KR20070047740A - 연골 및 골 치유 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 혈청, 및 진핵세포 발현 시스템에서 수득된 콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인을 갖는 형질전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD)을 사용한 증폭에 의한 연골-골 발생 계통으로 분화된 인간 중간엽 줄기 세포를 포함하는 골 및 연골 치유용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 위치 주입, 전신 순환으로 직접 주사하거나, 또는 적합한 생체 적합 물질 중에 흡착시킨 이식물을 사용할 수 있다.
콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인을 갖는 형질전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD), 인간 중간엽 줄기 세포, 골 및 연골 치유
Description
본 발명은 골격 치유 및 보다 구체적으로 임의의 병인, 척수 유합술 또는 관절 고정술, 골접합술, 관절성형술용 보형물, 골다공증 등의 연골 및 골 치유 과정, 및 골 또는 연골 조직의 임의의 다른 요구되는 치유 또는 재생을 다루는 생물 의학 산업에 적용되며, 이때 분화 시 세포의 보충적인 공급이 관련된 조직 치유를 달성하는데 유효한 도움을 수반한다.
조직 재생은 병변 부위에 존재하거나 보충된 매우 다양한 세포들의 축적을 수반하는 복잡한 과정이다. 상기 치유 과정에서 발생하는 모든 사건들은 성장 인자 및 사이토킨, 세포 및 세포 외 기질을 형성하는 분자 간의 다수의 상호작용들에 의해 유도된다.
뼈 중에는 다양한 유도 신호 및 성장 인자, 예를 들어 TGF-ß, PDGF, BMP, IGF 및 FGF가 공존한다(Becerra et al. Med Clin 2001; 116:23-24). 이들 중에서, 오직 BMP만이 골 유도 인자이나; 상기 인자들은 모두 소정의 골절의 치유에 관여한다(Reddi Nature Medicine 1998, 3:837-839; Groeneveld and Burger Eur J Endocrinol 2000; 142:9-21). 또한 뼈에는 상기 골절의 자극에 반응하는 골 발생 전구 세포가 존재하여, 골 형성 세포로 증식하고 분화하는 중간엽 줄기 세포(MSC) 의 이동을 유도하는 BMP를 활성화 및 생성시킨다(Guerado et al. Rev Ortop Traumatol. 2003; 47, 362-374). 그러나, 중간엽 줄기 세포와 골 조상세포 전구 세포간의 복잡한 상관성에 대한 이해는 그의 골 발생 계통으로의 이동, 증식 및 분화를 조절하는 생화학적 신호와 함께 여전히 중대한 결함을 나타낸다.
TGF-ß는 다수의 조직 및 종들에서 발현되는 유전자 계열을 암호화하는 성장 인자 그룹이다(Kingsley Genes Dev; 1994; 8:133-146; Bostrom and Asnis, Clin Orthop Relat R, 1998; 355S:124-131). 뼈는 세포 기능을 조절하는 능력을 갖는 TGF-ß의 국소 생산이 나타난 최초의 조직들 중 하나였다(Centrella et al. J Bone Joint Surg 1991; 73-A:1418-1428). 혈소판이 TGF-ß의 주요 공급원이지만, 뼈는 가장 중요한 저장소이며, BMP가 또한 함께 존재하는 다른 연 조직들에서보다 100 배 이상이다(Roberts et al. Biochemistry 1983;22:5692-5698).
중요한 결과들이 최근 수년간 획득되었으나, 이는 때때로 TGF-ß를 배양물 중의 골모세포에 가하는 경우 모순되었다. 상기의 신화발생적 또는 골분화 효과, 또는 이와 상반된 효과가 배양물 중의 세포 이질성, 다른 성장 작용제의 존재, 세포 밀도, 배양 조건 또는 상기 인자의 가능한 2상 효과에 기여하여 왔다(Noda et al., Endocrinology 1988; 124:612-617; Stein and Lian, Cellular and Molecular Biology of Bone. San Diego: Academic Press; 47-95 1993). 최근의 연구들은 또한 TGF-ß 또는 BMP에 대한 상이한 표적 세포들의 존재 가능성을 고려하며; 상기 TGF-ß는 골 발생 계통에 이미 관련된 줄기 세포 상에 작용하는 것으로 보이지만, BMP는 타협되지 않은 세포에 대해 작용할 수 있다(Ballock et al., J. Oprthop. Res. 1997;15:463-467). 어쨌든, MSC가 TGF-ß1의 존재 하에서 자기 재생 및 증폭을 수행할 수 있음은 분명한 것으로 보인다(Andrades et al., Cells. Exp Cell Res, 1999; 250:485-498).
생물학적 이용효능을 조절하고 MSC 배양물 중의 TGF-ß1의 일부 조절과 함께 그 존재를 확인하기 하기 위해서, 최근에 실험 과정이 개발되었으며, 이에 의해 래트 골수로부터 세포 집단이 단리, 증폭되고, 콜라겐 I에의 특이적인 결합을 위한 분자 도메인을 갖는 TGF-ß1의 존재 하에서 콜라겐 겔 중에서 배양될 때 골 발생 계통으로 유도되었다. 상기 콜라겐에의 결합을 위한 도메인은 상기가 결합하는 상기 겔 중에 활성 인자의 느린 방출을 허용하여, 그의 반감기를 연장하고 표적 세포 상에서 작용하기 위한 그의 유효성을 향상시키는 것이 제안되었다(Andrades et al. Cells, Exp Cell Res, 1999;250:485-498).
골 재생 능력은 나이에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 골수의 조혈 세포 수는 수명 전체를 통해 지속되는 반면, 상기 골수의 MSC는, 골 유도 인자가 결여되거나 또는 세포가 상기 인자를 생성하지못하거나 상기에 반응하지 못함으로 인한 진행의 일부 어려움에 더하여, 실질적으로 감소한다(Haynesworth et al., Musculoskeletal Soft-Tissue Aging: Impact on Mobility. Section 1, Chapter 7. Rosemont: AAOS, 80-86, 1994). 따라서, 골 치유 능력이 없는 개인의 MSC의 선택, 그의 생체 외 증폭 및 골 발생 계통으로의 능력 획득을 가능하게 하는 과정을 개발하는 것이 바람직하다.
상기를 신뢰성 있게 수행한 후에, 상기와 같이 처리된 세포를 환자가 골격 치유를 필요로 하는 부위로, 상기 세포를 적합한 생체 적합 물질과 함께 전달하고 따라서 상실되거나 심하게 위협받는 골 치유 기능을 유효하게 확립시킬 수 있는 일종의 자가 세포 치료를 개발해야 한다. 이는 또한 생물 활성 인자를 우선 치유 부위 이상에서 조절하는 것이 어렵고 그의 다면적인 영향은 면할 수 없는 위협이므로 상기 인자의 전신 또는 국소 감염의 바람직하지 못한 결과는 회피된다.
어쨌든, 2 개 이상의 골 단편의 경화가 필요한 경우 능력획득된 세포의 이식을 골 발생을 촉진하는 미세 환경에서 수행해야 한다. 이에 대해서, 골절 또는 비 경화 병터(의사-관절증)가 연골-골 발생 조직의 증식과 함께 과다 혈관(비 결합성 또는 비대성 의사-관절증)임을 특징으로 하는 경우, 세포 내 또는 세포 외 이식물에 의한 상기 병터의 단순한 강성의 비-동적인 안정화는 경화를 촉진시킬 것이다. 이러한 경우에, 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐의 담체 상에서 골 발생 계통으로의 능력 획득된 세포의 이식은 골접합술 후에, 골 발생성 가골의 발생에 이상적인 미세환경인 안정한 과다 혈관 층을 찾아낸다. 비 경화 또는 위축성 의사-관절증의 경우에, 상기 두 단편들 간의 섬유 조직을 제거하여 뼈와 뼈를 남기고 골 천공에 의해 혈관 공급원을 찾아 혈관화된 조직(일반적으로는 근육)을 내층화해야 한다. 상기 두 단편을 모두, 골 계면에서의 이동의 경우와 같이, 상기 계면에서의 이동을 방지하는 강성 골접합술에 의해 안정화시켜야 하며, 이는 혈관 증식을 파괴하고 방지할 것이며, 골 발생 대신에 연골 발생을 유도하는 화학 매개체의 발현을 자극할 것이다(Ruedi and Murphy, AO Principles of fracture management. Sttugart, Georg Thieme Verlag. 2000; Browne et al., Skeletal Trauma, Basic Science, Management, and Reconstruction. Philadelphia, Saunders, 2003).
골다공증이 있는 개인에서, 상기 환자의 골 형성과 재흡수 간의 불균형을 상기 골 형성의 희생 하에 중재함을 수반하는 과정에 의해 상기 개인의 골 질량 형성 능력을 증가시키는 과정을 개발하는 것이 또한 바람직하다. 생체 외에서 능력 획득된 세포의 골 발생 계통에의 전신 주입은 상기 평형상태의 균형을 허용할 것이다.
본 발명은 작은 비 연결 골절 또는 연골 병변에서 원위치에, 골다공성 개인의 전신 순환에 주입하거나 또는 적합한 생체 적합 물질(콜라겐, 하이드록시아파타이트 등) 중에 흡착 이식되어 일부 중요한 병변에서의 연골 또는 골 형성을 촉진시킬 수 있는, 골격 치유 및 보다 구체적으로 연골, 골 치유 과정, 골다공증, 관절성형술용 보형물 등에 사용되는 작용제 및 조성물의 제조에 분명한 용도를 갖는다. 더욱 또한, 상기 작용제 및 조성물은 고관절, 무릎 관절성형용 보형물을 코팅하는 하이드록시아파타이트(페리아파타이트)에 흡착되어 숙주에서 상기 보형물의 생물학적 통합을 향상시켜 상기 보형물의 수명을 연장시킬 수 있다. 이러한 제제를 또한 척수 유합술의 진전을 위한 척수 관절 고정술에 사용할 수 있으며 상기는 자가 이식편 또는 골 저장소를 사용하여 표준 과정에 의해 수행되는 상기 과정의 효율을 개선시킨다.
본 발명의 첫 번째 태양에서, 본 발명은 인간 혈청 및 진핵세포 발현 시스템에서 수득한 콜라겐 I에의 결합을 위한 분자 도메인을 갖는 형질 전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD)을 사용한 증폭에 의해 연골-골 발생 계통으로 분화된 인간 중간엽 줄기 세포를 투여함으로써 골 및/또는 연골 형성이 필요한 인간에서 상기 형성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 능력 획득된 세포의 투여를 원 위치 주입에 의해, 전신 순환 내로, 또는 적합한 생체 적합 물질에 흡착된 이식물에 의해 수행한다. 바람직한 실시태양은 적합한 물질 중에 흡착된 세포를 갖는 이식물을 사용하는 것이며, 훨씬 더 바람직한 실시태양은 50% 다공성의, 콜라겐 겔의 확산 챔버를 갖는 재흡수성 하이드록시아파타이트를 사용하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 인간 MSC는 글루코코르티코이드를 사용하여 그의 연골-골 발생 계통으로의 유도에 일조하였다. 덱사메타손의 사용이 바람직하다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 유도를 덱사메타손 및 ß-글리세로포스페이트의 존재 하에서 수행한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 콜라겐 I에의 결합을 위한 분자 도메인과 결합된 형질전환 인자-베타 1을 진핵세포 발현 시스템에서 발현시켰다. 바람직한 실시태양은 곤충 세포를 사용하는 발현이며, 바쿨로바이러스로 형질감염시킨 곤충 세포를 사용하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
본 발명의 두 번째 태양에서, 생체 외 능력 획득 과정은 인간 MSC로부터 연골-골 발생 세포를 제공하며, 하기의 단계들을 포함한다:
ㆍ 인간 혈청 및 콜라겐 I에의 결합을 위한 분자 도메인을 갖는 형질 전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD)이 보충된 배지에서 줄기 세포의 1 차 배양;
ㆍ 인간 혈청 및 TGF-ß1-CBD의 보충에 의한 후속 증폭;
ㆍ 덱사메타손 및 ß-글리세로포스페이트에 의한 연골-골 발생 유도.
인간 MSC를 환자의 상이한 조직과 병변, 및 골수, 제대혈, 말초혈액 또는 냉동 인간 배반포의 내부 덩어리로부터 수득할 수 있다.
상기 능력획득 과정의 바람직한 실시태양에서, 콜라겐 I에의 결합을 위한 분자 도메인과 융합된 형질전환 성장 인자-베타 1을 진핵세포 발현 시스템에서 발현시켰다. 보다 바람직한 실시태양은 발현에 곤충 세포를 사용하는 것이다. 바쿨로바이러스로 형질감염시킨 곤충 세포를 사용하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
또 다른 바람직한 실시태양에 따라, 상기 1 차 배양을 인간 유형 I 콜라겐 겔에서 수행한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 골수 MSC의 선택을 0.1 내지 1%, 바람직하게는 0.5% 량의 인간 혈청이 보충된 배양물에서 수행한다.
바람직한 실시태양에 따라, 상기 증폭을 1 내지 25일 범위의 기간 동안 수행하며, 이 동안 상기 배양 배지에 5% 내지 25%, 바람직하게는 20% 량의 인간 혈청을 보충한다.
본 발명의 세 번째 태양에서, 상기는 세포에 상기 언급한 능력획득 과정에 의해 획득할 수 있는 연골-골 발생 능력을 제공하며, 상기 과정은 MSC의 선택, 증폭 및 연골-골 발생 유도를 포함한다.
본 발명의 네 번째 태양에서, 인간의 골 및/또는 연골 치유용 조성물의 제조에서, 상기 언급한 능력획득 과정에 의해 획득할 수 있는 연골-골 발생 능력을 갖는 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 다섯 번째 태양에서, 생체적합성이고 골 전도성인 물질, 및 상기 언급한 능력획득 과정에 의해 획득할 수 있는 연골-골 발생 능력을 갖는 세포의 그룹을 포함하는, 골 발생을 유도할 수 있는 조성물을 제공한다.
도 1-a)는 rhTGF-ß1-CBD의 존재 하에서 콜라겐 겔 중에서 10 일간 생체 외 배양된 MO 세포를 나타낸다. 매우 적은 수의 단리된 세포들이 보인다. MO 세포를 rhTGF-ß1-CBD의 존재 하에서 콜라겐 겔 중에서 35일간 배양하고(b 및 c) 각각 덱사메타손 및 ß 글리세로포스페이트로 유도하였다. 보다 큰 세포 밀도 및 일부 콜로니들이 보인다(x60).
도 2-a)는 래트 피하 조직에서 이식 기간 후에 4 개의 상이한 챔버의 방사선 사진을 나타낸다. 상이한 밀도는 새로 형성된 조직의 상이한 질 및 양을 나타낸다. b)는 이식 기간 후의 챔버의 조직 단편을 나타내고, 이때 조절 조건 하에서 배양한 세포를 rhTGF-ß1-CBD 없이 놓았으며; 상기 내부는 대체로 섬유성 물질들이 가득하고, 연골-유골 조직 축적(별표, 챔버 필터)은 발견되지 않는다. 시리우스 레드-헤마톡실린. x10. c) 저 배율의 챔버 구획의 외관을 나타내며, 여기에서 생체 외 처리된 세포를 rhTGF-ß1-CBD의 존재 하에 두어, 다른 것들로부터 서 있는 필터(별표)에 가까운 새로 형성된 조직(화살표)의 여러 축합물을 검출하였다. 시리우스 레드-헤마톡실린. x10. d) 2 가지 부류의 조직으로 분화하는 상기 축합물들 중 하나, 연골 외관 중 하나(색칠 된 원), 유골 외관(빈 원) 중 불충분하게 염 색된 것과 또 다른 진하게 염색된 것에 대한 상세한 그림을 나타낸다. 옅은 조직의 밖에서, 더 염색된 섬유가 보이며, 이는 연골막(화살표)을 닮았다. 시리우스 레드-헤마톡실린(x40). e) 골드너 3가 크롬에 의해 염색된, 상기에 평행한 구획을 제공하며, 짙은 청색(빈 원), 가장 치밀한 조직(유골) 및 연골(색칠 된 원)처럼 보이는 옅은 색상의 어떤 것을 나타낸다. 상기 원 주위에 연골막 층(화살표)으로 보이는 일부 푸른빛을 띤 섬유가 존재한다(x40). f) 또 다른 평행 구획을 알시안 블루로 염색하는 경우, 상기 연골 조직은 청색(색칠 된 원)으로 보이는 반면, 상기 유골뿐만 아니라 연골막은 무색(빈 원)으로 보인다. x40. 이는 연골-유골 신생과 일치한다. 상기 시리우스 레드 및 3가 크롬은 모두 골 조직 및 연골막의 특징인 콜라겐, 특히 유형 I의 콜라겐을 짙게 염색하는 반면, 알시안 블루는 연골 기질 중에 풍부한 프로테오글리칸의 산 및 황산화된 그룹을 염색한다.
도 3은 하이드록시아파타이트 이식을 본 문에서 나타낸 바와 같이 처리한 세포를 사용하여 수행하는 경우 형성되는 조직의 구획을 나타낸다. 상기 물질을 절단 및 착색 전에 석회 제거하였으며, 빈 공간(별표)은 하이드록시아파타이트 섬유주의 벽에 해당한다. 상기 벽 중의 중공은 이제 수질(색칠 된 원)이라 칭할 수 있는 조직이 충전되는 반면, 상기 섬유주에 부착된 얇은 신생 조직 시트(화살표)가 존재한다. b) 동일한 구획을 편광된 빛으로 비출 때 복굴절에 의해 나타나는 바와 같이, a)는 콜라겐(시리우스 레드에 의한 짙은 적색)(화살표) 중에 상기 하이드록시아파타이트 벽을 내층화한 조직이 얼마나 풍부한가를 나타낸다. 상기 콜라겐은 그의 양성 성질에 의해 입증되는 바와 같이(화살표) 유형 I을 가지며, 이는 상 기 조직 구획을 c)에 나타낸 항-콜라겐 I 항혈청으로 처리할 때 나타난다(x20). d)는 보다 큰 배율로, 새로운 조직이 상기 조직을 합성하는 기질에 포착된 골모세포와 같이 내부에 세포를 함유함을 보인다(골드너 3 가 크롬). 상기 새로운 조직은 적색(보다 성숙한 조직) 또는 녹색을 띤 색상(미성숙 조직)을 나타낸다(x40). e)는 이식된 하이드록시아파타이트(별표)에 가까운 영역의 구획을 나타내며, 여기에서 숙주 조직의 여러 섬유주가 녹-청색을 띤 어린 뼈의 새로운 병치를 보이며, 이는 HA를 놓은 곳뿐만 아니라 그 둘레(이는 추정 상 세포 "확산" HA에 의해 유발된 "어느 정도 거리의 골 유도"를 가리킨다)(골드너 3 가 크롬)에서도 약간의 골 발생 활성을 가리킨다(x20). 이와 상반되게, f)는 상기 HA 단편의 장소로부터 떨어진, 동일한 숙주 뼈 영역의 구획을 나타내며, 여기에서는 골 섬유주들이 새로운 조직 통합을 나타내지 않고 따라서 골 유도가 상기 이식 영역에 추가로 도달하지 않았음을 보인다.
본 발명을 하기의 비 제한적인 실시예에 의해 예시한다.
실시예 1 - 콜라겐 I 결합 도메인을 갖는 인간 융합 재조합 단백질 TGF-ß1(rhTGF-ß1-CBD)의 구상 및 획득
상기 TGF-ß1 유전자에 대한 cDNA를 교정 능력을 갖는 DNA-폴리머라제를 사용하여 RT-PCR에 의해 수득하였다. 사용된 주형은 인간 골육종 세포 MG63(ATCC:CRL-1427)으로부터 촘친스키와 사키(Chomczynski and Sacci)(1987)의 방법에 의해 추출된 완전 RNA이었다. 프라이머를 진뱅크(the genbank)에서 공개한 mRNA 서열로부터 소프트웨어(Oligo v6.6)의 도움으로 구상한다. 상기 PCR 산물을 유지 플라스미드(pBSK II, Stratagene)에 "둔하게" 클로닝하였다. 일단 상기 유전자를 클로닝하였으면, 상기를 양쪽 가닥의 서열화에 의해 검사하였다. 상기 플라스미드를 주형으로서 사용하여, 상기를 성숙한 펩티드를 암호화하는 부위인 pfu-DNA-폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 상기 사용된 프라이머는 콜라겐-결합 도메인(CBD), 및 곤충 세포에 특이적인 펩티드 분비 신호에 대한 서열을 함유하는, 바쿨로바이러스 중의 발현 시스템의 전달 플라스미드(pAcGP67B, Pharmingen)에 직접 클로닝하기에 적합한 제한 부위를 함유한다. CBD가 없는 인자를 획득하기 위해서, 상기 프라이머는 단지 제한 부위만을 가졌다. 상기 쇄 센스 프라이머는 하기의 구조를 가졌다: 5'-(BamHI)-CBD-GGAGGA-(Nhel)-6 제 1 성숙 펩티드 뉴클레오티드 TGF-ß1의 서열. 상기 쇄 안티센스 프라이머는 상기 유전자의 5' 단부의 여러 뉴클레오티드에 의해 형성되며 정지 코돈을 포함하였다. 또한 상기는 Not I 부위를 가졌다. 모든 경우에, 상기 PCR 산물 또는 상기를 함유하는 전달 플라스미드를 서열화함으로써 구조를 검사하였다.
상기 인자에 대한 전달 플라스미드가 CBD와 함께 또는 상기 없이 획득되었으면, 곤충 세포를 전달 플라스미드와 상업적인 DNA 바쿨로바이러스(BacVector3000, Novagen)(폴리헤드린 유전자 외에 시스테인-프로테아제를 암호화하는 다른 유전자가 제거되었다)에 의해 구성된 혼합물로 동시 형질감염시켰다(sf9). 본 발명자들은 상사 회사의 지시에 따라 리포솜-매개된 전달 방법(리포펙틴, Novagen)을 사용한다.
일단 상기 DNA를 상기 세포로 전달하였으면, 상기를 수일간 세포 감염이 나타날 때까지 TNM-FH 배지에서 배양하였다. 이러는 동안, 상기 세포의 내부에서 동종 재조합이 발생하여 바이러스 DNA가 펩티드 서열 신호를 포함하는 플라스미드의 부위 + CBD가 있거나 없는 상기 인자의 부위인 상기 폴리헤드린 프로모터의 하부로 전달된다. 이러한 과정은 상기 세포를 죽이고 이를 환경으로 방출시켜 다른 세포들을 감염시키는 감염 바이러스를 발생시킨다.
재조합 바이러스를 배양 상등액 중의 재조합 바이러스의 혼합물로부터 선택하였다. 이를 반융합성 세포 배양물에 형질감염 상등액의 희석액을 뿌리는 것으로 이루어진 플레이트 시험에 의해 수행하였다. 상기 감염 기간(1 시간) 후에, 상기 플레이트를 배양 배지에 용해된 아가로스로 덮고 4 일 동안 배양물 중에서 방치시켰다. 이에 의해, 용해 플레이트를 생성시킨 일부 세포의 환경에 감염 확산이 발생하였다. 이러한 용해 플레이트를 개별적으로 회수하여 작은 분량의 배지에 놓아 바이러스를 추출하였다. 상기 첫 번째 선택된 용해 플레이트의 수 및 크기를 기준으로, 상기 과정을 선행 용해 플레이트로부터 다시 한 번 반복하였으며, 따라서 클로닝된 재조합 바이러스를 확실히 갖게 될 것이다. 일단 상기 바이러스를 증폭시켰으면, 상기가 적합한 유전자를 함유하였는지를 검사하기 위해서 상기를 상기 인자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 이어서 적정해야 하는 다량의 모액을 사용하여 pfu/㎖의 수(플레이트 형성 단위/㎖)를 확립시킬 필요가 있었다.
이러한 관점으로부터, 각각의 재조합 바이러스에 대해, 최적의 생성을 획득 하기 위해 적합한 감염 조건들을 확립시켰다. 이를 위해서, 12-웰 플레이트에 기지 수의 세포를 뿌렸다. 상기 중에, 상이한 배양 회수 이외에 상이한 퍼센트의 바이러스/세포 수(MOI, 감염 배수)를 뿌리고자 하였다. 48, 72 및 96 시간의 배양 시간에서 샘플링하여 0.1, 1 또는 10의 MOI를 시험하였다. 배양 배지의 혈청이 바람직하지 않은 단백질로 오염되지 않도록 하기 위해서, 감염 후 처음 24 시간 후에, 무 혈청 배지 또는 매우 낮은 퍼센트의 혈청을 사용하여 배양을 계속하였다. 각각의 실험 상황을 완료한 후에, 상등액을 수거하고 원심분리시켜 세포 잔류물을 제거하였다.
상기 웰 세포를 동결-해동에 의해 파괴하고 PBS로 추출하였다. 상기 두 샘플을 모두 환원제 없이 SDS-전기영동(변성 조건)에 의해 분석하였다. 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마씨 블루로 염색하였다(충분히 민감하지 않은 경우, 은 염색을 수행할 수 있다). 상이한 샘플들을 또한 TGF-ß1 특이 항체를 사용하여 면역블럿팅에 의해 분석하였다. 본 발명자들은 퍼옥시다제로 표지한 2 차 항체를 사용하였으며 그의 존재를 화학 발광(CSPD, Amersham)에 의해 확인하였다. 이러한 정보를 이용하여 본 발명자들은 생성된 단량체/이량체 퍼센트 및 상기 시스템의 수율을 평가하였다.
상당량의 재조합 단백질을 수득하기 위해서, 대략 250 ㎖의 액체 배양을 약 500,000 세포/㎖로 출발하였다. 약 2 x 106 세포/㎖의 증식에 도달하였을 때, 상기를 바이러스에, 최고 MOI를 사용하여 최대 수율로 접종하였다. 24 시간째에, 혈청이 있는 배지를 제거하고 세포를 무 혈청 배지에서 선행 시험에 의해 측정된 수일간 배양하였다. 이 시간 후에, 단백질을 아오노(Aono) 등(1995)에 의해 개시된 프로토콜에 따라 정제하였다. 상기 방법은 SP-세파로스 컬럼(Amersham-Pharmacia)을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한다. 상기 배양 배지를 pH 8로 균형을 잡고 우레아 4M을 가하였다. 상기 컬럼을 트리스-HCl 20 mM pH8 완충액, 우레아 4M으로 균형을 잡았다. 상기 배지를 상기 컬럼에 흐르게 한 후에, 상기를 상기 완충액으로 세척하고 단백질을 0 내지 0.7 M의 선형 구배의 NaCl로 용출시켰다. 상이한 분획들에 대해서, 280 ㎚에서 흡광도를 측정하고 단백질이 있는 구획들을 전기 영동에 이어서 상기 개시한 기법에 의해 분석하였다. 양의 분획을 모으고 한외 여과에 의해 농축시키고 생물 활성 분석에 사용하였다. 상기 최종 분획의 단백질 농도를 브래드포드(Bradford)에 의해 측정하였다.
실시예 2 - 인간 중간엽 줄기 세포의 획득 및 제조
인간 중간엽 줄기 세포를, 내용을 알고 있는 공여자의 엉덩뼈 융기부를 외과적으로 추출한 후에 인간 골수(BM)로부터 획득하였다. 상기 골수 조직을 항생제(100 ㎎/㎖의 페니실린 G(Sigma), 50 ㎎/㎖의 젠타마이신(Sigma) 및 0.3 ㎎/㎖의 펀지존(Flow-ICN))를 갖는 완전 배지(□-MEM, GIBCO, HD, US)에서 세척하였다. 개별화된 세포의 현탁액을 18, 20 및 22 번 게이지의 바늘을 통해 연속 분산시킨 후에 수득하고 조직 잔류물 및 세포 축적물을 분리시키기 위해서 최종적으로 20 마이크로미터 테플론 멸균 필터(Cell Strainer, Falcon, Lincoln Park, NJ)를 통해 여과하였다.
실시예 3 - 콜라겐 겔에서 MSC의 배양
실시예 2에 따라 수득한 세포 현탁액을 100 g에서 5 분간 원심분리시켰다. 상기 원심분리물을 매우 낮은 농도의 환자의 혈청(HS, 0.5%)을 갖는 배양 배지에 재현탁시켰다.
세포를 배양 웰에 놓기 전에, 48, 100 ㎖의 인간 콜라겐 I 용액(Sigma-Aldrich)의 플레이트를 상기 웰의 기부에 0.35 ㎎/㎖의 농도로 pH 7.4에서 놓았다. 웰 당 콜라겐 I의 혼합물 150 ㎖, 1 ㎎/㎖ 농도의 TGF-ß1, 및 2 x 106 골수 세포를 한 층 위에 놓았다. 상기 배양 플레이트들을 37 ℃에서 15 분간 배양 오븐에 놓아 상기 시간까지 액체인 콜라겐 겔이 형성되게 하였다. 이어서 웰 당 배양 배지(또한 동일한 농도의 TGF-ß1을 함유한다) 10 ㎖을 놓았다. 상기와 같이 배열된 배양물들을 공기 95% 및 CO2 5%의 분위기에서 37 ℃ 및 100% 상대 습도에서 배양하였다. 매 3일마다, 상기 배양 배지를, 각각의 경우 동일 농도의 TGF-ß1을 가하면서 교환하였다.
TGF-ß1의 최적 농도를 화학주성 반응에 대한 선행 시험에서 조사하였다. 각각의 실험 조건에 대해서, 콜라겐(0.35 ㎎/㎖) 150 ㎖을 혼합하였으며, 이때 상기 인자의 농도는 보다 큰 화학주성 능력을 갖는 것으로서 앞서 선택되었다. 융합성 래트 골수 배양물을 용해시키고 상기 세포를 보이든 챔버(Neuroprobe, Rockville, MD)의 상부 구획에 2 x 105 세포/□-MEM의 ㎖의 농도로 놓았다. 상기 챔버의 하부 구획은 상이한 농도의 시험 인자를 갖는 배지를 함유하였다. 37 ℃ 에서 5% CO2 중에서 4 시간 배양 후에, 필터들을 제거하고 메탄올에 고정시키고; 상기를 세척하고, 염색하고 슬라이드 상에 적재하였다. 화학주성을 각 필터에서 현미경(x400)의 20 개 시야에서 이동하는 세포의 수를 세어 정량화하였다.
실시예 4 - 세포의 능력획득을 위한 실험 과정(선택, 증폭 및 유도)
MO 세포를 상술한 실험 조건 하에서 10 일간 배양 배지를 교환하면서, 따라서 TGF-ß1을 매 3일마다 교환하면서 유지시켰다. 상기 10일 후에, 상기 배양 배지에 10%의 환자의 혈청(HS 10%)을 제공하였다. 이는 소위 선택기간을 완성하고 증폭 기간을 시작하며, 이 기간을 상기 이식을 가능하게 하는 세포의 양을 획득하는데 필요한 시간 동안 유지시켰으나, 어느 경우든 이 기간은 25일을 넘어서는 안 된다. 이 기간 후에, 상기 배지에 골 유도 화학 작용제로서 작용하는 덱사메타손(10 M-8) 및 ß-글리세로포스페이트(2 mM)를 제공하였다. 단지 2일뿐인 상기 기간을 유도라 칭한다.
세포 배양 시간 후에, 샘플을 0, 10, 14, 18, 21, 24, 27, 30, 33 및 36일째에 취하고, 세포의 수 및 알칼리성 포스파타제 및 칼슘 함량의 존재에 대해 분석을 수행하였다. 표 I, II, III은 획득된 값들을 나타낸다. 상기는 TGF-ß1-CBD가 대조군에 대해 세포의 수를 얼마나 증가시키는가를 나타낸다. 알칼리성 포스파타제의 합성에서도 동일하게 수행한다. 칼슘 함량도 또한 배양일수에 따라 증가하는 반면, 대조군에서는 상기 값을 감지할 수 없다.
개시된 과정 동안 배양물의 현미경 검사는 세포가 TGF-ß-1DUC의 존재 하에 있을 때 배양일 동안 상기 세포가 얼마나 증식하고 심지어 증폭 기간 동안 콜로니를 얼마나 형성하는가를 나타낸다(도 1). 세포를 상업적인 TGF-ß1(R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 처리할 때, 상기 세포는 분산되거나 불량하게 군생한다.
[표 1]
세포 복제에 대한 배양 조건의 효과(DNA ㎍)
배양 일수
(상기 데이터는 매 4 개의 샘플에 대한 평균값 및 그의 ±SD에 상응한다)
[표 2]
알칼리성 포스파타제의 활성에 대한 배양 조건의 효과(U AP/DNA ㎍)
배양 일수
(상기 데이터는 매 4 개의 샘플에 대한 평균값 및 그의 ±SD에 상응한다)
[표 3]
칼슘 함량에 대한 배양 조건의 효과(Ca ㎍/웰)
배양 일수
(ND, 측정 안 됨, p < 0.01 대 대조용 배양물. 상기 데이터는 매 4 개의 샘플에 대한 평균값 및 그의 ±SD에 상응한다)
실시예 5 - 능력획득된 세포의 전달
상기 배양 기간의 완료 후에, 콜라겐 겔을 콜라게나제로 표적화하고 세포를 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA로 27 ℃에서 분산시켰다. 세포를 원심분리시키고, 세척하고 무 혈청 배지에 재현탁시켰다. 적합한 카운트 후에, 상기 중 일부를 래트 피하 조직에 이식된 밀리포어 확산 챔버에 삽입하고 다른 일부는 특정한 골 병변에 이식된 하이드록시아파타이트 단편에 흡수시켰다(도 3).
실시예 6 - 피하 이식. 정규장소 외의 골 형성
개시된 과정에 의해 능력 획득되고 무 혈청 배지에 현탁된 1 x 106 인간 세포를 갖는 확산 챔버를 피셔(Fisher) 래트(7 개월 된 344 마리 암컷)의 등에, 상기 래트를 펜토바비탈 나트륨 3.5 ㎎/체중 100 ㎎을 피하 주입하여 마취시킨 후에 피하 이식하였다. 상기 등의 중앙에서 2 ㎝ 절단을 수행하여 챔버를 삽입하였다. 각각의 래트는 TGF-ß1-CBD로 처리된 세포 및 다른 대조용 세포(배양 기간 동안 처리되지 않거나 상업적인 TGF-ß1로 처리된 세포)가 있는 여러 개의 챔버를 가졌다. 상처를 봉합하고 베타딘으로 소독하였다. 4 주 후에(이식 기간), 상기 래트를 고 용량의 마취제에 의해 죽이고 챔버를 조직학 및 방사선 사진 연구를 위해 회수하였다. 후자를 저 밀도 X-선을 사용하여 수행하였다. 상기 조직학 연구를 위해서, 상기 챔버를 뷰닌(Bounin) 또는 10%로 완충시킨 포르말린 중에 고정시켰다. 고정 후에, 상기 챔버의 플라스틱 고리를 아세톤에 가라앉혀 용해시켰다. 탈수 후에, 상기를 파라핀에 매몰시키고 5 마이크로미터의 두께에서 여러 수준으로 시상 봉합적으로 절단하였다. 상기 구획들을 상기 이식 기간 도중 상기 챔버 내부에 형성된 조직을 분석하기 위해서 상이한 콜라겐 유형들에 대한 항체를 사용하여 상이한 조직화학 또는 면역세포화학적 기법에 의해 염색하였다.
도 2는 상이한 챔버 중에 형성된 조직의 연골 및 골 성질을 입증하는 상기 챔버들의 방사선 사진 및 조직 영상을 나타낸다. 소 섬유 조직이 거의 보이지 않는 대조용 챔버에 비해, 본 실험 챔버는 골 기질이 완전히 형성된 골 조직의 전조인 것으로 보이는 다른 특성들과 함께 연골 특성을 갖는 큰 조직 표면을 나타낸다. 상기 데이터는 상기 연골 조직이 유골로 형질전환되는 것으로 보이며, 따라서 상기는 실제 연골뼈 되기 과정이 상기 챔버의 내부에서 발생함을 가리키는 것으로 보임을 시사한다.
실시예 7 - 경골 골절에서 이식 실시예
약 0.5 ㎝ 직경의 하이드록시아파타이트 프루스테온(Proosteon) 500(Interopore)의 단편들을 세포 현탁액에, 상기 단편의 대부분의 구멍이 세포로 충전되도록 상기 단편 위에 수 마이크로리터를 적하하고 그의 위치를 변화시키면서 매몰하였다. 상기와 같이 배열된 세포를 무균상태에 주의하면서 0 ℃를 약간 초 과하는 온도에서 수술실로 옮겼다. 환자를 마취한 후에, 골절 표면을 준비하고 하이드록시아파타이트 단편을 별도로 도입시켰다. 상기 골절은 실제로 비 연결 또는 위축성 의사-관절증이며, 섬유 조직을 갖는 무혈관 병터, 혈관화된 연골-골 발생 조직의 무 증식을 특징으로 한다. 따라서, 상기 이식 전에, 동일한 수술 행위로, 상기 섬유 조직을 상기 골절 테두리로부터 제거하여 경화성 골 조직 중의 양쪽 표면을 모두 남기고, 각각 근위 및 원위에서 혈관 출처가 발견될 때까지 상기를 천공하였다. 하이드록시아파타이트의 단편들을 위치 상 골절 병터의 주변에 있는 상기 구멍 중에 놓았다. 총 95 개까지의 다른 하이드록시아파타이트 단편을 상기 골절 선에 놓았다. 상기 하이드록시아파타이트 단편들을 연골-골 수행능력 세포와 함께 놓은 후에, 상기 두 개의 골 단편을 모두 중립화 원리에 따라 티타늄 스크류로 압착시켜 부착시킨 티타늄 플레이트에 의해 강성의 비 동적인 토대 상에서 안정화시켰다.
도 3은 이식 후 6 주째에 생검법으로 수행된 조직 구획의 상을 나타낸다. 상기 상은 골 조직 특징을 갖는 하이드록시아파타이트 벽과 접촉된 새로 형성된 조직, 및 무기질 섬유주 사이에 남은 중공 중에 골수 조직의 형성을 나타낸다. 상기 제공된 증거는 상기 형성된 조직이 성숙한 뼈의 특성을 가짐을 보인다. 더욱 또한, 상기 상은 골 유도가 가까운 이식물에 도달하지만 더 멀리는 가지 않으며, 이는 이식된 세포가 상기 골 유도에 기여하기 때문에 설명될 수 있고, 세포가 이식 영역에서 자발적으로 확산하는 곳까지 연장됨을 보인다. 상기 이식물에서 더 먼 영역은 골 유도의 징후를 보이지 않는다.
Claims (20)
- 골 및/또는 연골 치유용 약물의 제조에서 인간 혈청, 및 진핵세포 발현 시스템에서 수득된 콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인을 갖는 형질전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD)을 사용한 증폭에 의한 연골-골 발생 계통으로 분화된 인간 중간엽 줄기 세포의 용도.
- 제 1 항에 있어서, 원위치 주입, 전신 순환, 또는 적합한 생체 적합 물질 중에 흡착시킨 이식물에 의한 약물의 투여를 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 투여를 적합한 물질에 흡착시킨 이식물에 의해 수행함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식물에 사용된 물질이 하이드록시아파타이트 또는 확산 챔버임을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중간엽 줄기 세포를 글루코코르티코이드를 사용하여 유도함을 특징으로 하는 용도.
- 제 5 항에 있어서, 글루코코르티코이드가 덱사메타손임을 특징으로 하는 용도.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, ß-글리세로포스페이트를 유도에 또한 사용함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인을 갖는 형질전환 성장 인자-베타 1이 진핵세포 발현 시스템에서 발현된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 8 항에 있어서, 사용된 발현 시스템이 곤충 세포임을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항에 있어서, 곤충 세포를 바쿨로바이러스로 형질감염시킴을 특징으로 하는 용도.
- 인간 중간엽 줄기 세포로부터의 생체 외 연골-골 발생 세포의 능력획득 과정으로,a. 인간 혈청 및 콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인을 갖는 형질전환 성장 인자-베타 1(TGF-ß1-CBD)이 보충된 배지에서 줄기 세포의 1 차 배양;b. 인간 혈청 및 TGF-ß1-CBD의 보충에 의한 후속 증폭;c. 덱사메타손 및 ß-글리세로포스페이트에 의한 연골-골 발생 유도의 단계들을 포함함을 특징으로 하는 과정.
- 제 11 항에 있어서, 콜라겐 I에 결합하기 위한 분자 도메인에 융합된 형질전환 성장 인자-베타 1을 진핵세포 발현 시스템에서 발현시킴을 특징으로 하는 과정.
- 제 12 항에 있어서, 사용된 발현 시스템이 곤충 세포임을 특징으로 하는 과정.
- 제 13 항에 있어서, 곤충 세포를 바쿨로바이러스로 형질감염시킴을 특징으로 하는 과정.
- 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 인간 유형 I 콜라겐 겔임을 특징으로 하는 과정.
- 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 초기 보충을 0.1% 내지 1%, 바람직하게는 0.5% 량의 인간 혈청으로 수행함을 특징으로 하는 과정.
- 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭을 1 내지 25 일 범위의 기간 동안 수행하고, 이 기간 동안 배양 배지를 5% 내지 25%, 바람직하게는 20% 량의 인간 혈청으로 보충함을 특징으로 하는 과정.
- 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 능력 획득 과정에 따라 획득할 수 있는 연골-골 발생 능력을 갖는 세포.
- 인간의 골 및/또는 연골 치유용 조성물의 제조에서 제 18 항에 따른 연골-골 발생 능력을 갖는 세포의 용도.
- 생체 적합성 골 전도성 물질, 및 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 능력획득 과정에 의해 획득할 수 있는 연골-골 발생 능력을 갖는 세포의 그룹을 포함함을 특징으로 하는, 골 발생을 유도할 수 있는 조성물.
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