KR19990082999A - 연골 유도를 위한 골유도 단백질과 배화 인자의 조합물의 용도 - Google Patents

연골 유도를 위한 골유도 단백질과 배화 인자의 조합물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 10:1 내지 1:10의 비의 골유도 단백질 및 배화 인자(dorsalizing factor)를 함유하는, 연골형성에 유용한 약학 제제에 관한 것이다.

Description

연골 유도를 위한 골유도 단백질과 배화 인자의 조합물의 용도{USE OF A COMBINATION OF AN OSTEOINDUCTIVE PROTEIN AND A DORSALIZING FACTOR FOR CARTILAGE INDUCTION}
본 발명은 골유도 단백질과 배화 인자(dorsalizing factor)의 조합물을 사용하여 간엽조직 간세포(stem cell)로부터 연골세포를 유도하기 위한 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
골유도 단백질은 연골세포 및 골세포로의 간엽조직 간세포의 분화를 유도하는 단백질이고, 예를 들면 헤지호그 단백질(hedgehog protein)(소닉(Sonic(Shh)), 인디안(Indian(Ihh)), 데저트(Desert(Dhh)); 킨토(Kinto) 등의 문헌[FEBS Letters, 404(1997) 319-323]) 또는 뼈 형태형성 단백질이다.
뼈 형태형성 단백질(BMP)은 뼈, 연골, 힘줄 및 뼈에 존재하는 기타 조직의 형성을 책임지는 분자이다. 뼈에서 이들 단백질의 존재와 함께 이들 단백질의 특이한 유도 활성은 단백질이 뼈 복원 과정의 중요한 조절 물질이고 뼈 조직의 정상 유지에 관련될 수 있다는 것을 시사한다. 여러 아과로 나누어질 수 있는 많은 이런 단백질은 공지되어 있다(레디(Reddi, A.H.)의 문헌[Cytokine & Growth Factor Reviews, 8 (1997) 11-20]). 이런 BMP는 예를 들면 BMP-2 내지 BMP-14 및 GDF-1 내지 GDF-14이다.
BMP는 다형질발현 조절 물질이고, 따라서 주화성, 유사분열 및 분화와 같은 뼈 및 연골 형성에서 다중 연속 단계를 조절한다. 특히, BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7은 연골형성 및 골형성을 개시한다.
그러나, BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7은 골형성의 부수적인 유도 없이는 단독으로 연골형성을 유도할 수 없다. 따라서, 연골내의 뼈 형성과 관련된 BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7의 약학적인 적용은 언제나 연골세포 및 골세포 유도를 일으킨다. 그러나, 연골 조직의 복원에 관련하여, 골형성의 부수적인 유도 없이 연골형성을 개시하는 것이 유리할 것이다.
뼈 형태형성 단백질 길항물질은 BMP의 골형성 성질을 억제하는 물질이고, 예를 들면 노긴(noggin), 코딘(chordin) 또는 폴리스타틴(follistatin)이다.
노긴은 예를 들면 미국 특허 제 5,670,481 호에 기술된 성장 인자이고 뼈 형태형성 단백질(BMP) 길항물질이다. 노긴은 스페만(Spemann) 형성체에서 발현되고, 스페만 형성체의 효과, 즉 중배엽의 신경 유도 및 배화의 매개체라고 생각된다. 노긴이 척삭 및 두부 중배엽에서 발현되기 때문에, 노긴은 신경판의 배-복 패턴 또는 복측-배측 패턴에 영향을 미친다고 생각된다. 노긴이 팔 궁상 신경능에서 발현되기 때문에, 노긴은 신경능 세포가 연골에 침적하는지 여부에 영향을 미치고, 또한 이후의 팔 궁상 성장 및 개조에 영향을 미친다고 생각된다. 노긴은 꼬리 지느러미 신경능에서 형성되고, 신경능이 지느러미의 성장에 필요하기 때문에, 노긴은 표피 또는 간엽조직에 대한 성장 인자로서 작용할 수 있다.
노긴은 높은 친화성으로 BMP-4와 결합할 수 있고(피콜로(Piccollo) 등의 문헌[Cell, 86(1996) 12141-12145]), BMP에 대한 길항물질이다(레엠-칼마(Re'em-Kalma) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(1995) 12141-12145]; 사사이(Sasai) 등의 문헌[Nature, 376(1995) 333-336]; 및 파인소드(Fainsod) 등의 문헌[Mechanisms of Development, 63(1997) 39-50]).
코딘은 분비 폴리펩티드이고 강력한 배화 및 신경 유도 인자이다(미국 특허 제 5,679,783 호; 사사이 등의 문헌[Cell, 79(1994) 779-790]). 코딘은 스페만 형성체에서 발현된다. 코딘 과발현은 척삭 및 신경 조직을 유도하고, 중배엽을 유도하지 않는다. 그러나, 코딘은 중배엽 특이화를 변형시킬 수 있다. 코딘 발현은 노긴과 중복되고, 노긴에 대해 유사하게 작용할 수 있다. 코딘은 BMP-4에 대해 길항적으로 작용하고(파인소드 등의 문헌[EMBO, 13(1994) 5015-5025]), 높은 친화성으로 BMP-4와 결합할 수 있다(피콜로 등의 문헌[Cell, 86(1996) 589-598]).
폴리스타틴은 분비 폴리펩티드이고, 스페만 형성체에서 발현되며, 원래 액티빈의 단백질 결합 및 액티빈 기능의 억제로서 기술된 바와 같이 배화 및 신경 유도 인자로서 작용한다(나카무라(Nakamura) 등의 문헌[Science, 247(1990) 836-838]; 헴마티-브리반로우(Hemmati-Brivanlou) 등의 문헌[Cell, 79(1994) 169-179]). 폴리스타틴은 또한 BMP와 결합할 수 있다(파인소드 등의 문헌[Mechanisms of Development, 63(1997) 39-50]).
연골 결손의 경우에, 성공은 단지 제한적으로 이루어졌다. 표준 과정은 원섬유화된 관절 연골 깍기, 좌멸괴사조직 제거술, 스폰지올레이지에이션(spongiolaziation), 찰과 연골 성형술, 절골술, 미세골절 및 연골 이식 기법, 예를 들면 연골주위 자가이식, 골막 자가이식이다. 단순하고 효과적인 치료는 아직 알려지지 않고 있다(히쓰(Heath) 및 마가리(Magari)의 문헌[Biotechnology and Bioengineering, 50(1996) 430-437]에 의한 평론을 참조한다). 신규한 치료법은 연골 세포 이식, 성장 인자 치료법, 세포 치료법(미국 특허 제 5,486,359 호), 유전자 치료법, 새로운 생체적합 물질을 수반할 수 있다. 현재 이들은 아직 사용되고 있지 않다.
본 발명의 목적은 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 골형성 인자와 뼈 형태형성 단백질 길항물질의 조성물을 사용하여 연골을 복원하는 방법을 제공한다.
놀랍게도, 골유도(골형성) 단백질, 바람직하게는 뼈 형태형성 단백질 2, 4, 5 및 7 또는 헤지호그 단백질은 10:1 내지 1:10의 비(BMP:노긴)로 존재할 때 노긴, 코딘 및 폴리스타틴과 같은 BMP 길항물질에 의해 생체내에서 완전하게 억제되지 않는다는 것이 발견되었다. 그러나, 여기에서 골형성 개시는 크게 억제되지만, 연골형성은 대개 영향을 받지 않고 진행된다. 본 발명에 따른 효과를 위해, BMP 길항물질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5 및 BMP-7에 대해 높은 결합 친화성을 나타내는 것이 필수적이다.
"골유도 단백질"은 바람직하게는 간엽조직 간세포를 기본으로 한 BMP-의존성 골형성을 유도하는 골형성 단백질로 이해된다. 이에 의해 BMP가 업레귤레이트(upregulate)되고, 이것은 연골세포의 형성을 일으킨다. BMP-의존성 골형성의 이런 유도는 예를 들면 BMP 그자체를 통해 또는 세포에서 BMP의 발현을 유도하는 물질, 예를 들면 헤지호그 단백질을 통해 이루어질 수 있다.
BMP-의존성 골형성을 유도하는 물질의 능력은 단순한 방법으로 시험될 수 있다. 이 목적을 위해, 예를 들면 간엽조직 세포, 예를 들면 C3H10T1/2 세포를 잠재적 골유도 인자의 존재하 및 부재하에 배양한다. 대조군 및 처치된 세포는 오스테오칼신 및 알칼리 포스페이테이즈 활성에 대해 측정된다. 오스테오칼신은 예를 들면 다코 캄파니(Dako Co.)로부터 상업적으로 시판되는 엘리사(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 알칼리 포스페이테이즈는 적합한 비색 기질, 예를 들면 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 광도계에 의해 측정될 수 있다. 오스테오칼신 및/또는 알칼리 포스페이테이즈의 증가된 활성은 골유도로서 기록된다. 다르게는, 오스테오칼신 및 알칼리 포스페이테이즈의 업레귤레이션(upregulation)은 오스테오칼신 및 알칼리 포스페이테이즈에 적합한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 측정된다.
본 발명에 따른 "배화 인자"는 뼈 형태형성 단백질 길항물질과 같이 BMP, 바람직하게는 BMP-2 또는 헤지호그의 골유도성을 억제하는 물질, 바람직하게는 단백질로 이해된다. 이런 억제는 예를 들면 뼈 골수 기질 세포 라인 검사(짐머만(Zimmermann) 등의 문헌[Cell, 86(1996) 599-606])로 측정될 수 있다. 배화 인자는 크세노푸스(Xenopus)에서 배 구조의 형성을 증진시키는 성질을 갖는다. 배화 활성은 크세노푸스 동물 캡 검사(animal cap assay)에 의해 측정될 수 있다. 크세노푸스 동물 캡 검사(루이지 알타바(Ruizi Altaba)의 문헌[Essential Developmental Biology, A Practical Approach, IRL Press, 1993, IRL Press, pp. 147-152]; 램(Lamb) 등의 문헌[Science, 262(1993) 713-718])는 신경 유도를 측정하는데 사용된다. 치료 후 동물 캡은 신경 마커, 예를 들면 NCAM의 존재 및 중배엽 마커, 예를 들면 근육 액틴의 부재에 대해 염색된다. 이런 인자들은 예를 들면 노긴, 코딘 및 폴리스타틴이다(파인소드 등의 문헌[Mechanisms of Development, 63(1997) 39-50]). BMP 길항물질은 예를 들면 레엠-칼마 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(1995) 12141-12145]; 사사이 등의 문헌[Nature, 376(1995) 333-336]; 및 파인소드 등의 문헌[Mechanisms of Development, 63(1997) 39-50])에 기술되어 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 골형성 단백질 및 배화 인자는 유전자 치료를 통해 세포에 도입될 수 있다. 이 방법을 위해, 골형성 단백질 및 배화 인자에 대한 유전자 코딩(coding)은 바람직하게는 같은 프로모터의 조절하에서 하나의 벡터에 또는 별개의 벡터에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 골유도 단백질 및 배화 인자를 발현할 수 있는 발현 벡터, 또는 골유도 단백질을 발현할 수 있는 벡터와 배화 인자를 발현할 수 있는 벡터의 조합물이 약학적 조성물의 필수 성분으로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법을 개시한다.
골형성 인자 및 배화 인자의 효과적인 발현을 위해, 벡터에 강한 프로모터를 사용하는 것이 필요하다. 이런 프로모터는 예를 들면 PGK 또는 CMV 프로모터이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 이런 강한 프로모터, 선택된 유전자의 전체-길이 mRNA, 예를 들면 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, Shh, Ihh 또는 Dhh, 노긴, 코딘 또는 폴리스타틴, 인공 인트론(intron) 및 폴리-A-부위로 구성된다. 적용을 위해, DNA는 콜라겐 해면체에 동결건조되거나 임의의 다른 적합한 담체, 바람직하게는 하이알루론 산 또는 알기네이트와 함께 적용된다.
본 발명에 따른 약학적 배합물은 또한 예를 들면 조성물의 전달 및/또는 지지 및/또는 연골 형성을 위한 표면을 제공하는데 적당한 매트릭스를 포함할 수 있다. 매트릭스는 골유도 단백질 및 뼈 형태형성 단백질 길항물질의 느린 방출을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 생체적합성 및/또는 생분해성인 매트릭스를 포함한다. 조성물을 위한 가능한 매트릭스는 예를 들면 하이알루론산, 알기네이트, 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록실아파타이트, 폴리락트산, 폴리언하이드라이드 또는 콜라겐을 함유한다.
투여 양생법은 본 발명의 배합물의 작용을 변형하는 여러 사실을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 배합물의 작용을 변형할 수 있는 인자는 형성시키고자 하는 연골의 양, 적용 부위, 손상 상태, 환자의 연령, 성별, 식사, 감염 정도, 투여 시간 및 다른 임상적인 인자를 포함한다. 투여량은 연골의 재구성에 사용된 매트릭스의 형태에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 뼈 형태형성 단백질과 뼈 형태형성 단백질 길항물질을 혼합하므로써 10:1 내지 1:10의 비로 뼈 형태형성 단백질과 뼈 형태형성 단백질 길항물질을 함유하는 약학적 조성물을 제조하는 방법, 및 생체내에서 연골형성, 특히 연골 결손이 있어서 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한 약학적 조성물의 용도이다.
다음의 실시예 및 참고 문헌은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 개시된다. 기술된 과정에서 본 발명의 요지로부터 이탈함이 없이 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다.
실시예 1
마이크로매스(micromass) 마우스 사지 검사
사지 아(bud)를 살균 조건하에서 미세해부 가위 및 시계제조용 핀셋을 사용하여 E11 마우스 배자(NMRI)로부터 단리한다. 헹구고 칼슘 없는 식염수 및 마그네슘 없는 식염수에서 헹구고 항온배양하고 이어서 37℃에서 1 %의 트립신 용액에서 20분동안 항온배양한 후 1 ml 피펫으로 반복된 흡인에 의해 분리시키므로써 세포 현탁액을 수득한다. 세포를 햄 배지(Ham's medium)에서 ml당 2 × 107개로 조정하고, 5개의 10 μl의 분취물을 살균 페트리 디쉬에 놓는다. 2시간의 배양 후, 2 ml의 햄 배지를 첨가하는데, 이때 햄 배지만 또는 햄 배지와 함께 10 ng/ml 미만 내지 약 100 μg/ml의 다양한 투여량으로 (a) BMP 길항물질 노긴, 코딘 또는 폴리스타틴(단독으로), (b) BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7 또는 Shh, 및 (c) BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7 또는 Shh와 길항물질의 조합물로 구성된 시험 화합물을 첨가한다. 배지는 5일의 배양기동안 변화하지 않는다. 이어서, 배양물을 고정시키고, 알시안 블루 또는 크리스탈-바이올렛으로 염색하고, 수돗물로 새척하고, 건조시킨다(스틸(Steele) 및 코핑(Copping)의 문헌[Postimplantation Mammalian Embryos, A Practical Approach, IRL Press 1990, 229-232]). 연골형성에 대해서는 알시안 블루로 염색하고 결합조직형성세포와 같은 세포에 대해서는 크리스탈-바이올렛으로 염색한 후 분화를 평가한다. 또한, 연골(예를 들면, 콜라겐 II, MIA, 콜라겐 X) 및 뼈 마커(예를 들면, 오스테오칼신, 알칼리 포스페이테이즈, 오스테오폰틴)의 발현에 대해 정량적 RT-PCR 분석을 수행한다.
실시예 2
연골세포 배양
2달된 마우스(NMRI)로부터 단리된 관절 연골세포에 대해, 경골 플래토우(plateau)를 무릎 관절로부터 외과적으로 수거하고, 관절 조직으로부터 조심스럽게 윤활 공동에 면한 섬유연골층을 포함한 오염성 부착 조직을 제거한다. 조직을 외과용 칼로 세분하고, 행크(Hank) 완충 식염수 용액중의 0.25 %의 트립신과 0.1 %의 조콜라게네이즈 혼합물에서 16시간동안 항온배양한다. 세포를 9일동안 단층 또는 아가로스 배양물(3차원 매트릭스)로서 혈청-없는 고글루코스 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 생육시킨다(드안젤로(d'Angelo) 및 파시피시(Pacifici)의 문헌[J. Bone and Min. Res, 12(1997) 1368-1377]). 세포를 10 ng/ml 미만 내지 약 100 μg/ml의 다양한 투여량으로 (a) BMP 길항물질 단독, (b) 유도 또는 변형 인자 단독, 및 (c) 유도 또는 변형 인자와 길항물질의 조합물로 처리한다. 치료 9일 후, 초기 증식 연골 마커(예를 들면, 콜라겐 II, MIA), 후기 성숙한 연골 마커(예를 들면, 콜라겐 X) 및 섬유 조직 마커(예를 들면, 콜라겐 I)의 발현에 대해 정량적 RT-PCR 분석을 수행한다.
실시예 3
연골, 뼈, 힘줄 및 인대 유도에 대한 마우스 생물검사
샘파쓰(Sampath) 및 레디(Reddi) 래트 전위성 삽입물 검사와 유사하게, 마우스 전위성 삽입물 검사를 2달된, 이계교배된 NMRI 마우스 또는 동계교배된 C3H 마우스를 사용하여 수행한다(샘파쓰 및 레디의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(1983) 6591-6595]; 국제 특허 공개공보 제 WO 95/16035 호). (a) BMP 길항물질(단독으로), (b) 유도 또는 변형 인자(단독으로), 및 (c) 유도 또는 변형 인자와 길항물질의 조합물을, BMP 단백질에 적당한 완충제, 예를 들면 0.1 %의 트리플루오로아세트산에서 동결건조한다. 인자 조합물의 경우, 완충제는 안정성에 따라 선택된다. 생체적합성, 생분해성, 안정성 및 기계적인 성질을 기준으로 임의의 적합한 담체, 예를 들면 콜라겐 타입 I 매트릭스, 콜라겐-헤파린 혼합물, 젤라틴 캡슐, 하이알루론산 또는 다른 기능적으로 동일한 장치가 사용될 수 있다.
삽입물은 7일 및 14일동안 마우스의 뒷다리 근육내에 설치한다. 7일 및 14일 후, 마우스를 경추 전위에 의해 죽인다. 삽입물을 단리하고, 표준 조직학 기법을 사용하여 처리한다(문헌[Theory and Practice of Histological Techniques, ed. Bancroft and Stevens, Churchill Livingstone 1996]을 참조한다). 파라핀(8 μm) 또는 글리콜메타크릴레이트 부분(1 μm)을 톨루이딘 블루, 알시안 블루, 폰 코사, 모바트 또는 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 가시화하고 각각의 삽입물내에 유도된 힘줄, 인대, 연골 및 뼈 조직의 양을 정량한다. 양의 삽입 대조군 그룹(예를 들면, BMP-2, GDF-5) 및 음의 삽입 대조군 그룹(예를 들면, 모조 장치)을 실험 삽입물과 비교한다.
유도된 연골 및/또는 뼈의 양을 평가하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 연골 및 뼈 마커에 대해 RNA 동일반응계 잡종형성 및 정량적 RT-PCR에 의해 유전자 발현을 연구할 수 있다.
실시예 4
전체 두께 관절 연골 복원 모델
다 자란 래빗의 대퇴-슬개골 관절에서의 전체 두께 관절 연골 결손 모델을 사용하여 BMP 길항물질, 유도 또는 변형 인자 및 담체의 조합물이 연골 및 뼈 복원에 영향을 미치는 능력을 평가한다. 다 자란 래빗을 마취시키고, 살균 외과용으로 준비한다. 관절 연골을 지나 그 아래의 아연골 뼈내로의 4 × 4 mm 이하의 결손에 무릎 관절의 슬개골 구내로 구멍을 뚫는다. 결손을 비우거나, 적당한 담체로 채우거나, BMP 길항물질과 유도 또는 변형 인자, 또는 각각의 인자만을 함유한 담체로 채운다. 동물을 4주동안 자유롭게 움직이게 한다. 4주 후, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 관절 연골/아연골 뼈 결손 부위를 조직 구조, 복원의 양 및 질에 대해 조직학적으로 평가한다.
실시예 5
부분 두께 관절 연골 복원 모델
다 자란 래빗의 대퇴-슬개골 관절에서의 부분 두께 관절 연골 결손 모델을 사용하여 BMP 길항물질, 유도 또는 변형 인자 및 담체의 조합물이 연골 및 뼈 복원에 영향을 미치는 능력을 평가한다. 다 자란 래빗을 마취시키고, 살균 외과용으로 준비한다. 밑에 있는 아연골 뼈를 원상태로 놔눈 채 4 × 4 mm 이하의 구멍을 무릎 관절의 슬개골 구내로 뚫는다. 결손을 비우거나, 적당한 담체로 채우거나, BMP 길항물질과 유도 또는 변형 인자, 또는 각각의 인자만을 함유한 담체로 채운다. 동물을 4주동안 자유롭게 움직이게 한다. 4주 후, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 관절 연골/아연골 뼈 결손 부위를 조직 구조, 복원의 양 및 질에 대해 조직학적으로 평가한다.
실시예 6
DNA를 사용한 연골, 뼈, 힘줄 및 인대 유도에 대한 마우스 생물검사
샘파쓰 및 레디 래트 전이성 삽입물 검사와 유사하게, 마우스 전이성 삽입물 검사를 예를 들면 2달된, 이계교배된 NMRI 마우스 또는 동계교배된 C3H 마우스를 사용하여 실행한다(샘파쓰 및 레디의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(1983) 6591-6595]; 국제 특허 공개공보 제 WO 95/16035 호). (a) 배화 인자(단독으로), (b) 골유도 인자(단독으로), 및 (c) 둘 모두의 조합물에 대한 발현 벡터를 적당한 완충제, 예를 들면 TE-완충제에서 동결건조시킨다(팡(Fang) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(1996) 5753-5758]). 생체적합성, 생분해성, 안정성 및 기계적인 성질을 기준으로 임의의 적합한 담체, 예를 들면 콜라겐 타입 I 매트릭스, 콜라겐-헤파린 혼합물, 젤라틴 캡슐, 하이알루론산 또는 다른 기능적으로 동일한 장치가 사용될 수 있다.
삽입물은 7일 및 14일동안 마우스의 뒷다리 근육내에 설치한다. 7일 및 14일 후, 마우스를 경추 전위에 의해 죽인다. 삽입물을 단리하고, 표준 조직학 기법(문헌[Theory and Practice of Histological Techniques, ed. Bancroft and Stevens, Churchill Livingstone 1996]을 참조한다)을 사용하여 처리한다. 파라핀(8 μm) 또는 글리콜메타크릴레이트 부분(1 μm)을 톨루이딘 블루, 알시안 블루, 폰 코사, 모바트 또는 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 가시화하고 각각의 삽입물내에 유도된 힘줄, 인대, 연골 및 뼈 조직의 양을 정량한다. 양의 삽입 대조군 그룹(예를 들면, BMP-2, GDF-5) 및 음의 삽입 대조군 그룹(예를 들면, 모조 장치)을 실험 삽입물과 비교한다. 유도된 연골 및/또는 뼈의 양을 평가하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 연골 및 뼈 마커에 대해 RNA 동일반응계 잡종형성 및 정량적 RT-PCR에 의해 유전자 발현을 연구할 수 있다.
참고 문헌
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문헌[Theory and Practice of Histological Techniques, ed. Bancroft and Stevens, Churchill Livingstone 1996]
미국 특허 제 5,486,359 호
미국 특허 제 5,670,481 호
미국 특허 제 5,679,783 호
국제 특허 공개공보 제 WO 95/16035 호
짐머만 등의 문헌[Cell, 86(1996) 599-606]
본 발명은 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위해 골유도 단백질과 배화 인자의 조합물을 함유한 약학적 조성물을 제공한다.

Claims (12)

  1. 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한, 10:1 내지 1:10의 비로 골유도 단백질 및 배화 인자(dorsalizing factor)를 함유하는 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    골유도 단백질이 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7 또는 헤지호그 단백질(hedgehog protein)인 약학적 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    배화 인자가 노긴(noggin), 코딘(chordin) 또는 폴리스타틴(follistatin)인 약학적 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    생체적합성 매트릭스를 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    생체적합성 매트릭스가 하이알루론산, 알기네이트 또는 콜라겐인 약학적 조성물.
  6. 골유도 단백질 및 배화 인자를 혼합하므로써 10:1 내지 1:10의 비로 골유도 단백질 및 배화 인자를 함유하는 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    골유도 단백질이 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7 또는 헤지호그 단백질인 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    배화 인자가 노긴, 코딘 또는 폴리스타틴인 방법.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    골유도 단백질 및 배화 인자를 생체적합성 매트릭스와 혼합하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    생체적합성 매트릭스가 하이알루론산, 콜라겐 또는 알기네이트인 방법.
  11. 골유도 단백질 또는 배화 인자를 위한 발현 벡터, 및 골유도 단백질의 발현을 위한 벡터와 배화 인자를 발현할 수 있는 벡터의 조합물을 함유하는, 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한 약학적 조성물.
  12. 골유도 단백질 및 배화 인자를 발현할 수 있는 발현 벡터, 또는 골유도 단백질을 발현할 수 있는 벡터와 배화 인자를 발현할 수 있는 벡터의 조합물을 조성물의 필수 성분으로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 연골 복원이 필요한 환자의 치료를 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법.
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