CN101705208B - 将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：从胎盘中分离出人羊膜组织；清洗上述人羊膜组织；消化清洗后的人羊膜组织；将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入到含有5％FBS、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM***和50ng/ml抗坏血酸的高糖DMEM培养基进行诱导培养，每隔24小时更换上述培养基一次，诱导21天后，得到骨或软骨细胞；利用上述方法得到的骨或软骨细胞可以用于修复人体内的骨或软骨组织以治疗骨缺损。
Description
技术领域
由于人羊膜间充质细胞(human Amnion mesenchymal cells，hAMCs)具有增殖活性和多分化潜能等干细胞生物学特点，本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法。
背景技术
股骨头缺血性坏死(AVN avascular necrosis of the femoral head)，又称股骨头无菌性坏死(ANFH aseptic necrosis of femoral head)或股骨头骨坏死(ONFH osteonecrosis of femoralhead)，是骨科的难治性疾病，在我国应用皮质类固醇(corticosteroid，以下简称激素)和过量饮酒是引起非创伤性ONFH的主要原因之一。股骨头坏死为进展性致残性疾病，多以关节塌陷为最终结局，需要进行人工关节置换。目前常用的方法包括：药物(抑制破骨，促进成骨)，钻孔减压术，自体或异体腓骨移植术，打压植骨术，旋髂动脉移植术，髋臼旋转截骨术，干细胞移植术等，但是没有一种方法能够有效阻止股骨头塌陷的进程。从理论上来说干细胞移植术是延缓股骨头塌陷的理想方法，但是由于自体抽取的骨髓基质干细胞量有限，因而疗效并不确定。而体外培养回植虽然可以获得大量干细胞，但是却存在致瘤性，很难获得临床应用。除了BMSCs外，也有学者将胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)诱导分化成骨及软骨细胞，但是异体移植后容易形成畸胎瘤和发生免疫排斥反应，此外，胚胎的应用还涉及法律和伦理学问题，限制了它们在临床中的广泛应用。因此迫切需要一种既可以分化为成骨细胞和血管内皮细胞，又没有生物安全性问题，而又来源广泛，没有伦理问题的种子细胞。
由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫***监视下，其表面人类白细胞抗原(HLA)--A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细胞是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和NK细胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人羊膜间充质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等对同一条件下人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活性进行比较，发现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于细胞接触和细胞剂量。
作为一种多潜能细胞，由于间充质干细胞在体内所定居的组织不同，微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进间充质干细胞向不同的谱系分化。人羊膜间充质细胞可以分化成为软骨细胞，并表达软骨相关基因，如SOX-9、SOX-5、SOX-6、骨形态蛋白(BMP)-2、-4和BMP受体，在体外应用BMP-2诱导HAM软骨形成后可产生II型胶原和蛋白聚糖；将HAM和BMP-2植入鼠的非软骨组织内或与胶原支架一起植入骨缺损处后可见HAM发生了形态改变并伴有II型胶原沉积。
发明内容
本申请的发明目的在于提供一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法。
为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：
(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)清洗上述人羊膜组织；
(3)消化清洗后的人羊膜组织；
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；
(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
其中：
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中用含有20％FBS的α-MEM的培养基调整到人羊膜间充质细胞的个数为1×105个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8-12小时细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：5％FBS、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM***和50ng/ml抗坏血酸，每隔24小时更换上述培养基一次，诱导21天后，得到骨或软骨细胞，然后种植到24孔板中，贴壁后可用于甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测，检测得到的细胞是否为骨或软骨细胞；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化液，放入37℃水浴锅中分两次共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10％FBS和的DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液清洗直至清洗液澄清为止；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离出单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入含10％FBS的DMEM/F12培养液后，用吸管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆形时，立即加入2ml DMEM/F12和10％FBS培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml-2×106个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(7)中的甲苯胺蓝染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，用PBS液漂洗24孔板，在24孔板中加入1％的甲苯胺蓝染色24小时后，用蒸馏水将未染色部分的颜色冲掉，用中性树脂封住孔板后，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞呈现均一异染，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为骨或软骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成骨或软骨细胞；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其中：所述的步骤(7)中的胶原免疫组化检测是采用以下步骤：取两个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，分别加入I型或II型胶原抗体，在温度为4℃下放置8-12小时后，再分别加入生物素化二抗和DAB显色，用苏木精衬染后，用流水冲洗使之蓝化，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞和I型或II胶原免疫细胞的染色呈现阳性，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为软骨或骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成软骨或骨细胞。
在成年机体中，间充质细胞存在于多种组织中，如骨或软骨髓、脂肪组织，但提取相当困难。目前间充质细胞的主要来源为成人骨或软骨髓，但成人骨或软骨髓间充质细胞(bone marrow-MCs，BM-MCs)细胞数量极少，Pittenger等发现仅0.001％～0.01％的经过密度梯度分离的单核细胞产生可塑性的贴壁细胞克隆，并且增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，供者间充质细胞的采集须行骨或软骨髓穿刺术，使来源受到限制。而人类羊膜作为胚胎发育的早期产物，无论从解剖结构还是在发育行为上，都包含有较为幼稚的胚胎干细胞及趋于成熟的成体干细胞成分；羊膜组织在胎儿娩出后即完成使命，对其研究不会涉及伦理道德问题；由于羊膜MCs是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫***监视下，间充质细胞表面人类白细胞抗原I(human leucocyte antigen，HLA)-A、B、C不表达，人类白细胞抗原HLA-DR低表达，从羊膜分离出间充质细胞样细胞，经体外扩增后成功植入新生大鼠和猪体内。上述优势使人羊膜间充质细胞有望成为人类组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。
利用上述方法得到的骨或软骨细胞可以用于修复人体内的骨或软骨组织以治疗骨缺损。
附图说明
图1为用本发明方法所得到的骨或软骨细胞在甲苯胺蓝染色后得到的结果；
图2为将用本发明方法所得到的骨或软骨细胞移植治疗骨或软骨缺损后，移植区内产生大量新生骨或软骨。
具体实施方式
本发明一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：
(1)在无菌条件下，从一个从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍；
(3)将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化，加入3ml的含10％FBS的DMEM/F12终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液清洗直至清洗液澄清为止；
(4)将上述人羊膜组织分离出单个人羊膜间充质细胞；其中采用以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10％FBS和DMEM/F12培养液后，用吸管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
(5)将得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12培养液放置培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆形时，立即加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml-2×106个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中用含有20％FBS的α-MEM的培养基调整到人羊膜间充质细胞的个数为1×105个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8-12小时细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：5％FBS、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM***和50ng/ml抗坏血酸，每隔24小时更换上述培养基一次，诱导21天后，得到骨或软骨细胞，然后种植到24孔板中，贴壁后可用于甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测，检测得到的细胞是否为骨或软骨细胞。其中所述的甲苯胺蓝染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，用PBS液漂洗24孔板，在24孔板中加入1％的甲苯胺蓝染色24小时后，用蒸馏水将未染色部分的颜色冲掉，用中性树脂封住孔板后，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞呈现均一异染，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为骨或软骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成骨或软骨细胞。
所述的胶原免疫组化检测是采用以下步骤：取两个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，分别加入I型或II型胶原抗体，在温度为4℃下放置8-12小时后，再分别加入生物素化二抗和DAB显色，用苏木精衬染后，用流水冲洗使之蓝化，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞和I型或II胶原免疫细胞的染色呈现阳性，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为软骨或骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成软骨或骨细胞。检测诱导后的人羊膜间充质细胞是否含有软骨细胞使用I型胶原抗体，检测诱导后的人羊膜间充质细胞是否含有骨细胞使用II胶原抗体。一般来说，软骨细胞再经过一段时间的发育后，会生产成骨细胞。
可以分别进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测，也可以即进行既进行甲苯胺蓝染色鉴定又进行胶原免疫组化检测。
图1为用本发明方法所得到的骨或软骨细胞在甲苯胺蓝染色后得到的结果，显示甲苯胺蓝染成呈蓝色，其中有较多钙化的骨组织，周围可见梭形的间充质细胞向软骨细胞分化。
图2为将用本发明方法所得到的骨或软骨细胞移植治疗骨或软骨缺损后，移植区内产生大量新生骨或软骨，图中显示了抗人线粒体抗原染色阳性400x移植区新生骨组织内(绿箭头)及血管壁内(红箭头)可见抗人线粒体抗原染色阳性细胞，提示有人源性细胞移植区存活且可以分化为成骨细胞和血管内皮细胞。实验证实了有发育成骨或软骨细胞的潜能。
从上述两个图中进一步的证实：用本发明方法所得到细胞为骨或软骨细胞。
以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改
Claims (9)
1.一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：
(1)在无菌条件下，从健康胎盘组织中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)清洗上述人羊膜组织；
(3)消化清洗后的人羊膜组织；
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；
(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
其特征在于：
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液用含有20％FBS的α-MEM的培养基调整到人羊膜间充质细胞的个数为1×105个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8-12小时细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：5％FBS、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM***和50ng/ml抗坏血酸，每隔24小时更换上述培养基一次，诱导21天后，得到骨或软骨细胞，然后种植到24孔板中，贴壁后可用于甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测，检测得到的细胞是否为骨或软骨细胞。
2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织。
3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用不含抗生素的D-hank’s液清洗3-5遍。
4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化液，放入37℃水浴锅中消化，分两次共消化45分钟，倒掉上述消化液，加入3ml的含10％FBS的DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液消洗直至清洗液澄清为止。
5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化。
6.如权利要求5所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离出单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到间充质细胞悬浊液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10％FBS和DMEM/F12培养液后，用吸管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml。
7.如权利要求6所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆形时，立即加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml-2×106个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量。
8.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(7)中的甲苯胺蓝染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，用PBS液漂洗24孔板，在24孔板中加入1％的甲苯胺蓝染色24小时后，用蒸馏水将未染色部分的颜色冲掉，用中性树脂封住孔板后，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞呈现均一异染，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为骨或软骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成骨或软骨细胞。
9.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(7)中的胶原免疫组化检测是采用以下步骤：取两个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，分别加入I型或II型胶原抗体，在温度为4℃下放置8-12小时后，再分别加入生物素化二抗和DAB显色，用苏木精衬染后，用流水冲洗使之蓝化，在显微镜下进行观察，若发现诱导后的人羊膜间充质细胞和I型或II胶原免疫细胞的染色呈现阳性，说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为软骨或骨细胞，否则，说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成软骨或骨细胞。
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| 宋秀军等.人羊膜间充质细胞具有分化成软骨及成骨细胞的潜能.《中国组织工程研究与临床康复》.2007,第11卷(第50期),10056-10060. * |
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