CN101014701A - 软骨和骨修复组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及软骨和骨修复组合物，包含一群通过用人血清和真核表达***中获得的具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子β1(TGF－β1－CBD)扩增分化成软骨成骨世系的人间充质干细胞，和被这样处理的细胞吸收的生物相容材料。可以在待修复的区域使用植入物来使用本发明的组合物或可以通过在损伤部位注射悬浮液中的细胞或将悬浮液中的细胞注入体循环使其广泛分布来直接使用本发明的组合物。

Description

软骨和骨修复组合物
技术领域
本发明可应用于涉及参与骨骼修复的药物制造的生物医学工业中，更具体地可应用于任何病因学的软骨和骨修复过程、脊柱融合术或关节固定术、骨缝合术、用于关节成形术的假体、骨质疏松症等，和任何其他需要骨或软骨组织修复或再生的情况中，且其中分化细胞的补充供应对于获得所涉及的组织修复具有有效的帮助。
背景技术
组织再生是一个复杂的过程，涉及使在损伤部位存在的或已经恢复的多种细胞达到极盛期。修复过程中发生的所有事件通过生长因子和细胞因子、细胞和形成胞外基质的分子之间的多种相互作用来支配。
包括TGF-β、PDGF、BMP、IGF和FGF的多种诱导物信号和生长因子共存在于骨中(Becerra等，Med Clin 2001；116：23-24)。其中，只有BMP是骨诱导物；然而，所有都参与特定骨折的修复(Reddi NatureMedicine 1998，3：837-839；Groeneveld和Burger Eur J Endocrinol2000；142：9-21)。在骨中还存在响应骨折刺激的成骨前体细胞，激活并产生诱导间充质干细胞(MSC)迁移的BMP，MSC增殖并分化成骨形成细胞(Guerado等，Rev Ortop Traumatol.2003；47，362-374)。然而，对于间充质干细胞和具有调节它们转移、增殖和分化成成骨世系的生化信号的骨起源前体细胞之间的复杂相互关系的理解，仍然显示出明显的不足。
TGF-β是一组生长因子，其由在多种组织和物种中表达的基因家族所编码(Kingsley Genes Dev；1994；8：133-146；Bostrom和Asnis，Clin Orthop Relat R，1998；355S：124-131)。骨是最重要的组织之一，在其中观察到具有调节细胞功能能力的TGF-β的局部产生(Centrella等，J Bone Joint Surg 1991；73-A：1418-1428)。尽管血小板是TGF-β的主要来源，但骨是最重要的存贮组织，大于其他软组织100倍，其中还共同存在着BMP(Roberts等，Biochemistry1983；22：5692-5698)。
近些年来已经获得了重要的结果，但将TGF-β加入培养物中的成骨细胞时，有时发生冲突。它们的mythogenic或骨分化效应，或相反，已经归因于培养物中的细胞异质性，其他生长因子的存在，细胞密度，培养条件或该因子可能的双相效应(Noda等，Endocrinology 1988；124：612-617；Stein和Lian，Cellular and Molecular Biology ofBone.San Diego：Academic Press；47-95 1993)。最近的研究还认为可能存在TGF-β或BMP的不同靶细胞；前者似乎作用于已经参与成骨世系的干细胞，而BMP可以作用于非缺乏抵抗力的细胞(non-compromisedcell)(Ballock等，J.Oprthop.Res.1997；15：463-467)。无论如何，似乎清楚的是MSC在TGF-β1的存在下可以进行自我更新和扩增(Andrades等，Cells.Exp Cell Res，1999；250：485-498)。
为了控制生物利用率和确保MSC培养物中具有一定控制的TGF-β1的存在，最近建立了一种实验方法，用该方法从大鼠骨髓分离出细胞群，在胶原蛋白凝胶中培养时，在具有特异性结合胶原蛋白I的分子结构域的TGF-β1存在下，该细胞群被扩增并诱导成成骨世系。已经提出结合胶原蛋白的结构域使凝胶中结合的活性因子缓慢释放，延长它的半衰期并提高它对靶细胞起作用的有效性(Andrades等，Cells.Exp CellRes，1999；250：485-498)。
已经证明骨再生能力随着年龄而降低。尽管骨髓造血细胞的数目在整个生命过程中持续不变，但其MSC实质上降低，此外还注意到由于缺乏骨诱导因子进展的一些困难或细胞产生或响应它们的无能(Hayne sworth等，Musculoskeletal Soft-Tissue Aging：Impact onMobility。第一部分，第7章，Rosemont：AAOS，80-86，1994)。
因此，理想的是建立能够选择骨修复无能个体的MSC，将它们体外扩增并获能成为成骨世系的方法。
确实进行上述方法后，将如此处理的细胞转移至患者需要骨骼修复的部位中，用合适的生物材料来运载它们，并由此建立一种自体细胞疗法，其能够有效地建立已经丧失或受到严重危害的骨修复功能。这还可避免生物活性因子全身或局部感染的不利影响，因为在修复部位之外控制它们目前是困难的，且它们的多效性影响是一种不可避免的威胁。
在任何情况中，当需要固定两个或多个骨碎片时，获能细胞的移植应当在促进骨生成的微环境中进行。关于这点，当骨折或非固定病灶(假关节)的特征在于是具有软骨成骨组织增生(没有固定或增殖性假关节)的多血管性的时，内部或外部骨髓植入物对该病灶的简单刚性非动态稳定应当促进固定。这些情况中，将获能细胞移植至羟磷灰石或胶原蛋白载体上的成骨世系中，在骨缝合术后获得稳定的多血管床，这是成骨骨痂生长的理想微环境。在非固定或萎缩性假关节的情况中，应当除去两个碎片之间的纤维组织，留下骨和骨并通过骨穿孔和具有血管化组织的内层(通常是肌肉)来寻找血管源。两个碎片必须通过防止骨接触面移动的刚性骨缝合术来稳定，因为在接触面移动的情况下，其将受到破坏并将阻止血管增生，且将刺激诱导软骨形成而不是骨生成的化学介质的表达(Rüedi和Murphy，AO Principlesof fracture management(骨折处理的AO原则).Sttugart，GeorgThieme Verlag.2000；Browne等，Skeletal Trauma，Basic Science，Management，and Recons truction(骨骼损伤，基础科学，处理和重建)，Philadelphia，Saunders，2003)。
同样理想的是开发提高骨质疏松个体中骨质量形成能力的方法，该方法包括干预这些患者中骨形成和吸收之间的不平衡，这种不平衡对前者不利。将获能细胞体外全身注射至成骨世系将平衡所述二者。
发明内容
本发明在制备用于骨骼修复的药物和组合物中具有明确的用途，更具体地用于软骨、骨修复过程，骨质疏松，用于关节成形术的假体等，该药物或组合物可以原位注射至小的非关节骨折或软骨损伤中，注入骨质疏松个体的体循环中或可以吸附于合适的生物材料(胶原蛋白，羟磷灰石等)中来植入以促进某种显著损伤中的软骨或骨形成。此外，可以将它们吸附于覆盖髋、膝关节成形术假体的羟磷灰石(periapatite)中来提高这些假体在宿主中的生物整合，延长它们的寿命。这些制剂还可以用于脊椎关节固定术中来促进脊柱融合并提高通过标准方法采用自体移植或骨库进行的这些方法的效率。
本发明的第一方面中，提供了通过给予分化成软骨成骨世系的人间充质干细胞来提高有此需要的人中骨和/或软骨形成的方法，所述的分化是通过用人血清和真核表达***中获得的具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子-β1(TGF-1-CBD)来进行的。
本发明的优选实施方案中，通过原位注射、注入体循环或通过吸附于合适生物材料中的植入物来进行这些获能细胞的给予。优选的实施方案是使用植入物，该植入物具有吸附于合适材料中的细胞，更优选的实施方案是使用具有50％孔隙率的可再吸收羟磷灰石，胶原蛋白凝胶的扩散盒。
本发明的优选实施方案中，使用糖皮质激素来帮助人MSC诱导成软骨成骨世系。优选使用***。更优选的实施方案中，在***和β-甘油磷酸酯的存在下进行这种诱导。
本发明的另一优选实施方案中，在真核表达***中表达与结合胶原蛋白I的分子结构域连接的转化因子-β1。优选的实施方案是使用昆虫细胞来表达，更优选的是使用杆状病毒转染的昆虫细胞。
本发明的第二个方面中，提供了使软骨成骨细胞从人MSC体外获能的方法，其包括以下步骤：
●在补充人血清和具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子-β1(TGF-β1-CBD)的培养基中原代培养干细胞；
●随后通过补充人血清和TGF-β1-CBD来扩增；
●用***和β-甘油磷酸酯来诱导软骨成骨。
人MSC可以从患者的不同组织和部位以及从骨髓、脐带血、外周血或冷冻人胚细胞的内部物质获得。
该获能方法的优选实施方案中，在真核表达***中表达与结合胶原蛋白I的分子结构域融合的转化生长因子-β1。更优选的实施方案是使用昆虫细胞来表达。更优选的实施方案是使用棒状杆菌转染的昆虫细胞。
根据另一个优选的实施方案，在人I型胶原蛋白凝胶中进行原代培养。
另一个优选的实施方案中，在补充0.1至1％，优选0.5％量的人血清的培养物中进行骨髓MSC的选择。
根据优选实施方案，在1至25天的时间段中进行扩增，在此期间，给培养基补充5％至25％，优选20％量的人血清。
本发明的第三方面中，提供了通过上述获能方法可获得的具有软骨成骨能力的细胞，其包括MSC的选择、扩增和软骨成骨诱导。
本发明的第四方面中，提供了通过上述获能方法可获得的具有软骨成骨能力的细胞在制备用于人骨和/或软骨修复的组合物中的用途。
本发明的第五方面中，提供了可以诱导成骨的组合物，其包含生物相容的骨传导材料，和一群通过上述获能方法可获得的具有软骨成骨能力的细胞。
附图说明
图1.-a)在rhTGF-β1-CBD存在下在胶原蛋白凝胶中体外培养10天的MO细胞。观察到非常少的分离细胞。在rhTGF-β1-CBD存在下在胶原蛋白凝胶中培养35天并分别用***和β-甘油磷酸酯诱导的MO细胞(b和c)。观察到更大的细胞密度和它们的一些集落。×60倍。
图2.-a)显示了在大鼠皮下组织中植入结束后四个扩散盒的射线照片。不同的密度显示出新形成组织的不同质量和数量。b)在植入期后扩散盒组织切片的显示，其中放置了在控制条件下培养的细胞，没有rhTGF-β1-CBD，它们内部充满了不同程度的纤维材料，发现没有软骨类骨质组织堆积物(星号，扩散盒滤器)。Sirius红-苏木精。×10倍。c)低放大倍数下扩散盒切片的外观，其中在rhTGF-β1-CBD存在下放置了体外处理的细胞，检测到几个高出其他的接近滤器(星号)的新形成组织(箭头)的聚集物。Sirius红-苏木精。×10倍。d)这些聚集物之一分化成两类组织的详图，一种是软骨外观(实心圆)，染色差，另一种是强烈染色的类骨质外观(空心圆)。在淡色组织外面，看到更多染色的纤维，其类似软骨膜(箭头)。Sirius红-苏木精。×40倍。e)呈现了与以上平行的切片，用Goldner三色染剂染色，最致密的组织(类骨质)显示出强烈的蓝色(空心圆)，浅色的东西看上去象软骨(实心圆)。圆的周围存在一些浅蓝色的纤维，似乎是软骨膜层(箭头)。×40倍。f)用阿尔新蓝染色另一个平行切片时，软骨组织显示为蓝色(实心圆)，而类骨质是无色的(空心圆)，还有软骨膜。×40倍。这与软骨类骨质新形成相一致。Sirius红和三色染剂都将骨组织和软骨膜所特有的胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白强烈染色，而阿尔新蓝将软骨基质中富含的酸和蛋白多糖的硫酸化基团染色。
图3.-所形成组织的切片，其中进行含有如文中所示处理细胞的羟磷灰石的植入。因为在切割和着色之前将材料脱钙，空的地方(星号)对应于羟磷灰石小梁的壁。现在这些壁中的空洞填满称为骨髓(实心圆)的组织，而薄的新形成的组织层(箭头)附着于这些小梁上。a)显示了羟磷灰石壁内层的组织富含胶原蛋白的程度(Sirius红的强烈红色)(箭头)，如用偏振光照射相同切片时，b)中双折射所示的。该胶原蛋白是I型的，如用抗胶原蛋白I抗血清处理这些组织切片时其阳性性质所示(箭头)，显示于c)中。×20倍。d)以更大的放大倍数，显示了新的组织内含有细胞，如截留于它们合成基质中的成骨细胞(Go1dner三色染剂)。新的组织显示出红色(更成熟的组织)或浅绿色(未成熟的组织)。×40倍。e)显示了接近于植入的羟磷灰石(星号)区域的切片，其中可以看到宿主组织的几个小梁显示出浅绿色新骨的新对合，这表明一定的成骨活性，不仅在我们放置HA的地方，而且在其周围，这表明了“一定距离的骨诱导”，可能是由“扩散”HA的细胞所致(Goldner三色染剂)。×20倍。相反，f)显示了远离HA碎片位置的相同宿主骨区域的切片，其中看到骨小梁没有显示出新的组织掺入，因此，骨诱导没有进一步延伸到植入物的区域。×20倍。
具体实施方式
通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例1-具有胶原蛋白I结合结构域的人融合重组蛋白TGF-β1(rhTGF-β1-CBD)的设计和获得
通过RT-PCR，使用具有校正能力的DNA-聚合酶获得TGF-β1的cDNA。所用的模板是总RNA，通过Chomczynski和Sacchi(1987)的方法从人骨肉瘤细胞MG63(ATCC中的参考号：CRL-1427)提取。借助软件(Oligo v6.6)根据Genbank中公开的mRNA序列来设计引物。在维持质粒(pBSK II，Stratagene)中“in dull”克隆PCR产物。一旦基因得到克隆，通过双链测序来检测。使用这些质粒作为模板，用pfu-DNA-聚合酶通过PCR来扩增，该区域编码成熟肽。所用的引物含有胶原蛋白结合结构域(CBD)和适于在杆状病毒表达***转移质粒中定向克隆的限制位点，含有昆虫细胞特异性的用于肽信号分泌的序列(pAcGP67B，Pharmingen)。为了获得无CBD的因子，引物只含有限制位点。正义引物链具有以下结构：CBD-GGAGGA-(Nhel)-6个最初的成熟肽材苷酸TGF-β1的5’-(BamHI)-序列。通过该基因5’端的几个核苷酸形成反义引物链并包括终止密码子。此外，它具有Not I位点。所有情况中，通过对PCR产物或含有其的转移质粒进行测序来检测结构。
一旦获得用于具有和不具有CBD的因子的转移质粒，用由转移质粒和商业DNA杆状病毒(BacVector 3000，Novagen)制成的混合物共转染昆虫细胞(sf9)，此外该杆状病毒已除去了多角体蛋白基因，编码半胱氨酸蛋白酶的其它基因。我们根据商业公司的说明使用了脂质体介导的转移方法(lipofectin，Novagen)。
一旦将DNA转移至细胞，将它们在TNM-FH培养基中培养数天，直至观察到细胞倾向(affectation)。在此期间，在细胞内发生同源重组，借此将病毒DNA转移至多角体蛋白启动子下游，包含肽序列信号的质粒的区域加上具有或不具有CBD的因子的区域。该过程产生了杀伤细胞的感染病毒，其释放至环境中并感染其他细胞。
从培养物上清液中的重组病毒混合物中选择重组病毒。这通过平板测试来进行，包括在半汇合细胞中接种转染上清液的稀释液。感染期(1小时)后，用溶解于培养基中的琼脂糖覆盖平板，并使其培养4天。这样，使得在一些细胞环境中发生感染的扩散，产生了溶胞平板。将这些溶胞平板单个取出并置于小体积的培养基中来提取病毒。基于第一次选择的溶胞平板的数量和大小，从前一个溶胞平板将该程序再重复一次，因此我们将能确定具有克隆的重组病毒。一旦该病毒得到扩增，使用因子特异性的引物通过PCR分析来检测其含有相关基因。然后需要使用大量原液来滴定以确定pfu/mL(平板形成单位/mL)的数量。
从这点看，对于每个重组病毒，为了获得最佳产量，建立合适的感染条件。为此，使用已知数量的细胞来接种12-孔平板。其中，除了不同的培养时间，还要计划接种不同百分比的病毒/细胞数量(MOL，感染复数)。测试0.1，1或10的MOI，在培养48，72和96小时时取样。为了使培养基的血清不受不良蛋白质的污染，在感染后头24小时后，用无血清培养基或用非常低百分比的血清来持续培养。完成每个实验情形后，收集上清液并离心除去细胞残余物。
通过冻-融使完整细胞破裂并用PBS提取。通过SDS-电泳(变性条件)来分析两种样品，没有使用还原剂。用Coomassie蓝将聚丙烯酰胺凝胶染色(如果不是足够灵敏，可以进行银染色)。还使用特异性的TGF-β1抗体通过免疫印迹来分析不同的样品。我们使用了过氧化物酶标记的二次抗体并通过化学发光(CSPD，Amersham)鉴定了它的存在。利用该信息，我们算出了所产生的单体/二聚体的百分比和该体系的产量。
为了获得显著量的重组蛋白质，使用约500,000细胞/mL开始约250mL的液体培养。当达到约2×l06细胞/mL的生长时，接种病毒，使用最高的M0I并以最大的产量。在24小时时，除去含有血清的培养基，并用无血清培养基将细胞培养通过之前的测试所确定的天数。该时间后，按照Aono等(1995)所述的实验方案来纯化蛋白质。该方法使用阳离子交换色谱，使用SP-琼脂糖柱(Amersham-Pharmacia)。将培养基在pH8平衡并加入4M尿素。用Tris-HCl 20mM pH8缓冲液，4M尿素来平衡柱子。培养基流过柱子后，用缓冲液洗涤，并用0至0.7M的NaCl线性梯度来洗脱蛋白质。对于不同的级分，在280nm处测量吸光度，并在上述的技术之后，通过电泳来分析含有蛋白质的那些级分。收集阳性级分并通过超滤来浓缩，用于生物活性测定中。通过Bradford来测量该最终级分的蛋白质浓度。
实施例2.-获得并制备人间充质干细胞
从通知的捐献者外科手术取出髂嵴后，从人骨髓(BM)获得人间充质干细胞。将骨髓组织在含有抗生素(100mg/mL青霉素G(Sigma)，50mg/mL庆大霉素(Sigma)和0.3mg/ml两性霉素B(Flow-ICN))的完全培养基(-MEM，GIBCO，HD，US)中洗涤。在通过18，20和22号的针头连续分散后获得个别化细胞的悬浮液，并最终通过20微米特氟隆无菌滤器(Cell Strainer，Falcon，Lincoln Park，NJ)来过滤，用于分离组织残余物和细胞堆积物。
实施例3.-胶原蛋白凝胶中的MSC培养
将根据实施例2获得的细胞悬浮液在100g离心5分钟。将离心物重悬浮于含有非常低浓度的患者血清(HS，0.5％)的培养基中。
将细胞置于48孔培养平板孔中之前，将pH7.4，0.35mg/mL浓度的100mL人胶原蛋白I溶液(Sigma-Aldrich)置于其底部。将每孔150mL的1mg/mL浓度的胶原蛋白I和TGF-β1的混合物，并将2×106个骨髓细胞置于上层。将培养平板置于37℃培养箱中15分钟使得在该时间之前为液体的胶原蛋白形成胶原蛋白凝胶。然后每孔放入10mL培养基，也含有相同浓度的TGF-β1。将如此准备好的培养物在95％空气和5％CO2的气氛中于37℃和100％相对湿度下培养。每3天，更换一次培养基，在所有情况下都加入相同浓度的TGF-β1。
在之前对趋化性反答的测试中研究了TGF-β1的最佳浓度。对于每个实验条件，将150mL胶原蛋白(0.35mg/mL)和之前选定的具有较大趋化性能力之浓度的因子混合。使汇合的大鼠骨髓培养物分离并以2×105细胞/mL的-MEM浓度将细胞置于Boyden室(Neuroprobe，R0ckville，MD)的上部间隔中。该室的下部间隔容纳含有不同浓度测试因子的培养基。在37℃5％CO2中培养4小时后，取出滤器并固定于甲醇中；将它们洗涤，染色并置于载玻片上。计数每个滤器中在显微镜(×400倍)的20个视野中移动细胞的数量来定量趋化性。
实施例4.-细胞获能的实验方法(选择，扩增和诱导)
将MO细胞维持于上述实验条件下10天，每3天更换一次培养基，且因此改变TGF-β1。在这10天后，向培养基中补充10％的患者血清(HS 10％)。这完成了所谓的选择期并开始扩增期，将扩增期维持获得相当数量的能够移植的细胞所需要的时间，但是无论如何，此时期不应超过25天。此后，向培养基中补充作为诱导骨的化学试剂的***(10-8M)和β-甘油磷酸酯(2mM)。只有2天的此时期称为诱导。
在细胞培养期间，在第0，10，14，18，21，24，27，30，33和36天取样，并对细胞数量和碱性磷酸酶的存在以及钙含量进行分析。表I，II，III显示了所获得的值。它们显示了TGF-β1-CBD与对照相比使细胞数量增加的程度。对于碱性磷酸酶的合成产生了相同的结果。钙含量也随着培养天数而提高，而对照中的值是不显著的。
在所述过程中培养物的显微镜检验表明了在TGF-β-1DUC的存在下，细胞在培养期间增殖的程度，甚至在扩增期间形成集落的程度(图1)。当用商品TGF-β1(R&D Systems，Minneapolis，MN)处理细胞时，它们是分散的或群集差。
表1.培养条件对细胞复制(DNA μg)的影响
                                                                                             培养天数
  0   10  14   18   21   24   27   30   33     36
  对照   28.5±1.55   2.9±0.67  4.9±0.52   6.6±0.91   8.2±0.86   8.5±0.86   8.5±0.74   9.0±0.70   9.7±0.88   10.6±0.76
  rhTGF-β1-F2   0.00+0.00   6.8+0.89  14.1±2.74   19.5±2.79   20.3±1.49   22.8±1.49   25.4±2.10   27.8±2.23   29.1±2.00   31.7±2.56
  数据对应于每四个样品的平均值及其±SD
表2.培养条件对碱性磷酸酶活性(U AP/μg DNA)的影响
                                                                              培养天数
0   10   14   18   21   24   27   30     33   36
 对照 2.2±0.20   0.2±0.01   1.0±0.03   1.4±0.06   1.4±0.05   1.5±0.07   1.5±0.09   1.5±0.12     1.4±0.10   1.44±0.11
 rhTGF-β1-F2 2.2+0.20   1.0+0.03   2.91±0.27   3.8±0.21   3.43±0.17   3.58±0.15   3.5±0.21   4.2±0.28     3.61±0.24   3.18±0.19
 数据对应于每四个样品的平均值及其±sD
表3.培养条件对钙含量(μg Ca/孔)的影响
                                                                          培养天数
 0  10  14 18  21  24 27  30  33  36
 rhTGF-β1-F2  ND  ND  ND  0.045±0.07  0.062±0.08   0.075±0.06 0.086±0.09  0.170±0.01  0.171±0.01  0.173±0.01
 ND，未检出，相对于对照培养物p＜0.01。数据对应于每四个样品的平均值及其±SD
实施例5.-获能细胞的转移
完成培养期之后，用胶原酶处理胶原蛋白凝胶并用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA在27℃分散细胞。将细胞离心，洗涤并重悬浮于无血清培养基中。适当计数后，将一部分细胞放入植入大鼠皮下组织的Millipore扩散盒中，使另一部分细胞吸附于植入特定骨损伤的羟磷灰石碎片中(图3)。
实施例6.-皮下植入。异位骨的形成。
在皮下注射3.5mg/100mg体重的戊巴比妥钠使大鼠麻醉后，将含有用所述方法获能的并悬浮于无血清培养基中的1×106人细胞的扩散盒皮下植入334只7个月大的雌性Fisher大鼠的背部。在背部中线进行2cm的切口来***扩散盒。每只大鼠具有几个含有用TGF-β1-CBD处理的细胞的扩散盒，和其他含有培养期间未处理的或用商品TGF-β1处理的细胞的对照盒。将伤口缝合并用聚乙烯吡咯酮碘消毒。四周后(移植期)，通过过量的麻醉杀死大鼠，并取出上述盒用于组织学和射线照相研究。后者使用低强度X-射线来进行。对于组织学研究，将盒固定于Bounin或10％缓冲的***中。固定后，通过沉浸在丙酮中来溶解盒的塑料环。干燥后，将它们包埋于石蜡中并在几个适当的位置上，以5微米的厚度来径向切割。通过不同的组织化学或免疫细胞化学技术(使用针对不同胶原蛋白类型的抗体)将这些切片染色，以便分析移植期间在盒内所形成的组织。
图2显示了不同盒的射线照相和组织学图象，表明了其中形成的组织的软骨和骨性质。与其中几乎看不到纤维状组织的对照盒相比较，实验盒显示出具有软骨特征的大的组织表面，和其中类骨质基质似乎是完全形成的骨组织的先兆的其他组织表面。数据表明软骨组织似乎转变成类骨质骨，因此这似乎表明了盒内发生了真正的软骨内骨化过程。
实施例7.-胫骨骨折中植入的实例
在直径约0.5cm的羟磷灰石Proosteon 500(Interopore)碎片中填入细胞悬浮液，在碎片上面滴几微升，并改变它们的位置以确保它们的大部分孔中填满细胞。将如此准备好的细胞转移至手术室中，注意无菌和温度略高于0℃。将患者麻醉后，准备骨折表面并分开引入羟磷灰石碎片。该骨折实际上是非连接或萎缩性假关节，特征在于具有纤维组织的无血管病灶，没有血管化的软骨成骨组织的增生。因此，在植入之前，且在同一外科手术中，从骨折边缘取出纤维组织，留下硬化骨组织的两个表面并对它们穿孔直至分别发现近端和远端的血管源。将羟磷灰石碎片置于孔中，位于骨折病灶周围。将其他多达总共95个羟磷灰石碎片置于骨折线中。通过用钛螺丝压实连接的钛板将两个骨碎片固定于硬的非动态的基底上，遵从中立原则。
图3显示了植入六周后在活组织检查中进行的组织学切片的图象。它们显示了与骨组织骨折处的羟磷灰石壁接触的新形成的组织，和矿物质小梁之间留下的空洞中骨髓组织的形成。所提供的证据表明所形成的组织具有成熟骨的特征。此外，图象显示出骨诱导到达植入物的附近，但没有到达更远处，这可以解释为植入的细胞引起了这种骨诱导，并延伸至细胞在植入区域中自发扩散的地方。远离植入物的区域没有显示出骨诱导的征兆。

Claims (20)

1.通过用人血清和真核表达***中获得的具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子-β1(TGF-β1-CBD)扩增分化成软骨成骨世系的人间充质细胞在制备用于骨和/或软骨修复药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于通过原位注射、注入体循环或通过吸附于合适生物材料中的植入物来给予该药物。
3.根据权利要求1至2任一项的用途，其特征在于通过吸附于合适材料中的植入物来进行给药。
4.根据权利要求1至3任一项的用途，其特征在于用于植入的材料是羟磷灰石或扩散盒。
5.根据权利要求1至4任一项的用途，其特征在于使用糖皮质激素来诱导人间充质干细胞。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于糖皮质激素是***。
7.根据权利要求5至6任一项的用途，其特征在于将β-甘油磷酸酯另外用于诱导。
8.根据权利要求1至7任一项的用途，其特征在于在真核表达***中表达了具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子-β1。
9.根据权利要求8的用途，其特征在于所用的表达***是昆虫细胞。
10.根据权利要求9的用途，其特征在于用杆状病毒来转染昆虫细胞。
11.软骨成骨细胞从人间充质干细胞体外获能的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.在补充人血清和具有结合胶原蛋白I的分子结构域的转化生长因子-β1(TGF-β1-CBD)的培养基中原代培养干细胞；
b.随后通过补充人血清和TGF-1β-CBD来扩增；
c.使用***和β-甘油磷酸酯来诱导软骨成骨。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于在真核表达***中表达与结合胶原蛋白I的分子结构域融合的转化生长因子-β1。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于所用的表达***是昆虫细胞。
14.根据以上权利要求13的方法，其特征在于用杆状病毒来转染昆虫细胞。
15.根据权利要求11至14任一项的方法，其特征在于培养基是人I型胶原蛋白凝胶。
16.根据权利要求11至15任一项的方法，其特征在于用0.1％至1％，优选0.5％量的人血清来进行培养基的初始补充。
17.根据权利要求11至16任一项的方法，其特征在于在1至25天的时间段内进行扩增，在此期间给培养基补充5％至25％，优选20％量的人血清。
18.根据权利要求11至17任一项的获能方法可获得的具有软骨成骨能力的细胞。
19.根据权利要求18的具有软骨成骨能力的细胞在制备用于人骨和/或软骨修复的组合物中的用途。
20.能够诱导成骨的组合物，其特征在于包含生物相容的骨传导材料，和一群根据以上权利要求11至17任一项的获能方法获得的具有软骨成骨能力的细胞。
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