inducción.
Durante el tiempo que duró el cultivo de las células, se tomaron muestras a los días 0, 10, 14, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 36 y se realizaron análisis del n° de células y presencia de fosfatasa alcalina y contenido de calcio. Las Tablas I, II, III representan los valores obtenidos. En ellas se observa cómo el TGF-βl-DUC incrementa el número de células respecto al control. Lo mismo ocurra con la síntesis de fosfatasa alcalina. El contenido de calcio también va incrementándose con los días de cultivo, mientras que en el control los valores son imperceptibles.
El examen microscópico de los cultivos durante el proceso descrito, muestra cómo las células proliferan a lo largo de los días de cultivo e incluso forman colonias durante el período de amplificación, cuando están en presencia de TGF-βl-DUC (Figura 1). Cuando las células son tratadas con el TGF-β 1 comercial (R&D Systems, Minneapolis, MN), permanecen dispersas o escasamente agrupadas. TABLA 1. Efecto de las condiciones de cultivo sobre la replicación celular (μg ADN).
Días de cultivo
0 10 14 18 21 24 27 30 33 36
Control 28.5 ±1.55 2.9 ±0.67 4.9 ±0.52 6.6 ±0.91 8.2 ±0.86 8.5 ±0.74 9.0 ±0.70 9.3 ±0.82 9.7 ±0.88 10.6 ±0.76 rhTGF-βl-F2 O.O±O.OO 6.8±0.89 14.1 ±2.74 19.5±2.79 20.3 ±1.49 22.8 ±1.65 25.4±2.10 27.8±2.23 29.1±2.00 31.7 ±2.56
Los datos corresponden a los valores medios y sus ± SD para cada cuatro muestras.
O
D TABLA 2. Efecto de las condiciones de cultivo sobre la actividad fosfatasa alcalina (U FAμg ADN) m Días de cultivo c
10 14 18 21 24 27 30 33 36
C Control 2.2±0.20 0.2 ±0.01 1.0 ±0.03 1.4 ±0.06 1.4 ±0.05 1.5 ±0.07 1.5 ±0.09 1.5±0.12 1.4±0.10 1.44±0.11
O
Z rhTGF-βl-F2 2.2±0.20 1.0 ±0.03 2.9±0.27 3.8 ±0.21 3.4 ±0.17 3.5±0.15 3.5 ±0.21 4.2±0.28 3.6±0.24 3.18±0.19 rπ Los datos corresponden a los valores medios y sus ± SD para cada cuatro muestras.
O i- >
£* TABLA 3. Efecto de las condiciones de cultivo sobre el contenido en calcio (μg Ca/pocillo).
*"" Días de cultivo
0 10 14 18 21 24 27 30 33 36 rhTGF-βl-F2 ND ND ND 0.045±0.07 0.062±0.08 0.075±0.06 0.086±0.09 0.170 ±0.01 0.171 ±0.01 0.173 ±0.01
ND, no se detecta, p < 0.01 comparado con los cultivos controles. Los datos corresponden a los valores medios y sus ± SD para cada cuatro muestras.
Ejemplo 5.- Transferencia de las células capacitadas.
Terminado el período de cultivo, los geles de colágeno se digirieron con colagenasa y se disgregaron las células con tripsina 0,05 % y EDTA 0,02 %, a 37 °C. Las células se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en medio sin suero. Tras el recuento correspondiente, parte de ellas se introdujeron en cámaras de difusión Millipore que se implantaron en el tejido subcutáneo de la rata, y otra parte se absorbieron en fragmentos de hidroxiapatita que se implantan en una lesión ósea concreta (Figura 3).
Ejemplo 6.- Implantación subcutánea. Formación de hueso ectópico.
Las cámaras de difusión con lxl O6 células humanas capacitadas por el procedimiento descrito y suspendidas en medio sin suero se implantaron subcutáneamente en la espalda de ratas Fischer 344 hembras de 7 meses de edad, previa anestesia con inyección subcutánea de pentobarbital sódico 3,5 mg/100 g de peso corporal. Se practicó una incisión de 2 cm. en la línea media de la espalda para introducir las cámaras. Cada rata albergó varias cámaras con células tratadas con TGF-βl-DUC y otras control, con células que transcurrieron el período de cultivo sin tratamiento o con TGF-β 1 comercial. Las heridas fueron suturadas y desinfectadas con Betadine. Cuatro semanas después (período de implantación), las ratas fueron sacrificadas por sobredosis de anestésico y las cámaras extraídas para su estudio histológico y radiográfico. Este último se practicó con rayos X de baja intensidad. Para el estudio histológico, las cámaras se fijaron en Bounin o en Formalina tamponada al 10%. Tras la fijación se disolvió el anillo plástico de las cámaras por inmersión en acetona. Tras la deshidratación, se incluyeron en parafina y se cortaron sagitalmente a varios niveles, a 5 micrómetros de grosor. Las secciones fueron teñidas por diferentes técnicas histoquímicas o inmunocitoquímicas con anticuerpos contra diferentes tipos de colágeno, con objeto de analizar el tejido formado en el interior de las cámaras durante el período de implantación.
En la figura 2 se presentan imágenes radiográficas e histológicas de diferentes cámaras que demuestran la naturaleza cartilaginosa y ósea del tejido formado en las mismas. Frente a las cámaras control en las que apenas se observa un tejido fibrilar, en las experimentales se observan grandes superficies de tejido con características cartilaginosas, junto a otras donde la matriz osteoide parece el preludio de un tejido óseo plenamente constituido. Los datos sugieren que el tejido cartilaginoso parece transformarse en osteoide-óseo, por lo que ello parece indicar que en el interior de las cámaras se da un autentico proceso de osificación endocondral.
Ejemplo 7.- Ejemplo de Implantación en una fractura de tibia. Fragmentos de hidroxiapatita Proosteon 500 (hiterpore) de alrededor de 0,5 cm de diámetro fueron embebidas con la suspensión celular, goteando sobre ellas varios microlitros, y cambiando la posición de las mismas para asegurar que la mayoría de sus cavidades quedaban llenas de células. Las células así dispuestas se trasladaron al quirófano, cuidando la asepsia y la temperatura ligeramente por encima de los 0°C. Anestesiado el paciente, se procedió a la preparación de las superficies de fractura y se introdujeron separadamente los fragmentos de hidroxiapatita. Esta fractura era realmente una no unión o pseudoartrosis atrófica, caracterizada por un foco avascular con tejido fibroso, sin proliferación de tejido condro-osteogénico vascularizado. Por tanto, previamente al implante, y en el mismo tiempo quirúrgico, se extirpó el tejido fibroso de los extremos fracturarios, dejando ambas superficies en tejido óseo esclerótico y perforándolas hasta encontrar respectivamente proximal y distalmente una fuente vascular. Los fragmentos de hidroxiapatita se colocaron en los agujeros y periféricos al foco fracturario "on lay". El resto de los fragmentos de hidroxiapatita, hasta un total de 95, se colocaron en la línea de fractura. Tras colocar los fragmentos de hidroxiapatita con las células cóndro-osteocompetentes, ambos fragmentos óseos se estabilizaron de forma rígida, no dinámica, mediante una placa atornillada de titanio a compresión con tornillos también de titanio, cumpliendo un principio de neutralización
En la figura 3 se presentan imágenes de secciones histológicas realizadas en biopsia tras seis semanas de implantación. En ellas se muestra el tejido neoformado en contacto con las paredes de la hidroxiapatita con cualidades de tejido óseo, así como la formación de tejido medular en los huecos que quedan entre las trabéculas del mineral. Las pruebas que se presentan demuestran que el tejido formado tiene características de hueso en proceso de maduración. Así mismo, las imágenes muestran que la osteoinducción se extiende a las proximidades de los implantes pero no mucho más allá, lo que puede explicarse porque las células transplantadas son las responsables de tal osteoinducción, extendiéndose esta allí donde las células, de forma espontánea, difunden en la zona del implante. Las zonas más alejadas del implante no presentan síntomas de osteoinducción.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de células madre mesenquimáticas humanas diferenciadas hacia el linaje condroosteogénico mediante su amplificación con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-βl-DUC) obtenido en sistemas de expresión eucarióticos en la preparación de un medicamento para la reparación ósea y/o cartilaginosa.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación anterior 1, caracterizado porque dicho medicamento se administra por inyección in situ, en la circulación sistémica o mediante implantes, adsorbidas en el biomaterial adecuado.
3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la administración se realiza mediante implantes, adsorbidas en el material adecuado.
4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque el material empleado para el implante es hidroxiapatita o cámaras de difusión.
5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque las células madre mesenquimáticas humanas han sido inducidas utilizando un glucocorticoide.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación anterior 5, caracterizado porque el glucocorticoide es dexametasona.
7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 5 a 6, caracterizado porque en la inducción además se emplea β-glicerofosfato.
8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque el factor de crecimiento transformante beta 1 fusionado con un dominio molecular de unión al colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión eucarióticos.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación anterior 8, caracterizado porque el sistema de expresión empleado son células de insecto.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación anterior 9, caracterizado porque las células de insecto han sido transfectadas con baculovirus.
11. Un procedimiento de capacitación in vitro de células condro-osteogénicas a partir de células madre mesenquimáticas humanas, caracterizado porque comprende las etapas de: a. el cultivo primario de las células madre en un medio suplementado con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-βl-DUC); b. posterior amplificación mediante la suplementación con suero humano y TGF-βl-DUC; c. la inducción condro-osteogénica con dexametasona y β- glicerofosfato.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior 11, caracterizado porque el factor de crecimiento transformante beta 1 fusionado con un dominio molecular de unión al colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión eucarióticos.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior 12, caracterizado porque el sistema de expresión empleado son células de insecto.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior 13, . caracterizado porque las células de insecto han sido transfectadas con baculovirus.
15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 14, caracterizado porque el medio de cultivo es un gel de colágeno tipo I humano.
16. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 15, caracterizado porque la suplementación inicial del medio de cultivo se realiza con una cantidad entre el 0,1% y el 1% de suero humano, preferiblemente el 0,5%.
17. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 16, caracterizado porque la amplificación tiene lugar durante un periodo comprendido entre 1 a 25 días, durante los que el medio de cultivo se suplementa con una cantidad entre el 5% y el 25% de suero humano, preferiblemente el 20%.
18. Células con capacidad condroosteogénica obtenibles de acuerdo con el procedimiento de capacitación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 17.
19. Uso de las células con capacidad condro-osteogénica de acuerdo con la reivindicación anterior 18, en la preparación de una composición para la reparación ósea y/o cartilaginosa en humanos.
20. Composición capaz de inducir osteogénesis caracterizada porque comprende un material biocompatible y osteoconductor, y un conjunto de células con capacidad condro-osteogénica obtenidas según el procedimiento de capacitación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores 11 a 17.
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